CN101352444A

CN101352444A - 雷公藤红素在制药中的新应用

Info

Publication number: CN101352444A
Application number: CNA2008101984854A
Authority: CN
Inventors: 周光飚; 马亮; 吴福群; 刘永强; 刘姿
Original assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Current assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Priority date: 2008-09-11
Filing date: 2008-09-11
Publication date: 2009-01-28

Abstract

本发明公开了雷公藤红素在制备治疗表达CIP2A蛋白的癌症的药物中的应用。本发明所述的雷公藤红素有以下特点：不具有细胞系特异性的显著下调CIP2A蛋白，能时间和剂量依赖性的降低肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌中癌蛋白CIP2A的表达，导致受CIP2A稳定的癌蛋白C－Myc产生相应的降解，在肺癌和肝癌细胞中显示出显著的细胞毒作用，在裸鼠肺癌肿瘤移植模型中具有有效的抗肿瘤增殖作用。雷公藤红素在治疗肺癌、头颈鳞状细胞癌、结肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌及其它一些表达CIP2A癌蛋白的癌症中具有广泛的应用前景。

Description

雷公藤红素在制药中的新应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体地，是涉及雷公藤红素在制药中的新应用。

背景技术

癌症是一种异常复杂且种类繁多的疾病，全世界约有1/8的人口死亡由癌引起，超出艾滋病、结核病以及疟疾三者死亡人数总和，在发达国家，继心脏病之后癌是第二大死亡原因，在发展中国家居于第三位。几乎所有癌症在发展过程中都具备同样的特点，概括起来，主要体现在以下几方面：产生自我维持生长信号、对生长抑制信号不敏感、逃避凋亡、无限复制潜能、持续的血管发生以及获得组织浸润和转移能力。究其病因，癌主要由内外两种因素引起，外部因素包括吸烟、化学物质，辐射、病原体感染等，内部因素可分为遗传突变、激素、免疫情况以及代谢途径紊乱等，其中一种或多种内外因素相互作用，从而导致癌症的发生。

目前在癌症的研究方面已取得很多突破性进展，特别是癌基因以及抑癌基因的发现，二者在肿瘤的发病机理研究以及治疗中起着极其重要的作用。肿瘤细胞中癌基因常发生突变或扩增，从而使得癌基因组成性的激活或高表达，产生过多的正常细胞中不表达或表达量很低的癌蛋白；抑癌基因与癌基因相反，突变、表观遗传学改变、与抑制蛋白相结合等作用通常导致抑癌基因产物表达量减少或活性降低等。癌基因或抑癌基因功能异常在生理水平起着相似的作用：通过促进细胞增殖或抑制凋亡及周期阻滞等增加肿瘤细胞数，进而导致肿瘤的发生。因此发现对肿瘤发生发展起关键作用的基因(如癌基因以及抑癌基因等)及其调控通路，并且寻找对该基因产物具有调控作用的化合物，对癌症的机理研究以及治疗都具有积极意义。

PP2A是蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，在哺乳动物细胞中参与多种信号调节，它由异三聚体构成(包括催化亚单位PP2A/C，结构亚单位PP2A/A以及调节亚单位PP2A/B，调节亚单位具有多种不同类型)，其中AC催化复合体单独就具备催化活性，B亚单位决定复合体的亚细胞定位以及底物特异性。A和C亚基在进化上保守且普遍表达，形成催化复合体(PP2A/AC)，并且至少与三个家族的调节亚基以及肿瘤抗原相互作用。很多证据显示PP2A主要起着肿瘤抑制基因的作用，它能使癌基因c-Myc的S62去磷酸化，从而导致c-Myc通过泛素——蛋白酶体途径降解，抑制PP2A介导的c-Myc的62位丝氨酸去磷酸化是细胞转化的先决条件。因此，在转化的细胞中，PP2A活性被抑制的分机制一直是人们研究的重点，从而导致一种抑制PP2A活性的蛋白——CIP2A的发现。

CIP2A最先是在肝癌病人中发现的一种自身抗原，由905个氨基酸组成，分子量约为90KDa，主要在细胞质中表达，其结构上最显著特点是C末端含有一个由255个氨基酸组成的卷曲螺旋结构，该结构可能具有潜在的与自身或其它蛋白形成大分子复合体的能力。现已证明，CIP2A能抑制PP2A活性，主要通过直接与癌转录因子c-Myc相互作用，抑制PP2A对c-Myc62位丝氨酸的去磷酸化酶活性，使c-Myc蛋白不能通过泛素蛋白酶体途径降解，从而对c-Myc起到稳定作用。此外，CIP2A还具备以下特点：能促进细胞锚定非依赖性生长及体内肿瘤的形成，过表达CIP2A能使人细胞发生转化，利用RNA干扰技术缺失CIP2A能显著抑制HeLa细胞的增值，最重要的是CIP2A在大部分非肿瘤组织中呈低水平表达，然而在多种人恶性肿瘤(包括人头颈鳞细胞癌、结肠癌、胃癌、肝癌等)中高表达。种种现象暗示CIP2A作为一种癌蛋白在肿瘤的发生或发展过程中起着重要作用。因此，在癌症治疗中，寻找作用于CIP2A并能使其蛋白下调的化合物，不仅能进一步的阐明CIP2A相关的作用通路，更重要是有望获得用于多种癌症治疗的药物。

雷公藤红素是从中药雷公藤中提取的一种单体，属三萜系化合物，分子式为C₂₉H₃₈O₄，相对分子质量为450600，其结构式如下。

之前的研究表明，雷公藤红素能抑制多种癌细胞的增值，包括白血病、神经胶质瘤、***癌以及胰腺癌等。此外，有证据显示，雷公藤红素能参与促炎症细胞因子、诱导性一氧化氮合酶、MHC-II抗原、黏附分子、蛋白酶体活性、拓扑异构酶II、钾通道以及热休克应答等调控。在体内研究方面，雷公藤红素能显著的抑制***癌以及胰腺癌细胞小鼠肿瘤移植模型中癌细胞的增殖，并且在***性红斑狼疮、哮喘、类风湿性关节炎以及胶原诱导的关节炎等动物模型中显示有效的抗炎症作用。虽然目前在雷公藤红素研究方面已取得许多进展，但其抗炎症、抗氧化以及抗癌作用确切的分子机制还未完全解释清楚，此外，雷公藤红素能否用于治疗表达CIP2A蛋白的癌症例如肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等高发性癌症或通过何种途径治疗上述各种癌症都还未见报道。因此，探索雷公藤红素在多种癌症中的治疗作用以及其参与调控的信号通路具有重要的理论以及应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种雷公藤红素在制药中的新应用。

实现上述目的的技术方案为：

雷公藤红素在制备治疗表达CIP2A蛋白的癌症的药物中的应用。

具体地，所述雷公藤红素在制备治疗肺癌、头颈鳞细胞癌、结肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌及其它一些表达CIP2A癌蛋白的癌症的药物中的应用。所述表达CIP2A蛋白的癌症还可以为白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、骨髓增殖性疾病等血液***恶性肿瘤。

本发明所述的化合物雷公藤红素呈时间和剂量依赖性的降低肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌细胞中癌蛋白CIP2A的表达，在肺癌和肝癌细胞中显示出显著的细胞毒作用，此外在裸鼠肺癌肿瘤移植模型中具有有效的抗肿瘤增殖作用。

通过大量的研究表明：化合物雷公藤红素能能显著且迅速的下调CIP2A蛋白的表达，在治疗CIP2A蛋白高表达癌症中的应用具有以下优点。

1雷公藤红素能显著的促进CIP2A蛋白降解，具有重要的临床应用价值。

2CIP2A蛋白在绝大多数正常组织中表达量非常低，但在许多癌细胞中高表达，因此，CIP2A可以说是一种肿瘤特异性蛋白，促进CIP2A蛋白的降解，对正常组织的损害较小。

3由于CIP2A在很多癌细胞中都高表达，且化合物雷公藤红素促进CIP2A蛋白的降解不具有细胞特异性，因此具有潜在的治疗多种CIP2A蛋白高表达癌症的作用。

4抑制CIP2A蛋白表达有效抑制HeLa细胞的增殖，提示CIP2A蛋白在癌细胞增殖过程中起着重要作用，因此用能促使CIP2A蛋白降解的化合物雷公藤红素和作用于其它通路的化合物联合使用，具有潜在的协同治疗癌症的作用。

总之，雷公藤红素通过显著下调CIP2A蛋白，具有潜在的对其它正常组织作用小、显著抑制癌细胞增殖、广谱抗癌作用等优点，在临床上具有广泛的抗癌应用前景，从而为治疗表达CIP2A蛋白的癌症的药物提供新的选择。

附图说明

图1化合物雷公藤红素能使多种癌细胞中CIP2A蛋白下调的作用图；

图2化合物雷公藤红素时间依赖性的下调肺癌细胞系A549中CIP2A蛋白的作用图；

图3化合物雷公藤红素剂量依赖性的下调肺癌细胞系A549中CIP2A蛋白的作用图；

图4免疫荧光技术显示雷公藤红素时间依赖性的下调肺癌细胞系A549中CIP2A蛋白的作用图；

图5免疫沉淀技术显示雷公藤红素时间依赖性的下调肺癌细胞系A549中CIP2A蛋白的作用图；

图6雷公藤红素联合蛋白翻译抑制剂(CHX)对CIP2A蛋白表达的作用图；

图7化合物雷公藤红素下调肺癌细胞系A549中c-Myc蛋白的作用图；

图8化合物雷公藤红素下调肝癌细胞系HepG2中c-Myc蛋白作用图；

图9雷公藤红素抑制多种肺癌细胞系增殖的示意图；

图10雷公藤红素抑制肝癌细胞系HepG2增殖的作用图；

图11肺癌细胞系A549皮下接种免疫缺陷裸鼠后用化合物雷公藤红素腹腔注射3周，肿瘤体积和裸鼠体重变化示意图。

具体实施方式

多方面的试验表明：雷公藤红素能引起多种癌细胞系中CIP2A蛋白的迅速降解，下调c-Myc蛋白，抑制肺癌以及肝癌等癌细胞系的增殖，并且能显著抑制肺癌细胞系A549肿瘤裸鼠移植模型中肿瘤的增殖。以下通过实施例来进一步阐述本发明，但其不构成对本发明保护范围的限制。

实施例1：

雷公藤红素(5μM)处理各种对数生长期的肺癌细胞(A549cells、HCC827cells、NCI-H1975 cells、NCI-H460 cells)、乳腺癌细胞系(MCF-7 cells)、胃癌细胞系(SGC-7901 cells)、肝癌细胞系(HepG-2)，药物作用时间按图2所示，然后收集细胞用RIPA裂解液(50mM Tris(pH7.4)，150mM NaCl，1％ TritonX-100，1％ sodium deoxycholate，0.1％ SDS，Protease Inhibitor Cocktail，1mMPMSF，1mM NaF，1Mm Na3VO4，1Mm EDTA)裂解细胞提取蛋白，用抗CIP2A的鼠单克隆抗体2G10-3B5(购自Santa Cruz生物技术公司)进行Western blot免疫印迹实验，结果显示，在所检测的多种癌细胞系中雷公藤红素能迅速显著的下调CIP2A蛋白，不具有细胞系特异性。参见图1。

实施例2：

雷公藤红素(5μM)处理对数生长期的肺癌细胞系A549，药物作用时间按图2所示，收集细胞用RIPA裂解液裂解细胞提取蛋白，然后用抗CIP2A的鼠单克隆抗体2G10-3B5(购自Santa Cruz生物技术公司)进行Western blot免疫印迹实验，结果显示，雷公藤红素能时间依赖性的下调CIP2A蛋白。参见图2。

实施例3：

各种浓度的雷公藤红素处理肺癌细胞系A549，药物作用时间6小时，收集细胞用RIPA裂解液裂解细胞提取蛋白，然后用抗CIP2A的鼠单克隆抗体2G10-3B5(购自Santa Cruz生物技术公司)进行Western blot免疫印迹实验，结果显示，雷公藤红素能剂量依赖性的下调CIP2A蛋白。参见图3。

实施例4：

取对数生长期的细胞在盖玻片上培养24小时，用雷公藤红素处理细胞，药物作用时间按图4所示，然后取出盖玻片用PBS洗2次，随后用4％的多聚甲醛固定15分钟(4℃)，用含100mM甘氨酸的PBS洗三次，每次5分钟，再用0.3％的tritonX100处理20分钟，用含0.05％的tween-20的PBS洗三次每次5分钟，用5％的BSA封闭30分钟，抗CIP2A的鼠单克隆抗体2G10-3B5(购自Santa Cruz生物技术公司，1∶100稀释)4℃孵育过夜，PBS洗三次，每次5分钟，用FITC标记的抗小鼠IgG二抗(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)孵育1.5小时，PBS洗三次，每次5分钟，加DAPI染核(1∶1000稀释，购自Sigma公司)2分钟，PBS洗三次，每次5分钟，滴加一滴防荧光淬灭剂(购自碧云天生物技术公司)，封片，用荧光显微镜检测。结果显示雷公藤红素时间依赖性的下调肺癌细胞系A549中CIP2A蛋白。参见图4.

实施例5：

取对数生长期的的A549细胞按每10cm皿3x10⁶的细胞数接种细胞，24小时后，用5μM雷公藤红素处理细胞，按图5显示的时间点加药，收集细胞，用冰冷的PBS洗二次，每皿用2ml的RIPA裂解液裂解细胞收蛋白，然后再用1ml的RIPA裂解液洗平皿，将两次的裂解液收集在一起，取适当的蛋白裂解液进行蛋白定量，取等量的蛋白裂解液进行免疫沉淀，每个实验组取约500μg的蛋白加入1.5mlEP管中，加1.5μgCIP2A一抗，4℃转鼓上摇晃孵育过夜，每管加入20μl Protein A/GPLUS Agarose(SC-2003，购自Santa Cruz生物技术公司)，4℃转鼓上摇晃孵育3小时，1000g离心5分钟沉淀琼脂糖珠，小心去除上清，用RIPA裂解液洗琼脂糖珠子，1000g离心5分，该过程重复5次，最后一次离心后，小心去除上清，然后每管加入50μl 1xSDS蛋白裂解缓冲液，100℃煮沸5分钟，2000g 4℃离心5分钟，吸取上清，取40μl进行SDS-PAGE电泳，结果显示，雷公藤红素能显著下调CIP2A蛋白。参见图5.

实施例6：

取对数生长期的的A549细胞按每6cm皿1x10⁶的细胞数接种A549细胞，24小时后，用100μg/mLCHX(放线菌酮)单独处理或联合雷公藤红素(5μM)处理细胞，药物作用时间按图6所示，收集细胞，用RIPA裂解液裂解细胞提取蛋白，然后用抗CIP2A的鼠单克隆抗体2G10-3B5(购自Santa Cruz生物技术公司)进行Westernblot免疫印迹实验，结果显示，单独加CHX在6小时内CIP2A蛋白的降解不显著，但与雷公藤红素联合后，能显著下调CIP2A蛋白，由此可见，雷公藤红素对CIP2A蛋白的作用可能主要体现在翻译后水平，能促进CIP2A蛋白的降解。参见图6。

实施例7：

雷公藤红素(5μM)处理对数生长期的肺癌细胞系A549，药物作用时间按图7所示，收集细胞用RIPA裂解液裂解细胞提取蛋白，然后用抗c-Myc的兔多克隆抗体(c-Myc(N-262)：sc-764，购自Santa Cruz生物技术公司)进行Western blot免疫印迹实验，结果显示，雷公藤红素能下调c-Myc蛋白表达。参见图7。

实施例8：

雷公藤红素(5μM)处理对数生长期的肝癌细胞系HepG2，药物作用时间按图8所示，收集细胞用RIPA裂解液裂解细胞提取蛋白，然后用抗c-Myc的兔多克隆抗体(c-Myc(N-262)：sc-764，购自Santa Cruz生物技术公司)进行Western blot免疫印迹实验，结果显示，雷公藤红素能下调c-Myc蛋白表达。参见图8。

实施例9：

取对数生长期的各种肺癌细胞系，分别接种与96孔板，每孔接种5000个细胞于90μl培养基中，设置5个雷公藤红素药物剂量组(对照组，0.5μM，1μM，2μM，5μM)，每组设4个复孔，培养24小时后，分别在每个细胞培养孔中加入10μl用培养基稀释的相应含量的雷公藤红素，使药物终浓度符合相应的药物剂量梯度。药物处理44小时后，加入10μlMTT染液，继续培养4小时，吸去培养基，每孔加入150μlDMSO，震荡10分钟使颜色产物充分溶解，用酶标仪于490nm波长处测光吸收值，抑制率按以下公式计算：抑制率＝(加药-对照)/(对照-空白)。结果显示，雷公藤红素能剂量依赖性的抑制多种肺癌细胞系的增殖。参见图9.

实施例10：

取对数生长期的肝癌细胞系HepG2，接种于96孔板，每孔接种5000个细胞于90μl培养基中，培养24小时后，分别在每个细胞培养孔中加入10μl用培养基稀释的相应含量的雷公藤红素，使药物终浓度符合相应的药物剂量梯度，药物作用时间和剂量见图9，在培养时间结束前4小时，加入10μlMTT染液，继续培养4小时，吸去培养基，每孔加入150μlDMSO，震荡10分钟使颜色产物充分溶解，用酶标仪于490nm波长处测光吸收值，抑制率按以下公式计算：抑制率＝(加药-对照)/(对照-空白)。结果显示，雷公藤红素能时间和剂量依赖性的抑制肝癌细胞系的增殖。参见图10.

实施例11：

将稳定转染了荧光素酶的处于对数生长状态的肺癌细胞系A549，移植入免疫缺陷的裸鼠(雄性，5周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司)的右侧皮下，每只移植2x10⁶个细胞，共15只；裸鼠在SPF级条件下饲养，待每只裸鼠皮下长出可见肿瘤块时，将裸鼠进行随机分组，每组5只共3组(对照组，雷公藤红素1mg/Kg组以及3mg/Kg组)。其中对照组注射安慰剂(10％的DMSO，70％的克列莫佛/乙醇(3∶1)，20％的PBS)，腹腔注射给药，给药频率为每天一次，每隔二天用游标卡尺测量瘤块的长径(a)和短径(b)，按公式v＝1/2*a*b²计算肿瘤体积。连续给药3周，以每组裸鼠平均肿瘤体积(mm³)为y轴，给药时间为x轴，绘制曲线，结果显示雷公藤红素显著抑制裸鼠肿瘤的生长，且对裸鼠体重没有明显影响。参见图11。

Claims

1、雷公藤红素在制备治疗表达CIP2A蛋白的癌症的药物中的应用。

2、根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述表达CIP2A蛋白的癌症为肺癌。

3、根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述表达CIP2A蛋白的癌症为肝癌。

4、根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述表达CIP2A蛋白的癌症为胃癌。

5、根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述表达CIP2A蛋白的癌症为头颈鳞状细胞癌。

6、根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述表达CIP2A蛋白的癌症为乳腺癌。

7、根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述表达CIP2A蛋白的癌症为白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、或骨髓增殖性疾病。