CN104740627B - 一种兽用伪狂犬弱毒活疫苗的规模化生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种兽用伪狂犬弱毒活疫苗的规模化生产方法，是利用细胞悬浮工艺培养伪狂犬病毒弱毒株，使反应器内悬浮培养的BHK21‑C13细胞密度大于或等于2×10⁶细胞/mL，然后用含伪狂犬病悬浮种毒的病毒维持液进行培养，再将收获的伪狂犬弱毒病毒液经澄清、配苗、分装、冻干后得到兽用伪狂犬弱毒活疫苗。本发明能够实现伪狂犬弱毒病毒大量增殖，大大提高病毒滴度与抗原产量，实现工艺自动化，提高了疫苗的质量，不仅能提高BHK21‑C13细胞密度，自动监控细胞生长或病毒繁殖的最适生化条件，提高病毒滴度，而且工艺规模放大相对容易，疫苗质量稳定、批间差小，生产和应用前景广阔。

Description

一种兽用伪狂犬弱毒活疫苗的规模化生产方法

技术领域

本发明属于生物医药领域中疫苗的制备方法，特别是涉及一种用悬浮培养细胞生产兽用伪狂犬弱毒活疫苗的方法。

背景技术

伪狂犬病是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的多种家畜和野生动物的急性传染病，尤其是危害全球养猪业的重大传染病之一。

目前，伪狂犬病在世界范围内普遍发生，己有40多个国家和地区报道发生了伪狂犬病。随着规模化养猪的不断发展和强毒株的出现，猪伪狂犬病的发生和流行日趋严重。在我国己有20多个省市报道发生了猪伪狂犬病，并己先后分离到多株PRV毒株，己报道分离到的毒株有闽A、陕A、京A、AKW、SR、YN、DQ-8401、S、Y株等。目前尚无针对猪伪狂犬病的有效治疗药物，主要依靠疫苗接种、隔离感染猪群、淘汰隐性感染动物得到控制。

目前，国内生产伪狂犬疫苗的方法仍然采用原代或传代细胞系贴壁培养方法，其采用的是传统转瓶生产工艺，具有抗原批量小、批间差大、效率低下、劳动强度大、占用场地多等缺点。而本发明利用悬浮培养工艺不仅可克服上述转瓶生产工艺的缺点，而且还可提高抗原产量、节约成本、提高产品品质，但是目前暂无生产伪狂犬弱毒活疫苗的悬浮培养工艺及其应用的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种用悬浮培养细胞生产兽用伪狂犬弱毒活疫苗的方法，以达到规模化生产优质兽用伪狂犬弱毒活疫苗的目的。

本发明所提供的兽用伪狂犬弱毒活疫苗的规模化生产方法，是利用细胞悬浮工艺培养伪狂犬病毒弱毒株，使反应器内悬浮培养的BHK21-C13细胞密度大于或等于2×10⁶细胞/mL，然后用含伪狂犬病悬浮种毒的病毒维持液进行培养，再将收获的伪狂犬弱毒病毒液经澄清、配苗、分装、冻干后得到兽用伪狂犬弱毒活疫苗。

其中，反应器内悬浮培养BHK21-C13细胞过程为：利用复苏的BHK21-C13悬浮细胞株在营养液中传代悬浮培养至BHK21-C13悬浮细胞的细胞密度≥2.0×10⁶细胞/mL，将悬浮细胞转移至反应器中，加入悬浮专用培养基至细胞密度0.2-0.5×10⁶细胞/mL，在36.5±0.5℃，pH值7.20±0.1，DO值30％-60％(溶解度百分比)，转速60-110rpm下培养48-72小时至反应器内的BHK21-C13细胞密度大于等于2×10⁶细胞/mL。

所述营养液或悬浮专用培养基为：在BBSM培养基中按1.15g/L加入碳酸氢钠，再添加3％-5％(体积百分比)新生牛血清，调节pH值至7.2±0.5。

培养伪狂犬生产用悬浮病毒液过程为：将反应器内培养合格的BHK21-C13悬浮细胞弃掉悬浮专用培养基，加入病毒维持液恢复至原培养体积，再按1％体积加入伪狂犬悬浮种毒，在36.5±0.5℃，pH值7.40-7.60，DO值30％-60％(溶解度百分比)，转速60-110rpm下培养，待细胞病变≥75％时收获病毒液。

所述病毒维持液为：BBSM培养基中按1.15g/L加入碳酸氢钠，再添加1％-3％(体积比)新生牛血清，pH值7.4±0.5。

以上所述的生产方法中，视生产规模由小至大反应器容积依次为5L、50L、500或5000L；且，大规模的生产使用大容积的反应器，该反应器中使用前一小规模生产容器中培养的BHK21-C13悬浮细胞。5L、50L、500L、5000L反应器中的培养方法及培养条件相同。

所述生产方法中，所述伪狂犬病悬浮种毒是用BHK21-C13悬浮细胞培养伪狂犬基础种毒培养的伪狂犬生产用悬浮种毒，具体获得过程如下：

1)伪狂犬基础种毒培养

取贴壁培养得到的长势良好且已铺满单层的BHK21-C13贴壁细胞，弃去原培养液，加入含1％(体积百分比)伪狂犬病弱毒种毒的病毒维持液(维持液同权利要求5)，在37℃培养，当细胞病变≥75％(数量百分比)时收获病毒液，-20℃冷冻保存，取样检测TCID₅₀，每0.1mL病毒含量应≥10^6.0TCID₅₀；

2)伪狂犬生产用悬浮种毒培养

将反应器内培养合格的悬浮BHK21-C13细胞，弃掉细胞营养液，加入病毒维持液恢复至原培养体积，再按1％(体积百分比)加入伪狂犬基础种毒，pH值7.40-7.60，DO20％-60％(溶解度百分比)，转速60-110rpm，温度36.0±0.5℃条件下累计悬浮培养72-96h，待细胞病变≥75％(数量百分比)时收获病毒液，-20℃冷冻保存；

为适应大规模生产，伪狂犬生产用悬浮种毒还包括哪些在反应器中传代扩大培养至种毒批所需体积的部分，即将步骤2)收获的病毒液经反应器扩大培养1-2代得到的生产用伪狂犬病悬浮种毒批。

所述生产方法中，兽用伪狂犬弱毒病毒液的澄清采用0.45μm滤芯正压过滤；

冻干包括：预冻阶段：常温进箱，1-2h将制品降至-42℃并维持2h；升华干燥阶段：1-2h将制品从-42℃升至-8℃并维持10h；0.5-1h将制品从-8℃升至0℃并维持0.5-1h；解吸干燥阶段：1-2h将制品从0℃升至28℃并维持7h，冻干结束。

本发明用悬浮培养细胞生产兽用伪狂犬弱毒活疫苗，实现了规模化生产优质兽用伪狂犬弱毒活疫苗。该方法的核心是利用生物反应器大规模悬浮培养BHK21-C13细胞并接种伪狂犬种毒，调节培养参数使伪狂犬病毒大量繁殖，从而获得高浓度及高滴度的伪狂犬病毒，病毒液经澄清、稀释、冻干制备兽用伪狂犬弱毒活疫苗。利用本发明提供的用BHK21-C13悬浮培养细胞制备兽用伪狂犬弱毒活疫苗工艺，作为伪狂犬病毒宿主细胞的BHK21-C13细胞悬浮培养非常成功，培养体积可达5000L，细胞密度达到2-4×10⁶细胞/mL。本发明能够实现伪狂犬弱毒病毒大量增殖，大大提高病毒滴度与抗原产量，实现工艺自动化，提高了疫苗的质量，解决了传统转瓶培养BHK21-C13细胞生产伪狂犬病毒产量低、疫苗效力低、免疫剂量大等技术难题。本发明还克服了目前工艺繁琐、抗原含量低，效力低，剂量大、批间差大等技术难题，不仅能提高BHK21-C13细胞密度，自动监控细胞生长或病毒繁殖的最适生化条件，提高病毒滴度，而且工艺规模放大相对容易，疫苗质量稳定、批间差小，生产和应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为本发明用悬浮培养细胞制备兽用伪狂犬弱毒活疫苗的工艺流程图

具体实施方式

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1、用悬浮培养细胞制备兽用伪狂犬弱毒活疫苗

如图1所示，本发明用悬浮培养细胞制备兽用伪狂犬弱毒活疫苗的主要工艺流程包括以下五个步骤：1、悬浮BHK21-C13种细胞培养；2、悬浮BHK21-C13细胞5L、50L、500L、5000L反应器培养；3、伪狂犬弱毒悬浮种毒培养；4、伪狂犬弱毒活疫苗生产用悬浮毒液培养；5、澄清、配苗、分装、冻干。

一、悬浮培养BHK21-C13种细胞

1、种细胞复苏

从液氮中取出一支冻存的BHK21-C13悬浮细胞株，37℃快速融化，1000rpm离心5分钟，弃上清液，加入悬浮专用培养基(配制：BBSM培养基中按1.15g/L加入碳酸氢钠，再添加3％-5％(体积百分比)新生牛血清，调节pH值至7.2±0.5。BBSM培养基购自北京清大天一科技有限公司，产品代码：MD910)，重悬，调节接种密度为0.2-0.5×10⁶细胞/mL，转至125mL细胞培养瓶中培养，培养体积：30-50mL，37℃、100rpm培养。

2、细胞传代

细胞培养48h后取样计数，若细胞密度≥2.0×10⁶细胞/mL时进行细胞传代，否则继续培养，取需要传代的细胞，加入悬浮专用培养基(配制同上)，将细胞液稀释至0.2-0.5×10⁶细胞/mL，将稀释好的细胞液分装培养瓶中悬浮培养1-3代，扩增至反应器所需体积和密度(细胞密度≥2.0×10⁶细胞/mL)。

二、反应器悬浮培养BHK21-C13细胞

1、BHK21-C13细胞5L反应器悬浮培养

将步骤一培养得到的符合要求的悬浮细胞(细胞密度≥2.0×10⁶细胞/mL，存活率大于90％)250-1000mL混合在专用接种瓶内。将接种瓶内的细胞转移至5L反应器中，补加悬浮专用培养基(配制同上)至5000mL，细胞密度稀释至0.2-0.5×10⁶细胞/mL，设定细胞培养温度：36.5±0.5℃，pH值：7.20±0.1，DO值：20％-60％(饱和度百分比)，转速随着细胞密度、培养体积、搅拌方式的不同而不同，一般在60-110rpm。细胞培养48h后取样计数，当细胞密度≥2.0×10⁶细胞/mL时将细胞液转至50L反应器内培养，或作为培养病毒使用(可用于伪狂犬生产用悬浮种毒培养，根据生产毒需求量不同，从而使用不同规格的反应器培养)，否则继续培养至所需细胞密度。经测，细胞密度达2-4×10⁶细胞/mL。

2、BHK21-C13细胞50L反应器悬浮培养

取步骤1培养的符合要求(细胞密度≥2.0×10⁶细胞/mL)的悬浮细胞，加入50L反应器中，补加悬浮专用培养基(组成同上)至50L，使细胞密度稀释至0.2-0.5×10⁶细胞/mL，设定细胞培养温度：36.5±0.5℃，pH值：7.20±0.1，DO值：20％-60％(饱和度百分比)，转速随着细胞密度、培养体积、搅拌方式的不同而不同，一般在60-110rpm。细胞培养48h后取样计数，当细胞密度≥2.0×10⁶细胞/mL时，可将细胞转至500L反应器内继续培养或培养病毒使用，否则继续培养至所需细胞密度。

3、BHK21-C13细胞500L反应器悬浮培养

取步骤2培养的符合要求(细胞密度≥2.0×10⁶细胞/mL)的悬浮细胞，加入500L反应器中，补加悬浮专用培养基(组成同上)至500L，使细胞密度稀释至0.2-0.5×10⁶细胞/mL，设定细胞培养温度：36.5±0.5℃，pH值：7.20±0.1，DO值：20％-60％(饱和度百分比)，转速随着细胞密度、培养体积、搅拌方式的不同而不同，一般在60-110rpm。细胞培养48h后取样计数，当细胞密度≥2.0×10⁶细胞/mL时，可将细胞转至5000L反应器继续培养或病毒培养使用，否则继续培养至所需细胞密度(细胞密度达到2-4×10⁶细胞/mL)。

4、BHK21-C13细胞5000L反应器悬浮培养

取步骤3培养的符合要求(细胞密度≥2.0×10⁶细胞/mL)的悬浮细胞，加入5000L反应器中，补加悬浮专用培养基(组成同上)约4500L，使细胞密度稀释至0.2-0.5×10⁶细胞/mL，设定细胞培养温度：36.5±0.5℃，pH值：7.20±0.1，DO值：20％-60％(饱和度百分比)，转速随着细胞密度、培养体积、搅拌方式的不同而不同，一般在60-110rpm。细胞培养48h后取样计数，当细胞密度≥2.0×10⁶细胞/mL时用于病毒培养，否则继续培养至所需细胞密度(细胞密度达2-4×10⁶细胞/mL)。

三、伪狂犬悬浮种毒培养

1、伪狂犬基础种毒培养

贴壁培养：从液氮中取出一支冻存的BHK21贴壁细胞株，37℃快速融化，1000rpm离心5分钟，弃上清液，加入少量MEM营养液(MEM培养基，用7.5％(质量体积百分比W/V)碳酸氢钠溶液调节pH值至7.2±0.5，添加8％-10％(体积百分比)的新生牛血清；MEM培养基购自宜兴市赛尔生物科技有限公司，产品代码：1605-030)重悬后加入75cm²细胞培养瓶中，补加MEM营养液至30mL，至37℃培养箱静置培养，待细胞长满单层后取用或继续传代。

细胞传代：取长满单层的贴壁细胞，弃去原培养液，加入消化液(0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA)5-10ml，细胞消化分散后按所需比例加入MEM营养液，将细胞液按比例分装至新细胞瓶中，至37℃培养箱静置培养，待细胞长满单层后取用或继续传代。

基础种毒培养：取长势良好且已铺满单层的BHK21-C13贴壁细胞，弃去原培养液，加入病毒维持液(维持液配方：MEM培养基，用7.5％(质量体积百分比W/V)碳酸氢钠溶液调节pH值至7.4±0.5，添加1％-3％(体积百分比)的新生牛血清；MEM培养基购自宜兴市赛尔生物科技有限公司，产品代码：1605-030)补充至原体积，再按1％(体积比)的比例加入伪狂犬种毒(例如Bartha-K61毒株，来源中国农业科学院哈尔滨兽医研究所)，于37℃培养，当细胞病变≥75％(数量百分比)时收获病毒液得到伪狂犬基础种毒，-20℃冷冻保存，取样检测TCID₅₀，每0.1mL病毒含量应≥10^6.0TCID₅₀。

2、伪狂犬生产用悬浮种毒培养

将反应器内培养合格的悬浮BHK21-C13细胞(步骤二获得，取用量依据规模调整)，弃掉原培养液，加入病毒维持液(维持液配方：BBSM培养基按1.15g/L加入的碳酸氢钠，添加1％-3％(体积百分比)新生牛血清，调节pH值至7.4±0.5)恢复至原培养体积，再加入1％(体积百分比)伪狂犬基础种毒(上述步骤1得到)，设定病毒培养的pH值为7.40-7.60，DO：20％-60％(饱和度百分比)，转速：60-110rpm，温度：36.0±0.5℃，累计悬浮培养72-96h，待细胞病变≥75％(数量百分比)时收获病毒液作为悬浮生产种毒，-20℃冷冻保存。

更大规模生产时，可用收获的生产用悬浮种毒液，经反应器再连续培养2-3代作为悬浮生产种毒，-20℃保存。

四、伪狂犬生产用悬浮毒液培养

1、50L反应器培养伪狂犬生产用悬浮病毒液

将反应器内培养合格的悬浮BHK21-C13细胞(步骤二获得)，弃掉悬浮专用培养基，加入病毒维持液(维持液配方：BBSM培养基按1.15g/L加入碳酸氢钠，添加1％-3％(体积百分比)新生牛血清，调节pH值至7.4±0.5)恢复至原培养体积，再加入1％(体积百分比)伪狂犬悬浮生产种毒(步骤三得到)，设定病毒培养的pH值为7.40-7.60，DO值：20％-60％(饱和度百分比)，转速：60-110rpm，温度：36.0±0.5℃。悬浮培养，待细胞病变≥75％(数量百分比)时收获病毒液，-20℃冷冻保存。取样检测TCID₅₀，每0.1mL中病毒含量应≥10^6.0TCID₅₀。将符合要求的病毒液用于配制疫苗。

2、500L反应器培养伪狂犬生产用悬浮病毒液

将反应器内培养合格的悬浮BHK21-C13细胞(步骤二获得)，弃掉悬浮专用培养基，加入病毒维持液(维持液配方：BBSM培养基按1.15g/L加入的碳酸氢钠，添加1％-3％新生牛血清，调节pH值至7.4±0.5)恢复至原培养体积，再加入1％(体积百分比)伪狂犬悬浮生产种毒(步骤三得到)，设定病毒培养的pH值为7.40-7.60，DO值：20％-60％，转速：60-110rpm，温度：36.0±0.5℃。悬浮培养，待细胞病变≥75％时收获病毒液，-20℃冷冻保存。取样检测TCID₅₀，每0.1mL中病毒含量应≥10^6.0TCID₅₀。将符合要求的病毒液用于配制疫苗。

3、5000L反应器培养伪狂犬生产用悬浮病毒液

将反应器内培养合格的悬浮BHK21-C13细胞(步骤二获得)，弃掉悬浮专用培养基，加入病毒维持液(维持液配方：BBSM培养基按1.15g/L加入碳酸氢钠，添加1％-3％(体积百分比)新生牛血清，调节pH值至7.4±0.5)恢复至原培养体积，再加入1％(体积百分比)伪狂犬悬浮生产种毒(步骤三得到)，设定病毒培养的pH值为7.40-7.60，DO：20％-60％(饱和度百分比)，转速：60-110rpm，温度：36.0±0.5℃。悬浮培养，待细胞病变≥75％(体积百分比)时收获病毒液，-20℃冷冻保存。取样检测TCID₅₀，每0.1mL中病毒含量应≥10^6.0TCID₅₀。将符合要求的病毒液用于配制疫苗。

五、澄清、配苗、分装、冻干、成品检验

1、澄清

将步骤四收获的悬浮生产毒液从冷库中提出，室温解冻，用0.45μm的已灭菌澄清过滤器预处理病毒液至带降温***的中转储存罐内。

2、配苗、分装

将检验合格的半成品加入适量冻干保护剂定量分装，每份疫苗至少含5000TCID₅₀。分装后迅速进行冷冻真空干燥。

3、冻干

预冻阶段：常温进箱，1-2h将制品降至-42℃并维持2h；

升华干燥阶段：1-2h将制品从-42℃升至-8℃并维持10h；0.5-1h将制品从-8℃升至0℃并维持0.5-1h；

解吸干燥阶段：1-2h将制品从0℃升至28℃并维持7h，冻干结束。

4、成品检验

对成品苗进行以下项目的检测：物理性状、无菌检验、剩余水分测定、真空度测定、安全检验、效力检验、热稳定性试验、细菌内毒素检查、异常毒性检查。相关检测方法及标准符合《中华人民共和国兽药典2010版第三部》之规定。

检验结果如表1所示。

表1 兽用伪狂犬弱毒活疫苗成品检验结果

由表1可以看出，本发明用悬浮培养细胞制备兽用伪狂犬弱毒活疫苗的生产工艺提高了单位制品产量，实现了细胞高密度培养及表达，降低了生产成本、劳动强度，保证了大规模生产疫苗制品的质量，生产和应用前景广阔。

Claims (12)

1.一种兽用伪狂犬弱毒活疫苗的规模化生产方法，是利用细胞悬浮工艺培养伪狂犬病毒弱毒株，使反应器内悬浮培养的BHK21-C13细胞密度达到2-4×10⁶细胞/mL，然后用含伪狂犬病悬浮种毒的病毒维持液进行培养，再将收获的伪狂犬弱毒病毒液经澄清、配苗、分装、冻干后得到兽用伪狂犬弱毒活疫苗，每0.1mL所述伪狂犬弱毒病毒液中病毒含量≥10^6.0TCID₅₀；

反应器内悬浮培养BHK21-C13细胞的营养液或悬浮专用培养基为：在BBSM培养基中按1.15g/L加入碳酸氢钠，再按体积百分比添加3％-5％新生牛血清，调节pH值至7.2±0.5；

培养伪狂犬生产用悬浮病毒液过程为：将反应器内培养合格的BHK21-C13悬浮细胞弃掉悬浮专用培养基，加入病毒维持液恢复至原培养体积，再按1％体积加入伪狂犬悬浮种毒，在36.0±0.5℃，pH值7.40-7.60，DO值20％-60％，转速60-110rpm下培养，待细胞病变≥75％时收获病毒液。

2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于：反应器内悬浮培养BHK21-C13细胞过程为：利用复苏的BHK21-C13悬浮细胞株在营养液中传代悬浮培养至BHK21-C13悬浮细胞的细胞密度≥2.0×10⁶细胞/mL，将悬浮细胞转移至反应器中，加入悬浮专用培养基至细胞密度0.2-0.5×10⁶细胞/mL，在36.5±0.5℃，pH值7.20±0.1，DO值30％-60％，转速60-110rpm下培养48-72小时至反应器内的BHK21-C13细胞密度大于等于2×10⁶细胞/mL。

3.根据权利要求1或2所述的生产方法，其特征在于：所述病毒维持液为：BBSM培养基中按1.15g/L加入碳酸氢钠，再按体积比添加1％-3％新生牛血清，pH值7.4±0.5。

4.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于：视生产规模由小至大反应器容积依次为5L、50L、500或5000L；且，大规模的生产使用大容积的反应器，该反应器中使用前一小规模生产容器中培养的BHK21-C13悬浮细胞。

5.根据权利要求4所述的生产方法，其特征在于：5L、50L、500L、5000L反应器中的培养方法及培养条件相同。

6.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于：所述伪狂犬病悬浮种毒是用BHK21-C13悬浮细胞培养伪狂犬基础种毒培养的伪狂犬生产用悬浮种毒，具体获得过程如下：

1)伪狂犬基础种毒培养

取贴壁培养得到的长势良好且已铺满单层的BHK21-C13贴壁细胞，弃去原培养液，加入含体积百分比1％伪狂犬病弱毒种毒的病毒维持液，在37℃培养，当细胞病变数量百分比≥75％时收获病毒液，-20℃冷冻保存，取样检测TCID₅₀，每0.1mL病毒含量应≥10^6.0TCID₅₀；

2)伪狂犬生产用悬浮种毒培养

将反应器内培养合格的悬浮BHK21-C13细胞，弃掉细胞营养液，加入病毒维持液恢复至原培养体积，再按体积百分比1％加入伪狂犬基础种毒，pH值7.40-7.60，DO值溶解度百分比20％-60％，转速60-110rpm，温度36.0±0.5℃条件下累计悬浮培养72-96h，待细胞病变数量百分比≥75％时收获病毒液，-20℃冷冻保存。

7.根据权利要求6所述的生产方法，其特征在于：所述伪狂犬生产用悬浮种毒还包括将步骤2)收获的病毒液经反应器扩大培养1-2代得到的生产用伪狂犬病悬浮种毒批。

8.根据权利要求7所述的生产方法，其特征在于：兽用伪狂犬弱毒病毒液的澄清采用0.45μm滤芯正压过滤；

冻干包括：

预冻阶段：常温进箱，1-2h将制品降至-42℃并维持2h；

升华干燥阶段：1-2h将制品从-42℃升至-8℃并维持10h；0.5-1h将制品从-8℃升至0℃并维持0.5-1h；

解吸干燥阶段：1-2h将制品从0℃升至28℃并维持7h，冻干结束。

9.根据权利要求1或2所述的生产方法，其特征在于：兽用伪狂犬弱毒病毒液的澄清采用0.45μm滤芯正压过滤；

冻干包括：

预冻阶段：常温进箱，1-2h将制品降至-42℃并维持2h；

升华干燥阶段：1-2h将制品从-42℃升至-8℃并维持10h；0.5-1h将制品从-8℃升至0℃并维持0.5-1h；

解吸干燥阶段：1-2h将制品从0℃升至28℃并维持7h，冻干结束。

10.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于：兽用伪狂犬弱毒病毒液的澄清采用0.45μm滤芯正压过滤；

冻干包括：

预冻阶段：常温进箱，1-2h将制品降至-42℃并维持2h；

升华干燥阶段：1-2h将制品从-42℃升至-8℃并维持10h；0.5-1h将制品从-8℃升至0℃并维持0.5-1h；

解吸干燥阶段：1-2h将制品从0℃升至28℃并维持7h，冻干结束。

11.根据权利要求5所述的生产方法，其特征在于：所述伪狂犬病悬浮种毒是用BHK21-C13悬浮细胞培养伪狂犬基础种毒培养的伪狂犬生产用悬浮种毒，具体获得过程如下：

1)伪狂犬基础种毒培养

取贴壁培养得到的长势良好且已铺满单层的BHK21-C13贴壁细胞，弃去原培养液，加入含体积百分比1％伪狂犬病弱毒种毒的病毒维持液，在37℃培养，当细胞病变数量百分比≥75％时收获病毒液，-20℃冷冻保存，取样检测TCID₅₀，每0.1mL病毒含量应≥10^6.0TCID₅₀；

2)伪狂犬生产用悬浮种毒培养

将反应器内培养合格的悬浮BHK21-C13细胞，弃掉细胞营养液，加入病毒维持液恢复至原培养体积，再按体积百分比1％加入伪狂犬基础种毒，pH值7.40-7.60，DO值溶解度百分比20％-60％，转速60-110rpm，温度36.0±0.5℃条件下累计悬浮培养72-96h，待细胞病变数量百分比≥75％时收获病毒液，-20℃冷冻保存。

12.根据权利要求11所述的生产方法，其特征在于：兽用伪狂犬弱毒病毒液的澄清采用0.45μm滤芯正压过滤；

冻干包括：

预冻阶段：常温进箱，1-2h将制品降至-42℃并维持2h；

升华干燥阶段：1-2h将制品从-42℃升至-8℃并维持10h；0.5-1h将制品从-8℃升至0℃并维持0.5-1h；

解吸干燥阶段：1-2h将制品从0℃升至28℃并维持7h，冻干结束。