CN107737124A - 一种姜黄素类似物在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

一种姜黄素类似物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的姜黄素类似物的结构如下式所示，所述的抗肿瘤药物用于选择性杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无毒性，可以作为一种有潜力的抗肿瘤药物。

Description

一种姜黄素类似物在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明属医药技术领域，具体涉及两种化合物CAA和CAI在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
肿瘤是引起人类死亡的主要原因之一，其发病率和致死率总体呈每年上升的趋势。统计显示，自2010年起，恶性肿瘤己成为城乡居民死亡首要死因。可见肿瘤的预防和治疗十分迫切。药物治疗是肿瘤的主要治疗手段之一。目前，虽然开发出了众多抗肿瘤药物，有效地延长了患者的生命或者提高了患者的生存质量。但肿瘤的药物研究和开发还面临巨大挑战，如抗肿瘤药物多为细胞毒药物，其副作用明显，限制了这些药物的临床应用。近二十年来，肿瘤的靶向疗法得到了飞速的发展，诸如伊马替尼、曲妥珠单抗等靶向肿瘤信号蛋白的药物在临床研究中展现出极具前景的治疗效果以及较低的毒副作用。然而，获得性耐药的出现及肿瘤基因组的多变性，使得靶向疗法同样面临着巨大的挑战。
越来越多的研究结果证明靶向肿瘤独有的生化特性变化，有望克服并解决获得性耐药这一顽固性难题。已有研究表明，恶性肿瘤细胞中的活性氧簇(Reactive oxygenspecies，ROS)的水平远远超过正常细胞，从而造成了肿瘤细胞过度氧化应激的现象。肿瘤细胞中ROS的增加可能对肿瘤的发生、发展有着重要作用，适量的ROS有助于肿瘤细胞的增殖与分化。然而，过量的ROS会杀伤肿瘤细胞。肿瘤细胞长期处于异常氧化应激的条件下，产生了对内源性ROS的耐受性，但是对外源性ROS的攻击反而变得比正常细胞还要敏感。由此，肿瘤细胞内氧化还原内环境的改变，造成了肿瘤细胞与正常细胞的区别，为促ROS生成的肿瘤细胞选择性杀伤药物的开发提供了依据。
本发明人长期致力于姜黄素类似物(Curcumin Analogs)的结构改造研究及其抗肿瘤活性筛选，从数百种化合物中筛选出了两种特定的分子姜黄素类似物A(CurcuminAnalogs A，CAA)和姜黄素类似物I(Curcumin Analogs I，CAI)，其针对某些特定的癌症具有十分优异的药效。此外，我们针对其药理作用机制展开了研究，发现其对于肿瘤细胞的抑制作用是依赖于ROS的产生的。并且，为了提高化合物的抗肿瘤作用，我们进一步研究了CAA、CAI联用荜茇酰胺(Piperlongumine，PL，一种ROS诱导剂)对其抗肿瘤活性的影响。结果证明了CAA和CAI对于肿瘤细胞有较好的选择性细胞毒作用，而对正常细胞无显著毒副作用。而联用PL对化合物具有抗肿瘤增敏作用。
发明内容
本发明目的在于提供一种选择性抗肿瘤姜黄素类似物的合成与应用，该抗肿瘤姜黄素类似物对肿瘤细胞具有较好的抑制作用，同时，对正常细胞无显著毒副作用。
一种姜黄素类似物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的姜黄素类似物的结构如下式所示：
所述的抗肿瘤药物用于选择性杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无毒性，具体合成方法见实施例1和实施例2。
作为优选，所述的姜黄素类似物通过提高细胞ROS水平，激活氧化应激而凋亡来选择性杀伤肿瘤细胞。
作为优选，所述的姜黄素类似物通过激活caspase-3、caspase-8和caspase-9来选择性杀伤肿瘤细胞。
作为优选，所述的肿瘤为淋巴瘤、乳腺癌或/和结肠癌。
优选本发明的肿瘤不是所有肿瘤，而是特定的肿瘤，如通过特定机制而能够诱导凋亡的肿瘤。如实施例3所述，优选所述肿瘤细胞是化合物CAA和CAI能抑制增殖的细胞，包括人组织细胞淋巴瘤U937细胞、人血液肿瘤细胞(T淋巴细胞白血病细胞E6-1、人乳腺癌细胞(三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231、MDA-MB-468)、人炎性乳腺癌SUM149细胞和人结肠癌细胞(HCT-116)。
机制研究结果表明(实施例4-6)，CAA和CAI的体外诱导肿瘤细胞凋亡作用是通过调节线粒体氧化应激信号通路所导致的。CAA和CAI可以诱导线粒体产生氧化应激，从而激活Caspase-3/8/9，并显著诱导肿瘤细胞凋亡。重要的是CAA和CAI对正常非肿瘤细胞不具有显著的毒性，即该化合物具有选择性杀伤肿瘤的作用。作为优选，所述的正常细胞选自人正常成纤维细胞NHF细胞、人外周血液单核细胞PBMCs细胞及人正常结肠粘膜细胞NCM 460细胞。
此外，体外将化合物CAA、CAI分别与多种临床抗肿瘤药物联用，能发挥协同抗肿瘤的药效。根据实施例7，联用CAA与荜茇酰胺(Piperlongumine，PL)，可在较低浓度明显增强U-937、E6-1、SUM149、和MDA-MB-231等细胞发生凋亡；并且在联合用药情况下，对正常细胞NHF、PBMCs、NCM 460细胞不会造成毒性。作为优选，所述的抗肿瘤药物包含姜黄素类似物和荜茇酰胺的组合。
此外，联用CAA、CAI后，有效地提高了FOLFOX疗法对结肠癌细胞系HCT116的最大疗效(实施例7)。作为优选，所述的抗肿瘤药物在治疗结肠癌时，所述的姜黄素类似物作为FOLFOX疗法增敏剂使用。
作为优选，所述的姜黄素类似物为CAA，用于抑制裸鼠肿瘤细胞移植瘤的生长。
作为优选，所述肿瘤细胞选自慢性粒细胞性白血病MV-4-11细胞、人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞。
作为优选，所述的抗肿瘤药物用于抑制肿瘤细胞增殖。
作为优选，所述肿瘤细胞选自人组织细胞淋巴瘤U937细胞、人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞以及人结肠癌HCT116细胞。
本发明中涉及的化合物CAA可以以抗肿瘤药物组合物的形式存在，所述组合物含有治疗有效量的化合物CAA与PL，以及药学上可接受的载体。
上文所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙/镁、聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
本发明可以组合物的形式通过口服，鼻吸入、直肠或者肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。
本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。
在体内活性中，CAA对特定肿瘤具有极强的抑制作用。在本发明的一个具体实施方式中，所述肿瘤中的细胞是能通过激活肿瘤组织中的Caspase信号通路而诱导肿瘤细胞产生凋亡的(实施例8)。
附图说明
图1为CAA和CAI的化学合成示意图。
图2为CAA和CAI剂量依赖性抑制多种恶性肿瘤的增殖。WST-1法检测药物对多种肿瘤细胞生长的影响。检测的肿瘤细胞包括：M4粒-单核细胞白血病细胞MV-4-11(A)、非小细胞肺癌细胞NCI-H23(B)、人骨肉瘤细胞Saos-2(C)、T淋巴细胞白血病细胞E6-1(D)、非小细胞肺癌细胞A549(E)、人骨肉瘤细胞MG-63(F)、人组织细胞淋巴瘤细胞U-937(G)、人结肠癌细胞HCT-116(H)、三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231(J)、三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-468)。
图3为CAA和CAI选择性诱导多种肿瘤细胞发生凋亡，对正常细胞没有显著毒性。使用Tali成像型多色细胞计数仪，检测化合物对多种细胞凋亡的影响，检测的细胞包括：T淋巴细胞白血病细胞E6-1(A)、人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231(B)、性乳腺癌细胞SUM149(C)、人结肠癌细胞HCT-116(D)、人成纤维细胞系NHF(F)、人非肿瘤来源乳腺上皮细胞MCF10A(G)、人外周血单核细胞PBMCs细胞(H)、人结肠粘膜细胞NCM460(I)。染色细胞在荧光显微镜下检测凋亡情况(E-J)。
图4为CAA和CAI通过调节线粒体氧化应激信号通路而诱导肿瘤细胞发生凋亡。(A-C)TMRM法检测化合物CAA和CAI对T淋巴细胞白血病细胞E6-1(A)、人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231(B)和人成纤维细胞系NHF(C)细胞线粒体膜电位稳态的影响。(D)E6-1细胞TMRM和Hoechst染色结果。(E)NHF细胞TMRM和Hoechst染色结果。(F)E6-1细胞药物处理后，Westernblot法检测细胞色素c从胞浆释放的情况。(G-H)Western blot法检测凋亡相关蛋白在E6-1细胞中的表达。
图5为CAA和CAI对人T淋巴细胞白血病E6-1细胞中Caspase-3、8、9、λ-H2AX的激活。1.2×106个肿瘤细胞用1640培养液培养于37℃，24小时后更新培养液。加入不同浓度的CAA和CAI和姜黄素，以多柔比星为阳性对照，并设置加入NAC以判断化合物诱导凋亡的机制，处理细胞24小时后收集细胞提取总蛋白，用Western Blot分别检测procaspase-3、caspase-3、procaspase-8、caspase-8、procaspase-9、caspase-9和λ-H2AX的含量，β-actin作为校准蛋白。
图6联用CAA可有效提高荜茇酰胺(PL)的抗白血病(A、B)及乳腺癌(C、D)的作用，这种增强效果因NAC的加入被完全抑制，这种化合物联用明显增强抗肿瘤活性，但对正常细胞影响较小(E-G)。
图7FOLFOX作为重要的一种结肠癌疗法，加入低浓度(0.5μM CAA、1μM CAI)化合物，即可对FOLFOX疗法起到良好的增敏作用。
图8CAA和CAI体内抗肿瘤效果。(A)CAA有效抑制慢性粒细胞性白血病MV-4-11细胞异种移植瘤的生长，而对小鼠体重无影响。(B)CAA显著抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞异种移植瘤的生长。
具体实施方式
本发明在以下的实施例中进一步说明。这些实施例只是为了说明的本发明的目的，而不是用来限制本发明的范围。
实施例1 CAA的合成
将10mmol 3,4,5-三甲氧基苯甲醛、5mmol N-甲基-4-哌啶酮溶于10mL无水乙醇中，在冰水浴条件下(5-8℃)搅拌10min，溶液无变化。称取氢氧化钠固体40g溶于60ml蒸馏水，配置成40％(w/w)的氢氧化钠溶液。边搅拌边缓慢滴加40％氢氧化钠溶液1.0mL于反应溶液中，搅拌反应2h后，出现大量不溶的淡黄色沉淀，用TLC检测反应液，至254nm紫外灯下，原料3,4,5-三甲氧基苯甲醛的黑色斑点不再变化，365nm下产物斑点明显。停止反应，将反应液过滤，产物先用水洗，随后用10％乙醇洗两次。将固体粉末拌样，硅胶柱层析法纯化，流动相为石油醚：乙酸乙酯＝4:1至2:1，梯度洗脱。旋去溶剂后，30℃下真空干燥过夜后得(3E,5E)-1-甲基-3,5-二(3,4,5-三甲氧基苯亚甲基)哌啶-4-酮，黄色粉末，收率16.9％，熔点139.55～142.4℃。1H-NMR(CDCl3),δ:7.786(s,2H,Ar-CH＝C×2),6.649(s,4H,Ar-H2×2,Ar-H6×2),3.959(s,6H,4-OCH3×2),3.916(s,12H,3-OCH3×2,5-OCH3×2),3.849(s,4H,CH2-N-CH2),2.509(s,3H,N-CH3).ESI-MS m/z:470.0(M+1)+,calcd for C26H31NO7:469.53。
具体合成路线见图1。
实施例2 CAI的合成
先将5mmol哌啶酮盐酸盐一水合物溶于2ml蒸馏水中，加入10mmol2,3-二甲氧基苯甲醛后，倒入10mL无水乙醇溶解，在冰水浴条件下(5-8℃)搅拌10min，溶液无变化。称取氢氧化钠固体40g溶于60ml蒸馏水，配置成40％(w/w)的氢氧化钠溶液。边搅拌边缓慢滴加40％氢氧化钠溶液1.5mL于反应溶液中，搅拌反应2h后，出现大量不溶的黄色沉淀，用TLC检测反应液，至254nm紫外灯下，原料2,3-二甲氧基苯甲醛的黑色斑点不再变化，365nm下产物斑点明显。停止反应，将反应液过滤，产物先用水洗，随后用10％乙醇洗两次。将固体粉末拌样，硅胶柱层析法纯化，流动相为石油醚：乙酸乙酯＝4:1至2:1，梯度洗脱。旋去溶剂后，30℃下真空干燥过夜后得黄色粉末状产物(3E,5E)-3,5-二(2,3-二甲氧基苯亚甲基)哌啶-4-酮，橙黄色粉末，收率27.36％，熔点70.2～76.0℃。1H-NMR(CDCl3)δ:7.978(2H,s,Ar-CH×2),7.068(2H,t,J＝8.0Hz,Ar-H2×2),6.947(2H,d,J＝8.0Hz,Ar-H3×2),6.815(2H,d,J＝7.5Hz,Ar-H4×2),4.025(4H,s,N-CH2×2),3.887(6H,s,2-O-CH3×2),3.834(6H,s,3-O-CH3×2),1.744(1H,s,-NH).ESI-MS m/z:396.3(M+1)+,calcd for C23H25NO5:395.45。
具体合成路线见图1。
实施例3 CAA和CAI剂量依赖性多种人源恶性肿瘤的增殖
人血液肿瘤细胞株(T淋巴细胞白血病细胞E6-1、M4粒-单核细胞白血病细胞MV-4-11、人组织细胞淋巴瘤细胞U-937)、人乳腺癌细胞株(三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231、MDA-MB-468)、人骨肉瘤细胞株(MG-63、Saos-2)、非小细胞肺癌细胞株(NCI-H23、A549)和人结肠癌细胞株(HCT-116)，均来源自美国细胞、菌种库(ATCC)。细胞接种于96孔培养板中，细胞悬液为含10％热灭活胎牛血清，10mg/mL庆大霉素的1640或DMEM培养基，每孔加入细胞密度为5000的细胞。于37℃含5％CO2饱和湿度的培养箱中培养。24h后把溶于DMSO的不同浓度化合物加入培养板中，孵育48h，终止培养前4h每孔加入5mg/mL水溶性四唑盐(WST-1)20μL。孵育完毕，加水充分溶解，在酶联免疫检测仪450nm波长下测定各孔光吸收值(Abs)，空白对照为DMSO组。以同一药物的不同浓度对肿瘤细胞生长率作图，可得到剂量反应曲线，结果见附图2。可见CAA、CAI对于多株不同类型的肿瘤细胞，皆能发挥良好的增殖抑制作用。
实施例4 CAA、CAI选择性诱导多种肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞没有显著毒性作用
人血液肿瘤细胞株(T淋巴细胞白血病细胞E6-1)、人三阴性乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)、人骨肉瘤细胞株(MG-63、Saos-2)、非小细胞肺癌细胞株(NCI-H23、A549)和人结肠癌细胞株(HCT-116)均来源自美国细胞、菌种库(ATCC)、炎性乳腺癌细胞SUM149由美国Stephen Ethier博士馈赠(Wayne State University,Detroit,MI,USA)；正常细胞株包括人成纤维细胞系(NHF，购于Coriell institute for Medical Research，美国)、人结肠粘膜细胞系(NCM460，购于INCELL公司，美国)、人非肿瘤来源乳腺上皮细胞(MCF10A，购于美国ATCC公司)。人外周血单核细胞PBMCs细胞，按照学校伦理指导，从加拿大温莎大学的自愿健康志愿者体内提取并分离。
细胞接种于6孔培养板中，密度为2.75×105个/孔，培养过夜后，收集细胞，离心，把溶于DMSO的CAA、CAI、姜黄素或紫杉醇(TAX)或多柔比星(DOX)加入培养板中，孵育48或72h。用1×PBS缓冲液冲洗三次，再使细胞悬浮于Annexin V binding buffer(10mM HEPES,140mM NaCl,2.5mM CaCl2,pH 7.4)。然后在37℃用Annexin V(Life Technologies Inc,商品号：A13201,Burlington,Canada)和propidium iodide(Life Technologies Inc,商品号：P3566,Burlington,Canada)染色15分钟后，使用成像型多色细胞计数仪(LifeTechnologies Inc,商品号：T10796，Burlington，Canada)定量分析结果。
使用绿色荧光(excitation 458nm；emission 525/20nm)和红色荧光(excitation530nm；emission 585nm)通道定量分析结果，细胞群分别被表示为早期凋亡细胞(绿色)、晚期凋亡细胞(绿色和红色结合，即黄色)和坏死细胞(红色)。结果(附图3A-E)显示CAA、CAI和姜黄素以剂量依赖性方式诱导E6-1、MDA-MB-231、SUM149和HCT119细胞凋亡，并且CAA、CAI与姜黄素相比，能在更低的给药剂量发挥诱导肿瘤凋亡的效果，表明CAA、CAI的效果要优于先导姜黄素，并略优于相同剂量的TAX和DOX。重要的是，化合物CAA、CAI对正常人体细胞株NHF、MCF10A、PBMCs和NCM-460没有显著的诱导凋亡作用，根据附图3F-J，CAA、CAII对NCM460细胞的毒性作用低于DOX，而对NHF细胞的毒性作用低于TAX。
实施例5 CAA、CAI是通过调节线粒体氧化应激信号通路而造成肿瘤细胞诱导凋亡
线粒体在呼吸氧化过程中，在内膜两侧造成质子及其他离子浓度的不对称分布而形成线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential，MMP)。线粒体谷胱甘肽的氧化及活性氧簇的增加，将导致MMP的去极化，使得膜通道孔的开放，细胞色素C(Cytochrome C，Cyto C)等内容物释放到胞质内，MMP被破坏。近年来研究表明，MMP在细胞凋亡早期病理变化以前就开始下降，该过程早于DNA片段化。因此，我们采用两种不同的染料Tetramethylrhodamine methyl ester(TMRM)和Hoechst与细胞作用，TMRM进入线粒体后，呈现强烈红色荧光，当MMP被破坏后，膜通道孔开放，荧光消失，而Hoechst则可以与凋亡细胞的DNA直接结合，呈碎块状致密浓染蓝色荧光，以此分析了CAA、CAI是否可以引起MMP的破坏，从而导致肿瘤细胞凋亡。
T淋巴细胞白血病细胞E6-1、人三阴性乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)、人成纤维细胞系(NHF)与CAA、CAI、姜黄素等药物(E6-1：0.5μM紫杉醇、1μM CAA、2μM CAI、10μM姜黄素以及空白对照DMSO；NHF：1μM多柔比星、1μM CAA、2μM CAI、10μM姜黄素以及空白对照DMSO)孵育48h后，使用TMRM法检测细胞的线粒体膜势能变化。结果以TMRM阳性细胞的比率进行定量分析。检测完的细胞样本，进一步用10μM的Hoechst染料进行复染45分钟，倒置荧光显微镜下观察结果(Leica Microsystems，Wetzlar，Germany)。
图4表明，在E6-1和MDA-MB-231细胞的结果中，DMSO对照组出现了较为明显的TMRM阳性结果(红色荧光较为强烈)，说明不加药时，细胞MMP正常；在加入1μM CAA后，基本观察不到红色荧光，MMP完全被破坏；此外，加入2μM CAI也能起到较好的MMP破坏效果。在Hoechst染色结果方面，除加入姜黄素组之外，其余各组均出现明显胞核碎裂的凋亡情况。以上现象说明了CAA、CAI对MMP的破坏作用，继而导致肿瘤细胞凋亡。而对于NHF细胞，TMRM染色和Hoechst染色结果显示CAA、CAI对正常细胞的MMP改变及凋亡情况方面基本无影响(图4A-E)。
线粒体内活性氧簇的增加，是导致MMP消失，细胞凋亡的重要原因。通过检测CAA、CAI对E6-1细胞、MV-4-11细胞TMRM阳性结果的影响，并加入抗氧化剂NAC，由此CAA、CAI对于MMP的破坏作用是否由于其对胞内ROS的堆积作用引起。由结果可知(附图4A-E)，CAA、CAI对肿瘤细胞TMRM阳性率的降低作用，会明显被NAC的加入而逆转，说明了化合物对于MMP的破坏作用就是通过ROS的积累发挥的。
MMP被破坏后，线粒体内的Cyto C被释放入胞质；琥珀酸脱氢酶A(Succinatedehydrogenase-A，SDHA)是反映线粒体功能的标志酶，MMP失去稳态后，细胞发生凋亡，导致SDHA活力下降。因此，为了进一步确认CAA、CAI对于肿瘤细胞MMP的作用，我们进一步检测了这两个化合物对E6-1细胞胞质和线粒体内Cyto C与SDHA表达情况的影响。将E6-1分别与1μM多柔比星、1μM CAA、2μM CAI、10μM姜黄素以及空白对照DMSO共孵育24小时，按照操作手册，使用线粒体分离试剂盒(Abcam Canada，商品号：ab110170，Toronto，Canada)对细胞培养液进行胞质和线粒体的分离，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度后，进行Westren Blot分析。结果如附图4F所示，与空白DMSO组对比，CAA、CAI组胞质内Cyto C表达量明显增加，SDHA则明显减少。与之对应，线粒体内的Cyto C和SDHA则与胞质内情况呈相反变化。由此，进一步确证了CAA、CAI对MMP稳态的干扰作用，从而导致肿瘤细胞的凋亡(图4G-H)。
实施例6 CAA、CAI对Caspase-3/8/9及λ-H2AX的激活
Caspase通道是重要的促细胞凋亡信号蛋白。我们检测了CAA、CAI对E6-1细胞内caspase-3、caspase-8和caspase-9的影响。如附图5，caspase-3、caspase-8和caspase-9的活性形式分别在1μM CAA、2μM CAI处理24h后被明显激活，而其前体procaspase-3、procaspase-8及procaspase-9表达量均明显减少，说明Caspase可能是CAA、CAI诱导细胞凋亡的重要信号转导途径。加入NAC后，化合物的caspase激活效果消失。
λ-H2AX，是组蛋白家族的一员，其主要功能为基因转录调控、DNA损伤修复、细胞周期调控等。作为一种重要的抑癌蛋白，其DNA损伤修复的能力确保了细胞的正常凋亡，不至于发生癌变。因此，我们还进一步检测了CAA、CAI对λ-H2AX的激活情况。由附图5可见，1μM的CAA、2μM的CAI对λ-H2AX已能发挥明显的激活作用，其作用强度与10μM姜黄素相同。同样的，这种激活作用也会因NAC的加入而被完全拮抗，再一次验证了化合物的抗肿瘤活性是依赖于ROS的产生。
实施例7 联用CAA显著增强PL、FOLFOX药物组合物的抗肿瘤活性，而不影响其对正常细胞的低毒性
荜茇酰胺(Piperlongumine，PL)是分离自荜茇的生物碱类抗肿瘤化合物，可通过促进ROS的生成，导致PI3K/Akt/mTOR、JAK/STAT等细胞增殖相关信号通路的抑制，对于包括乳腺癌、***癌、胃癌等多种恶性肿瘤有选择性杀伤作用。因此，我们进一步将CAA和PL联用，检测联用两个相同作用机制的化合物是否能起到药理活性的增效作用，方法：同实施例4。如附图6A、6B所示，在仅仅加入2μM PL或者0.5μM CAA的情况下，E6-1、U937细胞发生一定程度凋亡，但是较为微弱。在同时加入PL和CAA后，细胞凋亡程度增强，并且明显大于单加两个化合物时效果的总和。相同的，这种增效作用在CAA联和PL治疗乳腺癌SUM149、MDA-MB-231细胞的实验中同样存在(附图6C-D)。而对于正常外周血单核细胞系PBMCs、人成纤维细胞系NHF以及结肠粘膜细胞NCM460细胞，联用CAA和PL与单加PL的诱导凋亡效果基本相同(附图6E-G)。由此，说明了联用CAA可以维持对正常细胞低毒性的同时，显著极大地增强PL对肿瘤细胞的抑制作用。
此外，我们进一步检测了CAA对于临床上常用的化疗药物的增敏作用。FOLFOX药物组合物，是一种临床常用药物5-氟尿嘧啶(5-FU)、亚叶酸钙(FA)以及奥沙利铂(OX)三药联用的肿瘤治疗方案，目前在结肠癌的术后治疗较为常用。其毒性在于神经毒性、静脉炎、骨髓抑制，临床用药需严格控制剂量，开发其增敏剂在FOLFOX的临床使用中有重要意义。因此，在本研究中，我们首先检测了FOLFOX疗法的最大有效剂量。由附图7可知，12.5μM 5-FU、5μM FA和1.25μM OX的药物组合对HCT-116细胞已经到达最大抑制活性，即使将5-FU、FA的浓度加大，其作用亦没有任何变化(绿色柱形的高度代表早期凋亡细胞数量，加大药物浓度，其高度亦无变化)。此时，加入0.5μM低浓度的CAA，其抗肿瘤活性明显增强，超过了50μM5-FU、10μM FA和1.25μM OX组合的治疗效果。相同的，1μM CAI也能明显增加FOLFOX的疗效。由此，证明了CAA、CAI对于临床使用的化疗药物也有很好的增敏作用。
实施例8 CAA明显抑制小鼠MV-4-11慢性粒单核细胞白血病及MDA-MB-231三阴性乳腺癌移植瘤的生长
人慢性粒单核细胞白血病MV-4-11细胞，来源自美国细胞、菌种库(ATCC)。采用Iscove's Modified Dulbecco's Medium培养(ATCC，商品号：30-2005，Manassas，USA)。移植于CD-1裸鼠，雄性，来源于Charles River Laboratories，QC，Canada；
人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞(ATCC,商品号：HTB-26&HTB-132,Manassas,VA,USA)采用Dulbecco’s Modified Eagles培养(Sigma-Aldrich,Mississauga,Canada)，移植于雌性CD-1裸鼠(Charles River Laboratories,QC,Canada)。
小鼠按照温莎大学动物饲养管理委员会培养规范(University of WindsorAnimal Care Committee，AUPP#14-15)进行饲养，每天12小时的光照/黑暗条件下培养。细胞溶液与Basement Membrane Matrix(VWR International，商品号：47743-715，Mississauga,Canada)混合后形成0.2mL体积的注射液，无菌剥离皮下接种，MV-4-11细胞：每鼠双侧腋下皮下接种5×106细胞/0.2mL；MDA-MB-231细胞：每鼠单侧腋下皮下接种2×106细胞/0.2mL。分别设给药组与DMSO空白对照组，其中注射姜黄素组4只，给予CAA组与溶剂对照组每组5只。给药方式为皮下注射，给药剂量为：每300mLPBS 7mg/kg化合物(MV-4-11移植瘤)、每300mLPBS 3mg/kg化合物(MDA-MB-231移植瘤)或相同体积浓度的DMSO，每周给药三次，给药五周。
接种肿瘤细胞后，开始记录肿瘤体积的大小及小鼠体重的变化。肿瘤体积计算公式如下：Volume＝1/2(Length×Width2)。通过实验结果(附图8A)可以看出，给予相同剂量治疗MV-4-11细胞移植瘤，CAA的治疗效果要明显优于姜黄素，并且给药期间，两组给药组与对照组小鼠的体重呈相同的微弱增加趋势，说明姜黄素和CAA对小鼠并无毒副作用。剥离肿瘤的照片更直观展现了CAA对MV-4-11移植瘤的强烈抑制作用。而在MDA-MB-231细胞移植瘤模型中(附图8B)，CAA同样强效地抑制肿瘤生长，从给药开始，CAA几乎完全抑制了肿瘤的生长。CAA对小鼠的体重增长无影响。剥离后肿瘤的照片直观展现了CAA优秀的抗乳腺癌体内活性。

Claims (12)

1.一种姜黄素类似物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的姜黄素类似物的结构如下式所示：
所述的抗肿瘤药物用于选择性杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无毒性。
2.根据权利要求1所述的姜黄素类似物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的姜黄素类似物通过提高细胞ROS水平，激活氧化应激而凋亡来选择性杀伤肿瘤细胞。
3.根据权利要求1所述的姜黄素类似物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的姜黄素类似物通过激活caspase-3、caspase-8和caspase-9来选择性杀伤肿瘤细胞。
4.根据权利要求1～3任一项所述的姜黄素类似物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤为淋巴瘤、乳腺癌、结肠癌。
5.根据权利要求4所述的姜黄素类似物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞选自人组织细胞淋巴瘤U937细胞、人T淋巴细胞白血病E6-1细胞、人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞、人炎性乳腺癌SUM149细胞以及人结肠癌HCT116细胞。
6.根据权利要求1所述的姜黄素类似物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的正常细胞选自人正常成纤维细胞NHF细胞、人外周血液单核细胞PBMCs细胞及人正常结肠粘膜细胞NCM 460细胞。
7.根据权利要求1所述的姜黄素类似物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物包含姜黄素类似物和荜茇酰胺的组合。
8.根据权利要求7所述的姜黄素类似物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物在治疗结肠癌时，所述的姜黄素类似物作为FOLFOX疗法增敏剂使用。
9.根据权利要求1所述的姜黄素类似物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的姜黄素类似物为CAA，用于抑制裸鼠肿瘤细胞移植瘤的生长。
10.根据权利要求9所述的姜黄素类似物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞选自慢性粒细胞性白血病MV-4-11细胞、人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞。
11.根据权利要求1所述的姜黄素类似物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物用于抑制肿瘤细胞增殖。
12.根据权利要求11所述的姜黄素类似物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞选自人组织细胞淋巴瘤U937细胞、人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞以及人结肠癌HCT116细胞。
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