CN115011594B - 一种用于检测hpv的液相杂交捕获探针、应用及其试剂盒 - Google Patents
一种用于检测hpv的液相杂交捕获探针、应用及其试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于检测HPV的杂交捕获探针、方法及其试剂盒。设计覆盖多个亚型基因组的探针,其主要由探针之间互补配对的片段以及探针与靶区域互补配对的片段组成,探针的3’端或5’端有生物素修饰。该探针以病毒基因组为模板进行捕获,允许检测少于1个拷贝的病毒基因组,提高病原体检测效率,并实现单管探针中检测多个病毒亚型的目的,且可以用于检测HPV分型。本发明通过优化探针设计方案、杂交捕获***,提高探针与靶区域的结合能力、微量靶标的杂交捕获效率,以及提升整体的覆盖均一性以及稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检测领域,特别是一种检测HPV的探针及其杂交捕获方法。
背景技术
人***瘤病毒Human papillomavirus(HPV)是一种DNA病毒,共有200多个亚型,且不断发现新的亚型。其中40多个亚型会感染人类生殖***,诱发癌症,根据诱癌潜力划分,将HPV划分为高危险型hr-HPV(high risk(hr)-HPV)以及低危险型lr-HPV(low risk(lr)-HPV)。hr-HPV***的致癌因子,99.7%的***患者存在HPV感染。HPV致癌潜力高度依赖于病毒亚型,因为有些亚型具有强致癌性,对女性患者进行HPV感染亚型筛查,并制定有效的预防措施。
由病毒感染诱发的癌症有***和鼻咽癌,占全球癌症总量的13%,此类癌种可以通过病毒检测进行早期筛查。目前,基于这类病原体的检测技术主要以qPCR为主,针对病毒某一段特异性基因组片段设计引物,Taqman探针法或者染料法对阳性样本进行检测。原理上qPCR方法并不能检测到拷贝数在1以下的阳性样本,临床条件下受核酸提取方法以及qPCR检测灵敏度的影响,检测下限要高于1个拷贝;若病原体拷贝数小于1,检出率受限。除了检测灵敏度低的问题,还有分型检测难度较高、小靶标区域(panel)捕获效率偏低的问题,qPCR单管检测HPV亚型数量与仪器的荧光通道相关,HPV病毒同源序列较少,高危HPV不同亚型之间序列同源性很低,这使得不同亚型之间混合捕获可能性很高。若是使用杂交捕获,现有商品化液相杂交捕获***对大靶标区域(Panel)捕获效率较高、覆盖均一性以及可重复性均较高,但是对于小靶标区域则是捕获效率偏低、覆盖均一性以及可重复性偏差。而临床上HPV载量较低,采用常规杂交捕获,脱靶较为严重,捕获到的病原体的Read数非常少,造成测序数据的极大浪费。
传统或常规杂交捕获***主要针对PCR扩增后的DNA文库进行杂交捕获,且杂交捕获文库投入量不低于500ng,低投入量文库的杂交捕获,主要是因为传统杂交捕获***探针长度为120nt,针对DNA一条链设计,针对PCR free文库进行捕获时会导致另一条链信息的丢失。此外,现有杂交捕获流程过于繁琐,操作时间较长,临床样本检测时效性要求较高,限制了液相杂交捕获技术在mNGS临床检测技术领域应用的普及。
因此,目前市场较缺乏检测灵敏度高、对小靶标区域捕获效率高、捕获流程与操作时间短的检测方法。
发明内容
本发明开发了一种优化的病毒基因组捕获的方案,目的在于解决现有技术检测灵敏度低、分型检测难度较高、对小靶标区域捕获效率低、检测流程繁琐耗时等问题。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
本发明提供一种用于检测HPV的探针,上述探针包括:(1)与另一探针互补配对的探针结合序列,以及(2)与HPV病原体序列互补配对的靶特异性序列。
优选地,上述探针结合序列包括第一探针结合序列和第二探针结合序列。
更优选地,上述探针的5’端具有与另一探针的3’端互补配对的第一探针结合序列,并且上述探针的3’端具有与另一探针的5’端互补配对的第二探针结合序列。
优选地,上述靶特异性序列的长度为20-80nt。
优选地,上述探针结合序列的长度为8-30nt。
更优选地,上述探针5’端与另一探针互补配对的第一探针结合序列长度为8-30nt,上述探针3’端与另一探针互补配对的第二探针结合序列长度为8-30nt。
优选地,上述探针的3’端或5’端带有生物标记物。
更优选地,上述生物标记物为生物素。
本发明还提供前述探针在制备用于HPV检测试剂中的应用,上述探针可以透过杂交捕获的方式进行检测。
另一方面,本发明还提供一种用于检测HPV的杂交捕获方法,上述方法包括如下步骤:
(1)探针设计:根据HPV病原体序列设计探针池,上述探针包括与另一探针互补配对的探针结合序列以及与核酸靶序列互补配对的靶特异性序列,按照该序列合成寡核苷酸并对5’或3’末端进行生物标记物修饰;
(2)文库构建;
(3)杂交捕获
i.配置杂交体系:上述杂交体系包含上述探针;
ii.杂交反应:将上述杂交体系置于55~65℃进行杂交1~2小时;
(4)产物捕获:杂交反应结束后,反应体系中加入链霉亲和素磁珠进行杂交捕获;
(5)产物洗脱:捕获结束后,使用洗脱缓冲液I、洗脱缓冲液II以及洗脱缓冲液III各洗涤1次;
(6)产物扩增纯化:洗涤结束后,加入PCR反应体系,进行PCR扩增程序,反应结束后,使用磁珠进行纯化。
优选地,上述杂交体系中包含2-10fmol的探针、1×Hyb Buffer、1×Enhance、1μgHuman Cot-1,以及100pmmol的Blocker。
优选地,上述杂交反应的条件为95℃变性2分钟、60℃杂交1小时。
优选地,上述产物捕获的条件为60℃捕获20分钟。
优选地,上述PCR反应体系包括2×HiFi PCR Master Mix、5μL Index Primer Mix以及20μL TE。
优选地,上述文库建构包括将核酸片段酶切进行末端修复和接头连接。
优选地,上述洗脱缓冲液I的配方为5×SSPE、0.5%~5%SDS;所述洗脱缓冲液II的配方为2×SSPE、0.05%~0.5%SDS;所述洗脱缓冲液III的配方为0.1×SSPE、0.005%~0.05%SDS。
本发明还提供一种用于检测HPV的杂交捕获试剂盒,包括如下组分:探针、杂交反应液、洗脱缓冲液、链霉亲和素磁珠、核酸纯化磁珠;上述探针包括与另一探针互补配对的探针结合序列以及与HPV病原体序列互补配对的靶特异性序列。
优选地,上述试剂盒还包括末端修复酶混合物、末端修复反应缓冲液、含分子标签的接头、文库扩增引物、PCR预混液、接头封闭剂、DNA封闭剂、杂交增强剂、磁珠洗涤液、捕获文库PCR引物。
与现有技术相比,本发明的探针,有益效果在于:
1.检测灵敏度高:靶向捕获探针对模板多个靶区域设计特异性探针,可以检测出反应体系低拷贝的病原体或小于1个拷贝数的模板信号,并放大反应体系中的检测信号。
2.同一个杂交捕获体系检测多种亚型的病原体:HPV同源序列较少,高危HPV不同亚型之间序列同源性很低,这使得不同亚型之间混合捕获可能性很高,杂交捕获可在单管中放置捕获不同亚型病原体靶基因的探针,实现单管样本同时检测不同亚型病原体的目的。
3.提升捕获效率:使用该杂交捕获***,可以提高捕获效率,降低Off-target比例,提高有效数据占比,有效避免测序数据量浪费的现象。
4.提高低投入量样本捕获效率:传统杂交捕获***探针长度为120nt,优化后的杂交捕获***针对双链设计探针,与靶标结合的探针长度在20-80nt左右,相邻探针之间相互偶联,提高靶区域捕获效率,提高微量模板的杂交捕获效率、提高整体的覆盖均一性以及稳定性,适用于低浓度样本捕获。
5.简化流程,时效性更高。优化后的杂交捕获***将传统流程中的两轮PCR富集减少为一轮PCR富集,直接针对连接后的文库进行杂交捕获,减少实验流程;省略真空浓缩的步骤,简化流程的同时,节省设备成本。与传统杂交捕获流程相比,本发明对试剂进行了优化,减少洗脱试剂组分以及洗脱步骤,简化了操作流程。将繁琐的杂交捕获时间压缩到1天,节约时间,提高病原体检测效率。
6.利于自动化方案的实施:优化的液相杂交捕获技术通过简化实验流程,优化杂交捕获过程中对温度较为敏感的环节,省略真空浓度的步骤,减少全流程涉及的试剂组分数量,将全部的实验流程整合到自动化工作站,实现无人值守的目的。
7.通过优化探针设计方案,提高探针与靶区域的结合能力,优化杂交捕获***,提高微量靶标的杂交捕获效率、提高整体的覆盖均一性以及稳定性。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成本发明的不当限定。在附图中:
图1为本发明用于检测HPV探针的结构示意图。
图2为本发明快速检测HPV的靶向捕获方案流程。
图3A和图3B为不同稀释倍数的样本检测到的有效文库信息。图3A为人类基因组保留的有效文库信息;图3B为HPV16保留的有效文库信息。DCS211,利用双链分子标签,即互补链(Top/Bottom)分子标签进行一致性分析,形成双链一致性序列(Duplex ConsensusSequence,DCS),且Top与Bottom Reads均≥1;SSCS,利用单链分子标签进行一致性分析(Call Molecular Consensus Reads),形成单链一致性序列;SSCS<3为单链一致性序列拷贝数小于3的比例。
图4为简易杂交和常规杂交实验流程的对比图。
图5为比较两种杂交方案,即简易杂交和常规杂交对不同拷贝数HPV捕获效率差异。
具体实施方式
以下结合附图与具体实施例对本发明做进一步的描述,本发明的保护内容不局限于以下实施例。还应该理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围,并不是唯一性限定。在不背离发明构思的精神和范围下,本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中,并且以所附的权利要求及其任何等同物为本发明的保护范围。
本文中使用的所有技术和科学术语具有被本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。在其他情况下,本文使用的某些术语会在说明书中阐明其含义。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,均为本领域技术人员的普遍知识和公知常识。本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明,而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
本发明开发了一种优化的病毒基因组捕获的方案,以病毒双链基因组为模板进行捕获,允许检测少于1个拷贝的病毒基因组,提高病原体检测效率,设计覆盖多个亚型基因组的探针,实现单管探针中检测多个病毒亚型的目的,对HPV相关恶性肿瘤,提供了一种可以提高灵敏度的检测方案。该方法是一种检测HPV分型的方法,本方案使用的探针为相互偶联的短探针,与靶基因结合效率较高,可以显著提高低拷贝病原体捕获效率。
本发明提供了一套用于不同亚型HPV捕获的应用方案,该应用方案包括HPV的探针设计方案、实验流程方案以及检测试剂。其中包含了一套用于HPV捕获的探针,探针分别针对靶区域的正义链以及负义链设计,正义链探针以及负义链探针均采用无重叠的排列方式,探针3’端或5’端有生物素修饰,该生物素能够与链酶亲和素磁珠结合。
该探针主要由三部分组成(图1),分别是探针之间互补配对的片段以及探针与靶区域互补配对的片段,探针的3’端或5’端有生物素修饰,能够与磁珠上的链酶亲和素结合;探针与靶区域互补配对的片段长度在20-80nt之间;探针与探针之间互补配对的片段长度在8-30nt之间。
探针设计方法如下:
本实施例以HPV16、HPV18以及HPV45为例,介绍不同亚型病原体检测方案,选择不同亚型病原体特异性位点设计探针;
若需要捕获正义链,探针会针对正义链设计捕获探针;
若需要捕获反义链,探针会针对反义链设计捕获探针;
通过软件分析,剔除危险探针。危险探针会导致整个杂交捕获***严重脱靶,导致中靶率降低,靶区域捕获效率偏低,覆盖均一性变差。
本发明的探针来自探针池,探针池的设计方法如下:
1.设计工具输入初始序列信息和设计参数,生成探针序列信息。
2.初始序列信息:包括总和序列信息,即富集前文库中可能包含的序列信息;以及靶标序列信息,即需要从总和序列信息中富集到的序列信息,例如HPV亚型病原体特异性位点。
3.设计参数:包括探针与靶标序列结合的退火温度范围,此温度与杂交反应溶液的组成以及反应的设定温度有关,还包括探针与靶标结合区的序列长度范围。
4.设计工具的工作流程,包括:
(1)对总和序列信息的预处理。对总和序列信息的预处理包括总和序列不同区段特异性的评估,以及统计总和序列正链及互补链中长度为k的所有序列组合的出现次数,且其中k小于探针与靶序列结合区的序列长度范围的最小值。
(2)探针与探针结合区序列的选择。所述的探针与探针结合区序列,其特点包括:
(2.1)长度为k;
(2.2)退火温度小于探针与靶标序列结合的退火温度;
(2.3)上述(1)中的出现次数统计结果,其在总和序列中次数较少,或出现次数小于平均值5%。
(3)探针与靶标序列结合区的选择。选择过程包括:
(3.1)选择第i个靶标序列,i的初始值等于1;从选择的该靶标序列的第n个碱基开始选取探针与靶标结合区序列,n的初始值等于1。其中,探针与靶标结合区序列的退火温度满足上述第3点,且序列长度满足上述第3点的范围。其中,探针与靶标结合区序列,其总和序列不同区段特异性的评估,如果评估为高特异性(即未落入需要避开的序列区间),则放入探针池,且n加上一个数字m1,间隔m1个碱基尝试获得下一个靶特异性序列;如果评估为低特异性(即落入需要避开的序列区间),则不放入探针池,n加上一个数字m2,间隔m2个碱基再次尝试获得靶特异性序列。
优选地,上述数字m1,其值大于或等于上述放入探针池的探针与靶标结合区序列长度;上述数字m2,其值小于或等于上述的探针与靶标结合区的序列长度范围的最小值。
(3.2)当n小于第i个靶标序列的长度时,选择下一个探针与靶标结合区序列。
(3.3)当n大于或等于第i个靶标序列的长度时,完成第i个靶标序列的探针与靶标结合区序列选择。
(3.4)当第i个靶标序列的探针与靶标结合区序列选择结束后,对第i+1个靶标序列进行上述的探针与靶标结合区序列选择,直到所有靶标序列均完成探针与靶标结合区序列选择。
(4)对探针池中的探针与靶标结合区序列,对其5’端加上探针与探针结合区序列,对其3’端加上探针与探针结合区序列的反向互补序列。
(5)输出所有探针序列。
本发明还开发了一套杂交捕获流程,具体捕获流程如下:
从样本中提取核酸,核酸样本采用酶切打段的方式进行建库,酶切打断方式对样本造成的损伤较小,能够提高模板检出率。酶切之后进行末端修复、接头连接以及连接产物纯化,纯化后的产物直接进行杂交捕获,杂交捕获方案与使用的接头相关,使用全长UDI接头模块,可以进行多文库混合杂交,杂交产物使用Primer Mix对混和杂交捕获的文库进行PCR扩增;若使用截短型分子标签接头模块,只能进行单个样本的杂交,含分子标签接头的模块可以对样本进行低频突变检测,通过一致性序列分析过滤掉杂交以及PCR扩增引入的背景噪音。此处同时兼容Illumina以及MGI测序平台的接头模块,构建适用于不同测序平台的DNA文库。
接头连接产物无需真空浓缩,直接配置杂交捕获反应体系,也可以带着上一步的纯化磁珠直接进行杂交捕获。
杂交体系使用本项目设计的特异性探针,可以进行快速杂交,杂交时间为1-2小时,捕获时间20分钟,缩短了杂交捕获的时间,PCR扩增对杂交捕获文库进行富集,此步PCR扩增方案与使用的接头模块相关,使用分子标签接头模块时,搭配含Barcode序列的引物进行PCR扩增,若使用全长接头模块,搭配Primer Mix对靶向富集的DNA文库进行扩增(参见图2)。
本***所选择的杂交时间为1小时到16小时,最短的杂交时间为1小时。
本***所选择的杂交捕获温度为55-65℃,最优捕获温度为60℃左右,温度选择与探针长度、靶区域GC含量以及杂交时间相关。
本***杂交捕获文库构建,即从样本到捕获文库获取共需要6小时,相比传统的2天到4天,简化操作步骤的同时,大大缩短了全流程操作时间。
本发明涉及的杂交捕获试剂组分,使本发明能够达到此效果,在各个环节的设计方案以及试剂相容性开发做了深入研发,本发明流程对每一步的实验方案以及试剂方案都进行了优化,具体内容如下:
本发明流程要求接头连接产物使用40μL Beads纯化,且纯化产物使用试剂盒配置的磁珠洗涤液(Beads Wash Buffer),磁珠洗涤液配方如下:4mL乙腈加入1mL H2O。
杂交捕获反应体系包括以下试剂,详见表1:
表1
杂交***共涉及3种洗脱缓冲液,分别是洗脱缓冲液I、洗脱缓冲液II以及洗脱缓冲液III;这三种洗脱缓冲液配方参见表2:
表2
实施例1:检测不同亚型的病原体
设计覆盖HPV16、HPV18及HPV45特异性序列的捕获探针,探针名称为HPV(探针序列参见下表3),杂交反应***中会加入针对人类基因组的探针,名称为Nad-PC,覆盖靶区域大小为2kb左右。使用设计的探针搭配快速DNA酶切文库构建试剂盒v2以及EASY Hybrid Capture System进行杂交捕获检测不同亚型HPV基因组。
表3.HPV探针序列信息
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样本信息:Caski(HPV16,500拷贝),Hela(HPV 18,50拷贝),Siha(HPV 16,1-2拷贝),MS751(HPV45,1拷贝)HPV(Sequencing Facilitates Ultrasensitive Detection ofHPV Circulating Tumor DNA,Clin Cancer Res;27(21)November 1,2021.Characterization of HPV-16 E6/E7 transcription in CaSki cells byquantitative PCR.Molecular and Cellular Probes Pub Date:1992-12-01,DOI:10.1016/0890-8508(92)90042-v.;Detection and characterization of humanpapillomavirus type 45 DNA in the cervical carcinoma cell line MS751.Journalof General Virology Pub Date:1997-03-01,DOI:10.1099/0022-1317-78-3-655)提取以上细胞系的基因组,具体实验细节如下:
取30ng样本进行酶切打断,接头连接的步骤参见快速DNA酶切文库构建试剂盒v2,酶切时间20分钟,将样本打断至200-250bp左右。酶切以及接头连接步骤参见说明书,接头连接产物纯化以及杂交捕获实验步骤如下:
1.提前将SP Beads取出涡旋混匀,室温平衡30分钟后使用;
2.向接头连接产物中加入40μL SP Beads,混合均匀,25℃孵育5–10分钟;
3.将PCR管瞬时离心后放置于磁力架上5-10分钟至液体完全澄清,使用移液器吸取移弃上清;
4.加入200μL BW Buffer洗涤1次,静置2分钟,吸弃上清;
5.往杂交反应体系中加入杂交反应液(即kit里的Hyb buffer)。
杂交反应体系中含有10fmol的探针、1×Hyb Buffer、1×Enhance、1μg HumanCot-1、100pmmol的Blocker,将配置的杂交反应体系放置在温控仪反应,杂交反应条件如下:95℃变性2分钟、60℃杂交1小时;
杂交反应结束后,将上清转移到新的PCR管中,向PCR反应管中加入10μL M270Beads进行杂交捕获,60℃捕获20分钟;
捕获20分钟结束后,使用洗脱缓冲液(Wash Buffer)I、洗脱缓冲液(Wash Buffer)II以及洗脱缓冲液(Wash Buffer)III各洗涤1次;
洗涤结束后,向M270Beads中加入PCR反应体系,PCR反应体系主要包括2×HiFiPCR Master Mix、5ul Index Primer Mix以及20μL TE,在PCR温控仪上启动PCR扩增程序,反应结束后,使用1倍体积的磁珠进行纯化。
纯化产物在平台测序。
数据表现参见下表4和表5。
表4.不同样本测序结果质控
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表5.实际检测到的HPV拷贝数与人类基因组拷贝数比值
Caski细胞中含有HPV16,其中HPV16病原体拷贝是人类基因组拷贝数的500倍;Hela细胞中含有HPV18,其中HPV18病原体拷贝是人类基因组拷贝数的50倍;Siha细胞中含有HPV16,其中HPV16病原体拷贝是人类基因组拷贝数的1-2倍;MS751细胞中含有HPV45,其中HPV45病原体拷贝约等于人类基因组拷贝数。使用该***检测不同拷贝数的病原体,中靶率均高于50%,针对高拷贝的Caski样本,中靶率(On target)高达92%。不同亚型病原体均表现出较高的覆盖度。
本发明设计的HPV探针检测HPV16、HPV18以及HPV45,均表现出较优的捕获效率。本发明可实现同一杂交捕获反应,检测不同亚型病原体的目标。
实施例2:本发明HPV探针对不同拷贝数病原体的捕获效率
传统mNGS通过全基因组测序来鉴定未知病原体,或靶向捕获NGS。根据已知病原体序列设计靶向捕获探针,聚焦已知病原体的检测,缩小检测范围,但是临床样本中病原体含量有限,提高检测灵敏度以及捕获效率是靶向mNGS需要突破的技术难点。本***针对双链设计探针,与靶区域结合的探针长度在20-80nt左右,相邻探针之间互补配对,提高靶区域捕获效率,病原体的杂交捕获效率、提高整体的覆盖均一性以及稳定性,适用于低浓度样本捕获。
本实施例测试HPV探针对不同拷贝数的HPV捕获性能表现,评估本***对微量病原体的捕获效率。Siha基因组使用Female(ZYMO,G1521,Human Genomic DNA Female)样本进行倍比稀释,降低HPV16基因组的拷贝数,检测该杂交捕获***对不同拷贝数病原体的检测效率。样本稀释方案参见下表6,每组两个重复:
表6:实验分组方案
具体实验方案参见实施例1。
本发明对不同拷贝数病原体的样本,均表现出较优的捕获效率,测序覆盖度均大于98%,捕获效率均大于50%(表7)。
表7.测序数据质控
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本项目使用含分子标签的接头进行建库,分别对HPV16以及人类基因组进行一致性序列分析,DCS211为利用双链分子标签,即互补链(Top/Bottom)分子标签进行一致性分析,形成双链一致性序列(Duplex Consensus Sequence,DCS),且Top与Bottom Reads均≥1;SSCS为利用单链分子标签进行一致性分析(Call Molecular Consensus Reads),形成单链一致性序列。一致性序列反应了该建库***保留下来的有效文库信息参数。其中,人类基因组作为对照组,其保留的有效文库信息不变(图3A);而检测到的HPV16有效文库信息与模板拷贝数呈正比(图3B)。Siha样本按照一定的比例Spike-in到female样本中,使用一致性分子标签计算HPV16基因组拷贝数与人类基因组拷贝数比例,实际检测值符合预期(即理论值)(表8)。
表8.HPV拷贝数与人类基因组拷贝数比值
实施例3:常规杂交捕获与本发明***对病原体捕获效率的比较
常规杂交捕获探针长度120nt,针对PCR扩增后的文库进行捕获,微量样本捕获效率偏低,采用过夜杂交的方案,全流程操作时间在2天左右。本发明通过创新型探针设计思路,提高低浓度样本捕获效率,全流程操作时间为7小时左右,解决靶向mNGS操作流程时间长、步骤繁琐两大技术痛点。
本实施例通过设计覆盖相同靶区域的长探针(120nt)以及短探针,搭配相应的建库以及杂交捕获试剂盒。本实施例比较常规杂交捕获与本发明杂交捕获方案的捕获***对不同拷贝数的HPV捕获性能表现,评估本***对微量病原体的捕获效率。Siha基因组使用Female样本进行倍比稀释,降低HPV16基因组的拷贝数,检测该杂交捕获***对不同拷贝数病原体的检测效率。样本稀释方案参见下表6。实验流程图参见图4。其中简化杂交捕获流程参见实施例1,常规杂交捕获流程参见NadPrep杂交捕获***。
常规杂交捕获针对PCR扩增后的文库进行杂交捕获,杂交时长16小时;简化杂交捕获***针对PCR Free文库进行杂交捕获,杂交时长2小时。针对不同拷贝数HPV16,常规杂交捕获效率在10%左右,而简化杂交捕获捕获效率在60%以上(图5)。本发明优异的捕获效率不仅能够提高数据表现,同样可以节约测序成本,使用更少的测序数据量获取更多的有效文库信息。
以上所述仅为本发明的优选实施例,并不用于限制本发明。本发明提及的所有文献都在本申请中全文引用作为参考。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,凡在本发明的精神和原则之内,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式的修改同样落于本申请权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 纳昂达(南京)生物科技有限公司
<120> 一种用于检测HPV的液相杂交捕获探针、应用及其试剂盒
<141> 2022-06-22
<160> 454
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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cgtcggtctt ccaatcctcc aaaatagtgg tattcatatt atgaatgtcg accgacg 57
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<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 26
cgtcggtccc tttaaatcca cattccaaaa ctttaactta tcatagggcg accgacg 57
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<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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cgtcggtccc aaactggcag atggtggagg agctacagca aaacgaccga cg 52
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<211> 57
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 30
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<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<400> 88
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<213> Artificial Sequence
<400> 120
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<400> 109
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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cgtcggtcca ggtaacagca actgattgca caaaacgata tgtatccgac cgacg 55
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<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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cgtcggtctg tttaatttgc tttgaattat atgtagacat agactgtgcg accgacg 57
<210> 115
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 115
cgtcggtccc acagtaacaa atacctgatt gccccaacaa ataccgaccg acg 53
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<213> Artificial Sequence
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<210> 117
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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cgtcggtcta ctctttaaaa ttactacttt taaatgtagt atcactgtcg accgacg 57
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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cgtcggtcct agtagctgca tttctaacaa acctatatgc atcctccgac cgacg 55
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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cgtcggtcta ttccttaaat ttattagaat catacacagc tggtacagcg accgacg 57
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<211> 55
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<213> Artificial Sequence
<400> 220
cgtcggtcga cataacctct gcagttaaag taatagtgca caactgcgac cgacg 55
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 57
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 233
cgtcggtcca gttgtagata ctactcgcag caccaatctt tctcgaccga cg 52
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<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 234
cgtcggtcga ttctacaatt ttagaacagt ggaattttgg attaacatcg accgacg 57
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<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 235
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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cgtcggtcca caataatggt atttgttggg gcaatcagtt atttgttacg accgacg 57
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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Claims (12)
1.一组用于检测HPV的探针,其特征在于,所述探针由:(1) 与另一探针互补配对的探针结合序列,以及(2)与HPV病原体序列互补配对的靶特异性序列所组成;
所述探针结合序列由第一探针结合序列和第二探针结合序列所组成;
所述探针的5’端为与另一探针的3’端互补配对的第一探针结合序列,并且所述探针的3’端为与另一探针的5’端部互补配对的第二探针结合序列;
所述探针5’端与另一探针互补配对的第一探针结合序列长度为8-30nt,所述探针3’端与另一探针互补配对的第二探针结合序列长度为8-30nt,所述靶特异性序列的长度为20-80nt。
2.根据权利要求1所述的探针,其特征在于,所述探针结合序列的长度为8-30nt。
3.根据权利要求1所述的探针,其特征在于,所述探针的3’端或5’端带有生物标记物。
4.根据权利要求3所述的探针,其特征在于,所述生物标记物为生物素。
5.根据权利要求1-4任一项所述的探针在制备用于HPV检测试剂中的应用,其特征在于,所述探针可以通过杂交捕获的方式进行检测。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述杂交捕获包括如下步骤:
(1)杂交捕获
i. 配置杂交体系: 所述杂交体系包含所述探针;
ii. 杂交反应: 将所述杂交体系置于55~65°C进行杂交1~2小时;
(2)产物捕获:杂交反应结束后,反应体系中加入链霉亲和素磁珠进行杂交捕获;
(3)产物洗脱:捕获结束后,使用洗脱缓冲液I、洗脱缓冲液II以及洗脱缓冲液III各洗涤1次;
(4)产物扩增纯化:洗涤结束后,加入PCR反应体系,进行PCR扩增程序,反应结束后,使用磁珠进行纯化。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述杂交体系中包含2-10 fmol的探针、1×Hyb Buffer、1×Enhance、1μg Human Cot-1,以及100pmmol的Blocker。
8.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述杂交反应的条件为95°C变性2分钟、60°C杂交1小时。
9.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述产物捕获的条件为60°C捕获20分钟。
10.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述洗脱缓冲液I的配方为5×SSPE、0.5%~5%SDS; 所述洗脱缓冲液II的配方为2×SSPE、0.05%~0.5%SDS; 所述洗脱缓冲液III的配方为0.1×SSPE、0.005%~0.05% SDS。
11.一种用于检测HPV的杂交捕获试剂盒,其特征在于,包括如下组分: 权利要求1-4任一项所述的探针、杂交反应液、洗脱缓冲液、链霉亲和素磁珠、核酸纯化磁珠。
12.根据权利要求11所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括 末端修复酶混合物、末端修复反应缓冲液、含分子标签的接头、文库扩增引物、PCR预混液、接头封闭剂、DNA封闭剂、杂交增强剂、磁珠洗涤液、捕获文库PCR引物。
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