CN109750004A - 一株貉细小病毒性肠炎病毒ln株、貉细小病毒性肠炎灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一株貉细小病毒性肠炎病毒LN株、貉细小病毒性肠炎灭活疫苗及其制备方法，属于兽用生物制品领域。本发明的一株貉细小病毒性肠炎病毒LN株，该毒株已于2018年12月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.16627。本发明的貉细小病毒性肠炎灭活疫苗其有效活性成分为貉细小病毒性肠炎病毒LN株。本发明采用细胞全悬浮技术制备貉细小病毒性肠炎灭活疫苗，可抵御貉细小病毒强毒攻击，保护率在91.7％以上，能有效预防貉病毒性肠炎，免疫有效期6个月，解决了现有疫苗免疫貉子存在的效果不理想，采用转瓶培养疫苗存在的过程复杂、周期长、质量不稳定、批间差异大、副反应高的问题。

Description

一株貉细小病毒性肠炎病毒LN株、貉细小病毒性肠炎灭活疫 苗及其制备方法

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一株貉细小病毒性肠炎病毒LN株、貉细小病毒性肠炎灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

貉细小病毒性肠炎是一种急性、高度接触性传染病，近年来已经成为严重危害貉子养殖业的重要传染病之一。1984年貉细小病毒性肠炎在我国黑龙江省首次发生。临床主要以体温升高，达40度以上；精神沉郁，呕吐，食欲减退或废绝，渴欲增加；剧烈腹泻，排出混有血液、粘液的水样便或混有肠黏膜的稀便，有的出现管型便等。貉子细小病毒性肠炎连年愈演愈烈，目前国内还没有专门针对貉细小病毒性肠炎的疫苗，大多采用水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗或犬细小病弱毒疫苗进行免疫，虽然抗原在免疫学上有一定的交叉免疫保护，但免疫效果不够理想。

另外，不论传统灭活疫苗还是弱毒疫苗，其制备工艺采用的都是转瓶培养，培养过程繁琐复杂、周期长、劳动强度大、费工费力，且质量不稳定，批间差异大，注射动物后副反应较高。因此，开发安全、有效的貉细小病毒性肠炎疫苗，是行业和市场的迫切需求，具有广阔的市场应用价值，对防控貉子乃至毛皮动物细小病毒性肠炎具有重要意义。

发明内容

为了解决目前大多采用水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗或犬细小病弱毒疫苗对貉子进行免疫存在的免疫效果不理想，且采用转瓶培养疫苗存在的过程复杂、周期长、费时费力、质量不稳定、批间差异大、副反应高的问题，本发明提供一株貉细小病毒性肠炎病毒LN株、貉细小病毒性肠炎灭活疫苗及其制备方法。

本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：

本发明的一株貉细小病毒性肠炎病毒LN株，该毒株已于2018年12月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.16627。

本发明的一种菌剂，其有效活性成分为上述的一株貉细小病毒性肠炎病毒LN株。

本发明的一种貉细小病毒性肠炎灭活疫苗，其有效活性成分为上述的一株貉细小病毒性肠炎病毒LN株。

本发明的一种貉细小病毒性肠炎灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、悬浮细胞复苏

对F81-TY株细胞进行复苏；

步骤二、悬浮细胞传代

将步骤一复苏后的F81-TY株细胞用低血清悬浮培养液进行扩大培养，得到F81-TY株细胞培养液；

步骤三、病毒摇瓶驯化

对貉细小病毒性肠炎病毒LN株进行培养驯化，筛选出用于悬浮培养的貉细小病毒性肠炎病毒生产毒种；

步骤四、病毒增殖培养

将步骤三驯化后的貉细小病毒性肠炎病毒生产毒种接种至步骤二得到的F81-TY株细胞培养液中，增殖后收获病毒液；

步骤五、制苗

利用步骤四得到的病毒液制备貉细小病毒性肠炎灭活疫苗。

作为优选的实施方式，按照步骤三、步骤一、步骤二、步骤四、步骤五的顺序进行疫苗制备。

作为优选的实施方式，步骤一的具体过程如下：

取液氮冻存的F81-TY株低血清全悬浮细胞，置于37℃水浴中快速解冻并接种于含有低血清悬浮培养液400mL的摇瓶中，血清浓度为1-5％，置于37℃、60rpm、5％(v/v)CO₂摇床培养72小时，待细胞密度达到8.0×10⁵个/mL以上，且细胞活力≥95％时，得到复苏后的F81-TY株细胞。

作为优选的实施方式，步骤二的具体过程如下：

(1)将步骤一复苏后的F81-TY株细胞按与低血清悬浮培养液体积比为1:4的比例接种于装有低血清悬浮培养液的摇瓶中，于37℃、60rpm、5％(v/v)CO₂摇床培养72小时；待悬浮细胞密度不低于7.5×10⁵个/mL，且细胞活力≥90％时，得到摇瓶生长的细胞悬浮液；

(2)将摇瓶生长的细胞悬浮液直接接种到工作体积5L的生物反应器中，接种体积为1000-2000mL，补加低血清悬浮培养液至5L，生物反应器参数设定三路气体，分别为空气、氧气和二氧化碳，转速为60-75rpm，温度为37℃，PH为7.1，培养36小时后，将溶氧设定为50％，继续培养36小时后的细胞培养液细胞密度不低于7.5×10⁵个/mL，且细胞活力≥90％；

(3)取步骤(2)中得到的细胞培养液3.5L转移至工作体积10L的生物反应器中，补加低血清悬浮培养液至10L，生物反应器参数设定三路气体，分别为空气、氧气和二氧化碳，转速为75-85rpm，温度为37℃，PH为7.1，溶氧为70％，继续培养72小时后进行台盼蓝染色法计数及活力检测，当检测到的活细胞密度不低于7.5×10⁵个/mL时，即得到用于接毒的细胞培养液；

(4)将工作体积5L的生物反应器剩余细胞培养液1.5L补加低血清悬浮培养液至5L，按照步骤(2)和步骤(3)继续培养，作为细胞种子连续培养，得到F81-TY株细胞培养液。

作为优选的实施方式，步骤三的具体过程如下：

(1)将步骤2的(1)中获得的摇瓶生长的细胞悬浮液按照传代比为1:3或1:4的比例传代，同步接种貉细小病毒性肠炎病毒LN株，接毒剂量为5-10％(v/v)；

(2)于37℃、5％(v/v)CO₂摇床培养48小时，每12小时取样检测其病毒效价及血凝效价，检测悬浮细胞条件下的原病毒敏感性，记为F1代；

(3)将F1代病毒液按照步骤(1)重复接毒，接毒剂量为细胞悬浮液体积的5-10％，按步骤(2)条件培养，每12小时取样检测其病毒效价及血凝效价记为F2代，如此反复接种至F8代，接毒剂量为5％(v/v)，检测各代次病毒效价及血凝效价，从F5代开始，病毒含量及血凝效价分别稳定在10^7.0TCID₅₀/ml，HA为2¹⁰，获得用于悬浮培养的貉细小病毒性肠炎病毒生产毒种，于-20度保存。

作为优选的实施方式，步骤四的具体过程如下：

按F81-TY株细胞培养液体积的5-10％比例同步接入步骤3驯化后的貉细小病毒性肠炎病毒生产毒种，培养条件为：生物反应器参数设定三路气体，分别为空气、氧气和二氧化碳，转速为40-50rpm，温度为37℃，PH为6.8，溶氧为40-50％；每12小时取样进行台盼蓝染色法细胞计数及活力检查，培养72-96h后，待活细胞密度低于5×10⁴个/mL或细胞活性≤50％时，在无菌条件下收获病毒液，并通过血凝实验、TCID₅₀检测病毒效价，获得制苗用病毒液，其病毒含量TCID₅₀为10^6.7/ml，血凝价HA为2¹⁰。

作为优选的实施方式，步骤五的具体过程如下：

(1)灭活

按灭活剂β-丙内酯与病毒液体积比为1:1500的比例向步骤4得到的病毒液中加入灭活剂β-丙内酯，搅拌30min，混匀，4℃灭活48h，间歇搅拌3-5次，每次20min，37℃水解3-6h，4℃保存，得到灭活液；

(2)半成品检验

无菌检验：对步骤4收获的病毒液取样进行无菌检验；

灭活检验：对步骤(1)所得的灭活液，在37℃下分别接种4瓶正常猫肾传代细胞，每瓶接种0.4mL，置37℃下培养，24h后弃掉MEM培养基，补加新的MEM培养基，继续培养3天后再传代1次，细胞应不出现病变，收获培养液，血凝试验应呈现阴性，判定灭活合格；

(3)乳化与配苗

将灭活液和氢氧化铝胶按体积比为9:1(v/v)的比例混合，并按终体积的0.01％加入硫柳汞，再按终体积的50％加入灭菌生理盐水，乳化混匀，用灭菌碳酸氢钠调节PH值为7.2-7.4，得到貉细小病毒性肠炎灭活疫苗。

本发明的有益效果是：

1、本发明从临床发病貉子肠道内分离得到的一株对貉子安全、免疫原性良好、病毒增殖稳定的貉细小病毒性肠炎疫苗株，命名为：貉细小病毒性肠炎病毒LN株，其微生物保藏号为保藏编号为：CGMCC NO.16627。

2、首次针对貉子细小病毒性肠炎病毒流行毒株(LN株)制备了灭活疫苗，用来预防貉子细小病毒性肠炎，提升了貉子病毒性肠炎的保护率，解决了以往依靠水貂病毒性肠炎灭活疫苗或者犬病毒性肠炎弱毒活疫苗对貉子病毒性肠炎交叉保护力不足的缺陷。

3、悬浮工艺制备抗原复合物，病毒增殖和收获时间与悬浮工艺应用并没有相关性。本发明发现低血清悬浮培养F81-TY株细胞在貉细小病毒性肠炎病毒生产中的应用，使靶病毒快速增殖，收毒时间较传统转瓶工艺提前了24h，缩短了该抗原复合物的生产周期。悬浮培养F81-TY株细胞在貉细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物生产中的应用，有望终结貉细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物的转瓶时代。

4、本发明通过实验参数的调整，多次悬浮传代驯化，筛选出一株适应低血清悬浮F81-TY株细胞培养的貉细小病毒适应株用于貉细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物的生产，解决了传统贴壁细胞制备的病毒在悬浮细胞工艺中不易感，不增殖的弊端，为悬浮工艺在貉细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物制备中的应用解决了技术难点。

5、本发明选用低血清悬浮F81-TY株细胞系代替传统贴壁F81细胞制备貉细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物，解决了因转瓶贴壁细胞生长瓶间、批间差异大而导致产品质量批间差异大的问题，并且为将来下游纯化工艺提供了有利条件，保证了产品质量均一稳定。

6、本发明选用低血清悬浮F81-TY株细胞系代替传统贴壁F81细胞制备貉细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物，降低了血清浓度，节约生产成本的同时，减少了产品因血清因素带来的副反应，提高了产品的安全性。

7、本发明选用低血清悬浮F81-TY株细胞系代替传统贴壁F81细胞制造貉细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物，改良了灭活剂的种类及浓度，且该灭活剂水解后无残留，保证了产品质量的同时，降低了因灭活剂导致的临床副反应的发生。

8、本发明选用低血清悬浮F81-TY株细胞系代替传统贴壁F81细胞制备貉细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物，减少了培养基的使用量，收获的病毒液的量就是消耗的培养基量，而传统转瓶工艺消耗的培养基的量是收获病毒液的2倍。节约了生产成本。

9、本发明采用细胞全悬浮技术制备的貉细小病毒性肠炎病毒抗原，经灭活、乳化及配苗等工艺制成貉细小病毒性肠炎灭活疫苗。经实验证明，该貉细小病毒性肠炎灭活疫苗可抵御貉细小病毒强毒攻击，保护率在91.7％以上，能够有效预防貉病毒性肠炎的发生，免疫有效期6个月。本发明的提出为貉细小病毒性肠炎的防控提供了新选择。

附图说明

图1为低血清悬浮培养F81-TY株24h细胞照片(100×)。

图2为低血清悬浮培养F81-TY株48h细胞照片(100×)。

图3为低血清悬浮培养F81-TY株72h细胞照片(100×)。

图4为低血清悬浮培养F81-TY株接种貉细小病毒性肠炎病毒LN株48h收毒照片(100×)。

具体实施方式

本发明的一株貉细小病毒性肠炎病毒LN株，系申请人从临床发病貉子肠道内分离得到的，命名为：LN株，该毒株对貉子安全、免疫原性良好、病毒增殖稳定。该毒株已于2018年12月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCC NO.16627，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号(中国科学院微生物研究所)，保藏单位邮编为100101。

本发明的一种菌剂，其有效活性成分为上述的一株貉细小病毒性肠炎病毒LN株。

本发明的一种貉细小病毒性肠炎灭活疫苗，其有效活性成分为上述的一株貉细小病毒性肠炎病毒LN株。

本发明采用敏感F81贴壁细胞连续传代的方式以及全悬浮工艺，从市场发病的貉子肠道内分离、克隆纯化貉细小病毒，获得一株对貉安全、免疫原性良好、病毒增殖稳定的貉细小病毒性肠炎疫苗株。采用F81-TY全悬浮细胞培养技术制备貉细小病毒抗原结合改良的β-丙内酯灭活、乳化及配苗等工艺制备貉细小病毒性肠炎灭活疫苗。本发明的一种貉细小病毒性肠炎灭活疫苗的制备方法，主要包括以下步骤：

步骤一、悬浮细胞复苏

对F81-TY株细胞进行复苏；

步骤二、悬浮细胞传代

将步骤一复苏后的F81-TY株细胞用低血清悬浮培养液进行扩大培养，得到F81-TY株细胞培养液；

步骤三、病毒摇瓶驯化

对貉细小病毒性肠炎病毒LN株进行培养驯化，筛选出用于悬浮培养的貉细小病毒性肠炎病毒生产毒种；

步骤四、病毒增殖培养

将步骤三驯化后的貉细小病毒性肠炎病毒生产毒种接种至步骤二得到的F81-TY株细胞培养液中，增殖后收获病毒液；

步骤五、制苗

利用步骤四得到的病毒液制备貉细小病毒性肠炎灭活疫苗。

还可以按照上手步骤三、步骤一、步骤二、步骤四、步骤五的顺序进行疫苗制备。

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下列实施例中的实验方法和所用的试剂，如无特别说明，均为常规方法和常规试剂。

一、材料

1、F81-TY株细胞：即F81-TY株低血清全悬浮细胞，由吉林特研生物技术有限责任公司制备并保存。

2、干粉培养基购自郑州爱科生物科技有限公司，名称：F81细胞专用低血清悬浮培养基干粉，货号：F-6011-D。

3、新生牛血清(以下简称血清)：内蒙古维克生生物技术股份有限公司，名称：新生牛血清，批号：20170830。

4、低血清悬浮培养液，其制备过程如下：

(1)取50L/包规格的F81细胞专用低血清悬浮培养基干粉溶解于注射用水中，所得的培养基的终体积为50L，注射用水的体积为终体积的80-90％，搅拌至澄清。

(2)将步骤(1)中得到的溶液用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调PH至6.8-7.0，并用注射用水将溶液体积补充至终体积50L。

(3)将步骤(2)中得到的溶液加入终体积1-5％体积的新生牛血清后，用0.2微米滤膜过滤除菌，分装备用，于2-8℃保存。

5、猫肾细胞(F81)：由吉林特研生物技术有限责任公司保藏。

二、仪器设备

二氧化碳培养箱，松下(MCO-230AICUVL-PC)；

PCR仪(BIO-RAD T100Thermal)；

离心机，HITACHICT-16RX型；

悬浮细胞培养瓶(500mL；1000mL)，购自郑州爱科生物；

磁力搅拌器，购自USABELLCO公司；

生物反应器，购自广州齐志(BC-5L；BC-10L)。

实施例1貉细小病毒性肠炎病毒LN株的分离与鉴定

1、病毒分离

(1)病料处理

采集的病料(河北滦南地区)用等量生理盐水稀释，充分混匀震荡，3000rpm离心30min，取上清，置于-20℃冰箱冻存备用。

(2)病毒分离

将处理后的病料用MEM营养液按照1:2的体积比进行稀释，同步接种于贴壁猫肾细胞(F81)一瓶，37℃培养24h，将营养液换成细胞维持液(含2％血清的MEM培养液)，逐日观察细胞病变，培养4-5天收毒，连续盲传4代，检测培养物HA特性，阳性冻存备用。

2、病毒鉴定

(1)电镜观察找到目标病毒，经PCR测序后分析显示为貉细小病毒性肠炎病毒；具有凝集猪血红细胞的能力，HA价2⁹；病毒含量为：10^6.5TCID₅₀/ml；对***等有机溶剂不敏感；经蚀斑克隆纯化后，获得一株纯净貉细小病毒性肠炎病毒(LN株)，经阳性血清中和后，接种猫肾细胞(F81)培养3天，细胞无病变。

(2)外源病毒及支原体检测结果显示：无犬冠状病毒、腺病毒及轮状病毒；支原体检检测为阴性。

3、保藏：将上述分离并鉴定的一株貉细小病毒性肠炎病毒LN株，命名为：LN株，已于2018年12月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCC NO.16627，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号(中国科学院微生物研究所)，保藏单位邮编为100101。

实施例2貉细小病毒性肠炎灭活疫苗的制备(悬浮工艺)

1、悬浮细胞复苏

取液氮冻存的F81-TY株低血清全悬浮细胞，置于37℃水浴中快速解冻并接种于含有低血清悬浮培养液400mL的摇瓶中，血清浓度为1-5％，置于37℃、60rpm、5％(v/v)CO₂摇床培养72小时，待细胞密度达到8.0×10⁵个/mL以上，且细胞活力≥95％时，得到复苏后的F81-TY株细胞。

2、悬浮细胞传代

将步骤1得到的复苏后的F81-TY株细胞用低血清悬浮培养液进行放大培养，得到F81-TY株细胞培养液。

其具体操作工程如下：

(1)将步骤1得到的复苏后的F81-TY株细胞按照与低血清悬浮培养液体积比为1:4的比例接种于装有低血清悬浮培养液的摇瓶中，于37℃、60rpm、5％(v/v)CO₂摇床培养72小时；待悬浮细胞密度不低于7.5×10⁵个/mL，且细胞活力≥90％时，得到摇瓶生长的细胞悬浮液；

(2)将摇瓶生长的细胞悬浮液直接接种到齐志BC-7L型(工作体积5L)生物反应器中，接种体积为1000-2000mL，补加低血清悬浮培养液至5L，生物反应器参数设定三路气体，分别为空气、氧气和二氧化碳，转速为60-75rpm，温度为37℃，PH为7.1，培养36小时后，将溶氧设定为50％，继续培养36小时后的细胞培养液细胞密度不低于7.5×10⁵个/mL，且细胞活力≥90％；

(3)取步骤(2)中得到的细胞培养液3.5L转移至齐志BC-14L型(工作体积10L)生物反应器中，补加低血清悬浮培养液至10L，生物反应器参数设定三路气体，分别为空气、氧气和二氧化碳，转速为75-85rpm，温度为37℃，PH为7.1，溶氧为70％，继续培养72小时后(过程中每24小时观察细胞形态，见附图1、图2、图3)进行台盼蓝染色法计数及活力检测，当检测到的活细胞密度不低于7.5×10⁵个/mL时，即得到可用作接毒的细胞培养液；

(4)将BC-7L型(工作体积5L)生物反应器剩余细胞培养液1.5L补加低血清悬浮培养液至5L，按照步骤(2)和步骤(3)继续培养，作为细胞种子连续培养，得到F81-TY株细胞培养液。

3、病毒摇瓶驯化

对实施例1分离得到的貉细小病毒性肠炎病毒LN株进行培养驯化，筛选出适应悬浮培养的貉细小病毒性肠炎病毒。

其具体操作工程如下：

(1)将步骤2的(1)中获得的摇瓶生长的细胞悬浮液按照传代比为1:3或1:4的比例传代，同步接种由贴壁猫肾细胞(F81)培养增殖的貉细小病毒性肠炎病毒毒种(实施例1分离的貉细小病毒性肠炎病毒LN株)，接毒剂量为5-10％(v/v)；

(2)于37℃、5％(v/v)CO₂摇床培养48小时，每12小时取样检测其病毒效价及血凝效价，检测悬浮细胞条件下的原病毒敏感性，记为F1代；

(3)将F1代病毒液按照步骤(1)重复接毒，接毒剂量为细胞悬浮液(步骤2的(1)中获得的摇瓶生长的细胞悬浮液)体积的5-10％，按步骤(2)条件培养，每12小时取样检测其病毒效价及血凝效价记为F2代，如此反复接种至F8代，接毒剂量为5％(v/v)，检测各代次病毒效价及血凝效价，从F5代开始，病毒含量及血凝效价分别稳定在10^7.0TCID₅₀/ml，HA为2¹⁰，获得适应悬浮培养的貉细小病毒性肠炎病毒生产毒种，于-20度保存。

4、病毒增殖培养

将步骤3驯化后的貉细小病毒性肠炎病毒生产毒种接种至步骤2得到的F81-TY株细胞培养液中，增殖后收获毒液。

其具体操作工程如下：

取步骤2得到的可用作接毒的F81-TY株细胞培养液，按照F81-TY株细胞培养液体积的5-10％比例同步接入步骤3驯化后的貉细小病毒性肠炎病毒生产毒种，培养条件为：生物反应器参数设定三路气体，分别为空气、氧气和二氧化碳，转速为40-50rpm，温度为37℃，PH为6.8，溶氧为40-50％；每12小时取样进行台盼蓝染色法细胞计数及活力检查，培养44-48h后，待活细胞密度低于5×10⁴个/mL或细胞活性≤50％时，在无菌条件下收获病毒液，并通过血凝实验、TCID₅₀检测病毒效价，获得制苗用毒液(收获时观察细胞形态，见附图4)，其病毒含量TCID₅₀为10^6.7/ml，血凝价HA为2¹⁰。

5、制苗：利用步骤4得到的制苗用毒液制备貉细小病毒性肠炎灭活疫苗。

其具体操作工程如下：

(1)灭活

按照灭活剂β-丙内酯与病毒液体积比为1:1500的比例向步骤4得到的病毒液中加入灭活剂β-丙内酯，搅拌30min，混匀，4℃灭活48h，间歇搅拌3-5次，每次20min，37℃水解3-6h，4℃保存，得到灭活液。

(2)半成品检验

无菌检验：先将步骤4收获的病毒液取样，按《中国兽药典》(2005年第三部)附录15页进行，应无菌生长。

灭活检验：取上述步骤(1)所得的灭活液，在37℃下分别接种4瓶正常猫肾传代细胞，每瓶接种0.4mL，置37℃下培养，24h后弃掉MEM培养基，补加新的MEM培养基，继续培养3天后再传代1次，细胞应不出现病变，收获培养液，血凝试验应呈现阴性，判定灭活合格。

(3)乳化与配苗

将灭活液和氢氧化铝胶按体积比为9:1(v/v)的比例混合，并按终体积的0.01％加入硫柳汞，再按终体积的50％加入灭菌生理盐水，充分乳化混匀，用灭菌碳酸氢钠调节PH值为7.2-7.4，得到貉细小病毒性肠炎灭活疫苗。

实施例3貉细小病毒性肠炎灭活疫苗的制备(悬浮工艺)

调整实施例2中具体步骤的前后顺序，即按照实施例2中的步骤3、1、2、4、5的顺序进行，其他部分均相同。

实施例4两种疫苗制备工艺(转瓶工艺与悬浮工艺)的比较

采用转瓶培养和悬浮培养方法分别进行貉细小病毒的培养，分别进行HA效价和病毒含量TCID₅₀的测定。

1、高血清F81转瓶贴壁细胞毒：病毒在转瓶中的培养，将1瓶MEM培养基培养至72h且长满致密单层的转瓶F81细胞，弃掉培养液，经PBS洗涤，胰酶消化后，用消化终止液收集细胞，按1:3比例接种于事先加入过滤除菌的含有8-10％新生牛血清的1000mL细胞培养液中，同时按1.5-3％同步接种貉细小病毒，混匀后上转机，置于37℃条件下温室培养，转速7-14转/min；接毒后培养68-72h，细胞病变达到75-85％时，细胞拉网呈岛屿状时收获病毒，冻融后进行HA效价和TCID₅₀检测。按此方法制备三批制苗用毒液，批号分别为ZP201801、ZP201802、ZP201803。

2、低血清悬浮F81-TY株生物反应器悬浮细胞毒：方法同实施例2，制备三批制苗用毒液，批号分别为XF201804、XF201805、XF201806。结果如表1所示。

表1不同方法进行貉细小病毒培养样品检测结果

两种细胞培养方式制备病毒抗原的综合对比分析，结果如下表2。

表2两种细胞培养方式制备病毒抗原的综合对比分析结果

对比项目	转瓶培养	全悬浮培养
			细胞生长方式	贴壁	全悬浮
生产工艺难易度	复杂	简单
			细胞密度	1.0*10<sup>6</sup>个/mL	1.5*10<sup>6</sup>个/mL
血清浓度	8％～10％	1～5％
			半成品病毒滴度	10<sup>6.50</sup>TCID<sub>50</sub>	10<sup>6.73</sup>TCID<sub>50</sub>
半成品血凝价	2<sup>7</sup>～2<sup>8</sup>	2<sup>9</sup>～2<sup>10</sup>
			纯化工艺难易度	中等	简单
副反应程度	低	极低
			批间差异	中	低
生产效率	低	高
			人工需求	20人以上	8-10人
综合成本	中	低

采用F81细胞转瓶贴壁培养制备病毒抗原。细胞培养阶段往往需要加入较高浓度新生牛血清(8-10％)，待细胞长满单层后需要弃去培养液，经PBS洗涤，胰酶消化后换用新生牛血清浓度为2-5％的细胞维持液，不仅工艺繁琐，且由于操作熟料程度不同导致细胞传代生长情况好坏不一，接毒后病毒增殖快慢不同，最后影响产品质量的均一稳定性。另外，高浓度血清的使用不仅增加了生产成本，且血清中杂蛋白在后期分离纯化工作中很难去除，接种后副反应大。另外，血清中可能存在外源病毒和支原体，增加了产品的生物安全风险。由于转瓶细胞生长面积有限，不利于细胞放大培养，且需要足够的温室与转机，占地多，人工多。

采用生物反应器低血清悬浮培养F81-TY株细胞制备病毒抗原。第一，自动化程度高，需要人员少，且可以采用具有工业化价值的低血清(1-5％)培养基，抗原成本比较优势显著。第二，低血清悬浮培养可大大减少血清中杂蛋白等热源物质，降低了产品后期纯化的难度及副反应的发生几率，使产品更具有安全性。第三，悬浮培养F81-TY株细胞，细胞增殖良好，易于放大培养，收毒时间较其他培养方式提前，缩短了生产周期，同时降低劳动强度。第四，降低培养基使用量，同步接毒方式让收获的病毒液的量就是消耗培养基的量，而其他工艺消耗培养基的量是收获病毒液的2倍。第五，不论HA效价还是TCID₅₀都略高于转瓶培养工艺，达到生产规程要求。第六，该方法制备的病毒抗原复合物安全有效，对貉病毒性肠炎起到了保护作用，具有较好的市场应用和推广前景。

实施例5貉细小病毒性肠炎灭活疫苗安全性试验

取实施例2检验合格的貉细小病毒性肠炎灭活疫苗进行后肢肌肉接种抗体阴性貉(60-70日龄)，设立单剂量、单剂量重复和超剂量(5倍)接种免疫组，同时设立生理盐水对照组。接种疫苗后连续观察14天，记录貉体温、食欲、精神状态及主要临床症状等指标。试验结果见表3。经疫苗安全性试验验证表明，貉子各项指标均正常，未出现任何临床症状，说明疫苗对貉安全。

表3貉细小病毒性肠炎灭活疫苗安全试验结果

组别	貉数	体温变化	临床症状	接种局部反应	发病和死亡数
						单剂量	10	正常	无	无	0
单剂量重复	10	正常	无	无	0
						超剂量	10	正常	无	无	0
对照	5	正常	无	无	0

注：疫苗批号20180901。

实施例6貉细小病毒性肠炎灭活疫苗与同类疫苗对貉的免疫效力比较

组1：实施例2制备的经检验合格的貉细小病毒性肠炎灭活疫苗。

组2：市场上销售的水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗(MEVB株)。

上述两种疫苗分别后肢肌肉接种抗体阴性貉(60-70日龄)，每只接种1ml，同时设立生理盐水对照组。免疫后21天采血，检测血清HI抗体效价，同时使用100个ID50强毒口服攻毒，观察15天。

试验结果见表4。经比较可知，组1免疫后21天血清中HI抗体水平高于组2；两组疫苗免疫攻毒后，组1可获得100％保护，组2保护率为60％。因此，本发明所制备的貉细小病毒性肠炎灭活疫苗的免疫效力明显优于市场上销售的水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗(MEVB株)。

表4貉细小病毒性肠炎灭活疫苗与同类疫苗对貉的免疫效力比较

实施例7貉细小病毒性肠炎灭活疫苗免疫产生期和持续期试验

取实施例2制备的经检验合格的貉细小病毒性肠炎灭活疫苗后肢肌肉接种抗体阴性貉(3-4月龄)，接种20只，每只免疫剂量为1ml，分别于免疫后7d、14d、21d、60d、120d、180d采血，检测血清HI抗体效价，在免疫120d、180d时，随机选12只貉子及对照组3只，分别口服100个ID50强毒进行攻毒，观察15d，测定疫苗免疫持续期。试验结果表明，免疫后7d开始产生抗体，21d可产生达到免疫保护的HI抗体(1:32)。疫苗免疫120d，经强度攻击获得100％保护，免疫180d，经强毒攻击获得91.7％(11/12)保护，说明貉细小病毒性肠炎灭活疫苗免疫期达180d以上。

通过上述的实验证明，经过全悬浮工艺制备得到的貉细小病毒性肠炎灭活疫苗免疫貉子后21d，可产生达到免疫效果的HI抗体水平(≥1:32)，免疫后180d，可有效保护貉子免于细小病毒强毒的攻击，保护率在91.7％，因此本发明制备得到的貉细小病毒性肠炎灭活疫苗可以有效保护貉免于强毒的攻击，有效预防貉细小病毒性肠炎的发生。具有很好的市场应用价值。

本发明公开了一株貉细小病毒性肠炎病毒LN株、貉细小病毒性肠炎灭活疫苗及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

Claims (10)

1.一株貉细小病毒性肠炎病毒LN株，其特征在于，该毒株已于2018年12月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.16627。

2.一种毒剂，其有效活性成分为权利要求1所述的一株貉细小病毒性肠炎病毒LN株。

3.一种貉细小病毒性肠炎灭活疫苗，其有效活性成分为权利要求1所述的一株貉细小病毒性肠炎病毒LN株。

4.制备权利要求3所述的貉细小病毒性肠炎灭活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、悬浮细胞复苏

对F81-TY株细胞进行复苏；

步骤二、悬浮细胞传代

将步骤一复苏后的F81-TY株细胞用低血清悬浮培养液进行扩大培养，得到F81-TY株细胞培养液；

步骤三、病毒摇瓶驯化

对貉细小病毒性肠炎病毒LN株进行培养驯化，筛选出用于悬浮培养的貉细小病毒性肠炎病毒生产毒种；

步骤四、病毒增殖培养

将步骤三驯化后的貉细小病毒性肠炎病毒生产毒种接种至步骤二得到的F81-TY株细胞培养液中，增殖后收获病毒液；

步骤五、制苗

利用步骤四得到的病毒液制备貉细小病毒性肠炎灭活疫苗。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，按照步骤三、步骤一、步骤二、步骤四、步骤五的顺序进行疫苗制备。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤一的具体过程如下：

取液氮冻存的F81-TY株低血清全悬浮细胞，置于37℃水浴中快速解冻并接种于含有低血清悬浮培养液400mL的摇瓶中，血清浓度为1-5％，置于37℃、60rpm、5％(v/v)CO₂摇床培养72小时，待细胞密度达到8.0×10⁵个/mL以上，且细胞活力≥95％时，得到复苏后的F81-TY株细胞。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤二的具体过程如下：

(1)将步骤一复苏后的F81-TY株细胞按与低血清悬浮培养液体积比为1:4的比例接种于装有低血清悬浮培养液的摇瓶中，于37℃、60rpm、5％(v/v)CO₂摇床培养72小时；待悬浮细胞密度不低于7.5×10⁵个/mL，且细胞活力≥90％时，得到摇瓶生长的细胞悬浮液；

(2)将摇瓶生长的细胞悬浮液直接接种到工作体积5L的生物反应器中，接种体积为1000-2000mL，补加低血清悬浮培养液至5L，生物反应器参数设定三路气体，分别为空气、氧气和二氧化碳，转速为60-75rpm，温度为37℃，PH为7.1，培养36小时后，将溶氧设定为50％，继续培养36小时后的细胞培养液细胞密度不低于7.5×10⁵个/mL，且细胞活力≥90％；

(3)取步骤(2)中得到的细胞培养液3.5L转移至工作体积10L的生物反应器中，补加低血清悬浮培养液至10L，生物反应器参数设定三路气体，分别为空气、氧气和二氧化碳，转速为75-85rpm，温度为37℃，PH为7.1，溶氧为70％，继续培养72小时后进行台盼蓝染色法计数及活力检测，当检测到的活细胞密度不低于7.5×10⁵个/mL时，即得到用于接毒的细胞培养液；

(4)将工作体积5L的生物反应器剩余细胞培养液1.5L补加低血清悬浮培养液至5L，按照步骤(2)和步骤(3)继续培养，作为细胞种子连续培养，得到F81-TY株细胞培养液。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤三的具体过程如下：

(1)将步骤2的(1)中获得的摇瓶生长的细胞悬浮液按照传代比为1:3或1:4的比例传代，同步接种貉细小病毒性肠炎病毒LN株，接毒剂量为5-10％(v/v)；

(2)于37℃、5％(v/v)CO₂摇床培养48小时，每12小时取样检测其病毒效价及血凝效价，检测悬浮细胞条件下的原病毒敏感性，记为F1代；

(3)将F1代病毒液按照步骤(1)重复接毒，接毒剂量为细胞悬浮液体积的5-10％，按步骤(2)条件培养，每12小时取样检测其病毒效价及血凝效价记为F2代，如此反复接种至F8代，接毒剂量为5％(v/v)，检测各代次病毒效价及血凝效价，从F5代开始，病毒含量及血凝效价分别稳定在10^7.0TCID₅₀/ml，HA为2¹⁰，获得用于悬浮培养的貉细小病毒性肠炎病毒生产毒种，于-20度保存。

9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤四的具体过程如下：

按F81-TY株细胞培养液体积的5-10％比例同步接入步骤3驯化后的貉细小病毒性肠炎病毒生产毒种，培养条件为：生物反应器参数设定三路气体，分别为空气、氧气和二氧化碳，转速为40-50rpm，温度为37℃，PH为6.8，溶氧为40-50％；每12小时取样进行台盼蓝染色法细胞计数及活力检查，培养72-96h后，待活细胞密度低于5×10⁴个/mL或细胞活性≤50％时，在无菌条件下收获病毒液，并通过血凝实验、TCID₅₀检测病毒效价，获得制苗用病毒液，其病毒含量TCID₅₀为10^6.7/ml，血凝价HA为2¹⁰。

10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤五的具体过程如下：

(1)灭活

按灭活剂β-丙内酯与病毒液体积比为1:1500的比例向步骤4得到的病毒液中加入灭活剂β-丙内酯，搅拌30min，混匀，4℃灭活48h，间歇搅拌3-5次，每次20min，37℃水解3-6h，4℃保存，得到灭活液；

(2)半成品检验

无菌检验：对步骤4收获的病毒液取样进行无菌检验；

灭活检验：对步骤(1)所得的灭活液，在37℃下分别接种4瓶正常猫肾传代细胞，每瓶接种0.4mL，置37℃下培养，24h后弃掉MEM培养基，补加新的MEM培养基，继续培养3天后再传代1次，细胞应不出现病变，收获培养液，血凝试验应呈现阴性，判定灭活合格；

(3)乳化与配苗

将灭活液和氢氧化铝胶按体积比为9:1(v/v)的比例混合，并按终体积的0.01％加入硫柳汞，再按终体积的50％加入灭菌生理盐水，乳化混匀，用灭菌碳酸氢钠调节PH值为7.2-7.4，得到貉细小病毒性肠炎灭活疫苗。