CN104830993A - 一种高通量、多种类型分子标记通用的分型技术 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高通量、多种类型分子标记通用的分型技术，属于分子生物学领域。采用5’末端生物素标记的杂交模板制备方法，可实现对有单核苷酸多态性，简单重复序列，***缺失，拷贝数变异等包含不同类型分子标记的目标区域以及外显子、物种特异单拷贝区域等目标区域的捕获及基因分型，同时可兼顾等位基因定性分型和精确定量检测，将液相杂交技术的位点选择灵活性与高通量测序技术通量高、成本低的优势结合在一起。与现有分子标记分型技术相比，本发明解决了现有定点分子标记分型技术只能对单一分子标记进行分型，不能同时实现多种标记同时分型，无法对等位基因精确定量检测，随机标记或不标记的杂交模板制备局限性等问题。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种高通量、多种分子标记通用的分型技术：HD-Marker (High-throughput Diverse Marker genotyping)。
背景技术
分子标记是脱氧核糖核苷酸（DNA）分子由于碱基***、缺失、重组、突变等造成的多态性标记，目前被广泛开发并应用的分子标记类型有单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)，简单重复序列（Simple Sequence Repeats，SSR），***缺失（Insertion and deletion，Indel），拷贝数变异（Copy number variation， CNV），物种特异单拷贝区域等。这些分子标记具有数目众多，全面覆盖基因组，多态性高、遗传信息含量丰富等优良特性，在遗传图谱构建，全基因组关联分析，群体遗传学分析，宏基因组研究及物种丰度检测等多个领域被广泛应用。利用分型技术对候选分子标记在实验样本中进行等位基因分型、拷贝数变异和物种丰度定量检测是应用分子标记的基础方法，也是研究者一直关注的热点问题。
近年来随着芯片技术的发展和新一代测序技术的不断改进，针对候选分子标记的高通量分型技术不断涌现。目前被广泛使用的技术有基于芯片的杂交捕获分型***，将高通量测序与液相杂交相结合的技术，利用分子倒置探针的捕获分型***等。这些检测***在可分析的标记类型、捕获效率及特异性、分型通量等方面各有优劣，研究者一般根据自己的研究需要选择可用的分型***。但是这些技术也存在明显的缺陷和不足。一方面，现有的技术只能对单一类型的分子标记，如单核苷酸多态位点或微卫星位点等进行分型，无法实现一种技术对不同长度范围目标区域的捕获和多种分子标记的通用分型。另一方面，已有候选位点捕获技术只能做到对多态位点的基因型定性检测，无法做到定量分析。
究其原因，首先是由于现有技术在杂交模板制备方面的局限性。目前的技术大多采用随机生物素杂交模板标记方法，生物素存在较大的空间位阻，对于较长的目的片段，很难做到上下游探针同时杂交成功，从而无法实现较长目的片段的捕获。有些技术为了避免这一问题，直接使用非标记DNA作为杂交模板，但导致的新问题是在目标片段富集方面的回收效率不高，后续需要通过增加聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）扩增循环数才能得到足够的文库样品，影响捕获位点的均匀性。因此，现有技术大多固定捕获区域的长度范围，只能对单一类型分子标记，如单核苷酸多态位点或微卫星位点进行分型，无法实现一种技术对多种分子标记的通用分型，这使得研究者在尝试对同一实验样品多种类型分子标记进行分析时，不得不尝试多种分型***，从而增加了实验成本和时间，严重影响了分型效率和研究进度。更重要的是，已有的候选位点捕获分型技术由于受到杂交效率和捕获均匀性的影响，只能对多态位点的等位基因类型进行定性检测，无法做到诸如拷贝数变异的拷贝数目以及样品中不同物种的特异单拷贝区域定量分析，限制了候选位点捕获技术在拷贝数变异检测、物种鉴定和宏基因组物种丰度分析中的应用。
鉴于已有技术的上述缺陷，亟需一种高通量、低成本、灵活方便、多种分子标记通用的分型技术，实行不同分子标记类型的定性分析和定量检测，以解决现有技术的局限性。
发明内容
本发明的目的在于开发一种新型高通量、多种类型分子标记通用的分型技术：HD-Marker（High-throughput Diverse Marker genotyping），以弥补现有技术的上述不足。
为了实现上述目的，本发明采用下述技术方案予以实现：
一种新型高通量、多种分子标记通用的分型技术，其特征在于按照下步骤：
1）5’末端生物素标记杂交模板的制备：提取样品基因组DNA，并对其进行限制性内切酶酶切，对酶切片段利用5’末端生物素标记的引物(由上海生工生物工程有限公司合成)进行聚合酶链式扩增反应，纯化后得到5’末端生物素标记的模板备用；
2）用于分子标记分型的目标位点筛选：根据研究需要和已知的序列信息，筛选含有单核苷酸多态位点、微卫星位点、***缺失或拷贝数变异等多态位点的分子标记或外显子区域作为目标位点，其中选取单核苷酸多态位点、微卫星位点和***缺失等多态位点主要是针对多态位点等位基因分型的定性检测，选取拷贝数变异多态位点主要是针对位点拷贝数目的定量分析检测；
3）用于宏基因组分析及物种丰度检测的目标位点筛选：选取样品中含有的候选物种基因组特异单拷贝区域作为目标位点，针对这些区域进行特定物种丰度定量分析检测；
4）位点特异性杂交探针的制备：首先根据目标位点的侧翼序列，设计两条序列：位点特异性捕获探针1（位点特异性捕获探针1）和位点特异性捕获探针2（位点特异性捕获探针2），两条探针间的间隔区域可根据不同的目标位点进行灵活调整，设计的探针在满足普通引物设计原则基础上，还需兼顾目标位点间隔区域的鸟嘌呤和胞嘧啶含量，控制在45%-65%之间。将设计好的多条位点特异性捕获探针1混合后得到位点特异性捕获探针1混合物，将设计好的多条位点特异性捕获探针2混合并5’磷酸化后得到位点特异性捕获探针2混合物备用；
5）目标位点杂交捕获：按照优化好的配置杂交缓冲液备用，将所述包含多对位点特异性捕获探针1/位点特异性捕获探针2的探针混合物和末端标记好的杂交模板与杂交缓冲液中混合后进行杂交，捕获得到目标位点，之后使用磁珠对目标位点进行富集。
6）目标位点间隔区域延伸连接：将所述杂交吸附产物进行不同长度范围的延伸连接反应，获得不同目标位点的多态性DNA片段；
7）测序文库制备及高通量测序：使用与美国Illunima公司的测序平台配套的扩增引物对得到的目标位点进行扩增，纯化后得到测序文库。根据捕获的不同目标位点的长度范围，灵活选择不同测序读长的测序平台进行高通量测序；
8）分子标记分型或序列丰度检测：使用RADtyping分型软件包对测序数据进行分析，得到目标位点等位基因多态性分型信息、拷贝数变异拷贝数目信息或者所分析样品中不同物种的丰度定量信息。
对技术方案的进一步优化：所述步骤(1)中发明了杂交模板5’末端生物素标记方法，即先使用限制性内切酶EcoRI和MseI对基因组DNA进行双酶切，之后利用5’末端生物素标记的引物进行扩增，纯化后得到的杂交模板均为5’末端生物素标记的DNA。
对技术方案的进一步优化：所述步骤(2)中发明了多种分子标记联合分型的通用技术。本技术可根据不同的研究需要以及序列数据库中的信息，实现对多种目标序列进行捕获和基因分型。不仅可做到单核苷酸多态位点、微卫星位点、***缺失等不同长度范围的分子标记目标区域捕获，而且还可以对外显子区域特异性的序列捕获及基因分型。
对技术方案的进一步优化：所述步骤(2)中实现了对拷贝数变异等多态性标记的拷贝数精确定量分析，即如果目标区域为拷贝数变异，可做到从1到10不等的拷贝数目精确定量检测。
对技术方案的进一步优化：所述步骤(3)中所述宏基因组分析中的物种丰度检测，如果待分析样品为宏基因组来源的多物种混合样品，目标区域为候选物种特异的单拷贝区域，通过分析捕获得到的不同物种特异序列的深度信息，可以获得样品中对应物种的丰度情况。
对技术方案的进一步优化：所述步骤(4)中所述位点特异性杂交探针的设计原则，要求探针本身和探针间隔区域的鸟嘌呤和胞嘧啶含量都限定在45%-65%之间，严格了目标位点筛选标准，保证了在间隔区域较长（100-500碱基对）的情况下，多个位点同时捕获和延伸扩增仍然具有较好的均匀性。
对技术方案的进一步优化：所述步骤(5)中所述目标位点杂交捕获所用的杂交缓冲液。1L体积的1×杂交缓冲液配方为：0.1g聚蔗糖，0.1g胎牛血清，5g 十二烷基硫酸钠, 75mmol柠檬酸三钠，0.75mol氯化钠，其余为蒸馏水，pH 7.0。
优化后的杂交缓冲液保证了杂交捕获实验的特异性、高效性和均匀性，不仅可以实现多种分子标记的杂交捕获，同时也是保证达到拷贝数目和物种丰度精确定量的关键技术要点。
本发明所述的一种新型高通量、多种分子标记通用的分型技术，适用于单核苷酸多态位点、微卫星位点、***缺失、拷贝数变异、外显子、物种特异单拷贝区域等多种类型分子标记/目标区域的高通量基因分型以及精确定量检测。
与现有分子标记分型技术相比，本发明的优点和积极效果是：针对现有定点分子标记分型技术只能对单一分子标记进行分型，不能同时实现多种标记同时分型，无法对等位基因精确定量检测，随机标记或不标记的杂交模板制备局限性等问题，本发明开发了一种新型高通量、多种分子标记通用的分型技术：HD-Marker。该技术的突出特点在于采用5’末端生物素标记的杂交模板制备方法，可实现对单核苷酸多态位点、微卫星位点、***缺失、拷贝数变异等包含不同类型分子标记的目标区域以及外显子、物种特异单拷贝区域等目标区域的捕获及基因分型，同时可兼顾等位基因定性分型和精确定量检测，将液相杂交技术的位点选择灵活性与高通量测序技术通量高、成本低的优势结合在一起。
本发明与现有技术相比，其原理合理可靠，工艺步骤安全易控，大规模筛选运行可靠，效果优良，可以大范围广泛应用于基础与实际研究中。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
实施例1
本发明提供了一种新型高通量、多种分子标记通用的分型技术HD-Marker，以栉孔扇贝（Chlamys farreri）基因组微卫星位点分型为例进行说明。本实施例以1个栉孔扇贝个体，33个微卫星位点、10个单核苷酸多态位点和5个拷贝数变异位点、两次重复实验为例通过实验的实施详细叙述本发明的技术方案。
本发明所述一种新型高通量、多种分子标记通用的分型技术HD-Marker具体包括以下步骤：
1、提取扇贝基因组DNA，限制性内切酶酶切后进行生物素标记的引物扩增，方法如下：
1）提取栉孔扇贝基因组DNA：取栉孔扇贝个体的闭壳肌约0.1g，加入500μl裂解缓冲液(氯化钠：100mM；Tris盐酸：10nM，pH=8.0；乙二胺四乙酸：1Mm，pH=8.0)，剪碎，再加入50μl 10%的十二烷基硫酸钠，以及5μl蛋白酶K（20mg/ml，宝生物工程有限公司），56℃水浴消化，至组织碎块完全裂解，裂解液澄清。加入等体积饱和酚（250μl）以及氯仿/异戊醇（24：1）（250μl），抽提3次，取上清液，加入等体积氯仿/异戊醇（24：1）（500μl）抽提1次，取上清液，加入1/10体积醋酸钠（3M，pH 5.2）（50μl）和2倍体积-20℃保存无水乙醇（1000ul），缓慢摇匀；-20℃沉淀30分钟，12000转/分钟离心10分钟，核酸将沉淀于管底。70%乙醇（1000ul）洗涤沉淀并干燥至乙醇全部挥发，加入100μl无菌水以及少量（1-2μl）RNA酶A，4℃冰箱保存备用。
2）基因组DNA的限制性内切酶酶切：酶切体系为20ul，包含200ng基因组DNA，5U EcoRI限制性内切酶（北京纽英伦生物技术有限公司），1U Mse I限制性内切酶（北京纽英伦生物技术有限公司），1×酶切缓冲液（北京纽英伦生物技术有限公司）；37℃温育2小时后4℃保存备用。
3）接头连接：连接体系为20uL：包含10μl 上步酶切产物，4μM EcoRI接头（上海生工生物工程有限公司），4μM Mse I接头（上海生工生物工程有限公司），2U T4 DNA连接酶（北京纽英伦生物技术有限公司），1×酶切缓冲液（北京纽英伦生物技术有限公司），16℃连接过夜。
4）扩增反应体系为20uL，包含50ng接头连接产物，2uM 生物素标记的EcoRI-P1引物（上海生工生物工程有限公司），2uM Mse I-P2引物（上海生工生物工程有限公司）, 6mM 脱氧核糖核苷酸（上海生工生物工程有限公司）, 1U超保真 Phusion DNA 聚合酶（北京纽英伦生物技术有限公司），1×超保真 Phusion DNA 聚合酶（北京纽英伦生物技术有限公司）；反应条件为98℃变性5 秒，60℃退火20 秒，72℃延伸10 秒，进行10-14个循环，最后72℃延伸5分钟。平行扩增3管，扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,利用扩增产物纯化试剂盒（上海凯杰生物有限公司）回收纯化扩增产物，4℃冰箱保存备用。
2、位点特异性引物混合物的制备，方法如下：
1）设计位点特异性引物：为了验证本发明的有效性，本实施例选取已发表的栉孔扇贝33个微卫星位点、10个单核苷酸多态位点和5个拷贝数变异位点，根据其侧翼序列设计两个杂交探针位点特异性捕获探针1和位点特异性捕获探针2，以位点CFAD157为例，
CFAD157位点特异性捕获探针1: 5'ctctatgggcagtcggtgTCTTTCCATCCCATACATTG3' （SEQ ID No：1）；
CFAD157位点特异性捕获探针2: 5'TTATATTTACTTGTTCCCACTGcactgacctcaagtctgca3'（SEQ ID No：2）
所述引物位点特异性捕获探针1包括3’端的位点特异性序列1和5’端的通用引物序列（Slx-1ST-MpPrimer-1）两部分，其中3’端的SP1为与目标位点一段侧翼序列22个碱基互补的序列，5’端的序列为通用引物Slx-1ST-MpPrimer-1的部分序列。
所述引物位点特异性捕获探针2包括5’端的位点特异性序列2和3’端的通用引物序列（Slx-1ST-MpPrimer-2-RC）两部分，其中5’端的位点特异性序列2为与目标位点另一侧侧翼序列22个碱基互补的序列，3’端为通用引物Slx-1ST-MpPrimer-2的部分反向互补序列。
所述引物位点特异性捕获探针1和位点特异性捕获探针2序列(以位点CFAD157为例)如下：
CFAD157位点特异性捕获探针1: 5'ctctatgggcagtcggtgTCTTTCCATCCCATACATTG3' （SEQ ID No：1）；
CFAD157位点特异性捕获探针2: 5'TTATATTTACTTGTTCCCACTGcactgacctcaagtctgca3'（SEQ ID No：2）
所述位点特异性捕获探针1和位点特异性捕获探针2中的X分别为位点特异性引物1和位点特异性引物2，具体序列因位点序列不同而不同，所述位点特异性捕获探针1 的5’端已知序列和位点特异性捕获探针2 的3’端已知序列与美国Illumina公司测序平台的通用测序引物相同。
所述位点特异性序列1和位点特异性序列2引物设计还遵循以下原则：1、位点特异性序列1和位点特异性序列2所在的位置不能含有其他突变位点；2、位点特异性序列1和位点特异性序列2所在的位置序列不能出现5个以上连续的相同碱基；3、位点特异性序列1和位点特异性序列2的长度一般定为22碱基，对于个别微卫星位点，为了满足退火温度的需要，位点特异性序列1和位点特异性序列2的长度可在20-24碱基之间波动；4、位点特异性序列1和位点特异性序列2的退火温度在55-65℃之间；5、位点特异性捕获探针1和位点特异性捕获探针2的间隔区域鸟嘌呤和胞嘧啶含量在45%-65%之间；退火温度采用在线软件OligoCalc (http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc. html) 计算，选择2Salt Adjusted参数。设计好的引物位点特异性捕获探针1和位点特异性捕获探针2由上海生工生物工程有限公司合成。6、位点特异性序列1和位点特异性序列2的长度一般定为22个碱基，对于个别微卫星位点，为满足退火温度的需要，位点特异性序列1和位点特异性序列2的长度可在20-24个碱基微调。
2）制备多位点引物混合物：将多个目标位点的位点特异性捕获探针1等量混合，得到位点特异性捕获探针1混合物；将多个目标位点的位点特异性捕获探针2等量混合后，将得到的位点特异性捕获探针2混合物进行5’磷酸化，反应体积为50ul，包含62.5uM混合物，10U T4多聚核苷酸激酶（北京纽英伦生物技术有限公司），1×T4连接缓冲液（北京纽英伦生物技术有限公司）；37℃温育30分钟，将位点特异性捕获探针2混合物磷酸化，65℃温育20分钟灭活T4多聚核苷酸激酶。将位点特异性捕获探针1混合物和位点特异性捕获探针2混合物稀释至适当浓度，-20℃冰箱保存备用。
3、位点特异性引物杂交及磁珠吸附，方法如下：
1）磁珠的平衡：将亲水性链霉素亲和磁珠（北京纽英伦生物技术有限公司）轻轻摇匀，吸出5ul至微量离心管中，放在磁力架上静置2分钟，吸去上清，用 30ul 1×杂交液（1L 1×杂交液的配方为0.1g聚蔗糖，0.1g胎牛血清，5g 十二烷基硫酸钠, 75mmol柠檬酸三钠，0.75mol氯化钠，其余为蒸馏水，pH 7.0）仔细洗涤一次，每次洗涤结束时在磁力架上静置2分钟,吸去上清液。洗涤完毕后备用。
2）位点特异性引物与基因组DNA杂交及磁珠吸附：反应总体积为50uL，包含1×杂交液（1L体积的1×杂交缓冲液配方为：0.1g聚蔗糖，0.1g胎牛血清，5g 十二烷基硫酸钠, 75mmol柠檬酸三钠，0.75mol氯化钠，其余为蒸馏水，pH 7.0），250nM 位点特异性捕获探针1引物混合物，250nM 5’磷酸化的位点特异性捕获探针2引物混合物，200ng生物素标记的基因组DNA，经平衡后悬浮于10ul 洗脱/结合缓冲液（北京纽英伦生物技术有限公司）的磁珠。
杂交反应在扩增仪中进行，反应条件为：70℃ 12分钟（以后每个循环减2℃），69℃ 12分钟（以后每个循环减2℃），进行20个循环之后，保持30℃，保证整个杂交反应进行至少16小时。
3）杂交产物洗涤：杂交及磁珠吸附完毕后，用磁架固定磁珠，静置2分钟，吸去杂交混合液。用50ul 溶液I（1L溶液I的配方为5g 十二烷基硫酸钠, 30mmol柠檬酸三钠，0.3mol氯化钠，其余为蒸馏水，pH 7.0）洗涤磁珠一次，再用50ul 溶液 II （1L溶液I的配方为30mmol柠檬酸三钠，0.3mol氯化钠，其余为蒸馏水，pH 7.0）洗涤磁珠一次，以去除多余的位点特异性捕获探针1混合物和位点特异性捕获探针2混合物，得到纯净的杂交吸附产物。
4、目的DNA片段的获得
1）位点特异性延伸连接反应：反应体积大约为50uL，包含上步洗涤得到的杂交吸附产物，1U 超保真 DNA 聚合酶(北京纽英伦生物技术有限公司)，80U DNA 连接酶(Taq DNA 连接酶，北京纽英伦生物技术有限公司)，1×高保真缓冲液（北京纽英伦生物技术有限公司），5mM 脱氧核糖核苷酸，1mM β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；45℃反应15分钟。
2）目的DNA片段的洗脱：连接延伸反应结束后，用50uL 溶液 III (1L溶液III的配方为1.576g Tris盐酸, 其余为蒸馏水，pH 8.5)洗涤1次后，将吸附在磁珠上的反应产物重悬于35uL 无菌水中，95℃ 温育1 分钟，用磁力架固定磁珠后，吸取上清约30ul至微量离心管中，得到扩增反应模板。
5、通用引物一轮扩增及目的片段扩增：
扩增引物为Slx-1ST-MpPrimer-1和Slx-1ST-MpPrimer-2。
Slx-1ST-MpPrimer-1：
5'ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTCTCTATGGGCAGTCGGTG3'（SEQ ID No：7）。
Slx-1ST-MpPrimer-2：
5'GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTGCTGTACGGCCAAGGCG3'（SEQ ID No：8）。
扩增反应体系为50uL：包含30uL反应模板，5uM Slx-1ST-MpPrimer-1 引物，5uM Slx-1ST-MpPrimer-2 引物, 15mM 脱氧核糖核苷酸, 1U超保真 Phusion DNA 聚合酶（北京纽英伦生物技术有限公司），1×超保真 Phusion DNA 聚合酶缓冲液；反应条件为98℃变性5 秒，60℃退火20秒，72℃延伸10秒，进行17-20个循环，最后72℃延伸 5分钟。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物大小约为90个碱基对,切胶回收扩增产物。
6、对回收的目的片段进行条形码特异性引物扩增：
为了实现多个个体混合测序分型，可以通过对每个个体添加不同的条形码来区分，利用反应的不同引物引入不同的条形码。
所述扩增引物序列如下：
Slx-2ND-MpPrimer:5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCT 3'（SEQ ID No：9）；
Slx-index-Barcode:5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT 3'（SEQ ID No：10）；
所述Slx-index-Barcode中的XXXXXX为条形码序列，用于不同样本的区分。不同条形码的碱基不同。
扩增反应体系为20uL，包含25ng一轮扩增纯化产物，2uM Slx-2ND-MpPrimer引物，2uM Slx-index-Barcode引物, 6mM 脱氧核糖核苷酸, 1U超保真 Phusion DNA 聚合酶（北京纽英伦生物技术有限公司），1×超保真 Phusion DNA 聚合酶缓冲液；反应条件为98℃变性5 秒，60℃退火20 秒，72℃延伸10 秒，进行17-20个循环，最后72℃延伸5分钟。平行扩增3管，扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物大小约为140个碱基对，利用产物纯化试剂盒(上海凯杰生物技术有限公司)回收纯化扩增产物。利用美国Illumina公司的测序平台测序，此部分由由测序公司完成。
6、数据分析：
利用RADtyping软件包分析数据，对两次重复实验的33个微卫星位点和5个拷贝数变异位点进行分型。对于微卫星位点，分析等位基因类型，对于拷贝数变异位点，分析拷贝数目。
7、有效性验证：
为了验证本发明的有效性，对1个栉孔扇贝的33个微卫星位点、10个单核苷酸多态位点和5个拷贝数变异位点的两次重复实验获得的数据进行了HD-Marker分型。实验结果显示HD-Marker对位点的检测效率可以达到98.5%，位点的分型率达到95.2%，两次重复实验的分型一致率达到99%以上。因此，充分验证了本方法能快速、高效的对多种分子标记进行分型，即可实现同时对多个微卫星位点等位基因的分型和拷贝数变异拷贝数目的准确分析。
表1本发明中涉及的引物序列表
*由于位点数较多，这里仅列出栉孔扇贝两个微卫星位点和1个单核苷酸多态位点的位点特异性捕获探针1和位点特异性捕获探针2的序列信息，其中小写部分为通用序列，大写部分为位点特异性序列。
本实施例具有通量高、灵活方便、多种分子标记通用的特点，适用于多种候选分子标记的等位基因分型及精确定量检测，在实际运行中效果安全达到了发明目的的要求。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国海洋大学
<120> 一种高通量、多种类型分子标记通用的分型技术
<160> 1
<170> Patent In version 3.3
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
1 CTCTATGGGC AGTCGGTGTC TTTCCATCCC ATACATTG 38
<110> 中国海洋大学
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<170> Patent In version 3.3
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
1 TTATATTTAC TTGTTCCCAC TGCACTGACC TCAAGTCTGC A 41
<110> 中国海洋大学
<120> 一种高通量、多种类型分子标记通用的分型技术
<160> 3
<170> Patent In version 3.3
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<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
1 CTCTATGGGC AGTCGGTGAT TGATCAACTA TTGATTGGTA A 41
<110> 中国海洋大学
<120> 一种高通量、多种类型分子标记通用的分型技术
<160> 4
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<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列
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1 GAGATGTCAG TCTCACATCA CTGACCTCAA GTCTGCA 37
<110> 中国海洋大学
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<160> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列
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1 CTCTATGGGC AGTCGGTGCC CTGCGGTACT GCTTGGTG 38
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1 GTGACTGGAG TTCAGACGTG TGCTCTGCTG TACGGCCAAG GCG 43
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1 CAAGCAGAAG ACGGCATACG AGATAACCTG GTGACTGGAG TTCAGACGTG T 51。
SEQUENCE LISTING
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1 CTCTATGGGC AGTCGGTGTC TTTCCATCCC ATACATTG 38
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<110> 中国海洋大学
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1 AATGATACGG CGACCACCGA GATCTACACT CTTTCCCTAC ACGACGCT 48
<110> 中国海洋大学
<120> 一种高通量、多种类型分子标记通用的分型技术
<160> 10
<170> Patent In version 3.3
<210> 10
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
1 CAAGCAGAAG ACGGCATACG AGATAACCTG GTGACTGGAG TTCAGACGTG T 51
Claims (7)
1.一种高通量、多种分子标记通用的分型技术，其特征在于按照以下步骤：
1）5’末端生物素标记杂交模板的制备：提取样品基因组脱氧核糖核苷酸，并对其进行限制性内切酶酶切，对酶切片段利用5’末端生物素标记的引物进行聚合酶链式扩增反应，纯化后得到5’末端生物素标记的模板备用；
2）用于分子标记分型的目标位点筛选：根据研究需要和已知的序列信息，筛选含有单核苷酸多态位点、微卫星位点、***缺失或拷贝数变异等多态位点的分子标记或外显子区域作为目标位点，其中选取单核苷酸多态位点、微卫星位点和***缺失等多态位点主要是针对多态位点等位基因分型的定性检测，选取拷贝数变异多态位点主要是针对位点拷贝数目的定量分析检测；
3）用于宏基因组分析及物种丰度检测的目标位点筛选：选取样品中含有的候选物种基因组特异单拷贝区域作为目标位点，针对这些区域进行特定物种丰度定量分析检测；
4）位点特异性杂交探针的制备：首先根据目标位点的侧翼序列，设计两条探针：位点特异性捕获探针1和位点特异性捕获探针2，两条探针间的间隔区域可根据不同的目标位点进行灵活调整，设计的探针在满足普通引物设计原则基础上，还需兼顾目标位点间隔区域的鸟嘌呤和胞嘧啶含量，控制在45%-65%之间；
将设计好的多条位点特异性捕获探针1混合后得到位点特异性捕获探针1混合物，将设计好的多条位点特异性捕获探针2混合并5’磷酸化后得到位点特异性捕获探针2混合物备用；
5）目标位点杂交捕获：按照优化好的配方配置杂交缓冲液备用，将所述包含多对位点特异性捕获探针1/位点特异性捕获探针2的探针混合物和末端标记好的杂交模板与杂交缓冲液中混合后进行杂交，捕获得到目标位点，之后使用磁珠对目标位点进行富集；
6）目标位点间隔区域延伸连接：将所述杂交吸附产物进行不同长度范围的延伸连接反应，获得不同目标位点的多态性DNA片段；
7）测序文库制备及高通量测序：使用与测序平台配套的扩增引物对得到的目标位点进行扩增，纯化后得到测序文库；
根据捕获的不同目标位点的长度范围，灵活选择不同测序读长的测序平台进行高通量测序；
8）分子标记分型或序列丰度检测：使用RADtyping分型软件包对测序数据进行分析，得到目标位点等位基因多态性分型信息、拷贝数变异拷贝数目信息或者所分析样品中不同物种的丰度定量信息。
2.根据权利要求1所述的一种高通量、多种类型分子标记通用的分型技术，其特征在于所述步骤(1)中采用杂交模板5’末端生物素标记方法，即先使用限制性内切酶EcoRI和MseI对基因组DNA进行双酶切，之后利用5’末端生物素标记的引物进行扩增，纯化后得到的杂交模板均为5’末端生物素标记的DNA；有效避免了随机生物素标记带来的空间位阻问题；与已有的随机生物素杂交模板标记方法相比，本发明的杂交模板末端标记法可有效解决由于随机生物素标记带来的空间位阻导致无法实现较长间隔区域延伸（100-500碱基对）的问题，同时，相较于非标记的普通杂交模板而言，末端标记的杂交模板有利于高效率地富集回收捕获的目标区域，保证了实验成功率，提高了操作的方便性。
3.根据权利要求1所述的一种高通量、多种类型分子标记通用的分型技术，其特征在于所述步骤(2)中实现了对拷贝数变异等多态性标记的拷贝数精确定量分析，即如果目标区域为拷贝数变异，可做到不同拷贝数目精确定量检测，实现对多种目标序列，包括含有单核苷酸多态位点、微卫星位点、***缺失等不同长度范围的分子标记区域和外显子区域等，进行捕获和基因分型，大大降低了分型成本，提高了实验操作的兼容性和方便性。
4.根据权利要求1所述的一种高通量、多种类型分子标记通用的分型技术，其特征在于所述步骤(2)中实现了对拷贝数变异等多态性标记的拷贝数精确定量分析，与已有方法只能检测等位基因种类的定性分析相比，本技术既可实现多态位点等位基因的分型定性分析，也可以做到拷贝数数目的精确定量检测。
5.根据权利要求1所述的一种高通量、多种类型分子标记通用的分型技术，其特征在于所述步骤(3)中实现了样品中不同物种基因组单拷贝区的精确定量检测，可用于宏基因组分析中的物种丰度分析，如果待分析样品为宏基因组来源的多物种混合样品，目标区域为候选物种特异的单拷贝区域，通过分析捕获得到的不同物种特异序列的深度信息，可以获得样品中对应物种的丰度情况。
6.根据权利要求1所述的一种高通量、多种类型分子标记通用的分型技术，其特征在于所述步骤(4)中位点特异性杂交探针的设计要求探针本身和探针间隔区域的鸟嘌呤和胞嘧啶含量都限定在45%-65%之间，与普通设计原则相比，本技术除考虑探针本身鸟嘌呤和胞嘧啶含量外，还限定了整个目标区域的鸟嘌呤和胞嘧啶含量，严格了目标位点筛选标准，保证了在间隔区域较长（100-500碱基对）的情况下，多个位点同时捕获和延伸扩增仍然具有较好的均匀性。
7.根据权利要求1所述的一种高通量、多种分子标记通用的分型技术，其特征在于所述步骤(5)中目标位点杂交捕获所用的杂交缓冲液1L体积的1×杂交缓冲液配方为：0.1g聚蔗糖，0.1g胎牛血清，5g 十二烷基硫酸钠, 75mmol柠檬酸三钠，0.75mol氯化钠，其余为蒸馏水，pH 7.0。
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