CN114317405B - 无血清全悬浮培养型f81细胞系及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了无血清全悬浮培养型F81细胞系及其构建方法与应用。该猫肾悬浮细胞系，名称为猫肾细胞F81悬浮细胞，于2021年11月4日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2021289，目前已传至65代，形态以大小均一、透亮圆形为主；病毒敏感性试验显示，该无血清全悬浮培养型F81细胞系对猫细小病毒敏感；该细胞系可用于培养、分离、检测病毒，制备病毒疫苗，筛选用于预防或治疗病毒感染所致的疾病的药物。

Description

无血清全悬浮培养型F81细胞系及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及无血清全悬浮培养型F81细胞系及其构建方法与应用。

背景技术

猫泛白细胞减少症(Feline panleukopenia，FPL)又叫猫瘟，是由食肉动物细小病毒1型(Carnivore protoparvovirus1)引起的一种具有高度传染性的疾病，典型症状为泛白细胞减少、严重的肠炎和免疫抑制，具有较高的发病率和死亡率。目前为止猫瘟仍未找到理想的治疗药物，疫苗接种仍是当今防止疫病发生和流行的最有效手段。

随着宠物行业的不断发展，宠物饲养数量逐年增多，以宠物猫和宠物狗为主，在宠物带给人们快乐的同时，宠物健康问题也威胁着公共安全。目前危害宠物猫的病毒主要有猫细小病毒，犬细小病毒，猫冠状病毒，猫疱疹病毒等，而对宠物猫产生严重危害的病毒就是猫细小病毒。增殖猫细小病毒，常用细胞为猫肾细胞(F81)，该细胞具有培养容易、增殖快、猫细小病毒感染效率高猫的特点，是国内外公认的最适合猫细小病毒培养的细胞系。其通常是以贴壁培养生长，细胞之间互相衔接或呈镶嵌状排列，并会在表面集合形成紧密的连接蛋白，从而形成单层贴壁细胞。但是，该培养方式存在一些缺陷，比如贴壁培养受基质表面积限制导致病毒产量下降；贴壁培养过程中换液等程序较为复杂繁琐，血清的使用易受微生物、病毒和支原体等的污染，无血清培养技术是阐明细胞生成、增殖、分化以及基因表达调控的基础问题的有效工具，但即使无血清贴壁培养也只适用于试验研究，不适用于大规模培养，不能满足病毒疫苗等实际生产需要。

细胞无血清全悬浮培养技术已日趋成熟，也是未来生物制品生产大趋势，目前国内已有多株生产用工程悬浮细胞系。但是目前尚不存在无血清全悬浮培养型F81细胞系。

发明内容

本发明第一方面的目的，在于提供一种无血清全悬浮培养型F81细胞系。

本发明第二方面的目的，在于提供第一方面的无血清全悬浮培养型F81细胞系的构建方法。

本发明第三方面的目的，在于提供第一方面的无血清全悬浮培养型F81细胞系的应用。

本发明第四方面的目的，在于提供一种培养病毒的方法。

本发明第五方面的目的，在于提供一种病毒疫苗的制备方法。

本发明第六方面的目的，在于提供一种病毒疫苗。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种无血清全悬浮培养型F81细胞系，名称为猫肾细胞F81悬浮细胞，于2021年11月4日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2021289。

本发明的第二个方面，提供本发明第一方面的无血清全悬浮培养型F81细胞系的构建方法，包括如下步骤：1)对贴壁培养型F81细胞进行低血清驯化，得到低血清贴壁型F81细胞系；2)对低血清贴壁型F81细胞系进行全悬浮无血清驯化，得到无血清全悬浮培养型F81细胞系。

优选地，步骤1)中所述低血清驯化包括如下步骤：依次将贴壁培养型F81细胞接种至含9.5～10.5％、5.5～6.5％、3.5～4.5％、1.5～2.5％胎牛血清的MEM培养基中进行传代培养。

进一步优选地，不同浓度的胎牛血清的MEM培养基中培养3～10代。

进一步优选地，不同浓度的胎牛血清的MEM培养基中的传代比例为1:(2～5)。

进一步优选地，所述传代培养的条件为35～38℃，4～6％CO₂，pH6.5～7.5。

优选地，步骤2)中所述全悬浮无血清驯化包括如下步骤：依次将低血清贴壁培养型F81细胞系接种至0.5～1.5％、0.25～0.75％、0％胎牛血清的全悬浮培养基进行传代培养。

进一步优选地，不同浓度的胎牛血清的MEM培养基中培养1～10代。

进一步优选地，不同浓度的胎牛血清的MEM培养基中的传代比例为1:(2～5)。

进一步优选地，所述传代培养的条件为35～38℃，4～6％CO₂，pH6.5～7.5，50～70r/mi n。

优选地，所述全悬浮培养基为MS01培养基。

本发明的第三个方面，提供本发明第一方面的无血清全悬浮培养型F81细胞系的应用：

本发明第一方面的无血清全悬浮培养型F81细胞系在培养病毒中的应用；

本发明第一方面的无血清全悬浮培养型F81细胞系在制备培养病毒的产品中的应用；

本发明第一方面的无血清全悬浮培养型F81细胞系在分离病毒中的应用；

本发明第一方面的无血清全悬浮培养型F81细胞系在制备分离病毒的产品中的应用；

本发明第一方面的无血清全悬浮培养型F81细胞系在非诊断治疗目的地检测病毒中的应用；

本发明第一方面的无血清全悬浮培养型F81细胞系在制备检测病毒的产品中的应用；

本发明第一方面的无血清全悬浮培养型F81细胞系在制备疫苗中的应用；

本发明第一方面的无血清全悬浮培养型F81细胞系在药物筛选中的应用，所述药物为用于预防或治疗病毒感染所致的疾病的药物。

优选地，所述病毒为猫细小病毒、犬细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒、猫传染性鼻气管炎病毒和水貂病毒性肠炎病毒中的至少一种；进一步为猫细小病毒。

本发明的第四个方面，提供一种培养病毒的方法，将病毒接种至本发明第一方面的无血清全悬浮培养型F81细胞系，培养。

优选地，所述病毒为猫细小病毒、犬细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒、猫传染性鼻气管炎病毒和水貂病毒性肠炎病毒中的至少一种；进一步为猫细小病毒。

优选地，所述培养的条件为31～39℃、100～140r/min、4～6％CO₂；进一步为33～37℃、120r/min、5％CO₂。

本发明的第五个方面，提供一种病毒疫苗的制备方法，将病毒接种至本发明第一方面的无血清全悬浮培养型F81细胞系，培养，灭活，得到病毒疫苗。

优选地，所述病毒为猫细小病毒、犬细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒、猫传染性鼻气管炎病毒和水貂病毒性肠炎病毒中的至少一种；进一步为猫细小病毒。

优选地，所述培养的条件为31～39℃、100～140r/min、4～6％CO₂；进一步为33～37℃、120r/min、5％CO₂。

本发明的第六个方面，提供一种病毒疫苗，通过本发明第五方面的制备方法得到。

本发明的有益效果是：

本发明通过发明人的大量创造性劳动，首次构建得到无血清全悬浮培养型F81细胞系，名称为猫肾细胞F81悬浮细胞，于2021年11月4日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2021289，目前已传至65代，形态以大小均一、透亮圆形为主；病毒敏感性试验显示，该无血清全悬浮培养型F81细胞系对猫细小病毒敏感；该细胞系可用于培养、分离、检测病毒，制备病毒疫苗，筛选用于预防或治疗病毒感染所致的疾病的药物。

本发明构建得到的无血清全悬浮培养型F81细胞系可适应无血清全悬浮培养，培养批次内细胞密度大，有利于培养基中的营养物质和细胞充分接触，而且易于在连续密闭的***中进行，减少了污染的几率，悬浮培养的细胞仍保持原本对病毒的敏感性和生物学特性；此外还便于连续扩大生产，容易控制培养条件如温度、pH和CO₂等，安全性有保证，能够大幅度降低实际生产中的场地和人力投入，有利于大规模生产，产生可观地经济效益。

附图说明

图1是实施例3中贴壁培养型F81细胞的细胞形态图。

图2是实施例3中低血清贴壁型F81细胞在200μm比例尺下的细胞形态图。

图3是实施例3中无血清全悬浮培养型F81细胞在400μm比例尺下的细胞形态图。

图4是实施例4中对照组无血清全悬浮培养型F81细胞在处理组接毒36h后细胞形态图。

图5是实施例4中无血清全悬浮培养型F81细胞按MOI为1接毒36h后的细胞形态图。

图6是实施例4中无血清全悬浮培养型F81细胞按MOI为1接毒36h后的细胞台盼蓝染色图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。

应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

本实施例中所使用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商购获得。

本实施例中采用的F81贴壁细胞由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所宠物疫病创新团队馈赠，该细胞已在文献：]翟志安.猫泛白细胞减少症病毒的分离鉴定及VP2基因遗传演化分析[D].中国农业科学院,2020.DOI:10.27630/d.cnki.gznky.2020.000345.中公开。

实施例1无血清全悬浮培养型F81细胞系的构建

1.复苏一支贴壁培养型F81细胞，接种到含10％胎牛血清的MEM培养基(以MEM(Gibco公司产品)为基础培养基，添加10％胎牛血清(Gibco公司产品)得到)进行培养，培养条件为37℃，5％CO₂，pH7.2；待细胞贴壁、培养瓶中单层汇合度达95％后，完全弃去培养液，用0.25％EDTA-胰酶消化分散，按照常规方法传代培养3代，细胞边缘清晰，形态扁平，生长正常可用于驯化；

2.将步骤1所获得的贴壁培养型F81细胞依次用含6％、4％、2％胎牛血清的MEM培养基依次各培养3代，传代比例按1：3分瓶，培养条件为37℃，5％CO₂，pH7.2，得到低血清贴壁型F81细胞系；

3.用含2％胎牛血清的营养液(MS01培养基，购自苏州沃美生物技术有限公司)将步骤2最后一代所获得的细胞密度调整至5×10⁵cells/mL，培养3代，传代比例按1：3分瓶，培养条件为37℃，5％CO₂，60r/min摇床培养；

4.待最后一代细胞密度达到1×10⁶cells/mL时，用含1％胎牛血清的营养液按1：2比例分瓶培养，培养3代；待最后一代细胞密度达到2×10⁶cells/mL时，用含0.5％胎牛血清的营养液按1：3比例分瓶培养；连续传代五次后，驯化得到低血清全悬浮培养型F81细胞系；

5.用无血清的营养液将步骤4中最后一代低血清全悬浮培养型F81细胞直接稀释到密度1×10⁶cells/mL，继续培养5代，培养条件为37℃，5％CO₂，120r/min摇床培养，驯化得到无血清全悬浮培养型F81细胞系。

上述无血清全悬浮培养型F81细胞系，名称为猫肾细胞F81悬浮细胞，于2021年11月4日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2021289。

实施例2无血清全悬浮培养型F81细胞系的检验

1.无菌检验

取实施例1步骤5驯化得到的无血清F81细胞培养过程中的上清液分别接种至硫乙醇酸盐培养基、酪胨琼脂培养基(斜面)和葡萄糖蛋白胨培养基中培养(分别在37℃与室温(22～26下培养，每组5管细胞样品液，观察7天)，结果均呈阴性，表明无菌污染。

2.不同接种密度下F81细胞的生长特性

分别以5×10⁵cells/mL、10×10⁵cells/mL、15×10⁵cells/mL对无血清全悬浮培养型F81细胞进行接种培养，培养条件为37℃、5％CO₂和120r/min摇床培养，每24h取样观察计数，结果如下：在5～10×10⁵cells/mL接种范围内细胞活率都保持在90％以上，并保持较快生长速率。但由于随着细胞密度的增加，营养物质消耗速度加快，为了给予F81细胞充足的营养环境并降低成本，最适宜的接种密度可选择10×10⁵cells/mL。

实施例3无血清全悬浮培养型F81细胞系的特性

分别取驯化前的贴壁培养型F81细胞、实施例1中步骤2得到的低血清贴壁型F81细胞、第13代无血清全悬浮培养型F81细胞接种至相应培养基(驯化前的贴壁培养型F81细胞为5％胎牛血清浓度的MEM培养基，低血清贴壁型F81细胞为2％胎牛血清浓度的MEM培养基，无血清全悬浮培养型F81细胞为MS01培养基)，37℃，5％二氧化碳浓度下培养48h，结果如图1、2、3所示：图1显示驯化前的贴壁培养型F81细胞在有血清贴壁培养状态下贴附于培养介质表面，呈镶嵌的铺路石状；图2显示低血清培养基培养的低血清贴壁型F81细胞有结团现象，细胞形态较饱满，边界较光滑，细胞大小均一；图3显示无血清全悬浮培养型F81细胞在无血清培养状态下F81细胞呈单个分散生长状，无结团现象，细胞形态饱满完整，边界光滑清晰，细胞大小均一，质量高。

实施例4猫细小病毒感染无血清全悬浮培养型F81细胞系的敏感性

1)取无血清全悬浮培养型F81细胞系第30代细胞复苏，使用无血清的营养液培养，细胞密度控制在10×10⁵cells/mL，传代周期为48h，连续稳定传代5代以后进行下一步实验，培养条件为120r/min、37℃、5％CO₂摇床培养；

2)取步骤1)最后一步所得细胞进行实验，细胞培养48h后，将细胞密度控制在10×10⁵cells/mL，取20mL悬浮液放入125mL摇瓶内，传代时同步接种猫细小病毒(FPLV BJ04，由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所宠物疫病创新团队赠送，已在文献：刘琪,史利军,梁琳,等.一株猫泛白细胞减少症病毒的分离鉴定及其VP2和NS1基因的变异分析[J].畜牧兽医学报,2019,50(5):1106-1112.中公开)，MOI为1，每隔24h取样计数并留样检测用，培养至80％细胞死亡后(接毒后72h)收毒，培养条件为120r/min、37℃、5％CO₂摇床培养；

3)TCID50检测：贴壁F81细胞用血清浓度为5％的MEM培养液铺板，铺板时细胞密度2×10⁵cells/mL，每孔100μL，6h后，待细胞贴壁以后，进行换液，对照孔每孔加100μL血清浓度为2％的MEM培养液，然后待检样品(步骤2)得到的病毒液)作连续10倍系列稀释，稀释液为2％血清浓度的MEM培养液，稀释每个梯度时更换枪头，依次按-9、-8、-7、-6、-5的顺序加样(共5个稀释度)，每孔100μL，每个稀释度8个重复。

经TCID50检测，病毒效价为10^7.5TCID₅₀/0.1mL。接毒36h后，观察细胞病变情况，结果如图5、6所示：接毒36h后，细胞透亮度降低，细胞碎片渣滓较多，形态大小不一，有部分死细胞；对照组(加入等量2％血清浓度的MEM培养液)细胞图如图4所示：细胞单个生长，整体形态统一且边缘平滑，透亮度高和细胞碎片较少。可见，猫细小病毒感染无血清全悬浮培养型F81细胞系对猫细小病毒敏感。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种无血清全悬浮培养型F81细胞系，名称为猫肾细胞F81悬浮细胞，于2021年11月4日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2021289。

2.权利要求1所述的无血清全悬浮培养型F81细胞系在（1）～（4）中任一项中的应用；

（1）培养病毒；

（2）制备培养病毒的产品；

（3）分离病毒；

（4）制备分离病毒的产品；

所述病毒为猫细小病毒、犬细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒、猫传染性鼻气管炎病毒和水貂病毒性肠炎病毒中的一种。

3.权利要求1所述的无血清全悬浮培养型F81细胞系在（5）～（6）中任一项中的应用；

（5）非诊断治疗目的地检测病毒；

（6）制备检测病毒的产品；

所述病毒为猫细小病毒、犬细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒、猫传染性鼻气管炎病毒和水貂病毒性肠炎病毒中的一种。

4.权利要求1所述的无血清全悬浮培养型F81细胞系在（7）～（8）中任一项中的应用；

（7）制备病毒疫苗；

（8）药物筛选；

所述药物为用于预防或治疗病毒感染所致的疾病的药物；

所述病毒为猫细小病毒、犬细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒、猫传染性鼻气管炎病毒和水貂病毒性肠炎病毒中的一种。

5.一种培养病毒的方法，将病毒接种至权利要求1所述的无血清全悬浮培养型F81细胞系，培养；

所述病毒为猫细小病毒、犬细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒、猫传染性鼻气管炎病毒和水貂病毒性肠炎病毒中的一种。

6.一种制备病毒疫苗的方法，将病毒接种至权利要求1所述的无血清全悬浮培养型F81细胞系，培养，灭活，得到病毒疫苗；

所述病毒为猫细小病毒、犬细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒、猫传染性鼻气管炎病毒和水貂病毒性肠炎病毒中的一种。

7.一种病毒疫苗，通过权利要求5所述培养病毒的方法或权利要求6所述制备病毒疫苗的方法制得。