TWI551291B - 一種具降低癌細胞抗藥性之樟芝菌絲體萃取物及其醫藥或食品組合物 - Google Patents
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Description
本發明係關於一種樟芝菌絲體萃取物,該萃取物及其醫藥或食品組合物具有降低癌細胞之抗藥性。
癌症是現代人常見的疾病之一,每年都高居十大死因首位,大約每四個人就有一人會罹患癌症,癌症的預防和治療已成為現代人不可漠視的議題。我們的身體是由無數細胞所組成的,細胞會經由有絲***製造新細胞,從而令我們生長、取代舊細胞、或修補因受傷而損壞的細胞。這樣的機制由基因負責控制,要是基因調控上出現問題就容易導致細胞病變,進而產生不正常增生的細胞而導致癌症。這些細胞病變在我們接收外在環境及壓力時逐漸累積,也有部分的人遺傳到已損毀的基因。正常的細胞會隨基因調控有秩序地進行***和複製,當失去控制時,就會不停地複製,在身體裡累積成塊狀,成為腫瘤。腫瘤可分為良性(benign)和惡性(malignant)兩種,惡性的腫瘤又稱為癌,良性腫瘤的細胞不會擴散到身體其他部分,而惡性腫瘤因為有癌細胞,所以具有轉移的能力。它最初形成的時候,會守在原部位上,故稱為「原位癌」。但隨著情況惡化,它就會破壞周圍的組織並擴散至其他器官去,變成侵襲性的癌症。當腫瘤由原來位置擴散到身體其他部位時,這叫做繼發性癌症(secondary cancer)或轉移性
癌症(metastasis)。
癌症的治療方式取決於癌症的種類、發生的部位以及是否擴散到身體其他部位。常見的治療方式包括外科手術、化學治療、放射治療等等;有時候亦會結合使用來達到更好的治療效果。利用口服或靜脈注射抗癌藥物來消滅癌細胞或抑制癌細胞的生長一直是化學藥物治療之主流,使用之對象經常是已經轉移或是無法手術根除之惡性腫瘤。
在早期發現的癌症可以外科手術切除來治療,但當癌症晚期時會經由血液跟淋巴轉移到其他器官,此時單靠局部治療已經無法完全控制住癌細胞單靠局部治療通常無法完全控制住癌細胞便需要採用全身性的治療,例如化學治療,荷爾蒙治療或新一代的標靶治療等方式。目前常使用的化療藥物有紫杉醇類如paclitaxol和docetaxel、purine類似物如gemcitabine、topoisomerase II inhibitor如campto(CPT-11)、第三代白金類衍生物如oxaliplatin、微脂體之結合物如liposomal adriamycin,在提升化療的效果和減輕副作用上都有顯著進展。化學治療使用的目的上除了能殺死癌細胞外,也能減小腫瘤的體積,末期病人使用化療能減少患者痛苦,與手術及放射治療結合使用,減低復發風險。
1970年代發現臨床上癌症病人經化學治療後,對於多種的化療藥物的敏感度降低,稱為癌症多重抗藥性(multidrug resistance;MDR),是造成化學治療失敗的重要原因。癌細胞轉變成具有抗藥性的過程,有許多的機制參與其中,目前已知的機制包括:增加藥物排出細胞外、改變藥物代謝途徑或產物、細胞週期調控點(checkpoint)改變、細胞凋亡途徑(cell apoptosis)調控失調及基因修補(gene repair)機制改變等。具有多重抗藥性的
癌細胞,會大量表現一種穿膜轉運蛋白,稱為P-醣蛋白(P-glycoprotein,P-gp),P-gp蛋白為ATP-dependent efflux pump,大量表現在腸道上皮細胞及肝臟。許多不同結構的藥物會經由P-gp蛋白攜帶而從細胞內被排出,因而降低細胞內藥物的濃度。在癌細胞中,當化療藥物刺激癌細胞時,癌細胞便會大量表現P-gp蛋白來將藥物排出,使化療藥物失效。P-gp蛋白在癌細胞表現多重抗藥性的角色雖已經被大量研究,顯示與化療藥物造成的多重抗藥性有重要關聯,而其他造成癌細胞多重抗藥性的機制也陸續被發現,但是仍無法解決臨床上因多重抗藥性導致化學治療失敗的問題。多數的抗癌藥物的治療指數(therapeutic index)都很狹窄,一旦癌細胞對於抗癌藥物的敏感度稍微降低,臨床上礙於毒性的考量,又不能提高劑量,因此造成治療中斷。
樟芝的型態棒芝又名牛樟菇、樟菰、樟窟內菰,台灣有稱陰陽對口菇。樟芝子實體屬多年生,具有強烈沖鼻的樟樹香氣,此與一般靈芝類有很大的差異,其外型呈板狀或鐘狀。板狀型態者,面為橘紅(黃)色,整面全有菌孔,板底層有淺黃白色的木栓質,藉此木栓質附著在牛樟樹中空心材內壁上生長。鐘狀型態者,子實層(鐘面)亦呈橘(黃)色,充滿菌孔(4-5個菌孔/毫米),內有孢子味極苦,新鮮時為橘紅色,之後會成為橘褐色或褐色,鐘體則呈暗綠褐色的皮殼。以顯微鏡觀察其擔孢子,其型態為平滑無色之透明微彎柱形。
野生的樟芝是生長在牛樟樹幹中空內壁上,因為這個特性,造成很多牛樟樹倒伏。文獻記載,樟芝是在牛樟樹上目前唯一發現的木材腐杉菌,病徵為褐色腐朽,故為褐腐菌。但是樟芝的病原性並不強,因此
牛樟樹很少因此死亡。雖然樟芝對牛樟樹而言是病原菌,但因樟芝價格昂貴,超過牛樟樹的經濟價值,因此是不是牛樟樹的病原菌已經不重要了。
樟芝的培養,人工栽培的技術,仍有待努力。所以,目前仍是以深山採集的方式來獲得。但是採集樟芝不是件容易的事,因為首先要尋找牛樟樹的產地。常有的困難是牛樟樹與冇樟,兩者極為相似,不易分辨。目前最直接的方法已由藤田安二提出,有樟幹油是以黃樟油(Saforle)與十五燒醛為主,因而有沙士中黃樟素的味道,牛樟幹油則以松油醇(d-terpinenol)為主,而有樟腦油的味道,藉此即可區別牛樟與冇樟;第二個困難是要從大片樹林中找到有中空洞的樹幹才行,此相當不易。空洞中若有樟芝,則可定期採集。
樟芝子實體在過去一直被認為對解毒、高血壓、止癢、腹瀉、過敏、肝癌的治療有效。因牛樟芝富含三萜類化合物(triterpenoids)、超氧歧化酶(superoxide dismutase:SOD)、腺苷(adenosine)、多醣體(polysaccharides)、β-D-葡聚醣(β-D-glucan)、維生素,其中豐富的三萜類化合物及多醣體成份被認為可以一定程度地抑制癌細胞增生,且具有殺死癌細胞之能力,特別是對於肝癌、胃癌、乳癌、子宮頸癌有不錯的保健功效。目前很多研究發現三萜類具有抗炎、鎮痛、毒殺腫瘤細胞及誘導腫瘤細胞調亡、抗缺氧等作用;而且還具有提高免疫力的作用。而β-D-葡聚醣能透過刺激巨噬細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞以及自然殺手細胞等,增強免疫功能進而達到抗腫瘤的效果。
有鑑於野生樟芝寄於牛樟木,牛樟木屬於保育類一級木樹種,且空心的牛樟木不易取得;又,癌症為十大死因之首,且化療過程常
因癌細胞產生抗藥性使化療的成效不佳;因此本案發明人經過長久的構思與研究,提供一種利用液態培養樟芝菌絲體萃取物之活性物質的方法,且證明該液態培養樟芝菌絲體萃取物之活性物質有降低癌細胞抗藥性之功效,即成為本發明在此欲解決的一重要課題。
鑒於前述之問題與缺失,本發明目的在於提供一種用於降低癌症抗藥性的之醫藥組合物,包含有效劑量的樟芝菌絲體萃取物或樟芝菌絲體之活性物質,降低癌細胞對化療藥物之抗藥性。
本發明的目的在於提供一種樟芝菌絲體萃取物用於製備藥品的用途,其中該樟芝菌絲體萃取物係萃取自樟芝菌絲體(CCRC35396菌株),該藥物係為Paclitaxel,且該樟芝菌絲體萃取物係降低癌細胞對該藥物之抗藥性,該抗藥性為MDR蛋白質表現量。
為達前述發明目的,該樟芝菌絲體萃取物係以下列步驟所製備者:步驟1:取牛樟芝菌絲體以有機溶劑經超音波震盪,再經過振搖後,得到牛樟芝菌絲體萃取液;該有機溶劑為甲醇;該牛樟芝菌絲體與該有機溶劑的體積比為1:5-20;步驟2:以減壓濃縮去除所述牛樟芝菌絲體萃取液中的有機溶液,再以乙酸乙酯和水進行分層,取乙酸乙酯層,去除乙酸乙酯,得牛樟芝菌絲體粗萃取物;
步驟3:將步驟2所得該牛樟芝菌絲體粗萃取物以膠體管柱層析純化,並以正己烷-乙酸乙酯沖提,得樟芝菌絲體之活性物質。
為達前述發明目的,其步驟3中該膠體管柱係為矽膠或Sephadex LH-20膠體管柱,該正己烷-乙酸乙酯比例為95:5至0:100。
為達前述發明目的,其中該樟芝菌絲體萃取物之有效劑量為20μg/ml。
為達前述發明目的,其中該癌細胞包括子宮頸癌細胞或肝癌細胞。
為達前述發明目的,其步驟1中該牛樟芝與該有機溶劑的體積比為1:10。
為達前述發明目的,其中該Paclitaxel之有效劑量為0.5μg/ml。
本發明之另一目的為一種樟芝活性物質製備藥品的用途,其中該樟芝活性物質包含4-Acetyl antroquinonol、Antrodin或Antroquinonol,該藥物係為Paclitaxel,且該樟芝活性物質係降低癌細胞對該藥物之抗藥性,該抗藥性為MDR1蛋白質表現量。
為達前述發明目的,其中該Paclitaxel之有效劑量為0.5μg/ml。
為達前述發明目的,其中該樟芝活性物質之有效劑量為10μg/ml。
綜上所述,本發明之特點包括:1. 樟芝菌絲體萃取物之萃取方式;2. 樟芝菌絲體萃取物可以抑制癌細胞之多重抗藥性蛋白MRD1表現;3. 樟芝菌絲體活性物質以抑制癌細胞之多重抗藥性蛋白MRD1表現。
第1圖係為樟芝菌絲體萃取物對MDR1表現量影響示意圖
第2圖係為樟芝菌絲體活性物質對MDR1表現量影響示意圖
本發明係以下面的實施例予以示範闡明,但本發明不受下述實施例所限制。
本說明書中所述之所有技術性及科學術語,除非另外有所定義,皆為該所屬領域具有通常技藝者可共同瞭解的意義。
菌株來源
本發明所使用之菌株A.camphorata CCRC-35396是購買自財團法人食品工業發展研究所。
實施例1
樟芝菌絲體的發酵
將CCRC-35396菌株接種至2公升Hinton錐形瓶,該錐形瓶內含有1公升培養基,該培養基成份為1.0%葡萄糖、0.5%黃豆粉、0.5%蛋白腖、0.01%硫酸鎂(MgSO4)、0.01%消泡劑(KM-72 antifoam),調整pH值至
pH4.0,於28℃下振盪培養10天。培養出之菌絲體於無菌室中轉移至一200公升醱酵槽,該醱酵槽內含有120公升上述培養基,在28℃下醱酵培養12天。
實施例2
樟芝菌絲體萃取
將醱酵所得之樟芝菌絲體發酵液進行冷凍乾燥,以10倍體積之100%甲醇於15-25℃超音波震盪1小時,可重複萃取數次再利用120rpm振搖隔夜萃取,將上述所得萃取液經減壓濃縮除去甲醇,殘餘之甲醇萃取物以乙酸乙酯與水進行分層,將乙酸乙酯層抽取液減壓濃縮除去溶劑後,以矽膠管柱層析作初步分離,依序以正己烷-乙酸乙酯(95:5→0:100)沖提得樟芝菌絲體之活性物質,共得12個部份。依照極性由小到大分別標示為ACME(A~K),回溶後保存於4℃。
實施例3
樟芝菌絲體活性物質的純化
將樟芝菌絲體活性物質分層ACME-G與ACME-H混和,以矽膠及Sephadex LH-20管柱層析進一步分離,得到化合物4-Acetyl antroquinonol B、Antrodin C、Antroquinonol,回溶後保存於4℃。得到之純化合物,經HPLC與標準品對照以確認。
實施例4
人類癌細胞株培養
於6孔平底細胞培養盤之每一孔加入1毫升培養基,其內含有5×104個細胞,於5%二氧化碳與37℃環境中培養24小時,使細胞貼覆於培養盤上;用以檢測樟芝菌絲體活性物質對人類子宮頸HeLa細胞及樟芝中之純
物質對人類肝癌HepG2細胞MDR1表現量的影響。
樟芝菌絲體活性物質溶解於二甲基亞石楓(Dimethyl sulfoxide,DMSO)中,檢測時DMSO之濃度不超過0.1%以避免其毒性影響細胞生長;細胞以樟芝菌絲體活性物質處理24小時,進行蛋白質萃取;實驗組為樟芝菌絲體活性物質合併加入化療藥物paclitaxel。
實施例5
MDR1蛋白偵測
蛋白質萃取步驟:所有步驟於冰上進行,移除細胞之培養基,以磷酸緩衝溶液清洗,加入含有蛋白酶抑制劑(protease inhibitor)的細胞溶解液(lysis buffer)以打破細胞並且避免蛋白質水解,用刮杓將細胞輕輕刮下,使用微量吸管重複抽吸以打破細胞,將打破之細胞液收集至離心管,離心12000-13000rpm、4℃、20分鐘,抽取上清液中作蛋白質定量後以西方墨點法(western blot)偵測MDR1表現量。
蛋白質定量步驟:樣品加入Bradford試劑,以酵素免疫分析測讀儀(ELISA READER)偵測於595nm之吸光值;以胎牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)做標準曲線,以回推樣品之蛋白質濃度。
西方墨點法步驟:將定量之蛋白質樣本以6%十二烷基硫酸鈉聚丙醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)電泳分離,MDR1蛋白之分子量為141KD;轉印後以MDR1之一級抗體辨識,壓片分析MDR1表現量,以β-actin表現量作內部定量控制以校正MDR1之表現量。
實施例6
樟芝菌絲體萃取物對MDR1表現量的影響
偵測樟芝菌絲體萃取物處理對人類子宮頸癌Hela細胞MDR1表現量的影響,以樟芝菌絲體萃取物處理Hela細胞24小時,再以paclitaxel處理細胞48小時,低濃度(0.1μM)paclitaxel處理使HeLa細胞之MDR1表現量增加11.3%(圖一),高濃度(0.5μM)paclitaxel處理使HeLa細胞之MDR1表現量增加44.6%(p<0.01);樟芝菌絲體萃取物處理(未合併使用paclitaxel)的HeLa細胞中,樟芝菌絲體活性物質分層ACME-F使MDR1表現量增加但沒有顯著差異,ACME-G跟ACME-H使HeLa細胞MDR1表現量降低,ACME-H使HeLa細胞MDR1表現量降低29%(p<0.05);ACME-F、ACME-G、ACME-H合併使用paclitaxel處理使HeLa細胞之MDR1表現量顯著降低(p<0.01),其中以ACME-G的抑制效果最為顯著,MDR1表現量由144.61%降低至10.43%(p<0.001)。
實施例7
偵測樟芝菌絲體活性物質處理對人類肝癌HepG2細胞MDR1表現量的影響,以樟芝菌絲體活性物質Antroquinonol處理HepG2細胞24小時,能有效減少MDR1表現量(圖二),再以化療藥物paclitaxel處理人類肝癌HepG2細胞48小時,低濃度paclitaxel(0.1μM)使Hep G2細胞中MDR1表現增加8.7%,而在高濃度paclitaxel(0.5μM)使Hep G2細胞中MDR1表現增加34.2%;以樟芝菌絲體活性物質處理人類肝癌HepG2細胞,4-Acetyl antroquinonol B使MDR1表現量增加45.8%(p<0.05),Antrodin C跟Antroquinonol使MDR1表現量顯著減少(p<0.001);以樟芝菌絲體活性物質合併使用paclitaxel,三種樟芝中之純化合物都使MDR1表現顯著降低
(p<0.01),其中以Antroquinonol的效果最顯著,MDR1表現量由134.16%降至9.34%(p<0.001)。
本發明之樟芝菌絲體活性物質,係以天然藥用真菌發酵而得,相較於化學合成藥物,除更具安全性,亦具有減少癌細胞抗藥性之功效。上列詳細說明乃針對本發明之可行實施例進行具體說明,惟該實施例並非用以限制本創作之專利範圍,凡未脫離本創作技藝精神所為之等效實施或變更,均應包含於本案之專利範圍中。
綜上所述,本案不僅在技術思想上確屬創新,且具上述減少癌細胞抗藥性之功效,已充分符合新穎性及進步性之法定發明專利要件,爰依法提出申請,懇請 貴局核准本件發明專利申請案,以勵發明,至感德便。
Claims (10)
- 一種樟芝菌絲體萃取物用於製備藥品的用途,其中該樟芝菌絲體萃取物係萃取自樟芝菌絲體(CCRC35396菌株),該藥物係為Paclitaxel,且該樟芝菌絲體萃取物係降低癌細胞對該藥物之抗藥性,該抗藥性為MDR1蛋白質表現量。
- 如申請專利範圍第1項所述之樟芝菌絲體萃取物用於製備藥物的用途,該樟芝菌絲體萃取物係以下列步驟所製備者:步驟1:取牛樟芝菌絲體以有機溶劑經超音波震盪,再經過振搖後,得到牛樟芝菌絲體萃取液;該有機溶劑為甲醇;該牛樟芝萃取物與該有機溶劑的體積比為1:5-20;步驟2:以減壓濃縮去除所述牛樟芝菌絲體萃取液中的有機溶液,再以乙酸乙酯和水進行分層,取乙酸乙酯層,去除乙酸乙酯,得牛樟芝菌絲體粗萃取物;步驟3:將步驟2所得該牛樟芝菌絲體粗萃取物以膠體管柱層析純化,並以正己烷-乙酸乙酯沖提,得樟芝菌絲體萃取物。
- 如申請專利範圍第2項所述之樟芝菌絲體萃取物用於製備藥品的用途,其步驟3中該膠體管柱係為矽膠或Sephadex LH-20膠體管柱,該正己烷-乙酸乙酯比例為95:5至0:100。
- 如申請專利範圍第1項所述之樟芝菌絲體萃取物用於製備藥品的用途,其中該樟芝菌絲體萃取物之有效劑量為20μg/ml。
- 如申請專利範圍第1項所述之樟芝菌絲體萃取物用於製備藥品的用途,其中該癌細胞包括子宮頸癌細胞或肝癌細胞。
- 如申請專利範圍第2項所述之樟芝菌絲體萃取物用於製備藥品的用途,其步驟1中該牛樟芝菌絲體與該有機溶劑的體積比為1:10。
- 如申請專利範圍第1項所述之樟芝菌絲體萃取物用於製備藥品的用途,其中該Paclitaxel之有效劑量為0.5μg/ml。
- 一種樟芝活性物質製備藥品的用途,其中該樟芝活性物質包含4-Acetyl antroquinonol、Antrodin或Antroquinonol,該藥 物係為Paclitaxel,且該樟芝活性物質係降低癌細胞對該藥物之抗藥性,該抗藥性為MDR1蛋白質表現量。
- 如申請專利範圍第8項所述之樟芝活性物質製備藥品的用途,其中該Paclitaxel之有效劑量為0.5μg/ml。
- 如申請專利範圍第8項所述之樟芝活性物質製備藥品的用途,其中該樟芝活性物質之有效劑量為10μg/ml。
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