TW201938139A - 蝦紅素用於製備抑制或治療皮膚失調之組合物的用途 - Google Patents

Abstract

本發明有關於蝦紅素(astaxanthin)於抑制或治療黑色素瘤(melanoma)的用途，藉此蝦紅素可用於製備抑制黑色素瘤細胞增生、轉移(metastasis)、遷徙(migration)與侵入(invasion)之醫藥品或保健品。

Description

蝦紅素用於製備抑制或治療皮膚失調之組合物的用途

本發明係有關於一種蝦紅素用於製備抑制或治療黑色素瘤之組合物的用途，尤其係指一種具誘導黑色素癌細胞凋亡特性的蝦紅素化合物，可有效抑制黑色素瘤細胞增生及/或轉移(metastasis)、遷徙(migration)與侵入(invasion)。

人類皮膚黑色素瘤(melanoma)，或稱黑色素癌(melanotic carcinoma)是具侵略性的皮膚癌之一，且黑色素瘤對於常規化療(conventional chemotherapy)具有高度抗性(resistance)，黑色素瘤癌細胞轉移至各人體部位的機率極高，但目前卻無有效治療黑色素瘤的藥物或方法。研究發現，使用化學預防治療方式抑制癌症的發展是有效的，化學預防治療大多為使用天然藥物，包括抗氧化劑和癌症預防劑，甚至是利用癌症治療藥劑來抵抗癌症。

然而，目前仍存在黑色素癌及其轉移之後難以治療的問題，因此如何開發有效抑制黑色素瘤增生、轉移或遷徙等之活性成分以有效治療黑色素癌，仍為相關領域發明人努力之方向。

蝦紅素(astaxanthin)是一種類胡蘿蔔素(carotenoid)的衍生物，其生理功能相似，且蝦紅素比類胡蘿蔔素更能有效防止各種不同生物膜於溶液中的脂質過氧化作用，可防止生物膜受氧化作用所導致的損傷。

蝦紅素分佈在海洋細菌、藻類、甲殼類動物和魚類中，高濃度蝦紅素呈現深橘紅色澤，是天然的抗氧化劑，具有相當的抗氧化、抗發炎能力。蝦紅素的抗氧化能力為維他命E的500倍，可以強力清除體內自由基的傷害，另有促進眼睛及中樞神經健康的功能，亦具有相當優異抗老功效，能保護肌膚免於受外在環境的侵害，預防並改善細紋、皺紋的產生。

舉例而言，中華民國專利公告第I351277號「含有還原型輔酶Q₁₀ 及類胡蘿蔔素之組合物」，即揭示一種含有還原型輔酶Q₁₀ 及類胡蘿蔔素類之抗氧化優異的組合物及使用該組合物而消除活性氧及/或自由基之方法，其中類胡蘿蔔素是選自蝦青素(astaxanthin)，其目的在於抗氧化與消除自由基；中華民國專利公告第I232103號「穩定的胡蘿蔔素-葉黃質小珠粒組成物及使用方法」，揭示應用於治療眼部相關疾病或增進眼睛的健康之組成物，該組合物包含一或多種葉黃質，係選自還原蝦紅素；一或多種胡蘿蔔素、類活蘿蔔素或其組合；一或多種抗氧化劑；及輔藥；中華民國專利公告第I359667號「具有在心血管系統上的健康促進功效之口服投與調配物」，揭示該口服投與用組合物之活性成分包含甘蔗原素(policosanol)或甘蔗原素類之混合物、紅酵母菌以及蝦青素(astaxanthin)及葉酸；美國專利公告第US 6433025 B1號「Method for retarding and preventing sunburn by UV light」揭示蝦紅素(astaxanthin)可用來預防日照所帶來的皮膚傷害，以及降低已受紫外線傷害之皮膚受損情形。另，Yoshihisa Y等人於期刊「Astaxanthin, a xanthophyll carotenoid, inhibits ultraviolet-induced apoptosis in keratinocytes」(Experimental dermatology 2014; 23: 178-183)揭示蝦紅素可抑制UV照射後引起的正常皮膚細胞凋亡(apoptosis)現象。

本發明主要目的為提供一種以式（I）之蝦紅素(astaxanthin)用於製備抑制黑色素瘤(melanoma)之組合物的用途；其中抑制黑色素瘤之組合物係抑制黑色素瘤增生及/或轉移(metastasis)、抑制黑色素瘤遷徙(migration)及抑制黑色素瘤侵入(invasion)之醫藥品或保健品。

本發明另一目的為提供一種蝦紅素用於製備治療黑色素瘤(melanoma)之醫藥品的用途。

於本發明之一實施例中，抑制黑色素瘤之組合物可進一步包含一藥學上可接受之載劑；較佳而言，藥學上可接受之載劑可例如選自於一或多種由溶劑、緩衝液、乳化劑、懸浮劑、分解劑、崩解劑、分散劑、黏結劑、賦形劑、安定劑、螯合劑、稀釋劑、膠凝劑、防腐劑、潤濕劑、潤滑劑、吸收延遲劑以及脂質體所構成之群組中的試劑。

於本發明之一實施例中，治療黑色素瘤之醫藥品可例如呈一口服(orally)的藥物劑型或非經腸道(parenterally)的藥物劑型。依據本發明，醫藥品可例如使用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成不同的投藥的劑型，其包括但不限於注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、錠劑(tablet)、片劑(troche)、***錠(lozenge)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)、外部製劑(external preparation)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)以及類似之物。

於本發明之一實施例中，治療黑色素瘤之組合物可進一步包含一藥學上可接受之載劑；較佳而言，藥學上可接受之載劑可例如選自於一或多種由溶劑、緩衝液、乳化劑、懸浮劑、分解劑、崩解劑、分散劑、黏結劑、賦形劑、安定劑、螯合劑、稀釋劑、膠凝劑、防腐劑、潤濕劑、潤滑劑、吸收延遲劑以及脂質體所構成之群組中的試劑。有關上述載劑的選用與數量皆涵蓋於熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

本發明之目的及其結構功能上的優點，將依據以下圖面所示之結構，配合具體實施例予以說明，俾使審查委員能對本發明有更深入且具體之瞭解。

本發明一種蝦紅素用於製備抑制或治療黑色素瘤之組合物的用途，其係藉由施予一有效劑量之蝦紅素(astaxanthin)於一所需個體以有效抑制黑色素瘤增生、轉移(metastasis)、遷徙(migration)以及侵入(invasion)，達到抑制或治療黑色素瘤。如本文中所使用的術語「施予(administering)」與「投藥」以及「施用(application)」可被交換地使用；另，術語「有效劑量(effective amount) 」意指當本發明的醫藥品被投予一需要抑制或治療的個體時，一足以提供所欲達致抑制功效並且不會對個體產生非所欲的不利副作用之較佳安全用量。

藉此，蝦紅素可適用於製備抑制或治療黑色素瘤之組合物以有效抑制黑色素瘤增生、轉移(metastasis)、遷徙(migration)與侵入(invasion)，所述組合物可包含醫藥品或保健品，又進一步包含一藥學上可接受之載劑；較佳而言，載劑可選自於一或多種由溶劑、緩衝液、乳化劑、懸浮劑、分解劑、崩解劑、分散劑、黏結劑、賦形劑、安定劑、螯合劑、稀釋劑、膠凝劑、防腐劑、潤濕劑、潤滑劑、吸收延遲劑以及脂質體所構成之群組中的試劑。

上述醫藥品包括以口服的藥物劑型或非經腸道的藥物劑型，較佳而言，可包括但不限於注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、錠劑(tablet)、片劑(troche)、***錠(lozenge)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)、外部製劑(external preparation)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)以及類似之物。

藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。

實施例一：檢測蝦紅素對於細胞存活率(cell viability)之影響

(1)細胞存活率測試 人類角質細胞株HaCaT 係由國立成功大學許漢銘(Hamm-Ming Sheu)教授提供，其培養方法參照J Cell Biol. 1988 Mar;106(3):761-71；原代培養的人類皮膚纖維母細胞(primary cultures of human skin fibroblasts)係由高雄醫學大學李書欣(Su-Shin Lee)醫師提供，且其培養方法參照J Agric Food Chem. 2011 Aug 10;59(15):8187-92或Exp Dermatol. 2011 Mar;20(3):242-8；人類皮膚黑色素瘤細胞株A2058 (BCRC 60263)與A375 (BCRC 60240)皆購自台灣食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute)的生物資源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center, BCRC)。簡言之，將上述細胞分別培養於含有DMEM (Gibco BRL；Gaithersburg, MD)培養基[添加有10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)、100 U/mL盤尼西林(penicillin)、0.1mg/mL鏈黴素(streptomycin)以及0.25μg/mL雙性黴素(amphotericin)(Biological industries)]的培養皿中，並將培養條件設定為37℃與5% CO₂ 進行單層培養(monolayer culture)；大約每隔2-3天更換新鮮的培養基，當細胞密度達到約80-90%匯聚(confluence)時，移除培養基並以PBS緩衝液清洗細胞共2次，接著加入胰蛋白酶-EDTA (trypsin-EDTA)以使細胞自培養皿的底部脫離；再加入新鮮培養基中和胰蛋白酶的活性並以微量吸管(pipette)反覆地吸沖培養基以充分打散細胞，然後將細胞懸浮液分配到新的培養皿中，並在培養條件被設定為37℃與5% CO₂ 的培養箱中進行培養。

蝦紅素(astaxanthin)由張瑞仁(Jui-Jen Chang)老師提供將溶於DMSO (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA)，並以12.5 mg/ml作為儲存液(stock)，以供後續稀釋成不同濃度，且所有濃度中DMSO的最終濃度皆小於1%。

＜MTT分析法＞ MTT分析法參照前案J Agric Food Chem. 2011 Aug 10;59(15):8187-92)，分別將HaCaT細胞、纖維母細胞、黑色素瘤細胞株A2058 (BCRC 60263)細胞與A375 (BCRC 60240)細胞，將每孔7×10³ 細胞數的A2058細胞和A375細胞分別培養於96孔盤(96-well microtiter plate)中，並加入5、25、50、100與125 μg/ml的蝦紅素處理24小時，控制組為加入僅具有10% FBS且最終體積為100μl的溶劑；於反應24小時之後，將培養液更換為添加有0.5 mg/mL MTT (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA)的100 μL新鮮培養液，再將細胞以培養條件37℃與5% CO₂ 培養2小時；之後，將細胞沉澱物回溶於100 μl of DMSO以溶解甲䐶(formazan)晶體；於黑暗中輕微搖動培養皿10分鐘以使紫色甲䐶晶體溶解後，定量上清液在595 nm處的光吸收(optical absorbance；A)值。細胞存活率計算公式為：細胞存活率(cell viability)(%) = [(樣品之吸光值-未添加樣品之吸光值)/(控制組之吸光值-未添加樣品之吸光值)] × 100%。

結果請參閱第一圖，蝦紅素對於人類正常表皮細胞和真皮細胞的細胞毒性(cytotoxicity)很低，相較於控制組，100 μg/ml以上的蝦紅素才會對HaCaT細胞造成細胞毒性，以及50 μg/ml以上的蝦紅素才會對纖維母細胞造成細胞毒性。

檢測蝦紅素作為抗癌劑抵抗人類皮膚黑色素瘤細胞(A2058細胞與A375細胞)之作用，結果如第二圖，利用劑量25 μg/ml 的蝦紅素處理A2058細胞，會造成A2058細胞存活率增加約50%，若處理A2058細胞50、100或125 μg/ml 的蝦紅素則造成A2058細胞存活率下降至少20%以上；於A375細胞，處理劑量100 µg/ml的蝦紅素會造成A375細胞細胞存活率下降約50%以上；由上述結果可知蝦紅素會抑制A2058細胞與A375細胞的生長，此抑制情形具有劑量依存性(dose-dependent)，且A2058細胞比A375細胞更敏感。

(2)蝦紅素對於黑色素瘤細胞週期分佈(cell cycle distribution)之影響 此實驗利用流式細胞儀(flow cytometry)評估蝦紅素對於黑色素瘤細胞停滯期(cell cycle arrest)和sub-G1期的累積情形，探討DNA損傷和細胞週期影響。分別於A2058細胞和A375細胞加入5、25、50、100與125 μg/ml的蝦紅素處理24小時，並利用PBS緩衝液清洗細胞，將細胞懸浮於1 ml 胰蛋白酶(trypsin)，再以PBS緩衝液清洗細胞共2次，加入70%乙醇並放置-20°C隔夜以固定細胞；將細胞放置4°C，以700 rpm離心5分鐘，之後加入含有1 mg/ml RNase和1 mg/ml propidium iodide (PI)染劑(Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA)的PBS緩衝液於37°C之避光環境中作用20 分鐘；利用PBS緩衝液清洗細胞之後，加入PI染劑，再將染色後的細胞(PI-stained cells)通過630/22 nm帶通濾波器(band-pass filter) 於488 nm下激發(excited) (J. Agric. Food Chem. 2011,59, 2284-2290)；使用Cell Lab Quanta流式細胞儀(Beckman Coulter)定量A2058細胞和A375細胞的細胞週期分佈情形，各點的圖式呈現於流式細胞儀分析軟體FlowJo 7.6。藉由計數每個區域的總DNA信號百分比(＞2000個細胞)表示各細胞週期階段，數據為平均值±標準偏差(n = 3)。

結果請參閱第三圖與第四圖，相較於控制組，蝦紅素皆增加A2058細胞和A375細胞停滯於sub-G1期，例如於A2058細胞處理劑量5、25、50、100與125 μg/ml蝦紅素，引發細胞停滯於sub-G1期的比例分別為7.68%、17.95%、33.16%、55.74%與77.43%，代表蝦紅素促使細胞DNA停滯(arrest)並促進黑色素瘤細胞凋亡(apoptosis)；由結果可知蝦紅素可促使黑色素瘤細胞凋亡與DNA斷裂，因此蝦紅素具有作為色素過度沉著相關皮膚病的治療劑的潛力。

實施例二：檢測蝦紅素對於黑色素瘤轉移(metastasis)、遷徙(migration)與侵入(invasion)之影響

(1) 傷口癒合分析(Wound healing assay)

此實驗藉由評估細胞癒合情形以檢測蝦紅素對於黑色素瘤細胞移動(motility)的有效性與細胞遷徙(migration)的能力。此方法參照Pigment Cell Melanoma Res. 2016 Jan;29(1):92-100，將每孔1×10⁵ 細胞數的A2058細胞或A375細胞培養於12孔盤(12-well plate)中，使細胞生長並遷徙至匯聚(shallow confluence)，使用200μl塑膠吸管(plastic pipette)尖端在A2058細胞和A375細胞匯聚培養物上形成約1 mm寬的傷口間隙；並加入0 (控制組)、5、25、50、100與125 μg/ml的蝦紅素培養24小時，利用相位差顯微鏡(TE2000-U, Nikon)觀察傷口區域周圍細胞癒合的情形，並利用TScratch軟體定量傷口未癒合面積(bared zone)，藉以評估蝦紅素對於A2058細胞和A375細胞遷徙能力的影響。

結果請參閱第五A圖與第五B圖，相較於控制組，A2058細胞處理劑量5、25、50、100與125 μg/ml蝦紅素，細胞移動力(motility)相對值分別為87.5、78.1、30.3、13.5與8.4%，以及A375細胞的遷徙能力相對值分別為72.7、50.2、28.2、4.4與0.9%；由結果可知蝦紅素對於A2058細胞和A375細胞皆具有抗遷徙能力(anti-migratory activity)並且具由劑量依存性(dose-dependent)。

(2) 博登細胞侵入分析(Boyden invasion assay)

本實驗藉由transwell分析細胞侵入能力，先將A2058細胞或A375細胞利用無血清培養基(serum-free medium)培養於含有上、下兩層博登腔室的上層(upper part)，並以孔徑大小為8 μm且預塗佈有重組基底膜蛋白質(matrigels)作為基礎基質(basement matrix)的上部***物(ThinCert^TM , Greiner, Frickenhausen, Germany)將上、下兩層做一區隔，於細胞添加指定劑量蝦紅素(5-125μg/ ml)或最終體積僅具有10% FBS的溶劑(控制組)；將細胞培養24小時之後，收集通過濾膜下表面的細胞，利用多聚甲醛(paraformaldehyde)進行細胞固定，並以Giemsa染色並計數細胞。

結果請參閱第六A圖與第六B圖，相較於控制組，蝦紅素處理皆能顯著地抑制黑色素瘤A2058細胞和A375細胞之侵入能力(invasion)，且具有劑量依存性(dose-dependent)。

(3) 基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)表現

由於傷口癒合實驗已顯示蝦紅素具有抗遷徙能力(anti-migratory activity)，而細胞的移動與細胞外基質(extracellular matrix)降解有關，因此進一步地確認蝦紅素對於細胞轉移(metastasis)中相關基質金屬蛋白酶表現的影響。利用西方墨點法(Western blot)檢測有無添加蝦紅素(5或125 μg/ml)培養24小時之A2058細胞和A375細胞，其基質金屬蛋白酶MMP-1、MMP-2和MMP-9的蛋白質表現量。

結果請參閱第七圖，相較於控制組，蝦紅素處理皆能顯著地抑制黑色素瘤A2058細胞和A375細胞中MMP-1、MMP-2和MMP-9的蛋白質表現，且具有劑量依存性(dose-dependent)；由結果可知蝦紅素係透過減少基質金屬蛋白酶的表現達到抑制黑色素瘤細胞轉移的效果。

實施例三：檢測蝦紅素對於黑色素瘤細胞凋亡(apoptosis)之影響

由於前述實驗已知蝦紅素促使黑色素瘤細胞停留於sub-G1期，代表蝦紅素具有誘導黑色素瘤細胞凋亡的能力，因此進一步檢測蝦紅素對於細胞凋亡相關蛋白表現的影響，其中與細胞凋亡或稱第一型細胞程序性死亡(Programmed cell death I)最相關的蛋白質為硫胱胺酸蛋白酶(caspase)。

本實驗利用西方墨點法(Western blot)檢測有無添加蝦紅素處理之A2058細胞和A375細胞，其細胞凋亡作用行刑者(executioner)蛋白Caspase-3和Caspase-7的蛋白質表現量。分別將 0 (控制組)、5、25、50、100與125 μg/ml的蝦紅素加入1 × 10⁶ 的A2058細胞和A375細胞處理24小時；之後，利用裂解緩衝液(lysis buffer) (Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer)萃取細胞中的總蛋白質，再將裂解物(lysates)以12,000 rpm離心30分鐘，並利用二金雞鈉酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白質分析套組(kit)(Pierce, Rockford, IL, USA)量測懸浮液(supernatant)中的蛋白質濃度；透過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離等量的蛋白質，然後將蛋白質電轉移至硝酸纖維素膜(PALL Life Science, Ann Arbor, MI, USA)；於硝酸纖維素膜加入含有5%脫脂奶粉的TBST 緩衝液(TBST 緩衝液包含TBS緩衝液與0.1% Tween 20)進行阻斷作用(blocking) 1小時；加入初級抗體(primary antibody) (Cell Signaling；Beverly, MA)進行反應，再以TBST緩衝液清洗共2次，再加入抗初級抗體之二級抗體(Anti-mouse and anti-rabbit IgG peroxidase-conjugated secondary antibodies) (Pierce；Rockford, IL)；最後，利用化學發光檢測試劑套組(chemiluminescence detection kit) (Amersham, Piscataway, NJ, USA)觀察蛋白質表現訊號。

結果請參閱第八圖，蝦紅素顯著增加A2058細胞和A375細胞內細胞凋亡相關蛋白Caspase-3和Caspase-7的表現量，且具有劑量依存性(dose-dependent)。

利用annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC)/propidium iodide (PI)螢光雙染色法檢測蝦紅素對於黑色素瘤細胞凋亡(apoptosis)機制之影響；將每孔1×10⁶ 細胞數的A2058細胞和A375細胞培養於6孔盤(6-well plate)中，於細胞添加指定劑量蝦紅素(5-125μg/ ml)或最終體積僅具有10% FBS的溶劑(控制組)反應24小時；之後，加入annexin V-FITC (10 μg/mL)/PI (10 μg/mL)進行螢光雙染色，並利用螢光顯微鏡或流式細胞儀觀察細胞螢光表現情形。

結果請參閱第九圖與第十圖， A2058細胞和A375細胞中標記annexin V-FITC/PI雙染的細胞數隨著蝦紅素處理劑量增加，且具有劑量依存性(dose-dependent)，代表黑色素瘤細胞確實呈現細胞凋亡狀態。

實施例四： 利用體內異種移植模式(in vivo xenograft model)檢測蝦紅素對於人類黑色素瘤生長之影響

此實驗藉由異種移植腫瘤分析法(xenograft tumor assay)檢測蝦紅素對於人類黑色素瘤生長之影響，週齡四週的BALB/c nu/nu雌性小鼠係購自國家實驗動物中心(台灣)；用以移植的人類黑色素瘤A2058細胞和A375細胞先經過培養至對數生長期(log phase)，再收集並以1x10⁶ cells/mL的細胞數回溶於PBS緩衝液；之後，以皮下(subcutaneous)注射方式施予小鼠，當平均腫瘤體積達100 mm³ ，將小鼠隨機分組(每組n=6)以施予不同測試物：將0 (對照組)或25 mg/kg蝦紅素以腹腔注射(i.p.)方式每2日1次施予小鼠直至第28天；犧牲動物後，利用測徑器(Vernier calipers)量測腫瘤體積，計算方式為腫瘤體積(Tumor volume)=(w ² xl )/2，其中w 為寬度，l 為腫瘤的直徑長度(mm)；接續以下述公式計算腫瘤生長抑制作用(tumor growth inhibition；TGI)百分比：TGI (%) = [1-(T/C)] x 100%，其中T和C分別代表治療組和對照組的平均腫瘤體積(mean tumor volume)。

結果請參閱第十一圖，相較於對照組，施予25 mg/kg蝦紅素分別降低異種移植黑色素瘤A2058細胞和A375細胞的腫瘤體積達76.0%和82.6%，由結果可知蝦紅素顯著地抑制黑色素瘤細胞的生長活性，達到降低腫瘤體積。

綜上所述，蝦紅素無論在體內(in vivo )和體外(in vitro )實驗皆展現抑制黑色素瘤生長的特性，黑色素瘤為皮膚癌中最具侵襲性的腫瘤，蝦紅素不僅可引發黑色素瘤產生細胞凋亡，亦可抑制黑色素瘤的發展，因此蝦紅素適合應用於抑制黑色素瘤增生、轉移、遷徙與侵入之醫藥品或保健品，達到治療黑色素瘤之功效。

實施例五：含有蝦紅素之益生酵母菌提取物的生物活性

由於蝦紅素的製備成本較高，不適用於量產，因此許多學者試圖以各種微生物模式進行蝦紅素的生產，例如大部分係利用天然微藻，如紅球藻(Haematococcus pluvialis )產生蝦紅素(Photosynth Res. 2010 Nov;106(1-2):155-77)，但此方法具有重金屬汙染和容易受天氣影響之缺失。

在此實施例係藉由乳酒念珠菌(Kluyveromyces marxianus 4G5)製備含有蝦紅素之益生酵母菌(probiotic astaxanthin-producing yeast) (Biotechnol Biofuels. 2012 Jul 27;5(1):53；Bioresour Technol. 2015 May;184:2-8; Bioresour Technol. 2017 Dec;245:899-905)。乳酒念珠菌可被用作為化妝品行業的潛在平台(Chang, Ho et al. 2012, Chang, Thia et al. 2015)，由酵母菌產生的生物活性物質含有豐富且多種被人類所需的營養素。本實驗利用乙醇提取含有蝦紅素之益生酵母菌(probiotic astaxanthin-producing yeast)生物活性物質，以得到一含有蝦紅素的提取物，命名為YEAST 。

(1) 檢測YEAST 對於斑馬魚模式(zebrafish model)之影響

斑馬魚成魚(AB strain zebrafish；Danio rerio )之飼養係遵循Wangta Liu’s實驗室之方法；將雄性成魚和雌性成魚以3：2置於繁殖槽中隔夜飼養，經過一天之後，成魚會受光照期刺激而***和受精。為了檢測YEAST 對於斑馬魚發展階段的毒性，將受精後3天(3 dpf)的幼魚放置於96孔盤(每孔3隻)並浸於含有YEAST 之溶液中(YEAST 飽和溶液稀釋1/2000倍)，其中0.05% DMSO作為控制組，於YEAST 處理過後將幼魚進行拍照。對於YEAST 飲食測試實驗，將受精後6天(6 dpf)之斑馬魚幼魚每日餵食含YEAST 的飲食(1g飼料中含0.1gYEAST )；在餵食期間，觀察斑馬魚每日的存活率、行為和外觀型態變化。

結果請參閱第十二圖，dpi代表以YEAST 浸泡後的時間(the time in days post immersion)，相較於控制組，YEAST 處理的斑馬魚組別其型態並無明顯差異。將斑馬魚浸於YEAST 溶液中，斑馬魚幼魚的存活率為92.3% (n = 39)，顯然對於幼魚的存活率並無特別影響。此外，將6 dpf之斑馬魚餵食含YEAST 的飲食，相較於控制組的存活率為81.5 % (n = 27)，餵食含YEAST 的飲食組別的存活率為100%，顯然可知YEAST 增加斑馬魚的存活率。除此之外，YEAST 對於斑馬魚的行為和外觀型態變化並無影響，對於斑馬魚的發展階段亦無造成毒性。

(2) 檢測YEAST 對於正常大鼠之影響

將週齡六週的Sprague-Dawley公鼠(BioLASCO Taiwan Co., Ltd., Taipei, Taiwan)隨機分成兩組：(1)空白對照組(vehicle control)係每次口服餵食(oral administration) 4 mL純水(n = 6)，以及(2)YEAST 組係每次口服餵食4 mL 的YEAST 溶液(n = 6)；餵食流程為每天一次，一週五天，共進行四週；每週量測並記錄大鼠體重。待實驗完成將動物犧牲後，採集大鼠內臟如腦、心、肺、肝、腎、脾、腎上腺和性器官等進行大量的病理檢查。

(2-1)檢測餵食YEAST 的大鼠體重變化

由表一顯示，相較於空白對照組，餵食YEAST 對於大鼠的體重變化和外觀並無影響，亦無造成其它異常。

表一

(2-2) 檢測高靈敏度C-反應蛋白(High sensitivity CRP)

IgE 、IgG 與CRP皆廣泛應用於作為發炎的臨床指標，餵食YEAST 的大鼠血液生化分析結果如表二，相較於空白對照組，餵食YEAST 對於大鼠的血液生化指標IgE 、IgG 與CRP並無差異。

表二

(3)檢測YEAST 對於小鼠黑色素瘤轉移(melanoma metastasis)之影響

此實驗藉由異種移植腫瘤分析法(xenograft tumor assay)檢測蝦紅素對於人類黑色素瘤生長之影響，由週齡五週的BALB/c裸小鼠(BioLASCO Taiwan Co., Ltd., Taipei, Taiwan)之尾巴靜脈注射4×10⁵ 的B16F10-PKH26腫瘤細胞，實驗後將小鼠麻醉並藉由Xenogen IVIS成像系統發光敏感CCD照相機（Xenogen IVIS Imaging System luminescence-sensitive CCD camera ；Xenogen Corp. CA，USA）成像。 本研究中小鼠分成三組，分別為「黑色素瘤組」、黑色素瘤加YEAST 組(melanoma plusYEAST ；簡稱「餵食YEAST 組」)，和黑色素瘤加蝦紅素組(melanoma plus astaxanthin；簡稱「蝦紅素(25 mg/kg)組」)，其中YEAST (在動物飼料中佔40%)係以餵食方式施予，蝦紅素係以靜脈注射(25 mg/kg ；每5天一次)方式施予。

結果請參閱第十三圖和第十四圖，相較於黑色素瘤組，餵食YEAST 組可以抑制黑色素瘤細胞的肺轉移，提高存活率(n = 4)；另，靜脈注射蝦紅素亦可以抑制黑色素瘤細胞的肺轉移，提高存活率(n = 4)。如第十四圖所示，相較於黑色素瘤組，餵食YEAST 組和蝦紅素(25 mg/kg)組治療後小鼠體重變化維持一定；餵食YEAST 組和蝦紅素(25 mg/kg)組的組織變化情形亦呈現於第十四圖，該等組織包括肺(標記為1)、肝臟(標記為2)、心臟(標記為3)、脾臟(標記為4)，和腎臟(標記為5)。由結果可知，含蝦紅素之YEAST 可顯著地抑制黑色素瘤細胞的生長活性，達到降低腫瘤體積。

(4) 檢測YEAST 對於DPPH自由基清除活性、亞鐵離子螯合能力、還原力與蘑菇酪胺酸酶抑制率之影響

(4-1) 測定DPPH自由基的清除能力

DPPH自由基分析實驗係根據先前研究之方法(Pin-Hui Li; Oxid Med Cell Longev. 2016;2016:2853543; Wang, Zhang et al. J Ethnopharmacol. 2005 Jun 3;99(2):259-64; Chen, Kuo et al.; Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers 41: 129-135)進行測試，並使用100 μM的維生素C作為正對照組；利用UV-vis分光光度計在30分鐘內，每隔10分鐘記錄520 nm處的吸光度，將待測物殘餘DPPH的百分比對照作圖，以獲得抗氧化劑降低DPPH初始濃度的量；計算公式如下：DPPH自由基清除活性(%) = [(控制組吸光值-待測物吸光值)/控制組吸光值] X 100%。

(4-2) 測定亞鐵離子的螯合能力

螯合亞鐵離子能力的實驗係根據先前研究之方法(Pin-Hui Li; Oxid Med Cell Longev. 2016;2016:2853543)進行，當螯合介質(chelating mediator)存在時，會構成Fe²⁺ 複合體(Fe²⁺ -complex)斷裂，導致深紅色的亞鐵離子複合物減少。在此實驗中，使用100 μM 的EDTA作為正對照組，將樣品提取物/標準物加入2 mM FeCl₂ ·4H₂ O (10μL)的溶液中，加入5 mM ferrozine (20μL)劇烈搖晃以開始作用，並將混合物於25℃下作用10分鐘；量測待測物溶液在562 nm處相對於空白控制組的吸光度。計算公式如下：螯合亞鐵離子能力(%) = [(控制組吸光值-待測物吸光值)/控制組吸光值] X 100%。

(4-3) 測定還原力

此實驗係參考Oyaizu方法(Pin-Hui Li; Oxid Med Cell Longev. 2016;2016:2853543)，此方法係透過待測物與2,4,6- tripyridyl-S-triazine Fe(III)-TPTZ複合物進行反應，並於700 nm測定產生深藍色的ferrous Fe(II)-TPTZ複合物的量。在此實驗中，使用100 μM 的3-tert-butyl-4-hydrox-yanisole (BHA)作為正對照組； 先將待測物加入約85 mL PBS (67mM，pH6.8)和2.5 L的20%鐵氰化鉀(potassium ferricyanide，K₃ Fe(CN)₆ )溶液中，於50^o C作用20分鐘，加入160 mL三氯乙酸(10%)混合，並以3,000 xg離心10分鐘；之後，取上層的溶液75 mL與25μL FeCl₃ (2%)混合，並利用96孔盤(96-well plate)在700 nm讀取光密度。

(4-4) 體外(in vitro )測定蘑菇酪胺酸酶抑制率

本實驗主要係根據先前研究之方法(You-Cheng Hseu，Current Pharmaceutical Biotechnology , 16(12), 1120-1126, 2015)。利用分光光度計讀數器(Molecular Devices,CA,USA)在490 nm處，測定96孔盤(96-well plate)中的吸光度，以得知待測物對於酪胺酸酶的抑制活性。在此實驗中，使用100 μM 的熊果素(Arbutin)作為正對照組；利用DMSO溶液溶解待測物(10.0 g/mL)，並與含有2.5 mg/mL L-酪氨酸(L-tyrosine)的50 mM PBS (pH6.8)進行作用；使相同緩衝液中25 U/mL蘑菇酪胺酸(SIGMA)增加，並將混合物於37℃下作用30分鐘；利用下述公式於490 nm處測定酪胺酸酶的抑制活性：蘑菇酪胺酸酶抑制率(%)=[(A-B)-(C-D)]/(A-B) X 100%；其中A 為未加待測物的吸光值(OD₄₉₀ )，B為未加待測物但有加入酪胺酸酶的吸光值(OD₄₉₀ )， C為加入待測物的吸光值(OD₄₉₀ )，以及D為加入待測物但未加入酪胺酸酶的吸光值(OD₄₉₀ )。

結果請參閱表三，相較於Tibicos酵母提取物(TW) (1×)組別的抗氧化能力，不同濃度百分比(%)為0%、1%、2%、3%、4%和10%的YEAST 加入1×TW，分別顯示具有抗氧化能力，且具有劑量依存現象(dose-dependent manner)，抗氧化力隨著YEAST 濃度百分比增加而提升。結果亦顯示，YEAST 具有較高的自由基清除活性、亞鐵離子螯合能力和還原三價鐵離子(ferric)的能力，可知含有蝦紅素的YEAST 具有極佳抗氧化活性。

另一方面，酪胺酸酶(tyrosinase)是涉及黑色素生物合成的最重要酵素之一，為真黑色素(eumelanin)和磷灰質素(pheomelanin)生物合成反應中的速率決定酵素(rate-limiting enzyme)；由表三測試結果，顯示YEAST 可以抑制蘑菇酪胺酸酶的活性。

表三

為了保有化妝品的高生物活性，本實驗將YEAST 進一步包覆於軟膠囊[Tibicos Time Capsule (CTDW)；Genetalks Biotech. Co. Ltd., Taiwan]內，並評估其生物安全性和生物功能。上述軟膠囊主要成分係包括0.35 mL液體護膚品，包括Tibicos酵母提取物(TW)、不含/含蝦紅素(YEAST )、深海水(deep ocean water, DOW)、熊果素(arbutin)、戊二醇(pentylene glycol)、苯氧乙醇(phenoxyethanol)、辛乙二醇(caprylyl glycol)、苯基三甲基聚矽氧烷(phenyl trimethicone)、聚二甲基矽氧烷醇PEG-9聚二甲基矽氧烷(dimethiconol PEG-9 dimethicone)、辛甲基聚矽氧烷(caprylyl methicone)、聚丙烯醯基二甲基牛磺酸鈉(sodium polyacryloyldimethyl taurate)、(和)氫化聚癸烯(hydrogenated polydecene)、(和)十三烷醇聚醚-10 (trideceth-10)、印加果籽油(plukenetia volubilis seed oil)、聚二甲基矽氧烷(dimethicone)和苯基三甲基聚矽氧烷(phenyl trimethicone)。

請參閱表四，結果皆係以平均值(n = 3)呈現，其中「–」表示未測出，「＜10.0」表示結果不具意義，「a」表示使用100 μM的維生素C作為DPPH自由基清除活性測試的正對照組，「b」表示使用100 μM的EDTA作為亞鐵離子螯合能力測試的正對照組，「c」表示使用100 μM的BHA作為還原力測試的正對照組。

根據DPPH自由基清除活性測試結果顯示，0.5倍濃度CTDW和0.5倍濃度CTDW+YEAST 兩個組別分別為31.6 ± 0.4%和45.3 ± 0.4%，而一倍濃度分別提高到39.3 ± 0.1%和51.6 ± 0.2%。亞鐵離子螯合能力測試結果顯示，0.5倍濃度CTDW和0.5倍濃度CTDW+YEAST 兩個組別分別為13.8 ± 0.9%和42.0 ± 0.1%，而一倍濃度分別提高到22.4 ± 0.4%和46.5 ± 0.5%。結果表明CTDW+YEAST 具有比CTDW更好的抗氧化能力。在還原力測試結果顯示，0.5倍濃度CTDW和0.5倍濃度CTDW+YEAST 兩個組別分別為0.87 ± 0.10%和1.18 ± 0.05%，且一倍濃度的CTDW提高到1.27 ± 0.07%，但一倍濃度的CTDW+YEAST 卻與0.5倍濃度CTDW+YEAST 沒有明顯差異。此研究結果亦顯示CTDW具有作為提高生物材料抗氧化能力之保護性容器的潛力，由於CTDW的主要的優點為每一次膠囊劑型均為單一劑量，因此承載於內部之護膚品不會因氧化損傷而變質。

表四

由上述之實施說明可知，本發明與現有技術相較之下，本發明具有以下優點:

1. 本案證實蝦紅素具有抑制人類黑色素瘤增殖、遷徙和侵入能力，可誘導黑色素瘤細胞凋亡。

2. 本案技術可應用於醫藥用品業、生技醫療業，藉以解決黑色素癌難以治療的問題。

綜上所述，本發明之蝦紅素用於製備抑制或治療黑色素瘤之組合物的用途，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。

惟，上述所揭之圖示及說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。

無

第一圖：蝦紅素對於HaCaT細胞與纖維母細胞存活率之影響。

第二圖：蝦紅素對於黑色素瘤A2058與A375細胞存活率之影響。

第三圖：蝦紅素對於黑色素瘤A2058細胞週期分佈之影響。

第四圖：：蝦紅素對於黑色素瘤A375細胞週期分佈之影響。

第五A圖：蝦紅素對於黑色素瘤遷徙影響之細胞示意圖。

第五B圖：蝦紅素對於黑色素瘤遷徙影響之細胞量化分析圖。

第六A圖：蝦紅素對於黑色素瘤侵入影響之細胞染色圖。

第六B圖：蝦紅素對於黑色素瘤侵入影響之細胞量化分析圖。

第七圖：蝦紅素對於黑色素瘤細胞中基質金屬蛋白酶(MMPs)之影響。

第八圖：蝦紅素對於黑色素瘤細胞凋亡蛋白之影響。

第九圖：蝦紅素對於黑色素瘤A2058細胞轉移之影響。

第十圖：蝦紅素對於黑色素瘤A375細胞轉移之影響。

第十一圖：蝦紅素對於異種移植人類黑色素瘤之生長影響。

第十二圖：含蝦紅素之YEAST 對於斑馬魚模式(zebrafish model)之影響。

第十三圖：含蝦紅素之YEAST 對於小鼠黑色素瘤之影響。

第十四圖：含蝦紅素之YEAST 對於小鼠體重維持與組織變化之影響。

Claims (10)

1. 一種蝦紅素(astaxanthin)用於製備抑制黑色素瘤(melanoma)之組合物的用途。
2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該抑制黑色素瘤之組合物係抑制黑色素瘤增生及/或轉移(metastasis)之醫藥品或保健品。
3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該抑制黑色素瘤之組合物係抑制黑色素瘤遷徙(migration)之醫藥品或保健品。
4. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該抑制黑色素瘤之組合物係抑制黑色素瘤侵入(invasion) 之醫藥品或保健品。
5. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該抑制黑色素瘤之組合物係進一步包含一藥學上可接受之載劑。
6. 如申請專利範圍第5項所述之用途，其中該藥學上可接受之載劑係選自於一或多種由溶劑、緩衝液、乳化劑、懸浮劑、分解劑、崩解劑、分散劑、黏結劑、賦形劑、安定劑、螯合劑、稀釋劑、膠凝劑、防腐劑、潤濕劑、潤滑劑、吸收延遲劑以及脂質體所構成之群組中的試劑。
7. 一種蝦紅素(astaxanthin)用於製備治療黑色素瘤(melanoma)之醫藥品的用途。
8. 如申請專利範圍第7項所述之用途，其中該治療黑色素瘤之醫藥品係進一步包含一藥學上可接受之載劑。
9. 如申請專利範圍第8項所述之用途，其中該藥學上可接受之載劑係選自於一或多種由溶劑、緩衝液、乳化劑、懸浮劑、分解劑、崩解劑、分散劑、黏結劑、賦形劑、安定劑、螯合劑、稀釋劑、膠凝劑、防腐劑、潤濕劑、潤滑劑、吸收延遲劑以及脂質體所構成之群組中的試劑。
10. 如申請專利範圍第7項所述之用途，其中該治療黑色素瘤之醫藥品係呈一口服的藥物劑型或非經腸道的藥物劑型。