CN106591441A

CN106591441A - 基于全基因捕获测序的α和/或β‑地中海贫血突变的检测探针、方法、芯片及应用

Info

Publication number: CN106591441A
Application number: CN201611095478.2A
Authority: CN
Inventors: 王君文; 李旭超; 高飞
Original assignee: SHENZHEN E-GENE TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Gao Fei; Wang Junwen
Priority date: 2016-12-02
Filing date: 2016-12-02
Publication date: 2017-04-26
Anticipated expiration: 2036-12-02
Also published as: CN106591441B

Abstract

本发明提供了一种基于全基因捕获测序的α和/或β‑地中海贫血点突变和缺失型突变的检测引物、方法、芯片及应用。本发明通过设计捕获探针富集所有参与α和β地贫的相关基因，检测各基因全长序列中的所有SNP、indel等突变信息，并通过增加如常染色体、X和Y染色体区域，同时增加各编码基因的上下游区域作为参照，检测各种SNV、CNV等结构变异。相对于目前各种热点突变位点的检测技术，本发明不仅可检测热点突变的信息，而且可以检测到一些罕见突变和未发现的新突变类型，实现目的基因全长序列特异性检测分析，突变类型全覆盖，极大的弥补常规检测方法对低频突变和稀有突变的漏检。

Description

基于全基因捕获测序的α和/或β-地中海贫血突变的检测探针、方法、芯片及应用

技术领域

本发明属于基因组学和分子生物学领域，具体而言涉及一种基于全基因捕获测序的α和/或β-地中海贫血突变的检测探针、方法、芯片及应用。

背景技术

地中海贫血又称珠蛋白生成障碍性贫血或海洋性贫血。地贫相关基因的突变类型和突变位点错综复杂，高达上千乃至几千种。如静止型α地贫(αα/α-)或(αα/ααT)、轻型α地贫(αα/--)或(α-/α-)患者虽然大多无明显临床症状，但如果夫妇双方是同型突变携带者，则其子女有25％的几率为重型地贫，50％的几率为基因携带者；不同于静止型或轻型地贫患者，血红蛋白H病(-α/--)、(α-/--)、(ααT/--)或(ααT/ααT)患者可呈现轻度至中度贫血和肝脾肿大等；更严重的HB Bart’s胎儿水肿综合征(--/--)多在妊娠晚期(34～40周)或产后数小时内死亡。同样对于β型地贫患者，轻型患者临床多无症状或轻度贫血，而重型患者临床上一般在出生3-6个月出现贫血，肝脾肿大，颧骨***、眼距增宽等骨骼改变。

截止目前，我国重型和中间型地贫患者在30万左右，突变基因携带者超过3000万人，其中以广西、云南、海南，广东、贵州等地较为普遍。地贫患者目前尚无有效的治疗方法，而且治疗费用昂贵，每月费用高达2000-3000元，给患者及家庭带来巨大的经济负担和精神痛苦。

基于地中海贫血危害的严重性和相关基因突变的多样性，开发一种有效的、覆盖α和β球蛋白基因全长的基因筛查检测技术或相应的检测试剂盒，用于地贫高发地区的人口筛查，对杜绝或预防该疾病在新生儿中的发生，提高出生人口素质和健康水平具有重要意义。

目前，所有的检测技术多是针对特定的突变位点进行筛查，尚无特异性检测α和β球蛋白基因全长的技术，其检测结果只能保证所检测的位点不存在突变，但不能保证所有致病突变均没有发生变异，存在大量位点漏检的风险，难以精确反映检测个体及其后代患病或携带相关突变的风险或概率。

目前相关技术包括：限制性片段长度多态性分析连锁分析技术，单链构象多态性检测、突变寡核苷酸延伸扩增、特定突变位点(多重)PCR扩增测序技术、探针斑点杂交技术、缺口PCR法(Gap-PCR)、荧光PCR、基因芯片等。其中专利(CN104789672A，2015.07.22)设计了一套检测探针，但该探针仍然是在已知突变位点的基础上进行设计，通过显色荧光检测固定的3个α缺失型突变、3个α非缺失型突变和17个β非缺失型突变，而非高通量全覆盖检测。类似的专利还包括CN104372100，2015.02.25；CN104293937A，2015.01.21；CN104204227A，2014.12.10和CN102277419A，2011.12.14等，均是通过已知突变位点设计探针和引物，对相应突变位点检测，不能检测所有的突变信息，更不能用于发现新的突变类型。虽然专利(CN102329876A，2012.01.25或CN102329876B，2014.04.02)发明了一种通过芯片捕获结合高通量测序检测疾病相关核酸分子的核苷酸序列的方法，然而其主要用于检测家族性腺瘤样息肉(捕获位置chr05:112073411)、多囊肾综合症(捕获位置chr06:51479999)、节性脑硬化综合症(捕获位置chr09:135766620)、苯丙酮尿症(捕获位置chr12:103231969)、马凡综合症(捕获位置chr15:48700368)和杜氏肌营养不良(捕获位置chrX:31137199)等单基因病，从某种意义上仍然是特定位点的捕获测序。专利虽提及可用于对地中海贫血的检测，然而并未给出明确的方法和手段。

因此，有必要提供一种便于检测新的突变类型，可覆盖α和β球蛋白基因全长的基因筛查检测技术、及检测试剂盒。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种基于全基因捕获测序的α和/或β-地中海贫血突变的检测探针、方法、芯片及应用。

第一方面，本发明提供了一种基于全基因捕获测序的α和/或β-地中海贫血突变的检测探针，所述检测探针包括目标探针组和对照探针组，其中，所述目标探针组包括表1所示第1-96号探针中的至少5种、优选至少10种、优选至少20种、优选至少30种、优选至少50种、优选至少80种、优选为全部96种；

所述对照探针包括表1所示第97-579号探针中的至少10种、优选至少20种、优选至少30种、优选至少50种、优选至少80种、优选至少100种、优选至少130种、优选至少160种、优选至少190种、优选至少220种、优选至少250种、优选至少280种、优选至少310种、优选至少340种、优选至少370种、优选至少400种、优选至少430种、优选为全部483种；

其中，对于表1所示第1-579号检测探针有如下定义：

表1第1列为检测探针的种类编号；

表1第2列为检测探针序列的可选基因位点区域；

表1第3列为检测探针序列的需覆盖的基因位点或基因区域；

其中，第1-96号探针中，每条探针的序列取第2列可选基因位点区域全长或在第2列可选基因位点区域任意选择连续的75-105nt个碱基作为目标探针的序列，每条探针的序列覆盖该探针对应第3列所示的基因位点或基因区域；

第97-579号探针中，每条探针的序列在第2列可选基因位点区域任意选择连续的60-120nt个碱基作为对照探针的序列。

优选地，表1的97-579号探针为可替换区域，本领域技术人员可根据已有单核苷酸多态性位点进行替换。

值得说明的是，本发明提供的检测探针可为表1第2列所示基因区域的正链或负链序列。

本发明一实施例中，检测探针以表1第2列所示基因区域的正链作为探针序列。

表1.检测探针编号及序列信息

优选地，所述检测探针覆盖了所有编码α基因族和β基因族的编码区域。

进一步优选地，所述检测探针还覆盖了HBB基因上、下游3kb区域。

进一步优选地，所述检测探针还覆盖了HBZ基因上游22.8kb至HBQ1基因下游8.8kb区域。

进一步优选地，所述检测探针还覆盖了X染色体区域。

进一步优选地，所述检测探针还覆盖了Y染色体区域。

进一步优选地，所述检测探针覆盖了还常染色体区域。

优选地，所述检测探针的5端还连接有生物素进行标记，以便捕获目标区域。

本发明第一方面提供的检测探针有如下优势：

A、可捕获所有编码α基因族和β基因族的编码区域，检测所有相关基因全长的各种可能的点突变和小indel突变等信息；B、通过将相关基因进行延伸，如HBB基因上下游3kb，HBZ基因上游22.8kb至HBQ1基因下游8.8kb同时捕获；C、同时增加X和Y染色体的部分区域作为内参，实现相关编码基因的大区域缺失的检测。

第二方面，本发明提供了一种基于全基因捕获测序的α和/或β-地中海贫血突变的检测芯片，所述芯片为液相芯片或固相芯片，其上结合有第一方面任一项所述的检测探针。

优选地，所述液相芯片是以DNA oligo为杂交探针的液相芯片。

第三方面，本发明提供了一种基于全基因捕获测序的α和/或β-地中海贫血突变的检测方法，包括使用第一方面任一项所述的检测探针或第二方面任一项所述的检测芯片与待捕获DNA样本进行杂交的步骤。

第四方面，本发明提供了一种基于全基因捕获测序的α和/或β-地中海贫血突变的检测方法，包括使用第一方面任一项所述的检测探针或第二方面任一项所述的检测芯片与待捕获DNA样本进行杂交的步骤；和使用第二代高通量测序技术对捕获得到的目标DNA进行测序的步骤。

优选地，所述检测方法包括如下步骤：

1)将待检测的基因组DNA样本打断成片段，优选打断成长度为200-500bp的片段，更有选为打断成长度为250-350bp的片段；

2)对步骤1)打断的片段进行纯化、末端修复、加A、加接头；

3)将步骤2)得到的产物与第一方面任一项所述的检测探针或第二方面任一项所述的检测芯片进行杂交，捕获到目标捕获区域的DNA片段；洗脱目标捕获区域的DNA片段后进行文库放大；

4)对步骤3)得到的测序文库进行高通量测序；

5)将步骤4)测序所得序列进行比对分析，获得测序结果。

进一步优选地，所述高通量测序为第二代高通量测序，并保证每个所述测序文库的原始数据量达到0.6Gb以上，目标区域的测序深度达到400×以上，目标区域覆盖度达到99％以上。

优选地，所述步骤7)具体包括：

a.基本统计：将目标区域划分为多个小区间，并统计每个小区间所包括的测序片段个数占非待测常染色体区间片段个数的百分比reads％和平均GC含量；

b.扩增偏向性修正：将落入各个统计小区间的reads％按平均GC含量分组，取各分组的reads％中位数除以所有区间的中位数得到修正系数；并将原始的每个区间的reads％乘以修正系数得到每个区间内测序片段百分比的修正值reads％’；

c.拷贝数变异检测：在数据分析过程中，引入一个正常人群作为对照样本，取对照样本的地中海贫血相关基因的拷贝数作为对照集来定义人类基因组地中海贫血相关基因的拷贝数基线，并计算每个待测样本中地中海贫血相关基因区间的修正值reads％’之和，并在对照集中计算此区间的平均值和方差；进而计算每个区间在对照样本中离群度，以z值表示，如果z小于-3或者大于3，则该区间发生了数目异常。

优选地，第一方面任一项所述的检测探针、第二方面任一项所述的检测芯片、第三方面或第四方面任一项所述的检测方法检测到的基因突变，所述基因突变为如下突变中的一种或多种：HBB基因上游第519 位核苷酸G突变为A、578位T突变为A、591位G突变为T、390位G突变为A、591位缺失核苷酸G、601位A突变为G、753位A突变为G；HBA1基因上游第672位核苷酸A突变为G、384位G突变为A、276为C突变为T；HBA2基因上游第1031位核苷酸T突变为C、771位核苷酸T突变为C；HBA2基因下游3端非编码区域795位核苷酸A突变为G。

第五方面，本发明提供一种基于全基因捕获测序的α和/或β-地中海贫血突变的检测试剂盒，包括第一方面任一项所述的检测探针或第二方面任一项所述的检测芯片，还包括检测试剂。

第六方面，本发明提供一种如一方面任一项所述的检测探针、第二方面任一项所述的检测芯片、第三方面或第四方面任一项所述的检测方法、或第五方面所述的检测试剂盒在检测α和/或β-地中海贫血突变中的应用。

如本发明所述的，在任一第一方面至第六方面中所述α和/或β-地中海贫血突变的形式包括α和/或β-地中海贫血点突变和/或缺失型突变；优选为碱基替换、***或缺失以及片段缺失或扩增。具体包括但不限于非同义突变、移码突变、移码缺失、翻译终止增加、翻译终止缺失。

本发明提供的技术方案的有益效果：

本发明提供的技术方案通过设计合成捕获探针，不仅富集所有参与α和β地贫的相关基因，检测各基因全长序列中的所有SNP、indel等突变信息，通过增加如X和Y染色体区域，同时增加各编码基因的上下游区域作为参照，可以检测到各种SNV、CNV等结构变异。实现相关编码基因的大区域缺失的检测。

相对于目前各种检测热点突变位点的技术，本发明不仅可检测热点突变的信息，而且可以检测到一些罕见突变和未发现的新突变类型，实现目的基因全长序列特异性检测分析，突变类型全覆盖，极大的弥补常规检测方法对低频突变和稀有突变的漏检。

实验上，通过设计带有不同index的接头，优化实验条件，实现一次捕获可以同时完成32个样品的建库和测序，极大地降低了成本，提高了检测的通量。

附图说明

图1是本发明实施例提供的全基因捕获测序的α和/或β-地中海贫血突变的检测流程图；

图2是本发明实施例构建的高通量测序文库2100检测文库的片段分布结果；

图3-4是本发明实施例提供的生物信息学地贫相关基因区间的拷贝数统计结果。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

本发明实施例中无特别说明外，所用试剂及耗材均为市售商品。

结合图1，本发明实施例提供了一种全基因捕获测序的α和/或β-地中海贫血突变的检测方法，具体包括：

1.目标基因和参考序列设计及合成

在本实施例中，目标区域包括：HBB基因及其上下游3kb的区域及HBZ基因上游22.8kb至HBQ1基因下游8.8kb的区域。同时，选取了Y染色体上的SRY基因区域作为实验过程中的质控位点；选取了基因组范围内其他染色体上共计270个位点作为拷贝数类型检测的参照位点。最终，选择了ROCHE NimbleGen平台进行探针的设计和合成过程，最终的芯片区域大小为125kb。

2.基因组DNA的片段化

选取32个已知突变类型的地贫患者的全血基因组DNA各2ug，使用Bioruptor或Covaris打断仪打断，电泳检测合格后(DNA片段主带集中在300bp，无蛋白、RNA污染)，经Ampure XP Beads(Agencourt)进一步片段筛选纯化，将约300bp的DNA片段回溶到32μl的Elution Buffer(Qiagen)中。

3.片段化DNA的末端修复：

1)将上一步得到的DNA按下表在1.5ml的离心管中配制末端修复反应体系：

2)将离心管放到调至20℃的Thermomixer(Eppendrf)上反应30min。反应完后用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen)进行纯化，最后将样品溶于34μl ElutionBuffer(EB)。

4.DNA片段3'末端加“A”碱基：

1)将上一步得到的DNA按下表在1.5ml的离心管中配制加“A”反应体系：

2)然后将管子放到调至37℃的Thermomixer(Eppendrf)上反应30min。反应完后用MiniElute PCR Purification Kit(Qiagen)进行纯化，最后将样品溶于20μL ElutionBuffer(EB)。

5.index Adapter的连接：

1)将上一步得到的DNA按下表配制Adapter连接反应体系，每一样品连接不同的index接头：

1)然后放到调至20℃的Thermomixer(Eppendrf)上反应15min。反应完后用MiniElute PCR Purification Kit(Qiagen)进行纯化，最后将样品溶于22μL ElutionBuffer(EB)。

Index Adapter:

TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNT(SEQ NO.1)

NNNNNNAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC(SEQ NO.2)

N为任意碱基

6.目标区域与探针的杂交

1)用Qubit fluorometer和相应的Quant-iT dsDNA HS Assay Kit(Invitrogen)对连接不同index接头的产物定量，每个样品取32ng的连接产物加入到一个新的1.5ml的EP管中，并加入10μL 1mg/ml的Cot1DNA(Invitrogen)和各1nmol的接头封闭序列Block1和Block2，混合物置于SpeedVac中蒸干，温度设置为60℃。

2)在蒸干的EP管中分别加入2×SC Hybridiation Buffer和SC HybridiationComponent A配制以下的杂交反应体系：

Block1：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNN(SEQ NO.3)

Block2：ANNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTA(SEQ NO.4)

N为任意碱基，且分别与index adapter的N碱基互补；

将样品震荡混匀后置于离心机上全速离心10秒。离心后将样品转移至95℃的heatblock中孵育10分钟，使DNA变性。

3)取出样品，震荡混匀后室温全速离心10秒，将其转移至一个0.2mL的PCR管中或96孔PCR板中，并加入4.5μL的设计的探针文库。震荡混匀后置于离心机上全速离心10秒，将反应体系放于PCR仪上，47℃杂交16h-72h，PCR仪的热盖温度设置为57℃。

7.杂交序列的捕获和洗涤洗脱

1)准备洗液

a)稀释以下四种Wash buffer(10×SC Wash Buffer I、10×SC Wash Buffer II、10×SC Wash Buffer III和2×Stringent Wash Buffer，NimbleGen)到1×溶液后贮存，贮存时间不宜超过2个星期。

b)47℃预热配制好的1mL Stringent Wash Buffer(NimbleGen)和1mL SC WashBuffer I(NimbleGen)两种溶液

2)准备链霉素磁珠

a)从冰箱中取出Dynabeads M-280Streptavidin(Invitrogen)磁珠，充分混匀后取100μL加入到一个新的1.5ml的EP管中；

b)将EP管置于磁力架上至澄清，用移液器小心的去除上清，加入200μL的Streptavidin Dynabead Binding and Wash Buffer(NimbleGen)；

c)Vortex混匀10s后，将EP管重新放回磁力架至液体澄清，用移液器小心的去除上清；

d)重复洗涤一次，总共洗两次；

e)用100μL的Streptavidin Dynabead Binding and Wash Buffer(NimbleGen)重悬磁珠，并将其转入0.2mL的小管中；

f)用磁力架结合磁珠(将小管靠到磁力架上)，直到液体澄清，用移液器小心的去除上清。

3)链霉素磁珠捕获杂交的DNA片段

将杂交混合物吸出来(记录杂交后剩余体积)加入到准备好的磁珠中，吹打混匀10次后将小管放在PCR仪上，47℃孵育45min(PCR仪热盖温度应设为57℃，每隔15min拿出在vortex 3s以防止磁珠沉淀)。

4)结合了捕获DNA的链霉素磁珠的洗涤

a)孵育45min后，将混合物从0.2mL的小管转入1.5mL的EP管中，将EP管置于磁力架上至液体澄清，小心的去除上清；

b)加入100μL预热到47℃的1×Wash Buffer I，vortex上混匀10s，将EP管置于磁力架上至液体澄清，小心的去除上清；

c)从磁力架上取下EP管，加入200μL预热到47℃的1×Stringent Wash Buffer，移液器吹打混匀10次(该操作应迅速以便管中的液体不低于47℃)；

d)47℃孵育5min后，将EP管置于磁力架上至液体澄清，小心的去除上清；

e)重复步骤c)-d)，共用1×Stringent Wash Buffer洗两次；

f)加200μL室温放置的1×Wash Buffer I，vortex混匀2min，如果液体溅到管盖上，用手指轻弹EP管使其集中到管低，将EP管置于磁力架上至液体澄清，小心的去除上清；

g)加200μL室温放置的1×Wash Buffer II，vortex混匀1min，将EP管置于磁力架上至液体澄清，小心的去除上清；

h)加200μL室温放置的1×Wash Buffer III，vortex混匀30s，将EP管置于磁力架上至液体澄清，小心的去除上清；

i)在捕获的磁珠中加入60ul的EB buffer，混合均匀。

8.捕获磁珠模板的PCR扩增及文库选择纯化：

1)将上一步得到的DNA按以下体系配制PCR反应体系：

PCR反应条件：

2)PCR产物经2％琼脂糖电泳后，运用QIAquick gel extraction kit(Qiagen)回收纯化300-450bp片段的文库，或直接用Agencourt AMPure Beads(Beckman Coulter)磁珠纯化回收PCR产物。

9.文库检测：

Bioanalyzer analysis system(Agilent,Santa Clara,USA)检测文库***片段大小及含量，文库2100检测结果见图2；Q-PCR精确定量文库的浓度。

10.测序及数据分析：

1)序列比对：

将每个样本测序得到的DNA序列(reads)与标准人类基因组参考序列(hg19)进行比对，得到所测DNA序列定位于基因组相应位置的信息。比对过程可以选用bwa、soap2、bowtie2等常规比对软件，本实施例采用bwa软件进行比对。同时，为了避免重复序列对后续分析的干扰，只选取与人类基因组参考序列唯一比对的序列片段进行后续的统计。

2)点突变及小***/缺失检测：

a.比对数据预处理：比对数据结果存储成BAM文件格式，随后添加序列配对信息、序列组别信息和PCR扩增引起的重复标记；

b.使用GATKUnifiedGenotyper软件鉴定点突变及小***/缺失；

c.使用ANNOVAR软件对点突变及小***/缺失进行注释，判断各个位置的点突变及小***/缺失是否造成基因的非同义突变、移码突变、移码缺失、翻译终止增加、翻译终止缺失等；

d.与已知地贫数据库比较，确定已知致病突变。

最终32例样品在地中海贫血相关基因的点突变与小***/缺失类型突变结果可见表2，其中，12例样本未见明显异常，20例样本检出点突变与小***/缺失，其中，4例17杂合、2例17杂合并βE杂合、1 例-28杂并41-42杂合、2例41-42杂合、1例654杂合、1例Hb CS杂合、1例Hb Q-Thailand杂合、1例HbQuong纯合并-28杂合、2例HbWestmead纯合、5例βE杂合。

3)拷贝数变异检测：

a.基本统计：将目标区域划分为多个小区域以便于数据统计。统计每个小区间所落的测序片段个数占非待测常染色体区域片段个数的百分比reads％和平均GC含量。

b.扩增偏向性修正：将落入各个统计区间的reads％按平均GC分组，取各分组的中位数除所有区域的中位数得到修正系数。将原始的每个区间的reads％乘以修正系数得到每个区间内测序片段百分比的修正值reads％’。

c.拷贝数变异检测：在数据分析过程中，引入一个正常人群的control集来定义人类基因组上地中海贫血相关基因的拷贝数基线。计算每个待测样本中地中海贫血相关基因区域的reads％’之和，在control集中计算此区域的平均值和方差。进而计算每个区域在对照样本中离群度，以z值表示。如果z小于-3或者大于3，则该区域发生了数目异常。

最终，32例样品在地中海贫血相关基因的缺失类型突变结果可见表2，其中，18例样本未见明显异常，10例样本检出SEA杂合型缺失，3.7型杂合缺失、4.2型杂合缺失、SEA复合4.2型缺失、SEA复合3.7型缺失各一例。

图3-4是本发明实施例提供的生物信息学地贫相关基因区间的拷贝数统计结果(纵坐标是拷贝数比例copyratio，横坐标是基因位点Locus)。

表2. 32例地贫患者全血基因组检测结果

为进一步说明本发明实施例的有益效果，本发明实施例还提供了对照试验，包括：

对本发明实施例的表2中各个待测样品，均同时采用如下3种试剂盒检测(该对比方法为行业内常规方法，也是目前深圳计生所采用的官方检测方法；具体地，本检测方法中，采用gap-PCR检测缺失型；PCR扩增结合反向点杂交检测突变型)：

α-地中海贫血基因检测试剂盒(gap-PCR法)亚能生物；

β-地中海贫血基因检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)试剂Ⅰ，亚能生物；

β-地中海贫血基因检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)试剂Ⅱ，亚能生物；

非缺失型α-地中海贫血基因突变检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)试剂Ⅰ，亚能生物；

非缺失型α-地中海贫血基因突变检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)试剂Ⅱ，亚能生物；

经过分析发现，对于Hbvar数据库中已有突变进行分析：

采用对比方法，对12号样品只能检测到SEA杂合一种致病突变(而采用本发明实施例提供的检测探针、检测方法可同时检测到Hb Westmead纯合致病型)；

对比方法对表2其它样品进行检测的结果与本发明实施例提供的检测探针、检测方法的检测结果完全一致。

此外，采用本发明实施例提供的检测探针、检测方法还能发现Hbvar数据库中未记载的突变，这些突变如表3所示(而对比方法并未检测出表3中的这些突变)：

表3.Hbvar数据库中未记载的突变

说明本发明实施例提供的检测探针、检测方法不仅简便、而且高效。还可获得常规商用检测试剂盒检测不出来的变异类型。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市易基因科技有限公司

<120> 一种基于全基因捕获测序的α和/或β-地中海贫血点突变和缺失型突变的检

测引物、方法、芯片及应用

<130> 2016

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (35)..(40)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 1

tacactcttt ccctacacga cgctcttccg atctnnnnnn t 41

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<213> 人工序列

<220>

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nnnnnnagat cggaagagca cacgtctgaa ctccagtcac 40

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (35)..(40)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 3

gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctnnnnnn 40

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(7)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 4

annnnnnaga tcggaagagc gtcgtgtagg gaaagagtgt a 41

Claims

1.一种基于全基因捕获测序的α和/或β-地中海贫血突变的检测探针，其特征在于，所述检测探针包括目标探针组和对照探针组，其中，所述目标探针组包括表1所示第1-96号探针中的至少5种、优选至少10种、优选至少20种、优选至少30种、优选至少50种、优选至少80种、优选为全部96种；

其中，对于表1所示第1-579号检测探针有如下定义：

表1第1列为检测探针的种类编号；

表1第2列为检测探针序列的可选基因位点区域；

表1第3列为检测探针序列需覆盖的基因位点或基因区域；

2.如权利要求1所述的基于全基因捕获测序的α和/或β-地中海贫血突变的检测探针，其特征在于，所述检测探针的5端还偶联有生物素进行标记。

3.一种基于全基因捕获测序的α和/或β-地中海贫血突变的检测芯片，其特征在于，所述芯片为液相芯片或固相芯片，其上结合有如权利要求1任一项所述的检测探针。

4.一种基于全基因捕获测序的α和/或β-地中海贫血突变的检测方法，其特征在于，包括使用权利要求1任一项所述的检测探针或权利要求3任一项所述的检测芯片与待捕获DNA样本进行杂交的步骤。

5.一种基于全基因捕获测序的α和/或β-地中海贫血突变的检测方法，其特征在于，包括使用权利要求1任一项所述的检测探针或权利要求3任一项所述的检测芯片与待捕获DNA样本进行杂交的步骤；和使用第二代高通量测序技术对捕获得到的目标DNA进行测序的步骤。

6.如权利要求5所述的基于全基因捕获测序的α和/或β-地中海贫血突变的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：

2)对步骤1)打断的片段进行纯化、末端修复、加A、加接头；

4)对步骤3)得到的测序文库进行高通量测序；

5)将步骤4)测序所得序列进行比对分析，获得测序结果。

7.如权利要求6所述的基于全基因捕获测序的α和/或β-地中海贫血突变的检测方法，其特征在于，所述步骤5)具体包括：

8.一种基于全基因捕获测序的α和/或β-地中海贫血突变的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1任一项所述的检测探针或权利要求3任一项所述的检测芯片，还包括检测试剂。

9.如权利要求1任一项所述的检测探针或权利要求3任一项所述的检测芯片、权利要求4-7任一项所述的检测方法、或权利要求8所述的检测试剂盒在检测α和/或β-地中海贫血突变中的应用。

10.如权利要求9所述的α和/或β-地中海贫血突变包括α和/或β-地中海贫血点突变和/或缺失型突变。