CN107513524A - 一株猪塞内加谷病毒毒株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株猪塞内加谷病毒毒株及其应用。本发明从福建省猪场发生猪特发性水疱病的病料中分离到塞内加谷病毒毒株CH‑FJZZ‑2017，保藏编号为CGMCC No.12160。本发明分离的猪塞内加谷病毒CH‑FJZZ‑2017株是中国境内新近爆发流行该病的猪群中分离得到的，代表目前国内流行优势毒株，具有良好的毒株背景，可作为灭活疫苗生产毒株及检验用毒种，为后续的相关实验研究提供了材料，奠定了物质基础。

Description

一株猪塞内加谷病毒毒株及其应用
技术领域
本发明涉及病原微生物领域，属于受用生物制品领域，具体涉及一株猪塞内加谷病毒毒株在制备猪塞内加谷病毒灭活疫苗中的应用。
背景技术
塞内加谷病毒(Senecavirus A，SVA)又称为Seneca Valley virus(SVV)，是一种无囊膜单股正链RNA病毒，属于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)塞内加谷(Senecavirus)病毒属。SVA基因组全长约7.3kb左右，包括一个开放阅读框及两端非编码区序列。SVA编码一个多聚蛋白，大小为2181aa，该蛋白能够被宿主细胞和病毒自身的蛋白酶水解，形成12种蛋白，分别为L、VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D等。其中，VP4、VP2、VP3、VP1是SVA的结构蛋白，VP2、VP3、VP1蛋白位于病毒的衣壳表面，能够诱导机体产生良好的免疫反应。
SVA是新近发现的一种能够引起猪特发性水疱病(swine idiopathic vesiculardisease,SIVD))及流行性暂时性新生仔猪损失(epidemic transient neonatal losses,ETNL)急性病原微生物，该病发病率高，病程快，传播速度快，死亡率较低，但仔猪死亡率高。临床上主要表现为猪鼻镜、蹄部冠状带水泡、溃烂，跛足、嗜睡，新生仔猪腹泻及急性死亡等症状。SVA临床症状与***、猪水疱病、水泡性口炎等类似，通过临诊诊断难以区分。该病感染谱较窄，暂无该病原自然感染牛、羊、犬、猫等家畜动物的报道。SVA引起的猪特发性水疱病首次在美洲国家被报道，例如美国，巴西，加拿大，继而在我国以及泰国、哥伦比亚等地陆续报道。
2015年，我国广东地区首发塞内加谷疫情，在2016及2017年，塞内加谷疫情继续蔓延，在我国多个省市暴发，疫情范围波及广东、福建、湖南、河南、黑龙江等省份，临床症状以水疱类病变为特点，偶见低日龄仔猪大量死亡，给养猪业带来巨大经济损失，严重威胁了我国的公共卫生安全及养殖业发展。
目前关于该病的防控尚无可用的生物疫苗制品。目前，猪塞内加谷病的防控依赖于猪场有效管理，但国内养猪模式复杂多样，猪场管理较为落后，鉴于塞内加谷病毒的病原特点，研制相应的生物制品防控该疫病的暴发流行十分迫切。
发明内容
本发明目的之一是提供一株新分离的猪塞内加谷病毒流行毒株。
本发明的另一目的是针对现有塞内加谷病毒生物制品的不足，提供一种有效安全的猪用塞内加谷疫苗以及该灭活疫苗的制备方法；该灭活疫苗所采用的制备方法简单安全，疫苗免疫效果良好。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明首先提供一株塞内加谷病毒，名称为塞内加谷病毒(Senecavirus A)CH-FJZZ-2017CGMCC No.12160。该病毒分离自猪，又称猪塞内加谷病毒；国际病毒分类委员会将其分类为：Picornavirus，Senecavirus；属于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)塞内加谷(Senecavirus)病毒属，本发明的猪塞内加谷病毒Senecavirus A(SVA)CH-FJZZ-2017株分离自福建省内发生非***、猪水疱病、水泡性口炎疫情的猪场。已于2017年8月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.12160。
上述猪塞内加谷病毒的分离培养方法，具体步骤如下：
采集塞内加谷病毒感染患猪水疱皮病变样品，剪碎后用含有100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素的无菌PBS制成1:5的悬液，研磨，涡旋振荡混匀，反复冻融3次，10000×g离心10min，上清用0.22μm的滤器过滤除菌，分装冻存于-70℃，备用；
将1×106个PK-15细胞接种于六孔细胞培养板，待其融合度达到80％时，用PBS洗涤两次；将1mL过滤的塞内加谷病毒处理液接种PK-15细胞，同时设置阴性对照孔，于37℃、5％CO2培养箱中吸附2h后，弃去接种物，加入2mL维持液，继续培养4～5d，每天观察细胞状态；待发生明显的细胞病变时，将细胞冻融3次后，收集细胞和培养液继续传代培养，同时对每一代细胞培养物进行RT-PCR鉴定；待接毒PK-15组出现稳定、明显的细胞病变时，即分离得到一株稳定传代的猪塞内加谷病毒毒株。
上述猪塞内加谷病毒的蚀斑纯化方法，具体步骤如下：
1)制备单层PK-15细胞，加入稳定传代的塞内加谷病毒液，吸附2h；
2)将吸附后的细胞用PBS洗涤两次，表面覆盖一层培养哺乳动物细胞用固体培养基，待其凝固，倒置培养至病毒蚀斑出现；
3)挑取8～10个病毒蚀斑，接种单层PK-15细胞，待其细胞发生病变，收获病毒培养物；
4)将收获的病毒培养物进行下一轮的克隆纯化试验，进行3轮蚀斑纯化试验，获得塞内加谷病毒克隆纯化毒株。
本发明提供的猪塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017 CGMCC No.12160能够用于制备预防由猪塞内加谷病毒所致疾病的疫苗，还能够用于制备猪塞内加谷病毒相关的诊断试剂和治疗药物。
本发明提供一种预防由猪塞内加谷病毒所致疾病的疫苗，其活性成分为经灭活的塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017 CGMCC No.12160；具体的该疫苗含有经灭活的塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017CGMCC No.12160和药学上可接受的佐剂。
本发明还公开了上述疫苗的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
1)病毒培养：将猪塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017 CGMCC No.12160接种至PK-15细胞进行培养，收获病毒培养物；
2)病毒培养物的灭活，病毒培养物经反复冻融三次，离心，收取上清，加入灭活剂，将病毒灭活，得到灭活的病毒液；
3)按比例混合灭活的猪塞内加谷病毒病毒液和佐剂，乳化，制备猪塞内加谷病毒灭活疫苗。
根据上述疫苗组合物的制备方法，其中步骤1)的具体过程为：用含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素的低糖DMEM培养基，37℃、5％CO2培养箱贴壁培养PK-15细胞；待其融合度达到80％左右时，弃去培养液，按感染复数为1接种猪塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017株，然后用含有2％胎牛血清、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素的低糖DMEM培养基，37℃、5％CO2培养箱贴壁培养48h左右，待细胞完全病变后收获细胞培养物。
根据上述疫苗组合物的制备方法，步骤2)所述灭活剂为二乙烯亚胺，病毒液中加入二乙烯亚胺的终浓度为1mmol/L，灭活条件为30℃灭活28h；灭活后加入硫代硫酸钠溶液中和二乙烯亚胺，所加入硫代硫酸钠溶液的终浓度为0.02g/ml。灭活效果接种PK-15盲传3代未出现病变为灭活合格。
根据上述疫苗组合物的制备方法，步骤3)所述的佐剂为ISA206或ISA201，灭活病毒液与佐剂的体积比例为1:1。
本发明的积极有益效果：
本发明分离的塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017 CGMCC No.12160是中国境内新近爆发流行该病的猪群中分离得到的，代表目前国内流行优势毒株，具有良好的毒株背景，可作为灭活疫苗生产毒株及检验用毒种，为后续的相关实验研究提供了材料，奠定了物质基础。
本发明公开了一种猪塞内加谷病毒分离培养及蚀斑纯化的方法，该方法具有稳定、易操作的优点，为分离及纯化猪塞内加谷病毒提供了一种简单可行的方法。
本发明的疫苗组合物有良好的免疫原性，免疫后能够诱导动物产生较强的中和抗体。由于国内外市场上尚无该类病原的疫苗相关的生物制品，该疫苗组合物所用毒株为近年来新近分离得到的毒株，与早期毒株相比，与近年来流行的毒株具有更近的亲缘关系，具备了较强的产品竞争优势，可有效的预防SVA在猪群中的流行与传播，降低该病造成的经济损失，具有广阔的应用前景。
本发明的疫苗所采用的制备方法快速、简单、安全。
附图说明
图1为组织病料中SVA-PCR检测图。
图2为SVA感染PK-15细胞诱导细胞病变。
图3为SVA在PK-15细胞传代各代次核酸检测,其中，P1、P2、P3、P4、P5分别表示传代1-5代的SVA的检测结果。
图4为SVA感染PK-15细胞蚀斑试验。
图5为SVA感染PK-15细胞诱导细胞病变。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
在本发明中，我们从中国东南部省份出现非***、猪水疱病、水泡性口炎疫情的猪场中，从猪水疱性病变症状的病猪体内分离了一株SVA病毒流行毒株，对其进行了分离培养、蚀斑克隆纯化。并进一步建立了以该流行毒株为基础制备灭活疫苗的方法，评价了该灭活疫苗的免疫原性，为及时、迅速的开发安全、高效的猪塞内加谷病毒灭活疫苗奠定基础。具体如下述实施例。
实施例1：塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017 CGMCC No.12160的分离鉴定
1.1实验材料
实验中所用的病料样本来源于福建省内发生非***、猪水疱病、水泡性口炎疫情的猪场，采集时间为2017年6月；猪肾细胞系(Porcine Kidney，PK-15)购自美国菌种中心ATCC。
1.2引物设计
参照GenBank中发表的SVA CH-HN-2017(KY747511)基因系列，使用Primier 5设计了1对特异性引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。所述特异性引物的核苷酸序列如下：SVA F:5’-GCCCTCATGCCCAGTCCTTC-3’；SVA R:5’-GTTCAGTGATCCGAGGTGG-3’。
1.3病料的采集与处理
采集患特发性水疱病的猪蹄冠部位水泡皮样本，剪碎后用含有100U/mL青霉素、100g/mL链霉素的无菌PBS制成1:5的悬液，使用研钵研磨至匀浆，涡旋振荡混匀，反复冻融3次，10000×g离心10min留取上清，用0.22μm的滤器过滤除菌，分装冻存于-70℃，备用；
1.4组织病料中SVA RNA的RT-PCR检测
按照Trizol法提取病料总RNA；以提取的RNA为模板，按照RevertAid FirstStrand cDNA Synthesis Kit(Invitrogen)配置反转录反应体系进行反转录反应；反转录获得cDNA为模板进行PCR扩增，扩增反应体系(50μL)为：2×Taq PCR StarMix 25μL、上下游引物(10pmol/μL)各1.5μL、cDNA模板2μL，补加灭菌双蒸水至50μL。PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。取10μLPCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测(结果见图1)。由图1可见，扩增出一条372bp左右的条带，与预期扩增片段大小相符。
将上述PCR产物用胶回收纯化试剂盒回收目的片段，克隆至pMD-18T载体上，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。测序结果通过手工校对、序列拼接，并利用Blast程序在NCBI数据库中进行相似性比对，发现该段序列基因与SVA已知序列同源性最高，存在93～98％的相似性，结果证实该病料中SVA核酸阳性。
1.5病毒的分离与培养
将1×106个PK-15细胞接种于六孔细胞培养板，待其融合度达到80％时，用PBS洗涤两次；将步骤1.3中冻存备用的塞内加谷病毒过滤液接种PK-15细胞，接种量为1mL，同时设置阴性对照孔，于37℃、5％CO2培养箱中吸附2h后，弃去接种物，加入2mL维持液，继续培养4～5d，每天观察细胞状态；如接种细胞在第5d未出现明显的细胞病变，将细胞冻融3次后，收集细胞和培养液继续传代培养；在PK-15细胞上连续传代4代，发生明显的细胞病变时。同时对每一代细胞培养物提取样品RNA，按照步骤1.4进行RT-PCR检测细胞中塞内加谷病毒核酸。
经观察发现，在传代培养过程中，从第5代起各代次均出现明显的细胞病变，表现为细胞聚集成“葡萄状”病变，随后细胞变圆、脱落、出现空斑(图2)。利用猪塞内加谷病毒特异性引物SVA F/SVAR对细胞培养物RNA进行RT-PCR扩增，能够检测出明显的SVA特异性目的片段(见图3)，而未接种的PK-15细胞阴性对照组为扩增出相应的核酸片段。病毒盲传至第5代时，在接种48h出现稳定的细胞病变，细胞变圆、脱落，表明该病毒已经适应PK-15细胞并且能够在该细胞上稳定增殖，分离得到一株可稳定传代的SVA毒株。
实施例2：猪塞内加谷病毒蚀斑纯化的方法
2.1细胞单层的制备
将T75cm2细胞培养瓶内生长良好、融合度98％以上的PK-15细胞用PBS洗涤1次，加入3mL 0.25％的胰蛋白酶(Gibco)消化，用70mL用含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素的低糖DMEM培养基悬浮细胞制成悬液，按照3mL/孔接种于六孔细胞培养板，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，待细胞长成单层时，用于做后续蚀斑纯化实验。
2.2病毒的稀释与感染
用含有2％胎牛血清、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素的低糖DMEM培养基将步骤1.5中稳定繁殖的SVA病毒液做10倍系列稀释至10-8，放置备用。吸弃六孔板中原有细胞培养液，每孔细胞用PBS洗涤1次，分别加入1mL上述稀释度为10-4～10-8的病毒稀释液，每一个稀释度做2个复孔，同时设置未接种病毒的阴性对照组，置于37℃、5％CO2培养箱中吸附2h。
2.3覆盖培养基培养形成蚀斑
待步骤2.2中病毒吸附步骤剩余40min时，将10mL 2g/L的低熔点琼脂糖无菌结冷胶溶液置于70℃水浴锅预热、融化；待其完全融化，与10mL 3％胎牛血清、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素的2×低糖DMEM培养液同置于50℃水浴锅温育。病毒吸附2h后，吸弃六孔板中的病毒液，PK-15细胞用PBS洗涤2次，之后快速混匀上述2g/L的低熔点琼脂糖胶溶液和2×低糖DMEM培养液，将混匀后的培养基在凝固前加入各个细胞孔中，每孔3mL，置于室温冷却30min。将冷却后的六孔板倒置于37℃、5％CO2培养箱培养。逐日观察并记录细胞病变现象。
经观察发现，上述覆盖低熔点琼脂糖凝胶的单层细胞在48h后呈现明显病毒蚀斑，随着时间的延长至96h，病毒蚀斑形成的范围逐渐扩大，但差异不明显(图4)。
2.4挑斑纯化病毒
待步骤2.3中形成明显蚀斑时，在显微镜下观察，选择病毒蚀斑个数较少(少于10个)，形态较好的细胞孔进行挑斑。对单个蚀斑进行挑取的方法如下步骤：首先将蚀斑在细胞培养板底层用记号笔进行标记；用无菌200μL微量移液器枪头将所标记空斑位置的覆盖层吸取，加入1mL无血清低糖DMEM培养基，吹打几次，使覆盖层培养基融于培养基；然后吸取50μL无血清低糖DMEM培养基反复吹打空斑部位，将病毒单斑完全吹起，将吸出的液体重新加入1mL无血清低糖DMEM培养基，反复冻融2次，该病毒液用PK-15细胞扩增繁殖2代。
将单斑克隆扩增2代的病毒液重新制备蚀斑，再重复蚀斑纯化2次，即获得克隆纯化的SVA病毒株，命名为CH-FJZZ-2017株。该CH-FJZZ-2017株用下述引物进行RT-PCR扩增可得到序列1所述的序列：SVA F:5’-GCCCTCATGCCCAGTCCTTC-3’；SVA R:5’-GTTCAGTGATCCGAGGTGG-3’。将上述RT-PCR扩增得到塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017毒株序列(序列表中序列1)与GenBank内其他53株塞内加谷病毒进行比对，同源性在93.7％到98.5％之间。分析显示塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017毒株与以往分离的塞内加谷病毒株序列不同，为一株新分离毒株。
本发明的猪塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017毒株为单股正链RNA病毒，病毒粒子呈典型的二十面体对称结构，直径约为27nm，分子量约为30KD。病毒粒子外层无囊膜，对脂溶剂具有一定的抵抗力。病毒基因组全长约7.3kb，包括一个开放阅读框和两端的非编码序列，在基因组3’末端以一段poly(A)结尾。基因组的两端非编码区域能够形成复杂的RNA结构，如茎环结构、假体结构，在病毒的复制和翻译过程中发挥重要的作用。塞内加谷病毒RNA编码一个多聚蛋白，大小为2181aa，该蛋白能够被宿主细胞和病毒自身的蛋白酶水解，形成12种蛋白，分别为L、VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D等。其中，VP4、VP2、VP3、VP1是SVA的结构蛋白，VP2、VP3、VP1蛋白位于病毒的衣壳表面，能够诱导机体产生良好的免疫反应。
截至目前，塞内加谷病毒仅含有一个血清型。该病感染谱较窄，暂无该病原自然感染牛、羊、犬、猫等家畜动物的报道。
该CH-FJZZ-2017株已于2017年8月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.12160。
实施例3：猪塞内加谷病毒毒株CH-FJZZ-2017病毒滴度的测定
将消化吹散的PK-15细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，每孔150μL，培养过夜；取步骤2.4中克隆纯化3次的CH-FJZZ-2017株的细胞培养物用细胞维持液进行10倍倍比稀释，稀释度从10-1到10-10；将96孔细胞培养板中细胞培养基吸弃，用无菌PBS洗涤PK-15细胞1次，加入细胞维持液，每孔100μL；然后将各个稀释度的CH-FJZZ-2017株病毒稀释液加入96孔板，每孔100μL，每个稀释度做8个重复，每个细胞培养板做设置未接种病毒阴性对照组；置于37℃、5％CO2培养箱培养。连续观察4d，逐日观察病变情况并记录。按照Reed-Muench法计算TCID50。结果表明猪塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017株的毒价为107.78TCID50/0.1mL
实施例4：猪塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017株灭活疫苗的制备
4.1病毒培养
用含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素的低糖DMEM培养基，T225cm2细胞培养瓶，37℃、5％CO2培养箱贴壁培养PK-15细胞；待其融合度达到80％左右时，弃去培养液，按感染复数为1接种猪塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017株，然后用含有2％胎牛血清、100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素的低糖DMEM培养基，37℃、5％CO2培养箱贴壁培养48h左右，待细胞完全病变后，反复冻融3次，10000×g离心10min，去除细胞碎片，收取上清，得到猪塞内加谷病毒液，置于-80℃，备用。
4.2病毒液的灭活及灭活检验
在病毒含量合格的病毒液中(优选≥107.0TCID50/0.1mL)加入灭活剂为二乙烯亚胺，使二乙烯亚胺的终浓度为1mmol/L，置于30℃恒温摇床，80rpm，灭活28h；灭活后加入硫代硫酸钠溶液中和二乙烯亚胺，所加入硫代硫酸钠溶液的终浓度为0.02g/ml。
将1×106个PK-15细胞接种于六孔细胞培养板，待其融合度达到80％时，用PBS洗涤两次；将灭活后的病毒液用维持液做10倍稀释，接种量为500μL，同时设置阴性对照孔，于37℃、5％CO2培养箱中吸附2h后，弃去接种物，加入2mL维持液，继续培养4～5d，每天观察细胞状态。盲传3代，未出现细胞病变；且对每一代细胞培养物提取样品RNA，按照步骤1.4进行RT-PCR检测细胞中塞内加谷病毒核酸。如果结果均为阴性，表明病毒液灭活完全。
4.3制备含塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017株的疫苗组合物
将灭活完全的CH-FJZZ-2017株病毒液与ISA 206佐剂按照体积比1:1混合，将油相和水相进行乳化，条件为30℃恒温摇床，120rpm，15min。待混合完全后，即得疫苗组合物，疫苗乳化质量能够达到国家规定的质量标准。
实施例5：猪塞内加谷病毒间接免疫荧光方法的建立
为筛选猪塞内加谷病毒抗体阴性猪进行猪塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017株灭活疫苗的免疫原性的评价工作，由于缺少合适的抗体诊断试剂盒及方法，我们建立了一种间接免疫荧光方法应用于检测猪体塞内加谷病毒抗体。
铺PK-15细胞于96孔细胞培养板，待其融合度达到80％时，将96孔细胞培养板中细胞培养基吸弃，用无菌PBS洗涤PK-15细胞1次，用细胞维持液稀释CH-FJZZ-2017株病毒稀至合适浓度，按感染复数为0.1接种猪塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017株，同时设置未接毒细胞组，每孔用维持液补足200μL；感染30h后，吸弃培养上清，PBS洗涤后用-20℃冷丙酮固定10min，弃去固定液，PBS洗涤3次，每次5min；在SVA接毒细胞孔和未接毒细胞孔中分别加入100μL 1：20稀释的被检血清或SVA阳性血清、阴性血清，置37℃湿盒中作用1h，PBS洗涤3次，每次5min；加入100μL兔抗猪荧光抗体(购自Sigma公司，按照说明书要求进行稀释)，37℃湿盒作用45min,PBS洗涤3次，每次5min；每孔加入50μL PBS，置于荧光显微镜下下观察。结果判定：阳性细胞孔内可观察到阳性细胞的胞浆或胞核内有典型的特异性亮绿色荧光，而阴性对照、空白对照的细胞孔内无特异性绿色荧光(图5)。
实施例6：塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017株灭活疫苗的免疫原性试验
6.1塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017株灭活疫苗免疫情况
通过步骤1.4和实施例5的方法对6周龄仔猪进行抗原抗体阴性筛选，选取8头抗原抗体阴性仔猪进行塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017株灭活疫苗的免疫原性评价试验。分组情况：随机选取5头仔猪免疫塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017株灭活疫苗，每头1头份疫苗，每头份含2mL疫苗组合物；对照组3头，，每头颈部肌肉注射细胞维持液2mL。免疫第0～7d每天测定体温；连续14d观察猪群采食情况；观察、触摸注射部位局部是否存在肿块。
猪塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017株灭活疫苗免疫仔猪后没有出现明显的体温升高现象(表1)，且猪群采食正常、精神状态良好；疫苗注射部位在免疫后5d触摸无痛感，无肿块。说明该疫苗对免疫仔猪安全性良好。
表1灭活疫苗免疫后动物体温监测表
6.2塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017株灭活疫苗诱导抗体的测定
为评估CH-FJZZ-2017株灭活疫苗免疫效果，在免疫后14及28d采集血清，利用间接免疫荧光和中和试验评价血清中抗猪塞内加谷病毒抗体产生状态，评估CH-FJZZ-2017株灭活疫苗的免疫原性。
按照步骤5中间接免疫荧光方法检测CH-FJZZ-2017株灭活疫苗免疫后产生抗体情况，由图2可见，CH-FJZZ-2017株灭活疫苗免疫14和28d能够诱导免疫仔猪产生塞内加谷病毒抗体，而对照组未产生相应的抗体。
为进一步评估CH-FJZZ-2017株灭活疫苗诱导仔猪产生抗体的效价，利用中和试验技术检测该灭活疫苗诱导免疫仔猪产生抗体水平。具体步骤如下：
1)将待检猪血清全部置于56℃水浴孵育30min，进行灭活处理；
2)将各份血清分别在96孔细胞培养板中进行1:5、1:10、1：20、1:40、1:80、1:160及1:320倍比稀释，每个稀释度各8个重复，每孔含稀释后的血清为100μL，用于FMDV中和抗体测定试验。
3)用细胞维持液将CH-FJZZ-2017株病毒液稀释至200TCID50/0.1mL，将稀释后的病毒液加入上述步骤中稀释的血清中，混匀，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育2h。
4)提前将生长状态良好的PK-15细胞传至96孔板内，待其融合度为80-90％时，PBS洗涤1次，将上述病毒液-血清混合液加入96孔板内，200μl/孔。同时设置病毒液与未加病毒液的阳性对照组与阴性对照组。置于37℃、5％CO2培养箱培养，每日观察细胞病变情况，记录病变情况，按照Reed-Muench法计算各组血清中和抗体情况。
测定血清中和抗体效价后对数据进行整理，结果见表2。由表2可知，CH-FJZZ-2017株灭活疫苗免疫14d后能够诱导免疫仔猪产生特异性抗体，基本达到免疫要求，最高抗体能够达到1:128；28d抗体持续升高，最高抗体能够达到1:258。而对照组免疫低糖DMEM维持液组，未检测到针对猪塞内加谷病毒的中和抗体(表2)。
表2灭活疫苗免疫后动物产生中和抗体水平
证明了本发明的猪塞内加谷病毒疫苗组合物能够诱导免疫动物产生对猪塞内加谷病毒较高滴度的中和抗体。此数据为该灭活疫苗的临床使用奠定一定的理论及实践基础。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例呈现，然而并非用于限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出一定范围内的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
序列表
<110> 中牧实业股份有限公司
<120> 一株猪塞内加谷病毒毒株及其应用
<130> WHOI170079
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 372
<212> DNA
<213> 猪塞内加谷病毒(Senecavirus A)
<400> 1
gccctcatgc ccagtccttc ctttcccctt ccggggggta aaccggctgt gtttgctaga 60
ggcacagagg agcaacatcc aacctgcttt tgtggggaac ggtgcggctc cgattcctgc 120
gtcgccaaag gtgttagcgc acccaaacgg cgcatctacc aatgctattg gtgtggtctg 180
cgagttctag cctactcgtt tctcccccat ccactcactc gcgcacaaaa agtgtgttgt 240
gactacaaga tttagccctc gcacgggatg tgcgataacc acaagattga ctcaagcgcg 300
gaatgcgctg taaccacatg ctgttagtcc ctttatggct gcgagatggc tatccacctc 360
ggatcactga ac 372

Claims (10)

1.一株塞内加谷病毒毒株，其特征在于：该毒株名称为CH-FJZZ-2017，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.12160。
2.权利要求权利1所述塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017CGMCC No.12160在制备防治由猪塞内加谷病毒所致疾病的疫苗中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述防治由猪塞内加谷病毒所致疾病的疫苗为灭活疫苗。
4.一种防治由猪塞内加谷病毒所致疾病的疫苗，其活性成分为经灭活的塞内加谷病毒毒株CH-FJZZ-2017CGMCC No.12160。
5.根据权利要求4所述的防治由猪塞内加谷病毒所致疾病的疫苗，其特征在于：所述防治由猪塞内加谷病毒所致疾病的疫苗包含经灭活的猪塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017CGMCCNo.12160和药学上可接受的佐剂。
6.权利要求4或5所述防治由猪塞内加谷病毒所致疾病的疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1)病毒培养：将塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017CGMCC No.12160接种至PK-15细胞进行培养，收获病毒培养物；
2)病毒培养物的灭活，病毒培养物经反复冻融三次，离心，收取上清，加入灭活剂，将病毒灭活，得到灭活的病毒液；
3)按比例混合灭活的塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017CGMCC No.12160病毒液和佐剂，乳化，制备猪塞内加谷病毒灭活疫苗。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述灭活剂为二乙烯亚胺，病毒液中加入二乙烯亚胺的终浓度为1mmol/L，灭活条件为30℃灭活28h；灭活后加入硫代硫酸钠溶液中和二乙烯亚胺，所加入硫代硫酸钠溶液的终浓度为0.02g/ml。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的佐剂为ISA206或ISA201，灭活病毒液与佐剂的体积比例为1:1。
9.塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017CGMCC No.12160在建立塞内加谷病毒病动物模型中的应用。
10.塞内加谷病毒CH-FJZZ-2017CGMCC No.12160在制备抗塞内加谷病毒病的抗体中的应用。
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