CN108220227A - 一种通过全悬浮传代细胞系悬浮培养新城疫病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

一种通过全悬浮传代细胞系悬浮培养新城疫病毒的方法，所述方法如下：取生长密度为8×106细胞/mL‑16×106细胞/mL的全悬浮EB66细胞系通过二阶培养法进行新城疫病毒的接种，接毒后继续培养，并每隔12h取样，以测定病毒的EID50，在病毒的滴度最高时收获病毒并保存，完成新城疫病毒的培养。本发明通过采用鸭胚胎干细胞EB66传代细胞系进行鸡新城疫病毒培养，有效提高所得到病毒的滴度及纯度，进而使生产出的疫苗具有较高品质，并降低生产成本。

Description

一种通过全悬浮传代细胞系悬浮培养新城疫病毒的方法
技术领域
本发明涉及一种新城疫病毒的全悬浮培养方法，特别涉及一种通过全悬浮传代细胞系悬浮培养新城疫病毒的方法，属于兽用生物制品技术领域。
背景技术
新城疫(Newcastle disease，ND)是由副黏病毒科(Paramyxoviridae)、副黏病毒属(Paramyxovirus)的新城疫病毒(Newcastle diseasevirus，NDV)引起的一种具有急性败血性、高度接触性的传染病，是当今世界危害最大的家禽传染病之一，鸡只在感染后的发病率和死亡率均在90％以上，，因此该病被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病，该类疾病在我国发病频繁，严重的影响着我国养禽业的健康发展。目前，新城疫在我国发病率仍然比较高，危害着我国的食品安全及人类健康。现有防控该病最主要的手段仍是采用疫苗接种的方式进行预防。随着我国养禽业的飞速发展，对于该病的防控也显得越来越重要，因此研制出一种安全、有效、工艺简便、价格低廉、适用性高的新城疫疫苗对我国养禽业有着巨大的意义。
目前，在我国鸡新城疫疫苗的生产主要是通过接种9-12日龄的鸡胚来培养制备疫苗，尽管对于国内的新城疫防控发挥了巨大作用，但是如需进行大批量繁殖新城疫病毒来制备疫苗时，直接采用胚体进行病毒繁殖易受非免疫胚体来源限制，导致无法保证鸡胚来源、品种以及母源抗体水平的一致，继而对鸡胚的孵化率及其所繁殖病毒的效价造成很大影响，进而无法确保不同批次间的疫苗具有稳定效果。此外，鸡胚培养的病毒悬液中含有大量杂蛋白，在疫苗制备过程中存在一定的安全隐患，同时胚体废弃物往往高压灭菌并不彻底，存在散毒的危险，因此急需选择新的新城疫病毒疫苗生产介质进行新城疫病毒的生产。
目前已有报道用传代细胞系包括MDCK细胞系、vero细胞系、marc-145细胞系、ST细胞系、BHK细胞系、MDBK细胞系以及鸡胚传代细胞DF-1细胞系来培养新城疫病毒制备疫苗，但是由于上述细胞表面新城疫病毒受体丰度低，造成病毒滴度低，形成蚀斑能力弱，给进一步深入研究疫苗的制备造成极大困难。因此，选择一株细胞表面受体丰度高，能够大幅提高新城疫病毒的生长滴度及蚀斑形成能力的细胞株显得尤为重要。本发明选择的EB66全悬浮传代细胞系，为进一步研究新城疫病毒的增殖以及大规模细胞培养生产疫苗奠定了基础。
近年来，生物反应器培养细胞、繁殖病毒的技术广泛应用于生物制药行业。相对于传统的鸡胚和转瓶贴壁培养工艺，悬浮培养工艺技术有着巨大的优势：(1)单位体积细胞密度大大增加；(2)培养条件可控，自动化检测，全封闭、管道化***生产不仅降低了细胞污染率，而且减轻了工作人员的劳动强度，提高生产效率；(3)随着大规模生物反应器的使用，产品的均一性、产量和质量均得以显著提高；(4)生物反应器悬浮培养病毒制备生产疫苗，其成本远低于传统鸡胚和转瓶贴壁培养工艺，大大降低综合成本。
发明内容
本发明提供了针对现有技术存在的问题，提供一种用全悬浮传代细胞系EB66细胞和生物反应器培养新城疫病毒的方法，采用该方法培养病毒，生产工艺简便易操作，病毒滴度高、批间差异小，质量稳定均一，可显著提高疫苗产量和质量，使生产出的鸡新城疫疫苗具有使用安全、免疫效果好等特点，对新城疫强毒的攻击具有完全的免疫保护作用。
本发明的目的在于提供一种通过全悬浮传代细胞系悬浮培养新城疫病毒的方法，所述方法如下：
取生长密度为8×106细胞/mL-16×106细胞/mL的全悬浮EB66细胞系通过二阶培养法进行新城疫病毒的接种，接毒后继续培养，并每隔12h取样，以测定病毒的EID50，在病毒的滴度最高时收获病毒并保存，完成新城疫病毒的培养。
进一步地，上述方法所使用的全悬浮传代细胞系EB66细胞系的制备方法如下：将低温保存的EB66细胞从液氮罐中取出，并迅速置于37℃水浴锅中进行融化，加入到约30mL培养基中，300g的条件下离心10min，弃上清液，得到的细胞沉淀置于培养基中并吹打均匀，将培养基转移至三角培养瓶中，置于CO2培养箱中的轨道摇床进行悬浮培养，每天取样计数，并计算活率，当细胞长至第二天或第三天时，进行传代，连续传代2-3代次后，用于病毒的接种或者继续传代。
更进一步地，上述所得细胞在生长至第3天密度达到8×106细胞/mL-16×106细胞/mL后应用于进行新城疫病毒的接种。
本发明还有一目的在于提供一种通过全悬浮传代细胞系和生物反应器悬浮培养新城疫病毒的方法，所述方法如下：
取生长密度为8×106细胞/mL-16×106细胞/mL的全悬浮EB66细胞系接种至生物反应器中，并采用二阶培养法进行新城疫病毒的接种培养，每隔12h取样测定病毒的EID50，在病毒滴度最高时收获病毒并保存。
进一步地，上述方法所使用的全悬浮传代细胞系EB66细胞系的制备方法如下：将低温保存的EB66细胞从液氮罐中取出，并迅速置于37℃水浴锅中进行融化，加入到约30mL培养基中，300g的条件下离心10min，弃上清液，得到的细胞沉淀置于培养基中并吹打均匀，将培养基转移至三角培养瓶中，置于CO2培养箱中的轨道摇床进行悬浮培养，每天取样计数，并计算活率，当细胞长至第二天或第三天时，进行传代，连续传代2-3代次后，采用逐级放大的方法，进行扩大生产，待所得EB66细胞系的细胞数量满足生物反应器接种量，进行生物反应器接种。
进一步地，所述全悬浮EB66细胞系接种至生物反应器后，还需再次细胞培养，每天取样计数，并计算活率，当细胞长至8.0×106细胞/mL-16×106细胞/mL，活率在90％以上后，再采用二阶培养法进行新城疫病毒的接种。
进一步地，所述EB66细胞培养温度为33℃-37℃，优选的培养温度为35℃-37℃，最优地培养温度为37℃；培养转速为120rpm-150rpm，优选的培养转速为150rpm；摇床轨道直径为20mm-25mm。
进一步地，所述EB66细胞接毒量为10-1-10-5MOI，优选的为10-2MOI。
进一步地，所述EB66细胞接毒后还需进行吸附，所述EB66细胞接毒后的吸附时间为0.5h-1h，优选的，吸附时间为1h；培养温度为33℃-37℃，优选的，培养温度为37℃；培养转速为120rpm-150rpm，优选的，培养转速为120rpm。
更进一步地，所述EB66细胞接毒吸附完成后，还需补加原有生长培养基体积1-4倍的新鲜生产培养基，优选的，补加2倍新鲜生产培养基。
更进一步地，补加新鲜的生产培养基后还需进行再次培养，培养温度为33℃-37℃，优选的，培养温度为33℃；培养转速为120rpm-150rpm，优选的，培养转速为120rpm。
更进一步地，在采用全悬浮传代细胞系EB66细胞培养病毒时，还需补加TPCK胰酶，所述补加TPCK胰酶的方法为：在病毒接种后的第0、1、2、3天各补加1mg/L的TPCK胰酶或在病毒接种后第0天一次性补加4mg/L的TPCK胰酶，优选的，补加TPCK胰酶的方法为在病毒接种后第0、1、2、3天各补加1mg/LTPCK胰酶。
进一步地，所述反应器选自搅拌式生物反应器或激流式生物反应器中的一种或两种。
进一步地，所述EB66细胞培养基为健顺生物自制研发的无血清、化学界定培养基CD EB66(DP210)。
进一步地，所述的新城疫病毒为新城疫病毒lasota株。
本发明相对于现有技术，具有如下有益效果：
1、本发明采用鸭胚胎干细胞EB66传代细胞系进行鸡新城疫病毒培养，不仅避免了胚体含有外源病毒的风险，还消除了污染生态环境的隐患。本发明制备的病毒抗原纯净、质量稳定均一且安全；
2、本发明采用鸭胚胎干细胞EB66传代细胞系进行鸡新城疫病毒培养，避免了采用传统培养工艺生产时存在的大量杂蛋白的影响；
3、采用本发明培养的新城疫病毒各批次之间质量差异小，疫苗质量好，又克服了大量生产疫苗时可能存在鸡胚供应不足的缺点，节省了生产成本。另外还具有生产工艺简便易操作、培养环境可控、可大规模生产等特点，因而有很好的经济效益和应用前景；
4、本发明采用先进的悬浮培养技术，具有如下优势：(1)大大增加了细胞培养密度；(2)病毒滴度及疫苗效价显著提高，同时降低了疫苗产生的副反应；(3)采用了全封闭、管道化***的细胞与病毒培养方式，培养条件可实现自动监测，确保培养环境及病毒的稳定性；(4)使用生物反应器全悬浮培养新城疫病毒，克服了传统新城疫病毒培养难以放大的缺点，适合工业化大规模的生产鸡新城疫病毒与疫苗。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
本发明实施例1-9采用的原料来源如下：
1.病毒：鸡新城疫病毒La sota株(中国兽医药品监察所中国兽医微生物菌种保藏管理中心，CVCCAV1615)，由肇庆大华农生物药品有限公司保存；
2.细胞系：EB66传代细胞系，由甘肃健顺生物科技有限公司提供；
3.无血清、化学界定培养基：CD EB66(DP210)培养基，由甘肃健顺生物科技有限公司提供。
本发明实施例9采用的反应器为赛多利斯(Sartorius B Plus)搅拌式反应器(2L)。
本发明实施例1-9所使用的全悬浮传代细胞系EB66细胞的制备方法如下：
将EB66细胞按0.35×106细胞/mL-0.75×106细胞/mL的细胞密度接种至三角培养瓶中，置于37℃，5％CO2培养箱中的轨道摇床进行悬浮培养，转速为150rpm，每天进行取样计数，并计算细胞活率，当细胞长至8.0×106细胞/mL-16×106细胞/mL，活率在90％以上时，即得到可用于病毒接种全悬浮传代细胞系EB66细胞。
本发明实施例1-9的EID50检测方法如下：
将收获的病毒反复进行冻融离心3次，取离心后的上清液，使用灭菌生理盐水对病毒悬液进行10倍系列稀释，取10-6、10-7、10-8、10-9四个稀释度的病毒悬液分为四组，每组分别向5个10日龄SPF鸡胚尿囊腔中按照每胚0.1ml病毒液的接种量来接种病毒，接种后的鸡胚置于36～37℃的温度下继续孵育120h。48h以内死亡的鸡胚弃去不计，在48h～120h内死亡的鸡胚即时取出，收获鸡胚液，并将使用同一稀释度病毒悬液接种的鸡胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价。至120小时，取出所有活胚，逐个收获鸡胚液，并分别测定红细胞凝集价，凝集价不低于1:160(微量法1:128)者判为感染，计算EID50。病毒含量应该不低于106.0EID50。
实施例1
实施例1新城疫病毒的培养方法如下：
步骤1：采用二阶培养法按10-2MOI接种新城疫病毒于全悬浮传代细胞系EB66细胞，细胞接毒后置于37℃、5％CO2、轨道摇床转速为120rpm的培养箱中吸附培养1h，完成吸附培养后，补加2倍于原有生长培养基体积的新鲜生产培养基，并置于33℃、5％CO2、轨道摇床转速为120rpm培养箱中继续培养。在接毒后的第0、1、2、3天各补加1mg/L的TPCK胰酶。每隔12h取样，进行EID50的检测。在病毒滴度最高的时段收获病毒作为下一代驯化的种毒；
步骤2：将步骤1中收获的种毒反复冻融离心3次，并重复步骤1的方法接毒，进行传代驯化，如此连续传代培养3-4代。
不同代新城疫病毒的EID50检测结果(表1)如下：
表1：新城疫病毒在EB66细胞中的传代驯化结果
代次 EID50/0.1mL
1 108.55
2 109.25
3 1010.17
4 1010.15
从表中可以看出，随着在EB66细胞中的连续传代驯化，新城疫病毒能够很好的适应EB66细胞，经检测，每0.1mL培养液病毒含量为1010EID50以上，并且病毒滴度稳定，符合《中华人民共和国兽药典》规程。因此选择全悬浮传代细胞系EB66细胞作为新城疫病毒培养的靶细胞是非常具有可行性的。
实施例2-6：
实施例2-6新城疫病毒的培养方法如下：
采用二阶培养法，将新城疫病毒接种于全悬浮传代细胞系EB66细胞中，接毒的细胞后置于37℃、5％CO2、轨道摇床转速为120rpm的培养箱中吸附培养1h，完成吸附培养后，补加2倍于原有生长培养基体积的新鲜生产培养基，并置于33℃、5％CO2、轨道摇床转速为120rpm培养箱中继续培养。在接毒后的第0、1、2、3天各补加1mg/L的TPCK胰酶。每隔12h取样，进行EID50的检测。
其中，实施例2的新城疫病毒接毒量(MOI)为10；实施例3的新城疫病毒接毒量(MOI)为5；实施例4的新城疫病毒接毒量(MOI)为1；实施例5的新城疫病毒接毒量(MOI)为0.01；实施例6的新城疫病毒接毒量(MOI)为0.0001。
对实施例2-6所得新城疫病毒进行EID50检测，结果如表2所示：
表2：实施例2-6中不同接毒量对新城疫病毒在EB66细胞中增殖的影响
接毒量(MOI) EID50/0.1mL
实施例2 10 107.5
实施例3 5 108.5
实施例4 1 109.25
实施例5 0.01 109.77
实施例6 0.0001 109.25
从表中可以看出，新城疫病毒在EB66细胞中的培养受到接毒量的影响，接毒量过低或者过高都不能达到最佳的培养效果，当按MOI为0.01接毒时，可达到最高滴度，为每0.1mL培养液病毒含量约达到1010EID50，因此新城疫病毒在EB66细胞中的最佳接毒量为0.01MOI。
实施例7-8
实施例7-8新城疫病毒的培养方法如下：
采用二阶培养法，将新城疫病毒接种于全悬浮传代细胞系EB66细胞中，接毒的细胞后置于37℃、5％CO2、轨道摇床转速为120rpm的培养箱中吸附培养1h，完成吸附培养后，补加2倍于原有生长培养基体积的新鲜生产培养基，并置于33℃、5％CO2、轨道摇床转速为120rpm培养箱中继续培养。在接毒后向培养基中补加TPCK胰酶。每隔12h取样，进行EID50的检测。
其中，实施例7TPCK胰酶补加方式为：接毒后第0、1、2、3天各补加1mg/L的TPCK胰酶；实施例8TPCK胰酶补加方式为：接毒后第0天一次性补加4mg/L的TPCK胰酶。
对实施例7、8收获的病毒分别进行EID50检测，检测结果如表3所示：
表3：实施例7-8采用不同TPCK胰酶补加方式对新城疫病毒在EB66细胞中增殖的影响
TPCK胰酶补加方式 EID50/0.1mL
实施例7 接毒后第0、1、2、3天各补加1mg/L的TPCK胰酶 1010
实施例8 接毒后第0天一次性补加4mg/L的TPCK胰酶 108.5
从表中可以看出，不同的TPCK胰酶补加方式对于新城疫病毒在EB66细胞中的增殖有一定的影响，通过两种不同TPCK胰酶补加方式的比较，结果显示，在接毒后第0、1、2、3天各补加1mg/L的TPCK胰酶的方式会比接毒后第0天一次性补加4mg/L的TPCK胰酶获得更高的病毒滴度。
实施例9：
本发明实施例新城疫病毒在生物反应器中的培养方法包括如下步骤：
步骤1：将EB66细胞按0.35×106细胞/mL-0.75×106细胞/mL的细胞密度接种至生物反应器(Sartorius B Plus)中进行培养，具体的培养参数如下：
每天取样计数，并计算活率，当细胞长至8.0×106细胞/mL-16×106细胞/mL，活率在90％以上时，用于病毒的接种。
步骤2：采用二阶培养法，将反应器中的细胞留600mL，其余细胞打入三角摇瓶中，并留10mL作为摇瓶对照，在反应器中，新城疫病毒按MOI为0.01接种EB66细胞，接毒后搅拌速度调整为80rpm，进行吸附培养1h，病毒吸附培养完成后，补加1.5倍于原有生长培养基体积的新鲜生产培养基，温度调整为33℃，pH设置为7.20±0.1继续培养，搅拌速度调整为120rpm，其他培养参数不变；在三角摇瓶中，新城疫病毒按MOI为0.01接种于EB66细胞，接毒后置于37℃、5％CO2、轨道摇床转速为120rpm的培养箱中，进行吸附培养1h，病毒吸附培养完成后，补加1.5倍于原有生长培养基体积的新鲜生产培养基，置于33℃，5％CO2培养箱、轨道摇床转速为120rpm中继续培养。同时，在接毒后的第0、1、2、3天分别向反应器、三角摇瓶中各补加1mg/L的TPCK胰酶，并每隔12h取样，进行EID50的检测。
对实施例9收获的病毒分别进行EID50检测，检测结果如表3所示：
从表中可以看出，新城疫病毒在EB66细胞中的反应器培养，当培养条件稳定时，收获的病毒的效价(最高为109.75EID50/0.1mL)相比于摇瓶(最高为109.50EID50/0.1mL)也会有所提升，并且较三角摇瓶提前达到最高滴度。
经过多次使用反应器进行培养验证，确定当反应器中细胞培养条件和接毒培养条件如下表时，监测的EID50结果稳定，新城疫病毒的培养效果好。
综上所述，本发明实施例通过以EB66细胞作为新城疫病毒的靶细胞，具有如下优势：(1)EB66细胞无内源性逆转录酶病毒表达，无致瘤性，利用该细胞制备的疫苗更具安全性；(2)EB66细胞为鸭胚胎干细胞，属于禽源细胞，目前可用于新城疫病毒细胞培养的BHK-21细胞、HeLa细胞等都属于异源性传代细胞系，EB66细胞作为禽源细胞系对于新城疫等禽类病毒具有更好的病毒敏感性及适应性，利用该细胞培养的新城疫病毒滴度高，免疫源性好，副反应作用大大降低，有利于对禽类提供更加完全的保护；(3)EB66细胞倍增时间段(约12好-14h)，生长密度高(>3,000万个细胞/mL)，与其他细胞源及鸡胚源生产相比，大大缩短了疫苗的生产时间，对于提高病毒疫苗的生产效率具有非常大的优势，同时因为单位细胞密度高，因此病毒增殖滴度也高，生产出的病毒疫苗无需经过浓缩等下游繁琐的程序，大大节约了生产成本，可以在大流行流感爆发的情况下迅速投入生产，提供疫苗产品，为养禽业保驾护航，减少损失，最大限度的保护养殖户的经济利益；(4)EB66细胞的代谢特性：即使是在高细胞密度的条件下，细胞生长所消耗的谷氨酰胺量很低，进而保持铵和乳酸的积累在一个较低的水平，这对于细胞及病毒培养条件的稳定起到重要作用，有利于细胞及病毒的增殖，避免了培养过程更换培养基，极大的提高了培养基的利用率，节省了成本；(5)EB66细胞已经完全实现了全悬浮无血清培养，对于传统的微载体悬浮培养和培养基需要添加血清的培养方式，EB66细胞在进行病毒疫苗制备时无需微载体，突破了细胞生长需要基质表面贴附的限制，有效节约设备空间，提高设备利用率，实现真正意义上的大规模培养；此外，由于本发明实施例无需添加血清和消化液，从而大大减少了杂质的引入，简化后期的产品分离纯化过程，有效的降低了生产成本；(6)EB66细胞使用的培养基为专利权人自制研发的无血清、化学界定的个性化培养基，相比于国外昂贵的进口培养基，具有突出的价格优势，大大节约了成本。
综上所述，EB66细胞属于鸭胚胎干细胞衍生细胞株，具有胚胎干细胞源性、无致瘤性的优点，可实现全悬浮无血清高密度培养，且倍增时间短，适合于疫苗的规模化生产。本发明通过采用EB66细胞，利用其具有病毒敏感性广、安全性高、生产成本低等优点，有效提高培养出新城疫病毒的滴度及纯度，并降低生产成本，进而可以利用培养得到的新城疫病毒进行大批量疫苗的生产，并有效确保疫苗的使用安全。
其中，本发明所述的二阶培养法接毒指的是，当EB66细胞密度生长至8.0×106细胞/mL-16.0×106细胞/mL时，进行病毒的接种，待病毒吸附完成后，给予1-4倍生产培养基的补液，使补液后细胞密度在1.5×106细胞/mL-8.0×106细胞/mL之间(也可在补液之后接毒)。该生产工艺简单，易放大，不需要对培养基进行更换，大大提高了培养基的利用率，并节省成本；应当注意的，其中生产培养基和生长培养基可以为不同的培养基，也可为相同的培养基。生产培养基和生长培养基按照一定比例混合，即可使EB66细胞实现二次生长，从而有利于促进病毒增殖，提高最终的病毒产量。
其中，本发明实施例的病毒接毒量在10-1-10-5MOI之间，在此感染范围内，既能保证病毒复制的滴度，同时不至于因为由于病毒接种量太高而导致细胞发生病变的时间提前，从而防止细胞因过快的产生病变而凋亡，确保病毒维持在一个较高的滴度。
其中，本发明实施例9是通过生物反应器进行病毒培养，以全悬浮传代细胞系作为新城疫病毒的靶细胞，采用无血清化学界定的个性化培养基进行新城疫病毒的全悬浮培养，既解决了传统新城疫病毒培养受制于鸡胚供应的缺陷，又避免了感染外源病毒的风险，同时，无血清全悬浮培养可以突破传统贴壁细胞生长表面积的限制，避免了昂贵的微载体和血清的使，有效节约设备空间，并提高设备利用率，便于扩大生产规模。此外，本发明实施例9因生产过程中无需微载体和消化液，大大减少了产品杂质的引入，简化产品后期的分离纯化过程，有效的降低生产成本。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，技术人员阅读本申请说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围之内。

Claims (10)

1.一种通过全悬浮传代细胞系悬浮培养新城疫病毒的方法，其特征在于，所述方法如下：
取生长密度为8×106细胞/mL-16×106细胞/mL的全悬浮EB66细胞系通过二阶培养法进行新城疫病毒的接种，接毒后继续培养，并每隔12h取样，以测定病毒的EID50，在病毒的滴度最高时收获病毒并保存，完成新城疫病毒的培养。
2.一种通过全悬浮传代细胞系和生物反应器悬浮培养新城疫病毒的方法，其特征在于，所述方法如下：
取生长密度为8×106细胞/mL-16×106细胞/mL的全悬浮EB66细胞系接种至生物反应器中，并采用二阶培养法进行新城疫病毒的接种培养，每隔12h取样测定病毒的EID50，在病毒滴度最高时收获病毒并保存。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述全悬浮EB66细胞系接种至生物反应器后，还需再次细胞培养，每天取样计数，并计算活率，当细胞长至8.0×106细胞/mL-16×106细胞/mL，活率在90％以上后，再采用二阶培养法进行新城疫病毒的接种。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述EB66细胞培养温度为33℃-37℃；培养转速为120rpm-150rpm；摇床轨道直径为20mm-25mm。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述EB66细胞接毒量为10-1-10-5MOI，优选的为10-2MOI。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述EB66细胞接毒后还需进行吸附，所述EB66细胞接毒后的吸附时间为0.5h-1h；培养温度为33℃-37℃；培养转速为120rpm-150rpm。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述EB66细胞接毒吸附完成后，还需补加原有生长培养基体积1-4倍的新鲜生产培养基，优选补加2倍新鲜生产培养基。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，补加新鲜的生产培养基后还需进行再次培养，培养温度为33℃-37℃；培养转速为120rpm-150rpm。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在采用全悬浮传代细胞系EB66细胞培养病毒时，还需补加TPCK胰酶，所述补加TPCK胰酶的方法为：在病毒接种后的第0、1、2、3天各补加1mg/L的TPCK胰酶或在病毒接种后第0天一次性补加4mg/L的TPCK胰酶，优选的补加TPCK胰酶的方法为在病毒接种后第0、1、2、3天各补加1mg/LTPCK胰酶。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反应器选自搅拌式生物反应器或激流式生物反应器中的一种或两种。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110129281A (zh) * 2019-05-15 2019-08-16 成都天邦生物制品有限公司 一种使用悬浮细胞培养新城疫病毒的方法及应用
CN110862956A (zh) * 2018-08-27 2020-03-06 北京鼎持生物技术有限公司 一种新城疫病毒/全悬浮chok1细胞株及其制法和采用该细胞株制备的抗原及疫苗
CN112294952A (zh) * 2019-08-02 2021-02-02 成都天邦生物制品有限公司 一种鸡新城疫、h9亚型禽流感和禽腺病毒三联灭活疫苗
WO2021051907A1 (zh) * 2019-09-20 2021-03-25 华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司 一种全基因组表达载体pBR322-DHN3的制备方法
CN113699119A (zh) * 2020-12-10 2021-11-26 华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司 一种新城疫病毒及疫苗的无血清全悬浮培养制备方法
CN114350595A (zh) * 2022-01-17 2022-04-15 苏州博腾生物制药有限公司 一种hek293ts悬浮细胞的慢病毒滴度检测方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101668539A (zh) * 2007-04-24 2010-03-10 维涡里斯公司 用于产生病毒疫苗的源自鸭胚胎的干细胞系
WO2011095596A1 (en) * 2010-02-04 2011-08-11 Vivalis Fed-batch process using concentrated cell culture medium for the efficient production of biologics in eb66 cells
WO2013102155A1 (en) * 2011-12-29 2013-07-04 Cell Machines, Inc. Cells for virus and protein production
CN103386127A (zh) * 2013-08-09 2013-11-13 浙江美保龙生物技术有限公司 用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的方法
CN104258385A (zh) * 2014-11-03 2015-01-07 中国兽医药品监察所 Bhk-21细胞全悬浮培养技术在新城疫疫苗生产中的应用
CN105311630A (zh) * 2014-06-20 2016-02-10 普莱柯生物工程股份有限公司 一种哺乳动物细胞悬浮培养制备疫苗的方法与应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101668539A (zh) * 2007-04-24 2010-03-10 维涡里斯公司 用于产生病毒疫苗的源自鸭胚胎的干细胞系
WO2011095596A1 (en) * 2010-02-04 2011-08-11 Vivalis Fed-batch process using concentrated cell culture medium for the efficient production of biologics in eb66 cells
WO2013102155A1 (en) * 2011-12-29 2013-07-04 Cell Machines, Inc. Cells for virus and protein production
CN103386127A (zh) * 2013-08-09 2013-11-13 浙江美保龙生物技术有限公司 用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的方法
CN105311630A (zh) * 2014-06-20 2016-02-10 普莱柯生物工程股份有限公司 一种哺乳动物细胞悬浮培养制备疫苗的方法与应用
CN104258385A (zh) * 2014-11-03 2015-01-07 中国兽医药品监察所 Bhk-21细胞全悬浮培养技术在新城疫疫苗生产中的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
STÉPHANE OLIVIER等: ""EB66 cell line, a duck embryonic stem cell-derived substrate for the industrial production of therapeutic monoclonal antibodies with enhanced ADCC activity"", 《LANDES BIOSCIENCE》 *
顾彦: ""价值1亿细胞株为何花落健顺？"", 《中国战略新兴产业》 *
马萍等: ""TPCK胰酶和普通胰酶对各亚型流感病毒在MDCK细胞分离培养中的影响"", 《中国卫生检验杂志》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110862956A (zh) * 2018-08-27 2020-03-06 北京鼎持生物技术有限公司 一种新城疫病毒/全悬浮chok1细胞株及其制法和采用该细胞株制备的抗原及疫苗
CN110862956B (zh) * 2018-08-27 2021-08-17 北京鼎持生物技术有限公司 一种新城疫病毒/全悬浮chok1细胞株及其制法和采用该细胞株制备的抗原及疫苗
CN110129281A (zh) * 2019-05-15 2019-08-16 成都天邦生物制品有限公司 一种使用悬浮细胞培养新城疫病毒的方法及应用
CN112294952A (zh) * 2019-08-02 2021-02-02 成都天邦生物制品有限公司 一种鸡新城疫、h9亚型禽流感和禽腺病毒三联灭活疫苗
WO2021051907A1 (zh) * 2019-09-20 2021-03-25 华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司 一种全基因组表达载体pBR322-DHN3的制备方法
CN113699119A (zh) * 2020-12-10 2021-11-26 华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司 一种新城疫病毒及疫苗的无血清全悬浮培养制备方法
CN114350595A (zh) * 2022-01-17 2022-04-15 苏州博腾生物制药有限公司 一种hek293ts悬浮细胞的慢病毒滴度检测方法

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