CN109771428B - 雷公藤红素联合erastin在治疗非小细胞肺癌的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了雷公藤红素联合erastin在治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。本发明实验证明，1‑5μM的雷公藤红素与1.25‑5μM的erastin联合处理非小细胞肺癌细胞后，可以显著诱导癌细胞发生细胞死亡，降低肺癌细胞的存活率，从而达到治疗肺癌的效应，在肺癌临床治疗方面提供重要思路。

Description

雷公藤红素联合erastin在治疗非小细胞肺癌的药物中的 应用

技术领域

本发明涉及雷公藤红素联合erastin在治疗非小细胞肺癌的药物中的应用，属于医药领域。

背景技术

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,已成为我国城市人口恶性肿瘤死亡原因的第1位。非小细胞型肺癌包括鳞状细胞癌(鳞癌)、腺癌、大细胞癌，与小细胞癌相比其癌细胞生长***较慢，扩散转移相对较晚。非小细胞肺癌约占所有肺癌的80％，约75％的患者发现时已处于中晚期，5年生存率很低。

2012年，科学家发现一种依赖于铁离子的新的细胞死亡模式，称之为铁死亡(ferroptosis)。铁死亡在形态学、生物化学和遗传学等方面均不同于细胞凋亡、细胞坏死和细胞自噬，主要特征是线粒体皱缩减小，双层膜密度增加，线粒体嵴减少或消失，同时伴有细胞质及脂质活性氧(ROS)增多。目前证明，铁死亡与肿瘤抑制、神经元变性、抗病毒免疫反应及缺血-再灌注损伤等多种生理和病理过程密切相关。因此，深入研究铁死亡的信号通路及调节机制对于相关疾病的治疗具有重要意义:一方面，可通过触发或加剧铁死亡直接清除癌细胞，或增加癌细胞对化疗的敏感性；另一方面可通过抑制铁死亡，抑制或延缓缺血-再灌注损伤、神经退行性疾病等病理进程。

作为经典的铁死亡(ferroptosis)诱导剂，erastin通过抑制细胞的System Xc-，减少细胞内胱氨酸的摄取而降低GSH的合成。GSH含量下降引起细胞内GPX4活性下降，导致脂质过氧化反应增加、脂质ROS聚集，最终促使细胞发生铁死亡。因此，erastin诱导癌细胞发生铁死亡也成为治疗癌症的一种新型策略。

雷公藤红素是一种醌甲基三萜类物质，为红色针状晶体，其分子式为C₂₉H₃₈O₄，相对分子质量为450.61。雷公藤红素与青蒿素、雷公藤甲素、辣椒素和姜黄素，在2007年被Cell杂志列为最有可能被开发为现代药物的五种传统天然药物化合物。1936年，雷公藤红素被科学家首次从雷公藤根部提取并分离出来，开创了雷公藤红素的研究先河。根据大量文献的报道，雷公藤红素具有多种显著的药理活性，如抗炎抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗病毒及神经退行性疾病(如帕金森病、亨廷顿病、阿尔海默病)等。在过敏性哮喘、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、风湿性关节炎等疾病的治疗中有潜在的前景。2006，科学家在发现了雷公藤红素的抗癌作用之后试图阐明其抗癌机制，自此引发了雷公藤红素抗癌作用及其机制的研究热潮。

雷公藤红素作为一种天然的蛋白酶体抑制剂，可影响细胞内多种信号通路及蛋白发挥作用，如NF-κB、HSP 90、蛋白酶体、c-Jun、AKT/mTOR、VEGFR等,并可诱导多种肿瘤细胞凋亡。临床上常用其治疗麻风反应、风湿性关节炎以及其他自身免疫性疾病等。然而，根据临床观察及文献报道，雷公藤红素主要毒副作用表现为生殖、内分泌及消化***损害，尤其是血液***及皮肤黏膜损害。雷公藤红素较大的毒副作用限制了其在临床的应用。但在低浓度下，雷公藤红素不易产生毒副作用，而其在诱导肿瘤细胞凋亡方面的显著活性正在不断得到实验的证实。

因此，如何在生物安全剂量内提高雷公藤红素的抗肿瘤作用已成为研究热点，而雷公藤红素对erastin诱导的铁死亡的作用及机制的研究甚少。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了雷公藤红素联合erastin在治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。本发明利用非小细胞肺癌细胞为实验材料，着眼于肿瘤铁死亡，深入研究不同浓度的雷公藤红素对erastin诱导的铁死亡的作用及分子机制，通过降低雷公藤红素的毒副作用，同时促进癌细胞死亡，从而对癌症的治疗提供理论基础及新途径。

治疗非小细胞肺癌的药物组合物，包括以下原料：雷公藤红素和erastin，其中，雷公藤红素的有效浓度为1-5μM，erastin的有效浓度为1.25-5μM。

进一步，还包括一种或多种药学上可接受的药物赋形剂，药物赋形剂为助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、防腐剂和抗氧化剂中的一种或多种。

雷公藤红素作为一种天然的蛋白酶体抑制剂，可影响细胞内多种信号通路及蛋白发挥作用，低浓度的雷公藤红素不易产生毒副作用，而且在诱导肿瘤细胞凋亡方面具有显著活性。erastin通过抑制细胞膜上的胱氨酸/谷氨酸反向转运体System Xc-，减少细胞内胱氨酸的摄取而降低GSH的合成。GSH含量下降引起细胞内GPX4活性下降，导致脂质过氧化反应增加、脂质ROS聚集，最终促使细胞发生铁死亡。1-5μM的雷公藤红素与1.25-5μM的erastin联合处理非小细胞肺癌细胞后，可以显著诱导癌细胞发生细胞死亡，降低肺癌细胞的存活率，从而达到治疗肺癌的效应。

本发明具有以下优点：

(1)药物组合物使用方式简单且药效较好，随着作用时间的延长，非小细胞肺癌细胞的增殖抑制作用增强；

(2)安全性高，副作用低，能够显著诱导癌细胞发生细胞死亡，降低肺癌细胞的存活率，且不会对机体的其它机能造成任何损害；

(3)成本低廉，适合大规模生产。

附图说明

图1为本发明实施例1中CCK-8法检测不同浓度的erastin对人非小细胞肺癌细胞活力的影响图；

图2为本发明实施例2中CCK-8法检测不同浓度的雷公藤红素对人非小细胞肺癌细胞活力的影响图；

图3为本发明实施例3中CCK-8法检测erastin和雷公藤红素同时处理对人非小细胞肺癌细胞活力的影响图；

图4为本发明实施例4中流式细胞术检测erastin和雷公藤红素同时处理对人非小细胞肺癌细胞内ROS水平的影响图；

图5为本发明实施例5中观察erastin和雷公藤红素同时处理对人非小细胞肺癌细胞形态的影响图；

图6为本发明实施例6中观察erastin联合雷公藤红素抑制非小细胞肺癌裸鼠移植瘤生长的影响图；

图7为本发明实施例6中观察erastin联合雷公藤红素抑制非小细胞肺癌裸鼠移植瘤生长的柱状图；

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

CCK-8法检测erastin对人非小细胞肺癌细胞活力的影响

实验原理

CCK-8试剂中含有WST-8(化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐)是一种类似于MTT的化合物，它在电子耦合试剂1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)存在条件下，可以被线粒体内的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒产物Formazan(参考图1)，生成的Formazan数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析，细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。用酶标仪在450nm波长处测定其吸光值，甲瓒产物Formazan形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强。

实验仪器与材料

细胞培养箱(Thermo Fisher)，ELX-800酶标仪(BioTek)，倒置显微镜(LEICADMIRB)，胎牛血清(Biological Industries)，DMEM(高糖)培养基(GIBCO)，CCK-8(MCE)，DMSO(Sigma)，erastin(Selleck)，96孔细胞培养板(NEST)，非小细胞肺癌细胞(HCC827细胞，中科院上海细胞所)。

实验步骤

将非小细胞肺癌细胞以约8000个/孔的密度接种于96孔板，在37℃，5％CO₂，含10％胎牛血清的DMEM高糖培养液的细胞培养箱中培养。当细胞密度达到70-80％时，加入梯度终浓度为0、0.625、1.25、2.5、5、10、20μM的erastin，以经DMSO处理的细胞为阴性对照组，每种细胞设三个复孔。分别继续培养24小时后，倒置显微镜下观察其形态。配置含10％CCK-8的培养基，以换液的形式加入到每孔中，培养箱内孵育一定时间后测定450nm吸光度，检测不同浓度的erastin对人非小细胞肺癌细胞活力的影响，结果如图1所示。

细胞存活率按下式计算：细胞存活率＝实验组OD值/空白对照组OD值×100％；数据统计以均数±标准差(x±s)表示，采用t检验。

由图1可知，随着erastin浓度的增加，非小细胞肺癌细胞的生存率逐渐降低，IC50值为6.263μM。结果说明erastin可以降低非小细胞肺癌细胞的生存率，且这种生存率呈浓度依赖性降低。

实施例2

CCK-8法检测雷公藤红素对人非小细胞肺癌细胞活力的影响

实验原理:同实施例1

实验仪器与材料

细胞培养箱(Thermo Fisher)，ELX-800酶标仪(BioTek)，倒置显微镜(LEICADMIRB)，胎牛血清(Biological Industries)，DMEM(高糖)培养基(GIBCO)，CCK-8(MCE)，DMSO(Sigma)，雷公藤红素(Sigma)，96孔细胞培养板(NEST)，非小细胞肺癌细胞(HCC827细胞，中科院上海细胞所)。

实验步骤

将非小细胞肺癌细胞以约8000个/孔的密度接种于96孔板，在37℃，5％CO2，含10％胎牛血清的DMEM高糖培养液的细胞培养箱中培养。当细胞密度达到70-80％时，加入梯度终浓度为0、0.625、1.25、2.5、5、10、20μM的雷公藤红素，以经DMSO处理的细胞为阴性对照组，每种细胞设三个复孔。分别继续培养24小时后，倒置显微镜下观察其形态。配置含10％CCK-8的培养基，以换液的形式加入到每孔中，培养箱内孵育一定时间后测定450nm吸光度。检测不同浓度的雷公藤红素对人非小细胞肺癌细胞活力的影响结果如图2所示。

细胞存活率按下式计算：细胞存活率＝实验组OD值/空白对照组OD值×100％；数据统计以均数±标准差(x±s)表示，采用t检验。

由图2可知，随着雷公藤红素浓度的增加，非小细胞肺癌细胞的生存率逐渐降低，IC 50值为3.812μM。结果说明雷公藤红素可以降低非小细胞肺癌细胞的生存率，且这种生存率呈浓度依赖性降低。

实施例3

CCK-8法检测erastin和雷公藤红素对人非小细胞肺癌细胞活力的影响

实验原理:同实施例1

实验仪器与材料

细胞培养箱(Thermo Fisher)，ELX-800酶标仪(BioTek)，倒置显微镜(LEICADMIRB)，胎牛血清(Biological Industries)，DMEM(高糖)培养基(GIBCO)，CCK-8(MCE)，DMSO(Sigma)，erastin(Selleck)，雷公藤红素(Sigma)，96孔细胞培养板(NEST)，非小细胞肺癌细胞(HCC827细胞，中科院上海细胞所)。

实验步骤

将非小细胞肺癌细胞以约8000个/孔的密度接种于96孔板，在37℃，5％CO2，含10％胎牛血清的DMEM高糖培养液的细胞培养箱中培养。当细胞密度达到70-80％时，加入2.5μM的erastin和梯度终浓度为0、0.3、0.625、1.25、2.5、5μM的雷公藤红素，以经DMSO处理的细胞为阴性对照组，每种细胞设三个复孔。分别继续培养24小时后，倒置显微镜下观察其形态。配置含10％CCK-8的培养基，以换液的形式加入到每孔中，培养箱内孵育一定时间后测定450nm吸光度。检测erastin和雷公藤红素同时处理对人非小细胞肺癌细胞活力的影响结果如图3所示。

细胞存活率按下式计算：细胞存活率＝实验组OD值/空白对照组OD值×100％；数据统计以均数±标准差(x±s)表示，采用t检验。

由图3可知，2.5μM的erastin和1.25-5μM的雷公藤红素同时处理非小细胞肺癌细胞时，细胞死亡率呈雷公藤红素浓度依赖性升高。

实施例4

流式细胞术检测erastin和雷公藤红素对人非小细胞肺癌细胞内ROS水平的影响

实验原理

活性氧(ROS)是机体代谢过程中，氧的部分还原产物。ROS在生命活动中具有重要作用，低水平的ROS有助于抑制炎症反应、促进细胞增殖。但高水平的ROS可以促进抗肿瘤信号转导，并诱导肿瘤细胞衰老和死亡。由于肿瘤细胞需要维持较高水平的ROS稳态，调控ROS的抗癌疗法具有潜在的应用价值。

DCFH-DA(2,7－双氯荧光素蛋白乙酸盐)是一种可渗透细胞的非标记性的氧化敏感的荧光探针。DCFH-DA(2,7－双氯荧光素蛋白乙酸盐)被细胞酯酶水解成2,7－双氯四氟双烷(2,7－双氯荧光蛋白，DCFH).而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针被装载在细胞内。然后细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH而产生有荧光的DCF，从而以荧光强度判断细胞内ROS的水平。此探针广泛用于检测细胞氧化还原反应。

实验仪器与材料

细胞培养箱(Thermo Fisher)，DCFH-DA(Sigma)，流式细胞仪FACSCalibur(BD),胎牛血清(Biological Industries)，DMEM(高糖)培养基(GIBCO)，DMSO(Sigma)，erastin(Selleck)，雷公藤红素(Sigma)，10cm细胞培养板(NEST)，非小细胞肺癌细胞(HCC827细胞，中科院上海细胞所)。

实验步骤

将非小细胞肺癌细胞以约2×10⁶个/板的密度接种于10cm细胞培养皿，在37℃，5％CO₂，含10％胎牛血清的DMEM高糖培养液的细胞培养箱中培养。当细胞密度达到70-80％时，加入2.5μM的erastin和1.25μM的雷公藤红素处理24h，以经DMSO处理的细胞为阴性对照组，每种细胞设三个重复。处理完毕后用1×PBS轻柔洗涤2-3次。弃去PBS，加入适量的终浓度为10uM的DCFH-DA ROS探针稀释液。将细胞放回37℃，5％CO2培养箱避光孵育。30min后弃去上清，然后用1×PBS轻柔洗涤2次，洗去多余的ROS探针。再用胰酶消化细胞，4℃800rpm离心3min。收集细胞后，用1×PBS轻柔洗涤1次，然后每个离心管加入500ul的1×PBS，用移液器重悬细胞后转移到BD Calibur流式上样管后，用流式细胞仪FL1通道检测DCFH-DA染色阳性细胞。每例样本至少要检测10,000个细胞，获得数据后结合流式细胞仪分析软件FlowJo计算分析细胞内ROS水平变化，并绘制ROS分布图，结果如图4所示。

由图4可知，2.5μM的erastin和1.25μM的雷公藤红素单处理虽可稍微提高细胞内ROS水平，但erastin和雷公藤红素联合处理显著增加细胞内ROS的水平。

实施例5

erastin和雷公藤红素同时处理对人非小细胞肺癌细胞形态的影响

实验原理:

erastin与雷公藤红素联合处理后非小细胞肺癌细胞，观察其形态学变化。

实验仪器与材料

细胞培养箱(Thermo Fisher)，倒置显微镜(Olympus)，胎牛血清(BiologicalIndustries)，DMEM(高糖)培养基(GIBCO)，CCK-8(MCE)，DMSO(Sigma)，erastin(Selleck)，雷公藤红素(Sigma)，10cm细胞培养皿(NEST)，非小细胞肺癌细胞(HCC827细胞，中科院上海细胞所)。

实验步骤

将非小细胞肺癌细胞以约2×10⁶个/皿的密度接种于10cm细胞培养皿中，在37℃，5％CO₂，含10％胎牛血清的DMEM高糖培养液的细胞培养箱中培养。当细胞密度达到70-80％时，加入2.5μM的erastin和1.25μM的雷公藤红素，以经DMSO处理的细胞为阴性对照组。分别继续培养24小时后，倒置显微镜下观察其形态。

倒置显微镜观察erastin与雷公藤红素同时处理对非小细胞肺癌细胞形态的影响，结果如图5所示。

由图5可知，2.5μM erastin和1.25μM雷公藤红素同时处理细胞时，细胞形态明显改变，诱导细胞死亡。

结果说明，小浓度的雷公藤红素与小浓度的erastin联合处理非小细胞肺癌细胞后，可以显著诱导癌细胞发生细胞死亡，降低肺癌细胞的存活率，从而达到治疗肺癌的效应。

实施例6

erastin联合雷公藤红素抑制非小细胞肺癌裸鼠移植瘤生长

实验原理:

用裸鼠建立异种移植瘤模型具有建模周期短、成功率高、肿瘤组织内仍保留原人癌的形态及生物学功能等特点，因此裸鼠异种移植瘤模型被广泛应用于抗肿瘤药物的筛选和癌症发生、发展的临床研究。本实验选择HCC827细胞为对象，建立人源非小细胞肺癌异种移植瘤模型，考察低浓度的erastin与雷公藤红素联合处理对肺癌的体内抑制效果。

实验仪器与材料

细胞培养箱(Thermo Fisher)，胎牛血清(Biological Industries)，DMEM(高糖)培养基(GIBCO)，erastin(Selleck)，雷公藤红素(Sigma)，10cm细胞培养皿(NEST)，非小细胞肺癌细胞(HCC827细胞，中科院上海细胞所)，BALB/c裸鼠(北京华阜康)。

实验步骤

重复细胞培养步骤，培养充足的细胞数目以便接种的需要。在接种当天，收集所有细胞，用PBS稀释到1×10⁶个/0.2ml。准备接种前，根据体重均衡分配各组雄性裸鼠6只(SPF级，体重为20±2g)。将非小细胞肺癌HCC827细胞以约1×10⁶个的数量接种于裸鼠右侧后肢皮下，随后及时测量裸鼠的生长状态和肿瘤体积。当实验裸鼠的肿瘤尺寸达到50mm³时，筛选出肿瘤大小和体重接近的裸鼠，分成4组：(1)模型对照组；(2)5mg/kg erastin处理组；(3)1mg/kg雷公藤红素处理组；(4)5mg/kg erastin+1mg/kg雷公藤红素联合处理组。模型组给予溶解药物的混合液，后三组按照体重进行一天一次的腹腔注射给药。裸鼠体重和肿瘤体积大小每隔3天测量一次，记录分析数据。药物处理2周后，实施裸鼠安乐死，解剖取出肿瘤组织，测量体积记录，结果如图6-7所示。

裸鼠肿瘤体积按下式计算：肿瘤体积(mm³)＝长径×短径²×0.5。

由图6-7可知，与模型组相比，5mg/kg erastin或1mg/kg雷公藤红素单处理组裸鼠肿瘤尺寸减小；与模型组和药物单处理组相比，5mg/kg erastin和1mg/kg雷公藤红素联合处理时抑瘤率显著增高，裸鼠的肿瘤尺寸显著减小(p<0.001)。

结果说明，小浓度的erastin和雷公藤红素联合处理能显著抑制HCC827荷瘤小鼠的肿瘤生长。

Claims (1)

1.雷公藤红素联合erastin在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的应用，其特征在于：

治疗非小细胞肺癌的药物中，包括以下原料：雷公藤红素和erastin，其中，雷公藤红素的有效浓度为1.25或2.5μM，erastin的有效浓度为2.5μM；

所述药物还包括一种或多种药学上可接受的药物赋形剂，药物赋形剂为助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、防腐剂和抗氧化剂中的一种或多种。

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