CN109715667A - 抗-gprc5d抗体、结合gprc5d和cd3的双特异性抗原结合分子及其用途 - Google Patents

抗-gprc5d抗体、结合gprc5d和cd3的双特异性抗原结合分子及其用途 Download PDF

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Abstract

本文提供了特异性地结合至GPRC5D的抗体。本发明还描述了能够编码所提供的GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段的相关多核苷酸、表达所提供的抗体或抗原结合片段的细胞、以及相关载体和带可检测标记的抗体或抗原结合片段。此外，还描述了使用所提供的抗体的方法。例如，所提供的抗体可用于诊断、治疗或监测GPRC5D表达型癌症的进展、消退或稳定性；以用于确定癌症患者是否应该接受治疗；或用于确定受治疗者是否患有GPRC5D表达型癌症，并因此可适于用GPRC5D特异性抗癌治疗剂诸如本文所述的针对GPRC5D和CD3的多特异性抗体治疗。

Description

抗-GPRC5D抗体、结合GPRC5D和CD3的双特异性抗原结合分子 及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求提交于2016年7月20日的美国临时申请序列号62/364,811的权益。上述申请的全部内容全文以引用方式并入本文。
序列表
本申请包含已经以ASCII格式电子递交的序列表，所述序列表据此全文以引用方式并入。所述ASCII副本创建于2017年6月28日，命名为PRD3422USNP_SL.txt，并且大小为57,673字节。
技术领域
本文所提供的公开内容涉及特异性结合G蛋白偶联受体C5家族亚型D(GPRC5D)的单克隆抗体，特异性结合GPRC5D和簇决定子3(CD3)的多特异性抗体，以及产生和使用所述抗体的方法。
背景技术
多发性骨髓瘤(MM)为第二常见的恶性血液肿瘤，并且占所有癌症死亡的2％。MM为一种异质性疾病，并且主要由染色体易位引起，尤其是t(11；14)、t(4；14)、t(8；14)、del(13)、del(17)(Drach等人，(1998)Blood 92(3):802-809；Gertz等人，(2005)Blood 106(8):2837-2840；Facon等人，(2001)Blood 97(6):1566-1571))。由于骨髓浸润、骨破坏、肾衰竭、免疫缺陷以及癌症诊断的心理负担，MM影响的患者可能经历各种疾病相关症状。截至2006年，MM的5年相对存活率约为34％，强调MM是目前尚无治愈选择的难治性疾病。
G蛋白偶联受体C5家族亚型D(GPRC5D)是2001年首次鉴定出的孤儿非典C类GPCR(-Osborne等人Biochim Biophys Acta.1518(3):237-248,2001)。GPRC5D及其它5族GPCR通常具有C类受体的较短氨基端结构域，并因此预测在构象上类似于A类受体。就这一点而言，它们较为独特，与C类GPCR具有序列同源性并且所预测的结构拓扑相当于A类受体。GPRC5D活化的功能性结果尚未描述并且配体仍然未知。其基因具有三个外显子并且位于人的染色体12p13.3上。GPRC5D受体在不同物种间高度保守并且与食蟹猴GPRC5D共享92％的同一性。
GPRC5D mRNA主要表达于MM患者的所有恶性浆细胞中(Atamaniuk JA等人Eur JClin Invest 42(9)953-960；2012；Frigyesi-blood和Cohen等人Hematology 18(6):348-35；2013)。GPRC5D的表达在患者间有差异并且与浆细胞负荷和遗传畸变如Rb-1缺失密切相关(Atamaniuk JA等人Eur J Clin Invest42(9)953-960；2012)。
该GPRC5D在浆细胞谱系上的独有表达使其被指定为抗骨髓瘤抗体的理想靶标。
发明内容
本文提供了特异性地结合至GPRC5D的抗体及其抗原结合片段。本文还描述了能够编码所提供的GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段的相关多核苷酸、表达所提供的抗体和抗原结合片段的细胞、以及相关载体和带可检测标记的抗体和抗原结合片段。此外，还描述了使用所提供的抗体和抗原结合片段的方法。例如，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段可用于诊断或监测GPRC5D表达型癌症的进展、消退或稳定性；以用于确定癌症患者是否应该接受治疗；或用于确定受治疗者是否患有GPRC5D表达型癌症，并因此可适于用GPRC5D特异性抗癌治疗剂诸如本文所述的针对GPRC5D和CD3的多特异性抗体治疗。
本文还提供了免疫特异性地结合至GPRC5D和CD3的多特异性抗体及其多特异性抗原结合片段。本文还描述了能够编码所提供的GPRC5D×CD3多特异性抗体的相关多核苷酸、表达所提供的抗体的细胞以及相关载体和可检测标记的多特异性抗体。此外，还描述了使用所提供的多特异性抗体的方法。例如，GPRC5D×CD3多特异性抗体可用于诊断或监测GPRC5D表达型癌症的进展、消退或稳定性；以用于确定癌症患者是否应该接受治疗；或用于确定受治疗者是否患有GPRC5D表达型癌症，并因此可适于用GPRC5D特异性抗癌治疗剂诸如本文所述的GPRC5D×CD3多特异性抗体治疗。
GPRC5D特异性抗体
本文描述了特异于GPRC5D的分离抗体和抗原结合片段。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段结合人GPRC5D。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段结合人GPRC5D和食蟹猴GPRC5D。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段结合具有SEQ ID NO.22的氨基酸序列的多肽的一个或多个残基。该GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段能够以28nM或更小的EC50在体外诱导ADCC。
表1提供了本文所述的一些GPRC5D特异性抗体的示例的汇总：
表1：针对人GPRC5D生成的mAb的CDR序列
在一些实施方案中，提供了GPRC5D特异性抗体或其抗原结合片段，它们包含含有表1所述抗体中的任一抗体的CDR1、CDR2和CDR3的重链。在一些实施方案中，提供了GPRC5D特异性抗体或其抗原结合片段，它们包含含有表1所述抗体中的任一抗体的CDR1、CDR2和CDR3的重链以及含有表1所述抗体中的任一抗体的CDR1、CDR2和CDR3的轻链。在本文所述的一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体或其抗原结合片段与包含含有表1所述抗体中的任一抗体的CDR1、CDR2和CDR3的重链以及含有表1所述抗体中的任一抗体的CDR1、CDR2和CDR3的轻链的抗体或抗原结合片段竞争性结合GPRC5D。
人IgG类分为四种同种型：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。它们在Fc区的氨基酸序列中共享大于95％的同源性，但显示的主要差别在于铰链区的氨基酸组成和结构。Fc区介导效应子功能，诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。在ADCC中，抗体的Fc区结合至免疫效应子细胞(诸如自然杀伤细胞和巨噬细胞)的表面上的Fc受体(FcgR)，导致靶细胞的吞噬作用或裂解。在CDC中，抗体通过触发细胞表面的补体级联反应来杀伤靶细胞。本文所述的抗体包括具有与任何IgG同种型组合的可变域的所述特征的抗体，包括其中Fc序列已经被修饰以实现不同效应子功能的修饰型式。
对于治疗性抗体的许多应用，Fc介导的效应子功能不是作用机制的一部分。这些Fc介导的效应子功能可能是有害的，并可能通过引起机制外毒性而带来安全风险。修饰效应子功能可通过改造Fc区以减弱其与FcgR或补体因子的结合来实现。IgG与活化性FcgR(FcgRI、FcgRIIa、FcgRIIIa和FcgRIIIb)和抑制性FcgR(FcgRIIb)或补体(C1q)的第一组分的结合取决于位于铰链区和CH2结构域中的残基。已经在IgG1、IgG2和IgG4中引入突变以降低或沉默Fc功能。本文所述的抗体可包括这些修饰形式。
在一个实施方案中，抗体包含具有以下特性中的一者或多者的Fc区：(a)与亲本Fc相比效应子功能降低；(b)对FcgRI、FcgRIIa、FcgRIIb、FcgRIIIb和/或FcgRIIIa的亲和力降低；(c)对FcgRI的亲和力降低；(d)对FcgRIIa的亲和力降低；(e)对FcgRIIb的亲和力降低；(f)对FcgRIIIb的亲和力降低；或(g)对FcgRIIIa的亲和力降低。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段是IgG或其衍生物，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4同种型。在其中抗体具有IgG1同种型的一些实施方案中，所述抗体在其Fc区中含有L234A、L235A和/或K409R置换。在其中抗体具有IgG4同种型的一些实施方案中，所述抗体在其Fc区中含有S228P、L234A和L235A置换。本文所述的抗体可包括这些修饰形式。
除所述GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段之外，还提供了能够编码所述抗体和抗原结合片段的多核苷酸序列。还提供了包含所述多核苷酸的载体，以及表达本文提供的GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段的细胞。还描述了能够表达所公开的载体的细胞。这些细胞可为哺乳动物细胞(诸如293F细胞、CHO细胞)、昆虫细胞(诸如Sf7细胞)、酵母细胞、植物细胞或细菌细胞(诸如大肠杆菌)。所述抗体也可由杂交瘤细胞产生。
使用GPRC5D特异性抗体的方法
还公开了使用所述GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段的方法。用于本部分所讨论的方法中的特定抗体包括具有针对表1中的抗体所述的那组CDR的那些抗体。例如，这些抗体或抗原结合片段可用于治疗癌症，通过干扰GPRC5D-受体相互作用或其中抗体缀合至毒素，从而将毒素靶向GPRC5D表达型癌症。此外，这些抗体或抗原结合片段还可用于检测生物样品诸如血液或血清中GPRC5D的存在；用于定量分析生物样品诸如血液或血清中GPRC5D的量；用于诊断GPRC5D表达型癌症；用于确定治疗患有癌症的受治疗者的方法；或用于监测受治疗者中GPRC5D表达型癌症的进展。在一些实施方案中，GPRC5D表达型癌症可为淋巴瘤诸如多发性骨髓瘤(MM)。所述方法可在受治疗者接受GPRC5D表达型癌症的治疗，诸如用针对GPRC5D和CD3的多特异性抗体治疗之前进行。此外，所述方法可在受治疗者接受GPRC5D表达型癌症的治疗，诸如用本文所述针对GPRC5D和CD3的多特异性抗体治疗之后进行。
所述检测生物样品中的GPRC5D的方法包括将生物样品暴露于本文所述的GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段中的一种或多种。
所述诊断受治疗者中GPRC5D表达型癌症的方法还包括将生物样品暴露于本文所述的GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段中的一种或多种；然而，该方法还包括定量存在于样品中的GPRC5D的量；将存在于样品中的GPRC5D的量与已知标准品或参照样品进行比较；并确定受治疗者的GPRC5D水平是否落入与癌症相关的GPRC5D水平内。
本文还描述了监测受治疗者中GPRC5D表达型癌症的方法。所述方法包括将生物样品暴露于本文所述的GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段中的一种或多种；定量存在于由抗体或其抗原结合片段结合的样品中的GPRC5D的量；将存在于样品中的GPRC5D的量与已知标准品或参照样品或先前从受治疗者中获得的类似样品中的GPRC5D的量进行比较；以及基于所比较的样品中GPRC5D的量的差异，确定受治疗者的GPRC5D水平是否指示癌症进展、消退或稳定疾病。
从受治疗者中获得或来源于受治疗者的样品是生物样品，诸如尿液、血液、血清、血浆、唾液、腹水、循环细胞、循环肿瘤细胞、非组织缔合的细胞、组织、手术切除的肿瘤组织、活体组织切片、细针抽吸样品或组织学制备物。
可对所述的GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段进行标记以用于所述方法或本领域技术人员已知的其它方法。例如，本文所述的抗体或其抗原结合片段可用放射标记物、荧光标记物、表位标签、生物素、发色团标记物、ECL标记物、酶、钌、111In-DOTA、111In-二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶，或者聚组氨酸或本领域已知的类似此类标记物进行标记。
GPRC5D特异性抗体试剂盒
本文描述了包括所公开的GPRC5D特异性抗体或其抗原结合片段的试剂盒。所述试剂盒可用于实施使用本文提供的GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段的方法或本领域技术人员已知的其它方法。在一些实施方案中，所述试剂盒可包括本文所述的抗体或抗原结合片段以及用于检测生物样本中是否存在GPRC5D的试剂。因此，所述试剂盒可包括本文所述的抗体或其抗原结合片段中的一种或多种，以及用于在不使用时盛装抗体或片段的容器、抗体或片段的使用说明、附连于固体支持物的抗体或片段和/或如本文所述的抗体或片段的可检测标记形式。
GPRC5D×CD3多特异性抗体
通过TCR/CD3复合体将T淋巴细胞重定向至表达GPRC5D的MM细胞代表了一种有吸引力的替代方法。T淋巴细胞的TCR/CD3复合体由在细胞表面共表达的TCR α/β或TCR γ/δ异二聚体与CD3标记的γ、δ、ε、ζ和η的不变亚基组成。人CD3ε以UniProt P07766描述(CD3E_HUMAN)。现有技术中所述的抗CD3ε抗体是SP34(Yang SJ，The Journal of Immunology，(1986)137；1097-1100)。SP34与灵长类和人CD3反应。SP34购自Pharmingen。现有技术中所述的另一种抗CD3抗体是UCHT-1(参见WO2000041474)。现有技术中所述的另一种抗CD3抗体是BC-3(Fred Hutchinson Cancer Research Institute，用于GvHD的I/II期试验，Anasetti等人，Transplantation，54:844(1992))。SP34与UCHT-1和BC-3的不同之处在于，SP-34识别仅存在于CD3的ε链上的表位(参见Salmeron等人，1991年，J.Immunol.，第147卷，第3047页)，而UCHT-1和BC-3识别由ε链和γ链二者贡献的表位。在WO2008119565、WO2008119566、WO2008119567、WO2010037836、WO2010037837和WO2010037838中提到了具有与抗体SP34相同序列的抗体的序列。在US8236308(WO2007042261)中提到了与抗体SP34的VH具有96％同一性的序列。
本文描述了结合GPRC5D和CD3的分离多特异性抗体(“GPRC5D×CD3多特异性抗体”)及其多特异性抗原结合片段。在一些实施方案中，提供了免疫特异性地结合至GPRC5D的分离抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，多特异性抗体的GPRC5D特异性臂结合人GPRC5D和食蟹猴GPRC5D。在一些实施方案中，GPRC5D×CD3多特异性抗体或抗原结合片段的GPRC5D特异性臂结合人GPRC5D的细胞外结构域。在优选的实施方案中，GPRC5D×CD3多特异性抗体或抗原结合片段是双特异性抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，提供了包含以下的分离GPRC5D×CD3双特异性抗体或其GPRC5D×CD3双特异性结合片段：a)第一重链(HC1)；b)第二重链(HC2)；c)第一轻链(LC1)；和d)第二轻链(LC2)，其中HC1和LC1配对形成免疫特异性地结合GPRC5D的第一抗原结合位点，并且HC2和LC2配对形成免疫特异性地结合CD3的第二抗原结合位点。在另一个实施方案中，提供了表达所述抗体或双特异性结合片段的分离细胞。在一些实施方案中，GPRC5D×CD3多特异性抗体的GPRC5D结合臂(或“GPRC5D特异性臂”)来源于自本文所述的GPRC5D抗体(例如，来源于具有表1所列的CDR序列的抗体)。
在一些实施方案中，GPRC5D×CD3多特异性抗体或抗原结合片段的GPRC5D特异性臂为IgG或其衍生物。在一些实施方案中，GPRC5D×CD3多特异性抗体的CD3结合臂(或“CD3特异性臂”)来源于小鼠单克隆抗体SP34，一种小鼠IgG3/λ同种型(K.R.Abhinandan和A.C.Martin，2008年，Mol.Immunol.，45,3832-3839)。在一些实施方案中，GPRC5D×CD3多特异性抗体的CD3结合臂包含选自表2的一个VH结构域和一个VL结构域。
表2：CD3特异性抗体和抗原结合片段的重链和轻链：
人IgG类分为四种同种型：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。它们在Fc区的氨基酸序列中共享大于95％的同源性，但显示的主要差别在于铰链区的氨基酸组成和结构。Fc区介导效应子功能，诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。在ADCC中，抗体的Fc区结合至免疫效应子细胞(诸如自然杀伤细胞和巨噬细胞)的表面上的Fc受体(FcgR)，导致靶细胞的吞噬作用或裂解。在CDC中，抗体通过触发细胞表面的补体级联反应来杀伤靶细胞。
对于治疗性抗体的许多应用，Fc介导的效应子功能不是作用机制的一部分。这些Fc介导的效应子功能可能是有害的，并可能通过引起机制外毒性而带来安全风险。修饰效应子功能可通过改造Fc区以减弱其与FcgR或补体因子的结合来实现。IgG与活化性FcgR(FcgRI、FcgRIIa、FcgRIIIa和FcgRIIIb)和抑制性FcgR(FcgRIIb)或补体(C1q)的第一组分的结合取决于位于铰链区和CH2结构域中的残基。已经在IgG1、IgG2和IgG4中引入突变以降低或沉默Fc功能。
在一个实施方案中，抗体包含具有以下特性中的一者或多者的Fc区：(a)与亲本Fc相比效应子功能降低；(b)对FcgRI、FcgRIIa、FcgRIIb、FcgRIIIb和/或FcgRIIIa的亲和力降低；(c)对FcgRI的亲和力降低；(d)对FcgRIIa的亲和力降低；(e)对FcgRIIb的亲和力降低；(f)对FcgRIIIb的亲和力降低；或(g)对FcgRIIIa的亲和力降低。
在一些实施方案中，衍生多特异性抗体的CD3特异性臂的CD3特异性抗体或抗原结合片段是IgG或其衍生物。在一些实施方案中，衍生多特异性抗体的CD3特异性臂的CD3特异性抗体或抗原结合片段是IgG1或其衍生物。在一些实施方案中，例如，衍生CD3结合臂的CD3特异性IgG1抗体的Fc区在其Fc区中包含L234A、L235A和F405L置换。在一些实施方案中，衍生多特异性抗体的CD3特异性臂的CD3特异性抗体或抗原结合片段是IgG4或其衍生物。在一些实施方案中，例如，衍生CD3结合臂的CD3特异性IgG4抗体的Fc区在其Fc区中包含S228P、L234A、L235A、F405L和R409K置换。在一些实施方案中，衍生多特异性抗体的CD3特异性臂的CD3特异性抗体或抗原结合片段结合原代人T细胞和/或原代食蟹猴T细胞上的CD3ε。在一些实施方案中，衍生多特异性抗体的CD3特异性臂的CD3特异性抗体或抗原结合片段激活原代人CD4+ T细胞和/或原代食蟹猴CD4+ T细胞。
除所述GPRC5D×CD3多特异性抗体之外，还提供了能够编码所述GPRC5D×CD3多特异性抗体的多核苷酸序列。在一些实施方案中，提供了编码GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段的HC1、HC2、LC1或LC2的分离合成多核苷酸。还提供了包含所述多核苷酸的载体，以及表达本文提供的GPRC5D×CD3多特异性抗体的细胞。还描述了能够表达所公开的载体的细胞。这些细胞可为哺乳动物细胞(诸如293F细胞、CHO细胞)、昆虫细胞(诸如Sf7细胞)、酵母细胞、植物细胞或细菌细胞(诸如大肠杆菌)。所述抗体也可由杂交瘤细胞产生。在一些实施方案中，提供了用于通过培养细胞产生GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段的方法。
本文还提供了包含GPRC5D×CD3多特异性抗体或抗原结合片段的药物组合物以及药学上可接受的载体。
使用GPRC5D×CD3多特异性抗体的方法
还公开了使用所述GPRC5D×CD3多特异性抗体及其多特异性抗原结合片段的方法。例如，GPRC5D×CD3多特异性抗体及其多特异性抗原结合片段可用于治疗对其有需要的受治疗者中的GPRC5D表达型癌症。在一些实施方案中，GPRC5D表达型癌症为淋巴瘤诸如多发性骨髓瘤。
所述治疗对其有需要的受治疗者中GPRC5D表达型癌症的方法包括对受治疗者施用治疗有效量的所述GPRC5D×CD3多特异性抗体或其多特异性抗原结合片段。在一些实施方案中，受治疗者是哺乳动物，优选是人。在优选的实施方案中，提供了通过向对其有需要的患者施用治疗有效量的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性抗原结合片段足以治疗癌症的时间，从而治疗患有癌症的受治疗者的方法。
本文还提供了用于抑制癌细胞的生长或增殖的方法，该方法通过施用治疗有效量的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段以抑制癌细胞的生长或增殖。
本文还提供了将T细胞重定向至GPRC5D表达型癌细胞的方法，该方法通过施用治疗有效量的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段而将T细胞重定向至癌症。
GPRC5D×CD3特异性抗体试剂盒
本文描述了包括所公开的GPRC5D×CD3多特异性抗体的试剂盒。所述试剂盒可用于实施使用本文提供的GPRC5D×CD3多特异性抗体的方法或本领域技术人员已知的其它方法。在一些实施方案中，所述试剂盒可包括本文所述的抗体和用于治疗GPRC5D表达型癌症的试剂。因此，所述试剂盒可包括本文所述的多特异性抗体或其多特异性抗原结合片段中的一种或多种、以及用于在不使用时盛装抗体或片段的容器和/或抗体或片段的使用说明、附连于固体支持物的抗体或片段和/或如本文所述的抗体或片段的可检测标记形式。
附图说明
图1：所选抗GPRC5D mAb针对人GPRC5D和未转染的HEK 293细胞的浓度依赖性结合特征。三种mAb即GC5B36、GC5B168和GC5B205也被观察到结合未转染的(GPRC5D空白)HEK293细胞。
图2：抗GPCR5D×CD3双特异性抗体对人GPRC5D HEK293F细胞的剂量依赖性结合。
图3：利用FACS，将双特异性抗体对MM1R和H929细胞的结合特征与过表达的人GPCR5D HEK293细胞和未转染的HEK293细胞进行比较。
图4A和4B：抗GPCR5D×CD3抗体对人GPRC5D表达型细胞的T-细胞介导的细胞毒性和T细胞活化。
图5A和5B：抗GPCR5D×CD3抗体对cyno GPRC5D表达型细胞的T-细胞介导的细胞毒性和T细胞活化。
图6A和6B：GPRC5D×CD3Ab在预防NSG小鼠模型中有效地杀伤H929细胞。GCDB32(6A)和GCDB35(6B)在10ug剂量下导致完全肿瘤生长抑制，并且GCDB32也能够在1ug剂量下100％抑制肿瘤生长。
图7A和7B：在不存在(7A)和存在(7B)Fc阻断时效力的比较。
图8A-8D：GCDB32、GCDB35、GCDB40和GCDB43与Fcγ受体的结合。
图9A和9B：杂交瘤衍生的mAb的FACS结合评估。
图10A和10B：GPRC5D×CD3双特异性抗体针对H929细胞的T-细胞介导的细胞毒性。
图11A-11E：结合GPRC5D阳性(H929，MM1R，LP1，OPM2)和阴性细胞系(NALM6)的GPRC5D×CD3双特异性抗体。
图12A-12D：GPRC5D×CD3双特异性Ab是体内有效的肿瘤抑制剂。所有的GPRC5D×CD3双特异性Ab(示于12A的GCDB32，示于12B的GCDB53，示于12C的GCDB61，以及示于12D的GCDB72)在10ug和1ug剂量下完全抑制多发性骨髓瘤细胞(H929)肿瘤生长。在0.1ug剂量下观察到分化，并且观察到GCDB72具有80％的肿瘤生长抑制。
图13：将GPRC5D+MM1.R细胞系用各种浓度前导抗体染色60分钟，以测量表面结合特征(n＝3)。藻红蛋白标记的人IgG4Fc用作第二抗体来捕获信号(Southern Biotech，克隆HP6025)。结合表示为归一化几何平均荧光强度，如由FACS所测。使用具有可变斜率(四个参数)的非线性回归和最小二乘拟合法在GraphPadPrism 6中完成数据的作图和拟合。
图14A和14B：将GPRC5D+细胞系用各种浓度的FAB6300和GC5M481抗体染色60分钟，以测量表面结合特征。藻红蛋白标记的人IgG4Fc用作第二抗体来捕获信号(SouthernBiotech，克隆HP6025)。结合表示为柱状图(黑线代表同种型，并且红线代表特异性GPRC5D抗体)(图14A)。图14B示出前导分子对GPRC5D+多发性骨髓瘤细胞系的结合模式。暗色虚线指示同种型对照，并且实线指示前导分子结合。
图15A和15B：相比于IgG4同种型对照，使用来自两名不同MM患者的冷冻骨髓衍生的单核细胞来评估GPRC5D×CD3双特异性抗体结合、浆细胞毒性和T-细胞活化。就细胞毒性测定而言，将来自正常健康供体的T细胞外源加入患者BM MNC样本并与四种前导分子温育48小时。GPRC5D×CD3双特异性抗体以剂量依赖性方式结合至所有供体样品的浆细胞，并且在Y轴上记录平均荧光强度。注意到响应于GPRC5D×CD3双特异性抗体处理，活的浆细胞(CD138+)损失并且T细胞上的CD25同时上调。
图16：在第0天，经皮下给NSG小鼠植入MM.1S人多发性骨髓瘤细胞。在研究第7天静脉内接种人PBMC。在15、18、22、24、29、32和36天静脉内给予PBS、GCDB72(0.1μg，1μg，10μg和50μg/动物(分别等同于0.005mg/kg，0.05mg/kg，0.5mg/kg和2.5mg/kg))和空白对照抗体。皮下肿瘤每周测量两次，并且结果表示为平均肿瘤体积(以各组的mm3±SEM表示)。相比于PBS，GCDB72抗体处理在以1μg(0.05mg/kg)给予时显著抑制sc肿瘤生长(TGI＝64％，p≤0.0001)。10μg/动物(0.5mg/kg)和50μg/动物(2.5mg/kg)的GCDB72剂量使肿瘤生长完全退化(p≤0.0001)。空白对照抗体具有可忽略的影响或无影响。利用Graph Pad Prism软件(版本6)，使用Tukey的多重比较测试进行多重比较，用双因素方差分析对统计显著性进行评价。当概率值(p)≤0.05时，组之间的差异被认为是显著的。
图17：在第0天，经皮下给NSG植入MM.1S人多发性骨髓瘤细胞。在研究第7天静脉内接种人PBMC。在15、18、22、24、29、32和36天静脉内给予PBS、GCDB72(0.1μg，1μg，10μg和50μg/动物(分别等同于0.005mg/kg，0.05mg/kg，0.5mg/kg和2.5mg/kg))和空白对照抗体。体重表示为处理开始到研究结束的绝对体重。
具体实施方式
定义
与说明书的各方面相关的各种术语在说明书和权利要求书中通篇使用。除非另外指明，否则此类术语被赋予本领域的普通含义。其它具体定义的术语应按照与本文所提供的定义相符的方式理解。
如本说明书和所附权利要求中所用，除非内容另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代。因此，例如，对“一个细胞”的提及包括两个或更多个细胞的组合等等。
如本文所用，术语“约”在涉及可测量值诸如量、时距等时，意指涵盖与指定值至多±10％的变化，因为这类变化适合执行本发明所公开的方法。除非另外指明，否则说明书和权利要求书中使用的表示成分的量、特性诸如分子量、反应条件等的所有数字在所有情况下均应理解为被术语“约”修饰。因此，除非有相反的说明，否则在下述说明书和所附权利要求书中列出的数值参数均为近似值，这些近似值可根据本发明寻求获得的期望特性而变化。在最低程度上且不试图将等同原则的应用限制到权利要求书的保护范围的前提下，至少应当根据所报告的数值的有效数位并通过应用惯常的四舍五入法来解释每一个数值参数。
尽管用以阐明本发明之宽范围的数值范围和参数是近似的，但在具体的实施例中提出的数值却是尽可能精确地报告的。然而，任何数值均固有地包含某些误差，所述误差必然会由存在于其各自测试测量法中的标准偏差产生。
“分离”意指生物组分(诸如核酸、肽或蛋白质)已经与组分天然存在的生物体的其它生物组分(即其它染色体和染色体外DNA和RNA以及蛋白质)基本上分离、分开得到或从其中纯化出来。因此，已经“分离”的核酸、肽和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。“分离”核酸、肽和蛋白质可为组合物的一部分，并且如果这样的组合物不是核酸、肽或蛋白质自身环境的一部分，则仍然是分离的。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸、肽和蛋白质以及化学合成的核酸。如本文所用，“分离”抗体或抗原结合片段旨在意指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体或抗原结合片段的抗体或抗原结合片段(例如，特异性地结合至GPRC5D的分离抗体基本上不含特异性地结合除GPRC5D以外的抗原的抗体)。然而，特异性地结合至GPRC5D的表位、亚型或变体的分离抗体可与其它相关抗原，例如来自其它物种(诸如GPRC5D物种同源物)的抗原具有交叉反应性。
同义地称为“核酸分子”、“核苷酸”或“核酸”的“多核苷酸”是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可为未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于单链和双链的DNA、为单链区和双链区的混合物的DNA、单链和双链的RNA以及为单链区和双链区的混合物的RNA、包含可为单链或更典型地为双链或者为单链区和双链区的混合物的DNA和RNA的杂合分子。此外，“多核苷酸”是指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰的碱基的DNA或RNA，以及具有出于稳定性或其它原因而被修饰的主链的DNA或RNA。“修饰的”碱基包括例如三苯甲基化的碱基和稀有碱基诸如肌苷。可对DNA和RNA进行多种修饰；因此，“多核苷酸”包括通常天然存在的多核苷酸的化学修饰、酶修饰或代谢修饰形式，以及病毒和细胞特有的DNA和RNA的化学形式。“多核苷酸”也包括相对短的核酸链，通常被称为寡核苷酸。
“基本上相同”的含义可根据使用该术语的上下文而不同。由于重链和轻链以及编码它们的基因之间可能存在的天然序列变异，预期在氨基酸序列或编码本文所述的抗体或抗原结合片段的基因中发现一定程度的变异，而对其独特的结合特性(例如，特异性和亲和力)产生的影响很小或无影响。此类预期部分归因于遗传密码的简并性以及保守氨基酸序列变异的成功进化，但这不会明显改变所编码蛋白质的性质。因此，在核酸序列的上下文中，“基本上相同”意指两个或更多个序列之间具有至少65％的同一性。优选地，该术语是指两个或更多个序列之间具有至少70％的同一性，更优选至少75％的同一性，更优选至少80％的同一性，更优选至少85％的同一性，更优选至少90％的同一性，更优选至少91％的同一性，更优选至少92％的同一性，更优选至少93％的同一性，更优选至少94％的同一性，更优选至少95％的同一性，更优选至少96％的同一性，更优选至少97％的同一性，更优选至少98％的同一性，以及更优选至少99％或更高的同一性。两个序列之间的百分比同一性是序列所共有的相同位置数目的函数(即，同源性％＝相同位置的数目/位置总数×100)，考虑到空位的数目和每个空位的长度，需要引入这些参数用于两个序列的最佳比对。两个核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性可例如使用E.Meyers和W.Miller，Comput.Appl.Biosci 4，11-17(1988)的算法(该算法已经并入ALIGN程序(版本2.0)中)，使用PAM120加权残基表、空位长度罚分12和空位罚分4来确定。此外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可使用Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48,444-453(1970)的算法来确定。
在蛋白质的氨基酸序列中可能发生的对蛋白质功能没有实质性影响的变异程度远低于核酸序列的变异程度，因为相同的简并性原则不适用于氨基酸序列。因此，在抗体或抗原结合片段的上下文中，“基本上相同”意指与所述抗体或抗原结合片段具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的抗体或抗原结合片段。其它实施方案包括具有框架、支架或其它非结合区的GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段，其不与本文所述的抗体和抗原结合片段具有显著的同一性，但确实并入一个或多个CDR或赋予与本文所述的此类序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的结合所需的其它序列。“载体”是复制子，诸如质粒、噬菌体、粘粒或病毒，其中可以可操作地***另一核酸区段以引起该区段的复制或表达。
“克隆”是来源于单细胞或共同祖细胞通过有丝***产生的细胞群。“细胞系”是能够在体外稳定生长许多代的原代细胞的克隆。在本文提供的一些示例中，通过用DNA转染细胞来转化细胞。
术语“表达”和“产生”在本文中同义使用，并且是指基因产物的生物合成。这些术语涵盖基因到RNA的转录。这些术语还涵盖RNA到一个或多个多肽的翻译，并且还涵盖所有天然存在的转录后和翻译后修饰。抗体或其抗原结合片段的表达或产生可在细胞的细胞质内，或者在胞外环境中诸如细胞培养物的生长培养基中。
术语“治疗”(“treating”或“treatment”)是指在减轻或改善损伤、病变或病症方面取得的任何成功或成功迹象，包括任何客观或主观参数，诸如症状减轻、缓解、削弱或使患者更能耐受病症，减缓退变或衰退速率，使退变终点衰竭程度降低，改善受治疗者的身体或心理健康，或延长存活时间。可通过客观或主观参数评估治疗；包括体格检查、神经学检查或精神评价的结果。
“有效量”或“治疗有效量”是指在所需剂量和时间段内有效实现所需治疗结果的量。GPRC5D×CD3抗体的治疗有效量可根据因素诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及抗体在个体中引发所需应答的能力而变化。治疗有效量也是其中抗体或抗体部分的治疗有益效应远远超过任何毒性或有害效应的量。
除非另有说明，否则“抗体”是指包括各种单体、聚合和嵌合形式的免疫球蛋白的所有同种型(IgG、IgA、IgE、IgM、IgD和IgY)。术语“抗体”具体地涵盖多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)和抗体样多肽，诸如嵌合抗体和人源化抗体。
“抗原结合片段”是可对特定抗原表现出结合亲和力的任何蛋白质性结构。抗原结合片段包括通过任何已知技术诸如酶切割、肽合成和重组技术提供的那些。一些抗原结合片段由完整抗体的保留亲本抗体分子的抗原结合特异性的部分组成。例如，抗原结合片段可包含已知结合特定抗原的抗体的至少一个可变区(重链可变区或轻链可变区)或者一个或多个CDR。合适的抗原结合片段的示例包括但不限于双体抗体和单链分子以及Fab、F(ab’)2、Fc、Fabc和Fv分子；单链(Sc)抗体；单个抗体轻链；单个抗体重链；抗体链或CDR与其它蛋白质之间的嵌合融合体；蛋白质支架；重链单体或二聚体；轻链单体或二聚体；由一条重链和一条轻链组成的二聚体；由VL、VH、CL和CH1域组成的单价片段；或如WO2007059782中所述的单价抗体；包含由铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；基本上由V.sub.H和C.sub.H1域组成的Fd片段；基本上由抗体的单臂的VL域和VH域组成的Fv片段；基本上由VH域组成的dAb片段(Ward等人，Nature 341,544-546(1989))，并且也被称为域抗体(Holt等人，Trends Biotechnol.，2003年11月，21(11):484-90)；羊驼或纳米抗体(Revets等人，Expert Opin Biol Ther.，2005年1月，5(1):111-24)；分离互补决定区(CDR)等。所有抗体同种型均可用于产生抗原结合片段。另外，抗原结合片段可包括非抗体蛋白质性框架，其可成功地以赋予感兴趣的给定抗原(诸如蛋白质支架)亲和力的取向并入多肽区段。抗原结合片段可重组产生或通过对完整抗体的酶切割或化学切割产生。短语“抗体或其抗原结合片段”可用于表示给定的抗原结合片段并入该短语中提及的抗体的一个或多个氨基酸区段。
术语“CDR”是指互补决定区(CDR)，其中三个构成轻链可变区(CDRL1、CDRL2和CDRL3)的结合特征，三个构成重链可变区(CDRH1、CDRH2和CDRH3)的结合特征。CDR有助于抗体分子的功能活性，并且由包含支架或框架区的氨基酸序列分开。确切定义的CDR边界和长度受限于不同的分类和编号***。因此，可通过Kabat、Chothia、contact或任何其它边界定义来引用CDR。尽管边界不同，但这些***中的每一个在可变序列内构成所谓的“高变区”的方面具有一定程度的重叠。因此，根据这些***的CDR定义可在长度和相对于相邻框架区域的边界区域方面不同。参见例如Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，NIH出版物号91-3242(1991)；Chothia等人，“Canonical Structures Forthe Hypervariable Regions of Immunoglobulins”，J.Mol.Biol.196:901(1987)；以及MacCallum等人，“Antibody-Antigen Interactions:Contact Analysis and BindingSite Topography”，J.Mol.Biol.262:732(1996))；这些文献中的每一篇全文据此均以引用方式并入。
通常，CDR形成可被分类为规范结构的环状结构。术语“规范结构”是指抗原结合(CDR)环所采用的主链构象。从比较结构研究中，已发现六个抗原结合环中有五个仅具有受限的可用构象库。每个规范结构可由多肽主链的扭转角来表征。因此，抗体之间的对应环可具有非常相似的三维结构，尽管环的大部分区域具有高氨基酸序列可变性(Chothia等人，“Canonical Structures For the Hypervariable Regions of Immunoglobulins”，J.Mol.Biol.196:901(1987)；Chothia等人，“Conformations of ImmunoglobulinHypervariable Regions”，I 342:877(1989)；Martin和Thornton，“Structural Familiesin Loops of Homologous Proteins:Automatic Classification,Modelling andApplication to Antibodies”，J.Mol.Biol.263:800(1996)；这些文献中的每一篇全文均以引用方式并入)。此外，采用的环状结构与其周围的氨基酸序列之间存在关系。特定规范类的构象由环的长度以及位于环内以及保守框架内(即，环外部)关键位置的氨基酸残基确定。因此，可基于这些关键氨基酸残基是否存在来进行对特定规范类的分配。
术语“多肽”可与术语“蛋白质”互换使用，并且从其最广泛的意义上来讲，是指两个或更多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或模拟肽物的化合物。亚基可由肽键连接。在另一实施方案中，亚基可由其它键连接，例如，酯、醚等。如本文所用，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然氨基酸或者合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D光学异构体和L光学异构体、氨基酸类似物和模拟肽物。在肽链短的情况下，通常将三个或更多个氨基酸的肽称为寡肽。如果肽链较长，所述肽通常称为多肽或蛋白质。
当在抗体或抗体片段的上下文中使用时，“特异性结合”或“特异地结合”或其衍生术语表示通过由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的结构域结合至感兴趣的蛋白质的一个或多个表位，而不优先结合含有混合分子群的样品中的其它分子。通常，抗体以如通过表面等离振子共振测定或细胞结合测定来测量的小于约1×10-8M的Kd结合至同源抗原。短语诸如“[抗原]特异性”抗体(例如，GPRC5D特异性抗体)意在表达所述抗体特异性地结合所述抗原。
同义地称为“核酸分子”、“核苷酸”或“核酸”的“多核苷酸”是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可为未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于单链和双链的DNA、为单链区和双链区的混合物的DNA、单链和双链的RNA以及为单链区和双链区的混合物的RNA、包含可为单链或更典型地为双链或者为单链区和双链区的混合物的DNA和RNA的杂合分子。此外，“多核苷酸”是指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰的碱基的DNA或RNA，以及具有出于稳定性或其它原因而被修饰的主链的DNA或RNA。“修饰的”碱基包括例如三苯甲基化的碱基和稀有碱基诸如肌苷。可对DNA和RNA进行多种修饰；因此，“多核苷酸”包括通常天然存在的多核苷酸的化学修饰、酶修饰或代谢修饰形式，以及病毒和细胞特有的DNA和RNA的化学形式。“多核苷酸”也包括相对短的核酸链，通常被称为寡核苷酸。
“载体”是复制子，诸如质粒、噬菌体、粘粒或病毒，其中可以可操作地***另一核酸区段以引起该区段的复制或表达。
如本文所用，术语“宿主细胞”可为任何类型的细胞，例如，原代细胞、培养中的细胞或来自细胞系的细胞。在具体的实施方案中，术语“宿主细胞”是指用核酸分子转染的细胞和此类细胞的后代或潜在后代。此类细胞的后代可与用核酸分子转染的亲本细胞不同，例如，由于可在后代中发生的突变或环境影响或者由于核酸分子整合到宿主细胞基因组中。术语“表达”和“产生”在本文中同义使用，并且是指基因产物的生物合成。这些术语涵盖基因到RNA的转录。这些术语还涵盖RNA到一个或多个多肽的翻译，并且还涵盖所有天然存在的转录后和翻译后修饰。抗体或其抗原结合片段的表达或产生可在细胞的细胞质内，或者在胞外环境中诸如细胞培养物的生长培养基中。“基本上相同”的含义可根据使用该术语的上下文而不同。由于重链和轻链以及编码它们的基因之间可能存在的天然序列变异，预期在氨基酸序列或编码本文所述的抗体或抗原结合片段的基因中发现一定程度的变异，而对其独特的结合特性(例如，特异性和亲和力)产生的影响很小或无影响。此类预期部分归因于遗传密码的简并性以及保守氨基酸序列变异的成功进化，但这不会明显改变所编码蛋白质的性质。因此，在核酸序列的上下文中，“基本上相同”意指两个或更多个序列之间具有至少65％的同一性。优选地，该术语是指两个或更多个序列之间具有至少70％的同一性，更优选至少75％的同一性，更优选至少80％的同一性，更优选至少85％的同一性，更优选至少90％的同一性，更优选至少91％的同一性，更优选至少92％的同一性，更优选至少93％的同一性，更优选至少94％的同一性，更优选至少95％的同一性，更优选至少96％的同一性，更优选至少97％的同一性，更优选至少98％的同一性，以及更优选至少99％或更高的同一性。两个序列之间的百分比同一性是序列所共有的相同位置数目的函数(即，同源性％＝相同位置的数目/位置总数×100)，考虑到空位的数目和每个空位的长度，需要引入这些参数用于两个序列的最佳比对。两个核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性可例如采用E.Meyers和W.Miller，Comput.Appl.Biosci 4，11-17(1988)的算法(该算法已经并入ALIGN程序(版本2.0)中)，使用PAM120加权残基表、空位长度罚分12和空位罚分4来确定。此外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可使用Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48,444-453(1970)的算法来确定。
在蛋白质的氨基酸序列中可能发生的对蛋白质功能没有实质性影响的变异程度远低于核酸序列的变异程度，因为相同的简并性原则不适用于氨基酸序列。因此，在抗体或抗原结合片段的上下文中，“基本上相同”意指与所述抗体或抗原结合片段具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的抗体或抗原结合片段。其它实施方案包括具有框架、支架或其它非结合区的GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段，其不与本文所述的抗体和抗原结合片段具有显著的同一性，但确实并入一个或多个CDR或赋予与本文所述的此类序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的结合所需的其它序列。
术语“受治疗者”是指人和非人动物，包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物诸如非人灵长类动物、小鼠、兔、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。在所述方法的许多实施方案中，受治疗者是人。
如本文所用，术语“重定向”或“重新定向”是指GPRC5D×CD3抗体使T细胞的活性由其固有同源特异性有效地向抗GPRC5D表达型细胞的反应***换的能力。
如本文所用，术语“样品”是指与受治疗者分离的类似流体、细胞或组织(例如，手术切除的肿瘤组织、活体组织切片，包括细针抽吸组织)以及存在于受治疗者中的流体、细胞或组织的集合。在一些实施方案中，样品是生物流体。生物流体通常是在生理温度下的液体，并且可包括存在于受治疗者或生物来源中，从受治疗者或生物来源中抽取、表达或以其它方式提取的天然存在的流体。某些生物流体来源于特定组织、器官或局部区域，并且某些其它生物流体可更全身性或***性地位于受治疗者或生物来源中。生物流体的示例包括血液，血清和浆膜液，血浆，淋巴液，尿液，唾液，囊液，泪液，粪便，痰，分泌组织和器官的粘膜分泌物，***分泌物，腹水诸如与非实体肿瘤相关的那些，胸膜、心包、腹膜、腹部和其它体腔的流体，通过支气管灌洗收集的流体等。生物流体还可包括与受治疗者或生物来源接触的液体溶液，例如细胞和器官培养基，包括细胞或器官条件培养基、灌洗液等。如本文所用，术语“样品”涵盖从受治疗者中取出的物质或存在于受治疗者中的物质。
“已知标准品”可为具有已知量或已知浓度的GPRC5D的溶液，其中所述溶液可为天然存在的溶液，诸如来自已知患有早期、中度、晚期、进行性或静态癌症的患者的样品；或者所述溶液可为合成溶液，诸如其中稀释了已知量的GPRC5D的缓冲水溶液。本文所述的已知标准品可包括从受治疗者中分离的GPRC5D、重组或纯化的GPRC5D蛋白质或与疾病病症相关的GPRC5D浓度值。
如本文所用，术语“G蛋白偶联受体C5家族亚型D”和“GPRC5D”特别包括人GPRC5D蛋白，例如，如GenBank登录号BC069341、NCBI参考序列：NP_061124.1和UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q9NZD1中所描述的那些(还可参见Brauner-Osborne,H等人，2001,Biochim.Biophys.Acta 1518,237-248)。
术语“CD3”是指人CD3蛋白质多亚基复合体。CD3蛋白质多亚基复合体由6个不同的多肽链构成。这些多肽链包括CD3γ链(SwissProt P09693)、CD3δ链(SwissProt P04234)、两条CD3ε链(SwissProt P07766)和一条CD3ζ链同源二聚体(SwissProt 20963)，并且该复合体与T细胞受体α和β链缔合。除非另有说明，否则术语“CD3”包括由细胞(包括T细胞)天然表达或者能够在用编码那些多肽的基因或cDNA转染的细胞上表达的任何CD3变体、同种型和物种同源物。
“GPRC5D×CD3抗体”为多特异性抗体，任选为双特异性抗体，其包含两个不同的抗原结合区，其中一个结合区特异性地结合至抗原GPRC5D，并且其中另一个结合区特异性地结合至CD3。多特异性抗体可为双特异性抗体、双体抗体或类似分子(关于双体的描述，参见例如PNAS USA，90(14),6444-8(1993))。除GPRC5D的一部分之外，本文提供的双特异性抗体、双体抗体等可结合任何合适的靶。术语“双特异性抗体”应理解为具有由不同抗体序列限定的两个不同抗原结合区的抗体。这能够被理解为不同的靶结合，但也包括结合至一个靶中的不同表位。
“参照样品”是可与另一个样品诸如测试样品进行比较以表征所比较样品的样品。参照样品将具有一些特征属性，作为与测试样品进行比较的基础。例如，参照样品可用作指示受治疗者患有癌症的GPRC5D水平的基准。参照样品不一定必须与测试样品并行分析，因此在一些情况下，参照样品可为先前确定用于表征给定条件的数值或范围，诸如指示受治疗者患有癌症的GPRC5D水平。该术语还包括已知与生理状态或疾病病症(诸如GPRC5D表达型癌症)相关但具有未知量的GPRC5D的用于比较目的的样品。
如在GPRC5D表达型癌症的进展的上下文中使用的术语“进展”包括癌症从不太严重状态到较严重状态的变化。这可包括肿瘤的数量或严重性、癌细胞转移程度、癌症生长或扩散的速度等增大。例如，“结肠癌的进展”包括此类癌症从不太严重状态到较严重状态的进展，诸如从I期到II期、从II期到III期等的进展。
如在GPRC5D表达型癌症的消退的上下文中使用的术语“消退”包括癌症从较严重状态到不太严重状态的变化。这可包括肿瘤的数量或严重性、癌细胞转移程度、癌症生长或扩散的速度等减小。例如，“结肠癌的消退”包括此类癌症从较严重状态到不太严重状态的消退，诸如从III期到II期、从II期到I期等的进展。
如在稳定的GPRC5D表达型癌症的上下文中使用的术语“稳定”旨在描述疾病病症在临床相关时间段内未或尚未出现显著变化以被认为是进展性癌症或消退性癌症。
本文所述的实施方案并不限于特定的方法、试剂、化合物、组合物或生物***，这些方法、试剂、化合物、组合物或生物***当然能够变化。
GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段
本文描述了特异性地结合GPRC5D的分离单克隆抗体或抗原结合片段。抗体分子的一般结构包括抗原结合域，该域包含重链和轻链以及Fc域，并发挥多种功能(包括补体固定和结合抗体受体)。
所述GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段包括所有同种型IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，以及四链免疫球蛋白结构的合成多聚体。所述抗体或抗原结合片段也包括通常存在于母鸡或火鸡血清和母鸡或火鸡蛋黄中的IgY同种型。
GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段可通过重组方式来源于任何物种。例如，抗体或抗原结合片段可为小鼠、大鼠、山羊、马、猪、牛、鸡、兔、羊驼、驴、人或其嵌合型式。为适于施用于人，非人源抗体或抗原结合片段可在施用于人类患者时被基因或结构改变成抗原性较低。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段是嵌合的。如本文所用，术语“嵌合”是指抗体或其抗原结合片段的至少一个可变域的至少某些部分来源于非人哺乳动物、啮齿动物或爬行动物的抗体氨基酸序列，而抗体或其抗原结合片段的其余部分来源于人。
在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。人源化抗体可为含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab’)2或抗体的其它抗原结合亚序列)。在很大程度上，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的互补决定区(CDR)中的残基由具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠或兔的CDR中的残基替换。一般来讲，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个，并且一般是两个可变域，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区，并且所有或基本上所有的框架区是人免疫球蛋白序列的那些框架区。人源化抗体可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。
本文所述的抗体或抗原结合片段能够以多种形式存在，但将包含表1所示的抗体CDR中的一者或多者。
本文描述了免疫特异性地结合至GPRC5D的分离抗体和抗原结合片段。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段为人IgG或其衍生物。虽然本文例示的GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段是人的，但是所例示的抗体或抗原结合片段也可为嵌合的。
在一些实施方案中，提供了GPRC5D特异性抗体或其抗原结合片段，它们包含含有表1所述抗体中的任一抗体的CDR1、CDR2和CDR3的重链。在一些实施方案中，提供了GPRC5D特异性抗体或其抗原结合片段，它们包含含有表1所述抗体中的任一抗体的CDR1、CDR2和CDR3的重链以及含有表1所述抗体中的任一抗体的CDR1、CDR2和CDR3的轻链。
在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:1的重链CDR1、含有SEQ ID NO:5的重链CDR2以及含有SEQ ID NO:9的重链CDR3。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包括含有SEQ ID NO:1的重链CDR1、含有SEQ IDNO:5的重链CDR2、含有SEQ ID NO:9的重链CDR3、含有SEQ ID NO:13的轻链CDR1、含有SEQID NO:16的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:19的轻链CDR3。该GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQID NO:52基本上相同或相同的重链可变结构域。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:52基本上相同或相同的重链可变结构域以及与SEQ IDNO:56基本上相同或相同的轻链可变结构域。本段中所讨论的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂为抗-GPRC5D臂。
在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:2的重链CDR1、含有SEQ ID NO:6的重链CDR2以及含有SEQ ID NO:10的重链CDR3。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包括含有SEQ ID NO:2的重链CDR1、含有SEQ IDNO:6的重链CDR2、含有SEQ ID NO:10的重链CDR3、含有SEQ ID NO:13的轻链CDR1、含有SEQID NO:16的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:19的轻链CDR3。该GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQID NO:53基本上相同或相同的重链可变结构域。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:53基本上相同或相同的重链可变结构域以及与SEQ IDNO:56基本上相同或相同的轻链可变结构域。本段中所讨论的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂为抗-GPRC5D臂。
在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:3的重链CDR1、含有SEQ ID NO:7的重链CDR2以及含有SEQ ID NO:11的重链CDR3。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包括含有SEQ ID NO:3的重链CDR1、含有SEQ IDNO:7的重链CDR2、含有SEQ ID NO:11的重链CDR3、含有SEQ ID NO:14的轻链CDR1、含有SEQID NO:17的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:20的轻链CDR3。该GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQID NO:54基本上相同或相同的重链可变结构域。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:54基本上相同或相同的重链可变结构域以及与SEQ IDNO:57基本上相同或相同的轻链可变结构域。本段中所讨论的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂为抗-GPRC5D臂。
在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:4的重链CDR1、含有SEQ ID NO:8的重链CDR2以及含有SEQ ID NO:12的重链CDR3。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包括含有SEQ ID NO:4的重链CDR1、含有SEQ IDNO:8的重链CDR2、含有SEQ ID NO:12的重链CDR3、含有SEQ ID NO:15的轻链CDR1、含有SEQID NO:18的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:21的轻链CDR3。该GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQID NO:55基本上相同或相同的重链可变结构域。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:55基本上相同或相同的重链可变结构域以及与SEQ IDNO:58基本上相同或相同的轻链可变结构域。本段中所讨论的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂为抗-GPRC5D臂。
在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:61的重链CDR1、含有SEQ ID NO:67的重链CDR2以及含有SEQ ID NO:72的重链CDR3。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包括含有SEQ ID NO:61的重链CDR1、含有SEQID NO:67的重链CDR2、含有SEQ ID NO:72的重链CDR3、含有SEQ ID NO:13的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:78的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:80的轻链CDR3。该GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:82基本上相同或相同的重链可变结构域。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:82基本上相同或相同的重链可变结构域以及与SEQID NO:92基本上相同或相同的轻链可变结构域。本段中所讨论的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂为抗-GPRC5D臂。
在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:2的重链CDR1、含有SEQ ID NO:28的重链CDR2以及含有SEQ ID NO:30的重链CDR3。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包括含有SEQ ID NO:2的重链CDR1、含有SEQ IDNO:28的重链CDR2、含有SEQ ID NO:30的重链CDR3、含有SEQ ID NO:13的轻链CDR1、含有SEQID NO:16的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:19的轻链CDR3。该GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQID NO:83基本上相同或相同的重链可变结构域。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:83基本上相同或相同的重链可变结构域以及与SEQ IDNO:56基本上相同或相同的轻链可变结构域。本段中所讨论的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂为抗-GPRC5D臂。
在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:27的重链CDR1、含有SEQ ID NO:29的重链CDR2以及含有SEQ ID NO:73的重链CDR3。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包括含有SEQ ID NO:27的重链CDR1、含有SEQID NO:29的重链CDR2、含有SEQ ID NO:73的重链CDR3、含有SEQ ID NO:14的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:17的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:20的轻链CDR3。该GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:84基本上相同或相同的重链可变结构域。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:84基本上相同或相同的重链可变结构域以及与SEQID NO:57基本上相同或相同的轻链可变结构域。本段中所讨论的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂为抗-GPRC5D臂。
在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:27的重链CDR1、含有SEQ ID NO:29的重链CDR2以及含有SEQ ID NO:11的重链CDR3。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包括含有SEQ ID NO:27的重链CDR1、含有SEQID NO:29的重链CDR2、含有SEQ ID NO:11的重链CDR3、含有SEQ ID NO:14的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:17的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:20的轻链CDR3。该GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:85基本上相同或相同的重链可变结构域。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:85基本上相同或相同的重链可变结构域以及与SEQID NO:57基本上相同或相同的轻链可变结构域。本段中所讨论的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂为抗-GPRC5D臂。
在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:62的重链CDR1、含有SEQ ID NO:68的重链CDR2以及含有SEQ ID NO:74的重链CDR3。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包括含有SEQ ID NO:62的重链CDR1、含有SEQID NO:68的重链CDR2、含有SEQ ID NO:74的重链CDR3、含有SEQ ID NO:14的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:17的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:20的轻链CDR3。该GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:86基本上相同或相同的重链可变结构域。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:86基本上相同或相同的重链可变结构域以及与SEQID NO:57基本上相同或相同的轻链可变结构域。本段中所讨论的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂为抗-GPRC5D臂。
在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:63的重链CDR1、含有SEQ ID NO:69的重链CDR2以及含有SEQ ID NO:75的重链CDR3。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包括含有SEQ ID NO:63的重链CDR1、含有SEQID NO:69的重链CDR2、含有SEQ ID NO:75的重链CDR3、含有SEQ ID NO:13的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:78的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:80的轻链CDR3。该GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:87基本上相同或相同的重链可变结构域。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:87基本上相同或相同的重链可变结构域以及与SEQID NO:92基本上相同或相同的轻链可变结构域。本段中所讨论的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂为抗-GPRC5D臂。
在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:64的重链CDR1、含有SEQ ID NO:70的重链CDR2以及含有SEQ ID NO:12的重链CDR3。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包括含有SEQ ID NO:64的重链CDR1、含有SEQID NO:70的重链CDR2、含有SEQ ID NO:12的重链CDR3、含有SEQ ID NO:15的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:18的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:21的轻链CDR3。该GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:88基本上相同或相同的重链可变结构域。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:88基本上相同或相同的重链可变结构域以及与SEQID NO:58基本上相同或相同的轻链可变结构域。本段中所讨论的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂为抗-GPRC5D臂。
在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:65的重链CDR1、含有SEQ ID NO:68的重链CDR2以及含有SEQ ID NO:76的重链CDR3。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包括含有SEQ ID NO:65的重链CDR1、含有SEQID NO:68的重链CDR2、含有SEQ ID NO:76的重链CDR3、含有SEQ ID NO:95的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:79的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:81的轻链CDR3。该GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:89基本上相同或相同的重链可变结构域。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:89基本上相同或相同的重链可变结构域以及与SEQID NO:93基本上相同或相同的轻链可变结构域。本段中所讨论的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂为抗-GPRC5D臂。
在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:66的重链CDR1、含有SEQ ID NO:71的重链CDR2以及含有SEQ ID NO:77的重链CDR3。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包括含有SEQ ID NO:66的重链CDR1、含有SEQID NO:71的重链CDR2、含有SEQ ID NO:77的重链CDR3、含有SEQ ID NO:15的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:18的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:21的轻链CDR3。该GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:91基本上相同或相同的重链可变结构域。在一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:91基本上相同或相同的重链可变结构域以及与SEQID NO:94基本上相同或相同的轻链可变结构域。本段中所讨论的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂为抗-GPRC5D臂。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段是IgG或其衍生物，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4同种型。在其中抗体是IgG1同种型的一些实施方案中，抗体包含IgG1 Fc区(SEQ IDNO.60)。
SEQ ID NO.60
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
在其中抗体具有IgG4同种型的一些实施方案中，所述抗体在其Fc区中含有S228P、L234A和L235A置换(SEQ ID NO.59)。
SEQ ID NO.59
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
由上述段落中讨论的CDR和/或可变结构域序列限定的特异性抗体可包含这些修饰。
本发明还公开了编码免疫特异性地结合至GPRC5D的抗体或抗原结合片段的分离多核苷酸。能够编码本文提供的可变域区段的分离多核苷酸可包括在相同或不同的载体上以产生抗体或抗原结合片段。编码GPRC5D抗体的示例性多核苷酸序列在以下示出：
重链序列(SEQ ID NO:96)：
atggcctgggtctggaccctgctgttcctgatggccgctgcccagagcatccaggcccaggtgcagctggtgcagagcggcgccgaggtgaagaagcccggcgccagcgtgaaggtgagctgcaaggccagcggctacagcttcaccggctacaccatgaactgggtgcggcaggcccccggccagggcctggagtggatgggcctgatcaacccctacaacagcgacaccaactacgcccagaagctgcagggccgggtgaccatgaccaccgacaccagcaccagcaccgcctacatggagctgcggagcctgcggagcgacgacaccgccgtgtactactgcgcccgggtggccctgcgggtggccctggactactggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgcctccaccaagggcccatccgtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaaaacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaatatggtcccccatgcccaccatgcccagcacctgaggccgccgggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggtaaatga
轻链序列(SEQ ID NO:90)：
atgcgggtgctggcccagctgctgggactgctgctgctgtgcttccctggcgccagatgcgacatccagatgacccagagccccagcagcctgagcgccagcgtgggcgaccgggtgaccatcacctgcaaggccagccagaacgtggccacccacgtgggctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagcggctgatctacagcgccagctaccggtacagcggcgtgcccagccggttcagcggcagcggcagcggcaccgagttcaccctgaccatcagcaacctgcagcccgaggacttcgccacctactactgccagcagtacaaccggtacccctacaccttcggccagggcaccaagctggagatcaagcgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttga
编码重组抗原结合蛋白的多核苷酸也在本公开的范围内。在一些实施方案中，所述多核苷酸(及其编码的肽)包含前导序列。可采用本领域已知的任何前导序列。前导序列可包含但不限于限制性位点或翻译起始位点。
本文所述的GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段包括这样的变体：其具有保留所述GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段的生物特性(例如，结合亲和力或免疫效应活性)的单个或多个氨基酸置换、缺失或添加。在本发明的上下文中，除非另有说明，否则以下符号用于描述突变；i)给定位置处氨基酸的置换被书写为例如S228P，其意指228位的丝氨酸被脯氨酸置换；以及ii)对于特定变体，使用特定的三字母或单字母代码(包括代码Xaa和X)指示任何氨基酸残基。因此，丝氨酸置换228位的精氨酸表示为：S228P，或者任何氨基酸残基置换228位的丝氨酸表示为S228P。在228位的丝氨酸缺失的情况下，用S228*表示。技术人员可制备具有单个或多个氨基酸置换、缺失或添加的变体。
这些变体可包括：(a)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸置换的变体，(b)其中一个或多个氨基酸添加到多肽或从多肽缺失的变体，(c)其中一个或多个氨基酸包括取代基的变体，以及(d)其中多肽与另一种肽或多肽(诸如融合配偶体、蛋白质标签或其它化学部分)融合的变体，其可赋予多肽有用的特性，诸如例如抗体的表位、多组氨酸序列、生物素部分等。本文所述的抗体或抗原结合片段可包括这样的变体：其中来自一个物种的氨基酸残基在保守位置或非保守位置处置换为另一物种中的对应残基。在其它实施方案中，非保守位置处的氨基酸残基被保守或非保守残基置换。得到这些变体的技术，包括基因技术(缺失、突变等)、化学技术和酶技术，是本领域普通技术人员已知的。
本文所述的GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段可包括若干抗体同种型，诸如，IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在一些实施方案中，抗体同种型为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型，优选为IgG1或IgG4同种型。抗体或其抗原结合片段的特异性主要是由CDR的氨基酸序列和排列决定的。因此，一种同种型的CDR可转变为另一种同种型而不改变抗原特异性。或者，已经建立技术使杂交瘤从产生一种抗体同种型转换到产生另一种同种型(同种型转换)而不改变抗原特异性。因此，这类抗体同种型在所述抗体或抗原结合片段的范围内。
还提供了包含本文所述的多核苷酸的载体。载体可为表达载体。因此，预期包含编码感兴趣多肽的序列的重组表达载体也在本公开的范围内。表达载体可含有一个或多个附加的序列，诸如但不限于调控序列(如启动子、增强子)、选择标记和聚腺苷酸化信号。用于转化多种宿主细胞的载体是熟知的，并且包括但不限于质粒、噬菌粒、粘粒、杆状病毒、杆粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)以及其它细菌、酵母和病毒载体。
本说明书范围内的重组表达载体包括合成的、基因组或cDNA衍生的核酸片段，这些片段编码可操作地连接至合适的调控元件的至少一种重组蛋白。此类调节元件可包含转录启动子、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译的终止的序列。表达载体，特别是哺乳动物表达载体还可包含一个或多个非转录元件，诸如复制起点、连接到待表达的基因的合适启动子和增强子、其它5'或3'侧翼非转录序列、5'或3'非翻译序列(诸如必需的核糖体结合位点)、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受***点或转录终止序列。也可并入赋予在宿主中复制能力的复制起点。
用于转化脊椎动物细胞的表达载体中的转录和翻译控制序列可由病毒源提供。示例性载体可如Okayama和Berg，3 Mol.Cell.Biol.280(1983)所述那样构建。
在一些实施方案中，将抗体编码序列或抗原结合片段编码序列置于强效组成型启动子(诸如用于以下基因的启动子：次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)、腺苷脱氨酶、丙酮酸激酶、β-肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸等)的控制下。此外，许多病毒启动子在真核细胞中组成性地发挥功能，并适合与所述实施方案一起使用。这类病毒启动子包括但不限于细胞巨化病毒(CMV)立即早期启动子、SV40的早期和晚期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、马罗尼白血病病毒的长末端重复序列(LTR)、人免疫缺陷病毒(HIV)、EB病毒(EBV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)和其它逆转录病毒，以及单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子。在一个实施方案中，将GPRC5D特异性抗体或其抗原结合片段编码序列置于诱导型启动子(诸如，金属硫蛋白启动子、四环素诱导型启动子、多西环素诱导型启动子、含有一种或多种干扰素刺激的反应元件(ISRE)(诸如蛋白激酶R 2',5'-寡腺苷酸合成酶、Mx基因、ADAR1等)的启动子)的控制下。
本文所述的载体可含有一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)。IRES序列包含在融合载体中可能有利于增强一些蛋白质的表达。在一些实施方案中，载体***将包括一个或多个聚腺苷酸化位点(例如，SV40)，这些位点可在任何上述核酸序列的上游或下游。载体组分可连续地连接，或以提供用于表达基因产物的最佳间距的方式(即通过在ORF之间引入“间隔区”核苷酸)排列，或以另一种方式定位。调控元件诸如IRES基序也可被布置成提供用于表达的最佳间距。
载体可包含本领域熟知的选择标记。选择标记包括阳性选择标记和阴性选择标记，例如抗生素抗性基因(例如新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因、青霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因)、谷氨酸合酶基因、HSV-TK、用于更昔洛韦选择的HSV-TK衍生物或用于6-甲基嘌呤选择的细菌嘌呤核苷磷酸化酶基因(Gadi等人，7 Gene Ther.1738-1743(2000))。编码选择标记或克隆位点的核酸序列可在编码感兴趣的多肽或克隆位点的核酸序列的上游或下游。
本文所述的载体可用于用编码所述抗体或抗原结合片段的基因转化各种细胞。例如，该载体可用于生成GPRC5D特异性抗体或产生抗原结合片段的细胞。因此，另一方面的特征是用包含编码特异性地结合GPRC5D的抗体或其抗原结合片段(诸如本文所描述和例示的抗体或抗原结合片段)的核酸序列的载体转化的宿主细胞。
本领域已知用于将外来基因引入细胞中的多种技术，并且出于实施所述方法的目的，这些技术可用于根据本文所描述和例示的各种实施方案构建重组细胞。所使用的技术应当使得异源基因序列向宿主细胞稳定转移，以致异源基因序列是可遗传的并且可由细胞子代表达，从而受体细胞的必要发育和生理功能不被破坏。可使用的技术包括但不限于染色体转移(例如细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移)、物理方法(例如转染、原生质球融合、显微注射、电穿孔、脂质体载体)、病毒载体转移(例如，重组DNA病毒、重组RNA病毒)等(描述于Cline,29Pharmac.Ther.69-92(1985))。也可使用磷酸钙沉淀和聚乙二醇(PEG)诱导的细菌原生质体与哺乳动物细胞的融合来转化细胞。
适用于表达本文所述的GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段的细胞优选为真核细胞，更优选为植物、啮齿动物或人来源的细胞，例如但不限于NS0、CHO、CHOK1、perC.6、Tk-ts13、BHK、HEK293细胞、COS-7、T98G、CV-1/EBNA、L细胞、C127、3T3、HeLa、NS1、Sp2/0骨髓瘤细胞和BHK细胞系等。此外，可使用杂交瘤细胞完成抗体的表达。用于产生杂交瘤的方法是本领域中已良好建立的。
可选择或筛选用本文所述的表达载体转化的细胞用于本文所述的抗体或抗原结合片段的重组表达。扩增和筛选重组阳性细胞，筛选表现出所需表型(诸如高水平表达、增强的生长特性或例如由于蛋白质修饰或改变的翻译后修饰产生具有所需生化特征的蛋白质的能力)的亚克隆。这些表型可能是由于给定亚克隆的固有性质或由于突变造成的。突变可通过使用化学品、UV波长光、辐射、病毒、***诱变剂、DNA错配修复的抑制或这些方法的组合来实现。
使用GPRC5D特异性抗体进行治疗的方法
本文提供了在治疗中使用的GPRC5D特异性抗体或其抗原结合片段。具体地讲，这些抗体或抗原结合片段可用于治疗癌症，诸如GPRC5D表达型癌症。因此，本发明提供了治疗癌症的方法，该方法包括施用如本文所述的抗体，诸如GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段。例如，该用途可通过干扰GPRC5D-受体相互作用或其中抗体缀合到毒素，从而将毒素靶向GPRC5D表达型癌症。在一些实施方案中，GPRC5D表达型癌症包括淋巴瘤诸如多发性骨髓瘤(MM)。用于这些方法的抗体包括上文所述的那些抗体，例如，具有表1所述特征的GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段，例如在这些抗体的进一步论述中的CDR或可变域序列。
在本文所述的一些实施方案中，GPRC5D特异性抗体的免疫效应子特性可通过本领域技术人员已知的技术经由Fc修饰得到增强或沉默。例如，Fc效应子功能诸如C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)、细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等，可通过修饰促成这些活性的Fc中的残基来提供和/或控制。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞介导的反应，在这个反应过程中，表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体并随后致使靶细胞裂解。
单克隆抗体诱导ADCC的能力可通过改造其寡糖组分来增强。人IgG1或IgG3在Asn297处被熟知的双分枝G0、G0F、G1、G1F、G2或G2F形式的大多数聚糖N-糖基化。未工程化的CHO细胞所产生的抗体通常具有约至少85％的聚糖岩藻糖含量。从连接到Fc区的双分枝复合物型低聚糖去除核心岩藻糖，可经由改善的Fc.γ.RIIIa结合来增强抗体的ADCC，而不会改变抗原结合或CDC活性。此类mAb可使用所报告的能引起具有双分枝复合物型Fc低聚糖的相对较高去岩藻糖基化抗体的成功表达的不同方法实现，诸如控制培养物渗透压(Konno等人，Cytotechnology，64:249-65，2012)，应用变体CHO细胞系Lec13作为宿主细胞系(Shields等人，J Biol Chem，277:26733-26740，2002)，应用变体CHO细胞系EB66作为宿主细胞系(Olivier等人，MAbs，2(4)，2010；Epub ahead of print；PMID：20562582)，应用大鼠杂交瘤细胞系YB2/0作为宿主细胞系(Shinkawa等人，J Biol Chem，278:3466-3473；2003)，引入特异性针对α1,6-岩藻糖基转移酶(FUT8)基因的小干扰RNA(Mori等人，BiotechnolBioeng，88:901-908，2004)，或共表达β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III和高尔基体α-甘露糖苷酶II或强效α-甘露糖苷酶I抑制剂，几夫碱(Ferrara等人，J Biol Chem，281:5032-5036，2006；Ferrara等人，Biotechnol Bioeng，93:851-861，2006；Xhou等人，BiotechnolBioeng，99:652-65，2008)。
在本文所述的一些实施方案中，也可通过抗体Fc中的某些置换来增强由GPRC5D抗体引发的ADCC。示例性置换为例如在氨基酸位置256、290、298、312、356、330、333、334、360、378或430(根据EU索引对残基进行编号)处的置换，如美国专利6,737,056中有所描述。
检测GPRC5D的方法
本文提供了用于通过使样本与本文所述的抗体或其抗原结合片段接触来检测生物样本中的GPRC5D的方法。如本文所述，样本可来源于尿液、血液、血清、血浆、唾液、腹水、循环细胞、循环肿瘤细胞、非组织缔合的细胞(即游离细胞)、组织(例如手术切除的肿瘤组织、活体组织切片，包括细针抽吸组织)、组织学制备物等。在一些实施方案中，所述方法包括通过使样本与本文所述的任何GPRC5D特异性抗体或其抗原结合片段接触来检测生物样本中的GPRC5D。
在一些实施方案中，样本可与本文所述的GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段中的多于一种接触。例如，样本可与第一GPRC5D特异性抗体或其抗原结合片段接触，然后与第二GPRC5D特异性抗体或其抗原结合片段接触，其中第一抗体或抗原结合片段和第二抗体或抗原结合片段不是相同的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，第一抗体或其抗原结合片段在接触样本之前可附连至表面，诸如多孔板、芯片或类似的底物上。在其它实施方案中，第一抗体或其抗原结合片段在接触样本之前完全可不附连或连接至任何物体。
可对所述GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段进行可检测地标记。在一些实施方案中，通过本文所述的方法，标记的抗体和抗原结合片段可有利于检测GPRC5D。许多这样的标记是本领域技术人员容易知晓的。例如，合适的标记包括但不应当认为其限于放射标记、荧光标记、表位标签、生物素、发色团标记、ECL标记或酶。更具体地，所述标记包括钌、111In-DOTA、111In-二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶、聚组氨酸(HIS标签)、吖啶染料、花青染料、荧光酮染料、噁嗪染料、菲啶染料、罗丹明染料、染料等。
所述GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段可用于多种测定中，以检测生物样本中的GPRC5D。一些合适的测定包括但不应当认为其限于蛋白质印迹分析、放射性免疫测定、表面等离振子共振、免疫荧光测定、免疫沉淀、平衡透析、免疫扩散、电化学发光(ECL)免疫测定、免疫组织化学、荧光激活细胞分选(FACS)或ELISA测定。
在本文所述的一些实施方案中，受治疗者中GPRC5D表达型癌细胞的检测可用于确定受治疗者是否可用针对GPRC5D的治疗剂进行治疗。
GPRC5D以可检测的水平存在于血液和血清样品中。因此，本文提供了用于通过使样品与特异性地结合GPRC5D的抗体或其抗原结合片段接触来检测来源于血液的样品(诸如血清样品)中的GPRC5D的方法。血液样品或其衍生物可被稀释、分馏或以其它方式处理以得到可对其执行所述方法的样品。在一些实施方案中，可通过本领域已知的任意数量的测定检测血液样品或其衍生物中的GPRC5D，这些测定诸如但不限于蛋白质印迹分析、放射性免疫测定、表面等离振子共振、免疫荧光测定、免疫沉淀、平衡透析、免疫扩散、电化学发光(ECL)免疫测定、免疫组织化学、荧光激活细胞分选(FACS)或ELISA测定。
诊断癌症的方法
本文提供了用于诊断受治疗者中GPRC5D表达型癌症的方法。在一些实施方案中，GPRC5D表达型癌症包括淋巴瘤诸如多发性骨髓瘤(MM)。在一些实施方案中，如上文所述，检测生物样品诸如血液样品或血清样品中的GPRC5D提供了诊断从其取得样品的受治疗者中癌症的能力。或者，在一些实施方案中，其它样品诸如组织学样品、细针抽吸样品、切除的肿瘤组织、循环细胞、循环肿瘤细胞等也可用于评估从其取得样品的受治疗者是否患有癌症。在一些实施方案中，可能已经知道从其取得样品的受治疗者患有癌症，但是可能尚未诊断出受治疗者所患癌症的类型或者初步诊断结果可能不清楚，因此检测获自受治疗者的生物样品中的GPRC5D可实现或明确癌症的诊断。例如，可能已知受治疗者患有癌症，但是可能不知道或可能不清楚受治疗者所患癌症是否是GPRC5D表达型的。
在一些实施方案中，所述方法涉及通过测定来源于受治疗者的生物样品中存在的GPRC5D的量来评估受治疗者是否患有GPRC5D表达型癌症；并且将所观测到的GPRC5D的量与对照或参照样品中的GPRC5D的量进行比较，其中来源于受治疗者的样品中GPRC5D的量与对照或参照样品中GPRC5D的量之间的差值指示受治疗者患有GPRC5D表达型癌症。在另一个实施方案中，可将所观测到的获自受治疗者的生物样品中GPRC5D的量与已知与癌症的某些形式或阶段相关的GPRC5D水平进行比较，从而确定受治疗者所患癌症的形式或阶段。在一些实施方案中，通过使样品与免疫特异性地结合GPRC5D的抗体或其抗原结合片段(诸如本文所述的GPRC5D特异性抗体)接触来评估来源于受治疗者的样品中GPRC5D的量。评估其中GPRC5D的存在的样品可来源于尿液、血液、血清、血浆、唾液、腹水、循环细胞、循环肿瘤细胞、非组织缔合的细胞(即游离细胞)、组织(例如手术切除的肿瘤组织、活体组织切片，包括细针抽吸组织)、组织学制备物等。在一些实施方案中，GPRC5D表达型癌症包括血液学癌症诸如多发性骨髓瘤(MM)。在一些实施方案中，受治疗者是人。
在一些实施方案中，诊断GPRC5D表达型癌症的方法将涉及：使受治疗者的生物样品与GPRC5D特异性抗体或其抗原结合片段(诸如可来源于表1中提供的抗体和片段的那些)接触；定量分析由抗体或其抗原结合片段结合的样品中存在的GPRC5D的量；将样品中存在的GPRC5D的量与已知标准品或参照样品进行比较；并确定受治疗者的GPRC5D水平是否落入与癌症相关的GPRC5D水平内。在另外的实施方案中，诊断方法之后可为施用或给出癌症特异性治疗的附加步骤。在另一个实施方案中，诊断方法之后可为传送测定结果以便于治疗癌症的附加步骤。在一些实施方案中，癌症特异性治疗可针对GPRC5D表达型癌症，诸如本文所述的GPRC5D×CD3多特异性抗体。
在一些实施方案中，所述方法涉及通过测定获自受治疗者的血液或血清样品中存在的GPRC5D的量来评估受治疗者是否患有GPRC5D表达型癌症；并且将所观测到的GPRC5D的量与对照或参照样品中的GPRC5D的量进行比较，其中来源于受治疗者的样品中GPRC5D的量与对照或参照样品中GPRC5D的量之间的差值指示受治疗者患有GPRC5D表达型癌症。
在一些实施方案中，对照或参照样品可来源于不患有GPRC5D表达型癌症的受治疗者。在一些实施方案中，对照或参照样品可来源于患有GPRC5D表达型癌症的受治疗者。在其中对照或参照样品来源于不患有GPRC5D表达型癌症的受治疗者的一些实施方案中，观察到的测试样品中存在的GPRC5D的量相对于观察到的对照或参照样品中GPRC5D的量有所增加，指示所评估的受治疗者患有GPRC5D表达型癌症。在其中对照样品来源于不患有GPRC5D表达型癌症的受治疗者的一些实施方案中，观察到的测试样品中存在的GPRC5D的量相对于观察到的对照或参照样品中GPRC5D的量有所减少或近似，指示所评估的受治疗者不患有GPRC5D表达型癌症。在其中对照或参照样品来源于患有GPRC5D表达型癌症的受治疗者的一些实施方案中，观察到的测试样品中存在的GPRC5D的量相对于观察到的对照或参照样品中GPRC5D的量近似，指示所评估的受治疗者患有GPRC5D表达型癌症。在其中对照样品或参照样品来源于患有GPRC5D表达型癌症的受治疗者的一些实施方案中，观察到的测试样品中存在的GPRC5D的量相对于观察到的对照或参照样品中GPRC5D的量有所减少，指示所评估的受治疗者不患有GPRC5D表达型癌症。
在一些实施方案中，通过使样品与特异性地结合GPRC5D的抗体或其抗原结合片段(诸如本文所述的抗体)接触来评估来源于受治疗者的样品中GPRC5D的量。评估其中GPRC5D的存在的样品可来源于血液样品、血清样品、循环细胞、循环肿瘤细胞、非组织缔合的细胞(即游离细胞)、组织(例如手术切除的肿瘤组织、活体组织切片，包括细针抽吸组织)、组织学制备物等。
在各个方面，通过使样品与特异性地结合GPRC5D的抗体或其抗原结合片段接触来测定GPRC5D的量。在一些实施方案中，样品可与特异性地结合GPRC5D的抗体或其抗原结合片段中的多于一种类型的接触。在一些实施方案中，样品可与特异性地结合GPRC5D的第一抗体或其抗原结合片段接触，然后与特异性地结合GPRC5D的第二抗体或其抗原结合片段接触。GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段，诸如本文所述的那些可用于该功能中。
能够使用GPRC5D特异性抗体和抗原结合片段的各种组合来提供“第一”和“第二”抗体或抗原结合片段以实施所述诊断方法。在一些实施方案中，GPRC5D表达型癌症包括淋巴瘤诸如多发性骨髓瘤(MM)。
在某些实施方案中，通过蛋白质印迹分析、放射性免疫测定、免疫荧光测定、免疫沉淀、平衡透析、免疫扩散、电化学发光(ECL)免疫测定、免疫组织化学、荧光激活细胞分选(FACS)或ELISA测定来测定GPRC5D的量。
在所述诊断方法的各种实施方案中，使用了对照样品或参照样品。该样品可为确保所用测定正常工作的阳性或阴性测定对照样；例如，该性质的测定对照样通常可用于免疫组织化学测定中。或者，该样品可为来自健康受治疗者的生物样品中GPRC5D量的标准化参照样品。在一些实施方案中，可将测试受治疗者的所观测到的GPRC5D水平与在来自已知患有GPRC5D表达型癌症的受治疗者的样品中所观测到的GPRC5D水平进行比较。在一些实施方案中，对照受治疗者可能患有感兴趣的特定癌症。在一些实施方案中，已知对照受治疗者患有早期癌症，其可能是或可能不是GPRC5D表达型癌症。在一些实施方案中，已知对照受治疗者患有中期癌症，其可能是或可能不是GPRC5D表达型癌症。在一些实施方案中，已知对照受治疗者患有晚期癌症，其可能是或可能不是GPRC5D表达型癌症。
用于监测癌症的方法
本文提供了用于监测受治疗者中GPRC5D表达型癌症的方法。在一些实施方案中，GPRC5D表达型癌症包括淋巴瘤诸如多发性骨髓瘤(MM)。在一些实施方案中，所述方法涉及通过测定来源于受治疗者的测试样品中存在的GPRC5D的量来评估GPRC5D表达型癌症是否正在进展、消退或保持稳定；并且将所观测到的GPRC5D的量与在较早时间点以类似方式获自受治疗者的生物样品中GPRC5D的量进行比较，其中测试样品与较早样品中GPRC5D的量之间的差值提供了癌症是否正在进展、消退或保持稳定的指示。就这一点而言，测试样品中GPRC5D的量相对于所观测到的较早样品中的量有所增加可指示GPRC5D表达型癌症的进展。相反，测试样品中GPRC5D的量相对于所观测到的较早样品中的量有所减少可指示GPRC5D表达型癌症的消退。
因此，测试样品中GPRC5D的量相对于所观测到的较早样品中的量差别不明显可指示GPRC5D表达型癌症处于稳定疾病状态。在一些实施方案中，通过使样品与特异性地结合GPRC5D的抗体或其抗体片段(诸如本文所述的抗体)接触来评估来源于受治疗者的生物样品中GPRC5D的量。评估其中GPRC5D的存在的样品可来源于尿液、血液、血清、血浆、唾液、腹水、循环细胞、循环肿瘤细胞、非组织缔合的细胞(即游离细胞)、组织(例如手术切除的肿瘤组织、活体组织切片，包括细针抽吸组织)、组织学制备物等。在一些实施方案中，受治疗者是人。
在一些实施方案中，监测GPRC5D表达型癌症的方法将涉及：使受治疗者的生物样品与GPRC5D特异性抗体或其抗原结合片段(诸如可来源于表1中所提供的抗体和片段的那些)接触；定量分析样品中存在的GPRC5D的量；将样品中存在的GPRC5D的量与在较早时间点以类似方式获自相同受治疗者的生物样品中所测定的GPRC5D的量进行比较；并确定受治疗者的GPRC5D水平是否随时间变化。测试样品中GPRC5D的量相对于所观测到的较早样品中的量有所增加可指示癌症的进展。相反，测试样品中GPRC5D的量相对于所观测到的较早样品中的量有所减少可指示GPRC5D表达型癌症的消退。因此，测试样品中GPRC5D的量相对于所观测到的较早样品中的量差别不明显可指示GPRC5D表达型癌症处于稳定疾病状态。在一些实施方案中，样品的GPRC5D水平可单独与已知标准品或参照样品进行比较，或者样品的GPRC5D水平除与所观测到的在较早时间点评估的样品中的GPRC5D水平进行比较之外，也可与已知标准品或参照样品进行比较。在另外的实施方案中，诊断方法之后可为施用癌症特异性治疗的附加步骤。在一些实施方案中，癌症特异性治疗可针对GPRC5D表达型癌症。
在各个方面，通过使样品与特异性地结合GPRC5D的抗体或其抗原结合片段接触来测定GPRC5D的量。在一些实施方案中，样品可与特异性地结合GPRC5D的抗体或其抗原结合片段中的多于一种类型的接触。在一些实施方案中，样品可与特异性地结合GPRC5D的第一抗体或其抗原结合片段接触，然后与特异性地结合GPRC5D的第二抗体或其抗原结合片段接触。抗体诸如本文所述的那些可用于该功能中。
能够使用表1中所述的抗体和抗原结合片段的各种组合来提供“第一”和“第二”抗体或抗原结合片段以实施所述的监测方法。在一些实施方案中，GPRC5D表达型癌症包括血液学癌症诸如多发性骨髓瘤(MM)。
在某些实施方案中，通过蛋白质印迹分析、放射性免疫测定、免疫荧光测定、免疫沉淀、平衡透析、免疫扩散、电化学发光(ECL)免疫测定、免疫组织化学、荧光激活细胞分选(FACS)或ELISA测定来测定GPRC5D的量。
用于检测GPRC5D的试剂盒
本文提供了用于检测生物样本中的GPRC5D的试剂盒。这些试剂盒包括本文所述的GPRC5D特异性抗体或其抗原结合片段中的一种或多种，以及试剂盒的使用说明。
所提供的GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段可为溶液；被冻干；附连到底物、载体或板；或被可检测地标记。
所述试剂盒还可包括用于实施本文所述方法的附加组分。举例来说，试剂盒可包括用于从受治疗者获得样本的装置、对照或参照样本(例如来自患有进展缓慢的癌症的受治疗者和/或不患癌症的受治疗者的样本)、一个或多个样本室和/或描述本发明方法的性能的说明材料、以及组织特异性对照或标准品。
用于确定GPRC5D的水平的装置还可包括例如在用于确定GPRC5D水平的测定中使用的缓冲液或其它试剂。说明书可为例如用于执行测定的印刷说明书和/或用于评价GPRC5D的表达水平的说明书。
所述试剂盒还可包括用于从受治疗者分离出样本的装置。这些装置可包括可用于从受治疗者中获得流体或组织的设备或试剂中的一项或多项。用于从受治疗者中获得样本的装置还可包括用于从血液样本中分离出血液组分诸如血清的装置。优选的是，将试剂盒设计成与人类受治疗者一起使用。
多特异性抗体
本文所述的抗-GPRC5D抗体的结合结构域识别在其表面上表达GPRC5D的细胞。如上文所述，GPRC5D表达可指示癌细胞。更特异性地靶向特定细胞亚群可通过制备结合至GPRC5D和另一个靶(诸如CD3和BCMA)的双特异性分子(诸如抗体或抗体片段)来实现。这通过制备包含结合至GPRC5D的第一区和结合至另一个靶抗原的第二结合区的分子来实现。抗原结合区可采取允许靶的特异性识别的任何形式，例如结合区可为或可包含重链可变结构域、Fv(重链可变结构域和轻链可变结构域的组合)、基于III型纤连蛋白结构域的结合结构域(诸如来自纤连蛋白或基于来自纤连蛋白的III型结构域的共有序列，或来自腱生蛋白或基于来自腱生蛋白的III型结构域的共有序列，诸如来自Janssen Biotech有限公司的Centyrin分子，参见例如WO2010/051274和WO2010/093627)。因此，提供了包含分别结合GPRC5D和另一抗原的两个不同抗原结合区的双特异性分子。
本文所述的一些多特异性抗体包含分别结合GPRC5D和CD3的两个不同的抗原结合区。在优选的实施方案中，提供了结合GPRC5D和CD3的多特异性抗体(GPRC5D×CD3多特异性抗体)及其多特异性抗原结合片段。在一些实施方案中，GPRC5D×CD3多特异性抗体包含配对形成特异性地结合GPRC5D的第一抗原结合位点的第一重链(HC1)和第一轻链(LC1)，以及配对形成特异性地结合CD3的第二抗原结合位点的第二重链(HC2)和第二轻链(LC2)。在优选的实施方案中，GPRC5D×CD3多特异性抗体是包含GPRC5D特异性臂和CD3特异性臂的双特异性抗体，GPRC5D特异性臂包含配对形成特异性地结合CD3的第一抗原结合位点的第一重链(HC1)和第一轻链(LC1)，CD3特异性臂包含配对形成特异性地结合GPRC5D的第二抗原结合位点的第二重链(HC2)和第二轻链(LC2)。在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体包括具有全长抗体结构的抗体。如本文所用，“全长抗体”是指具有两条全长抗体重链和两条全长抗体轻链的抗体。全长抗体重链(HC)包含重链可变结构域VH和重链恒定结构域CH1、CH2和CH3。全长抗体轻链(LC)包含轻链可变结构域VL和轻链恒定结构域CL。全长抗体可在一条或两条重链中缺少C-端赖氨酸(K)。术语“Fab臂”或“半分子”是指特异性地结合抗原的一个重链-轻链对。在一些实施方案中，抗原结合结构域之一是基于非抗体的结合结构域，例如基于3型纤连蛋白结构域的结合结构域，如Centyrin。
本文提供的多特异性抗体的GPRC5D结合臂可来源于上述GPRC5D特异性抗体中的任一种。在这类GPRC5D结合臂的一些示例性实施方案中，结合GPRC5D的第一抗原结合区包含来源于如表1中所述的抗体克隆的重链CDR1、CDR2和CDR3。在这类GPRC5D结合臂的一些示例性实施方案中，结合GPRC5D的第一抗原结合区包含来源于如表1中所述的抗体克隆的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3。在这类GPRC5D结合臂的一些示例性实施方案中，结合GPRC5D的第一抗原结合区包含克隆GC5B81、GC5B465、GS5B483、GC5B596、GC5B382、GC5B379、GC5B373、GC5B376、GC5B385、GC5B370、GC5B602、GC5B603、GC5B599、GC5B601、GC5B598或GC5B597的重链CDR1、CDR2和CDR3。
在这类GPRC5D结合臂的一些示例性实施方案中，结合GPRC5D的第一抗原结合区包含克隆GC5B81、GC5B465、GS5B483或GC5B596的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3。在这类GPRC5D结合臂的一些示例性实施方案中，结合GPRC5D的第一抗原结合区包含来源于如表1中所述的抗体克隆的重链可变结构域。在这类GPRC5D结合臂的一些示例性实施方案中，结合GPRC5D的第一抗原结合区包含来源于如表1中所述的抗体克隆的重链可变结构域和轻链可变结构域。在这类GPRC5D结合臂的一些示例性实施方案中，结合GPRC5D的第一抗原结合区包含克隆GC5B81、GC5B465、GS5B483或GC5B596的重链可变结构域。在这类GPRC5D结合臂的一些示例性实施方案中，结合GPRC5D的第一抗原结合区包含克隆GC5B81、GC5B465、GS5B483、GC5B596、GC5B382、GC5B379、GC5B373、GC5B376、GC5B385、GC5B370、GC5B602、GC5B603、GC5B599、GC5B601、GC5B598、或GC5B597的重链可变结构域和轻链可变结构域……
表3提供了GPRC5D×CD3双特异性抗体的列表，该双特异性抗体具有特异于GPRC5D的一个重链和轻链对和特异于CD3的另一个重链和轻链对，其中列出了特定抗体ID以描述用于产生所述实施方案的抗原特异性抗体臂。
表3：
GPRC5D特异性臂＝Ab ID CD3特异性臂＝Ab ID
GC5B81 CD3B219
GC5B465 CD3B219
GC5B483 CD3B219
GC5B596 CD3B219
GC5B382 CD3B219
GC5B379 CD3B219
GC5B373 CD3B219
GC5B376 CD3B219
GC5B385 CD3B219
GC5B370 CD3B219
GC5B602 CD3B219
GC5B603 CD3B219
GC5B599 CD3B219
GC5B601 CD3B219
GC5B598 CD3B219
GC5B597 CD3B219
在双特异性抗体的一些实施方案中，GPRC5D结合臂也结合食蟹猴GPRC5D，优选其细胞外结构域。
在一些实施方案中，多特异性抗体的GPRC5D结合臂为IgG或其衍生物，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4同种型。在其中GPRC5D结合臂具有IgG4同种型的一些实施方案中，所述结合臂在其Fc区中包含S228P、L234A和L235A置换。
在双特异性抗体的一些实施方案中，第二抗原结合臂结合人CD3。在一些优选的实施方案中，GPRC5D×CD3双特异性抗体的CD3特异性臂来源于结合并激活人原代T细胞和/或食蟹猴原代T细胞的CD3特异性抗体。在一些实施方案中，CD3结合臂结合至CD3ε的N端处的表位。在一些实施方案中，CD3结合臂接触包含CD3ε的六个N端氨基酸的表位。在一些实施方案中，双特异性抗体的CD3特异性结合臂来源于小鼠单克隆抗体SP34，一种小鼠IgG3/λ同种型。在一些实施方案中，CD3结合臂包含抗体SP34的CDR。此类CD3结合臂可以5×10-7M或更低，诸如1×10-7M或更低、5×10-8M或更低、1×10-8M或更低、5×10-9M或更低、或者1×10-9M或更低的亲和力结合至CD3。CD3特异性结合臂可为小鼠单克隆抗体SP34的臂的人源化型式。人框架适应(HFA)可用于人源化从其衍生CD3特异性臂的抗-CD3抗体。在双特异性抗体的一些实施方案中，CD3结合臂包含选自表2的重链和轻链对。
在一些实施方案中，CD3结合臂为IgG或其衍生物。在一些实施方案中，CD3结合臂为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在其中CD3结合臂具有IgG4同种型的一些实施方案中，所述结合臂在其Fc区中含有S228P、L234A、L235A、F405L和R409K置换。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段结合原代人T细胞上的CD3ε。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段结合原代食蟹猴T细胞上的CD3ε。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段结合原代人和食蟹猴T细胞上的CD3ε。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段激活原代人CD3+ T细胞。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段激活原代食蟹猴CD4+ T细胞。
在一些实施方案中，提供了具有GPRC5D结合臂的GPRC5D×CD3双特异性抗体，所述GPRC5D结合臂包含抗体克隆GC5B81、GC5B465、GS5B483、GC5B596、GC5B382、GC5B379、GC5B373、GC5B376、GC5B385、GC5B370、GC5B602、GC5B603、GC5B599、GC5B601、GC5B598或GC5B597的重链。……在一些实施方案中，提供了具有GPRC5D结合臂的GPRC5D×CD3双特异性抗体，所述GPRC5D结合臂包含抗体克隆GC5B81、GC5B465、GS5B483、GC5B596、GC5B382、GC5B379、GC5B373、GC5B376、GC5B385、GC5B370、GC5B602、GC5B603、GC5B599、GC5B601、GC5B598或GC5B597的重链和轻链。在一些实施方案中，提供了具有包含抗体克隆CD3B219的重链的CD3结合臂的GPRC5D×CD3双特异性抗体。在一些实施方案中，提供了具有包含抗体克隆CD3B219的重链和轻链的CD3结合臂的GPRC5D×CD3双特异性抗体。在一些实施方案中，提供了具有GPRC5D结合臂和CD3结合臂的GPRC5D×CD3双特异性抗体，所述GPRC5D结合臂包含抗体克隆GC5B81、GC5B465、GS5B483、GC5B596、GC5B382、GC5B379、GC5B373、GC5B376、GC5B385、GC5B370、GC5B602、GC5B603、GC5B599、GC5B601、GC5B598或GC5B597的重链，所述CD3结合臂包含抗体克隆CD3B219的重链。在一些实施方案中，提供了具有GPRC5D结合臂和CD3结合臂的GPRC5D×CD3双特异性抗体，所述GPRC5D结合臂包含抗体克隆GC5B81、GC5B465、GS5B483、GC5B596、GC5B382、GC5B379、GC5B373、GC5B376、GC5B385、GC5B370、GC5B602、GC5B603、GC5B599、GC5B601、GC5B598或GC5B597的重链和轻链，所述CD3结合臂包含抗体克隆CD3B219的重链和轻链。
表23中提供了示例性的GPRC5D×CD3双特异性抗体。
不同形式的双特异性抗体已有所描述，并且最近由Chames和Baty在Curr OpinDrug Disc Dev，2009年，第12卷，第276页中进行了综述。
在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体是通过受控Fab臂交换得到的双体抗体、交叉体或双特异性抗体，如本发明所述的那些。
在一些实施方案中，双特异性抗体包括具有互补CH3结构域以强制发生异源二聚体化的IgG样分子；重组IgG样双靶向分子，其中该分子的两侧各自含有至少两种不同抗体的Fab片段的一部分或Fab片段；IgG融合分子，其中全长IgG抗体与额外的Fab片段或Fab片段的部分融合；Fc融合分子，其中单链Fv分子或稳定的双体抗体与重链恒定域、Fc区或其部分融合；Fab融合分子，其中不同的Fab片段融合在一起；基于ScFv和双体抗体的重链抗体(例如域抗体、纳米抗体)，其中不同的单链Fv分子或不同的双体抗体或不同的重链抗体(例如域抗体、纳米抗体)彼此融合或与另一蛋白或载体分子融合。
在一些实施方案中，具有互补CH3结构域分子的IgG样分子包括Triomab/Quadroma(Trion Pharma/Fresenius Biotech)、纽扣结构(Knobs-into-Holes)(Genentech)、CrossMAbs(Roche)和静电配对体(electrostatically-matched)(Amgen)、LUZ-Y(Genentech)、链交换工程结构域体(Strand Exchange Engineered Domain body)(SEEDbody)(EMD Serono)、Biclonic(Merus)和DuoBody(Genmab A/S)。
在一些实施方案中，重组IgG样双靶向分子包括双重靶向(DT)-Ig(GSK/Domantis)、二合一抗体(Genentech)、交联Mabs(Karmanos Cancer Center)、mAb2(F-Star)和CovX体(CovX/Pfizer)。
在一些实施方案中，IgG融合分子包括双重可变结构域(DVD)-Ig(Abbott)、IgG样双特异性抗体(InnClone/Eli Lilly)、Ts2Ab(MedImmune/AZ)和BsAb(Zymogenetics)、HERCULES(Biogen Idec)以及TvAb(Roche)。
在一些实施方案中，Fc融合分子包括ScFv/Fc融合体(Academic Institution)、SCORPION(Emergent BioSolutions/Trubion,Zymogenetics/BMS)、双亲和性再靶向技术(Fc-DART)(MacroGenics)以及Dual(ScFv).sub.2-Fab(中国国家抗体医药研究中心(National Research Center forAntibodyMedicine--China))。
在一些实施方案中，Fab融合双特异性抗体包括F(ab)2(Medarex/AMGEN)、Dual-Action或Bis-Fab(Genentech)、Dock-and-Lock(DNL)(ImmunoMedics)、二价双特异性抗体(Biotecnol)和Fab-Fv(UCB-Celltech)。基于ScFv的、基于双体抗体的结构域抗体包括但不限于双特异性T细胞衔接器(BiTE)(Micromet)、串联双体抗体(Tandab)(Affimed)、双亲和性再靶向分子(DART)(MacroGenics)、单链双体抗体(Academic)、TCR样抗体(AIT，ReceptorLogics)、人血清白蛋白ScFv融合体(Merrimack)和COMBODY(Epigen Biotech)、双靶向纳米抗体(Ablynx)、仅双重靶向重链结构域抗体。
本发明的全长双特异性抗体可例如使用两个单特异性二价抗体之间的Fab臂交换(或半分子交换)通过下列方式产生：在每个半分子中的重链CH3交界处引入置换以促成两个在体外无细胞环境中或使用共表达而具有不同特异性的抗体半分子的异源二聚体形成。Fab臂交换反应是二硫键异构化反应和CH3域解离-缔合的结果。亲本单特异性抗体的铰链区中的重链二硫键减少。亲本单特异性抗体之一的所得游离半胱氨酸与第二亲本单特异性抗体分子的半胱氨酸残基形成重链间二硫键，同时亲本抗体的CH3结构域通过解离-缔合而释放和重新形成。可将Fab臂的CH3域改造成促成异源二聚化而非同源二聚化。所得产物是具有两个Fab臂或半分子的双特异性抗体，这两个Fab臂或半分子各自结合不同的表位，即GPRC5D上的表位和CD3上的表位。
如本文所用，“同源二聚化”是指具有相同CH3氨基酸序列的两条重链的相互作用。如本文所用，“同源二聚体”是指具有含有相同CH3氨基酸序列的两条重链的抗体。
如本文所用，“异源二聚化”是指具有不同CH3氨基酸序列的两条重链的相互作用。如本文所用，“异源二聚体”是指具有含有不同CH3氨基酸序列的两条重链的抗体。
“钮扣”技术(参见，例如PCT国际二聚抗体WO 2006/028936)可用于产生全长双特异性抗体。简而言之，在人IgG中形成CH3域的交界的选定氨基酸可在影响CH3域相互作用的位置处突变，从而促进异源二聚体形成。将具有小侧链(扣)的氨基酸引入特异性地结合第一抗原的抗体的重链中，并将具有大侧链(钮)的氨基酸引入特异性地结合第二抗原的抗体的重链中。在两种抗体共表达后，由于具有“扣”的重链与具有“钮”的重链的优先相互作用而形成异源二聚体。形成钮和扣的示例性CH3置换对(表示为第一重链的第一CH3结构域中的修饰位置/第二重链的第二CH3结构域中的修饰位置)是：T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S和T366W/T366S_L368A_Y407V。
还可使用其它技术，诸如通过在一个CH3表面置换带正电荷的残基并在另一CH3表面置换带负电荷的残基使用静电相互作用促进重链异源二聚化，如美国专利公布号US2010/0015133；美国专利公布号US2009/0182127；美国专利公布号US2010/028637或美国专利公布号US2011/0123532中所述。在其它技术中，可通过下面的置换(表示为第一重链的第一CH3结构域中的修饰位置/第二重链的第二CH3结构域中的修饰位置)促进异源二聚化：L351Y_F405AY407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V K409F Y407A/T366A_K409F或T350V_L351Y_F405A Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W，如美国专利公布号US2012/0149876或美国专利公布号US2013/0195849中所述。
除上述方法之外，本发明的双特异性抗体还可在体外无细胞环境中通过下列方式产生：在两种单特异性同源二聚抗体的CH3区中引入不对称突变，并且在还原条件下由两种亲本单特异性同源二聚抗体形成双特异性异源二聚抗体，从而根据国际专利公布号W02011/131746所述的方法使得二硫键异构化。在所述方法中，将第一单特异性二价抗体(例如，抗-GPRC5D抗体)和第二单特异性二价抗体(例如，抗-CD3抗体)改造为在CH3结构域处具有促进异源二聚体稳定性的某些置换；将这些抗体在足以使铰链区中的半胱氨酸发生二硫键异构化的还原条件下一起温育；从而通过Fab臂交换产生双特异性抗体。温育条件最佳可恢复到非还原条件。可使用的示例性还原剂为2-巯基乙胺(2-MEA)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、谷胱甘肽、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱氨酸和β-巯基乙醇，优选为选自2-巯基乙胺、二硫苏糖醇和三(2-羧乙基)膦的还原剂。例如，可使用如下条件：在至少25mM 2-MEA的存在下或至少0.5mM二硫苏糖醇的存在下，在5-8的pH例如pH7.0或pH7.4，至少20℃的温度下，温育至少90分钟。
除所述GPRC5D×CD3多特异性抗体之外，还提供了能够编码所述GPRC5D×CD3多特异性抗体的多核苷酸序列。还提供了包含所述多核苷酸的载体，以及表达本文提供的GPRC5D×CD3多特异性抗体的细胞。还描述了能够表达所公开的载体的细胞。这些细胞可为哺乳动物细胞(诸如293F细胞、CHO细胞)、昆虫细胞(诸如Sf7细胞)、酵母细胞、植物细胞或细菌细胞(诸如大肠杆菌)。所述抗体也可由杂交瘤细胞产生。
治疗组合物和使用多特异性抗体及其多特异性抗原结合片段进行治疗的方法
上文所述的GPRC5D双特异性抗体，例如上文所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体可用于治疗中。具体地讲，GPRC5D双特异性抗体可用于治疗癌症。本文还提供了用于治疗哺乳动物中过度增殖性障碍的治疗组合物，该组合物包含治疗有效量的本文所述的多特异性抗体或多特异性抗原结合片段和药学上可接受的载体。在优选的实施方案中，多特异性抗体为如本文所述的GPRC5D×CD3多特异性抗体或其多特异性抗原结合片段，更优选为如本文所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或其GPRC5D×CD3双特异性抗原结合片段。在一个实施方案中，所述药物组合物用于治疗GPRC5D表达型癌症，包括(但不限于)以下癌症：GPRC5D表达型B细胞癌症，诸如多发性骨髓瘤(MM)；以及其中表达GPRC5D的其它尚待确定的癌症。可用于治疗癌症(诸如血液学癌症，包括上文所述的特定癌症)的特定双特异性抗体包括抗体GC5B81、GC5B465、GS5B483或GC5B596。
本文提供的药物组合物包含：a)有效量的本发明的多特异性抗体或抗体片段，以及b)药学上可接受的载体，其可为惰性或生理活性载体。在优选的实施方案中，多特异性抗体为如本文所述的GPRC5D×CD3多特异性抗体或其多特异性抗原结合片段，更优选为如本文所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或其GPRC5D×CD3双特异性抗原结合片段。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂等。合适的载体、稀释剂和/或赋形剂的示例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等以及它们的任意组合中的一者或多者。在许多情况下，优选的是组合物中包含等渗剂，诸如糖、多元醇或氯化钠。具体地，合适的载体的相关示例包括：(1)pH为约7.4、含或不含约1mg/mL至25mg/mL人血清白蛋白的杜氏磷酸盐缓冲盐水，(2)0.9％盐水(0.9％w/v氯化钠(NaCl))，以及(3)5％(w/v)右旋糖；并且还可含有抗氧化剂诸如色胺和稳定剂诸如
本文的组合物还可含有对所治疗的特定障碍必需的另外治疗剂。优选的是，多特异性抗体或抗体片段和补充活性化合物将具有不会对彼此产生不利影响的互补活性。在一个优选的实施方案中，另外的治疗剂为阿糖胞苷、蒽环霉素、组胺二盐酸盐、或白介素2。在一个优选的实施方案中，另外的治疗剂为化学治疗剂。
本发明的组合物可具有多种形式。这些形式包括例如液体、半固体和固体剂型，但优选的形式取决于预期的施用模式和治疗应用。典型的优选组合物为可注射或可输注溶液的形式。优选的施用方式为肠胃外施用(例如静脉内施用、肌内施用、腹膜内施用、皮下施用)。在一个优选的实施方案中，本发明的组合物通过推注静脉内施用或通过在一段时间内连续输注施用。在另一个优选的实施方案中，这些组合物通过肌内、皮下、关节内、滑膜内、肿瘤内、肿瘤周围、病灶内或病灶周围途径注射，以发挥局部以及全身治疗效果。
用于肠胃外施用的无菌组合物可通过下列方式制备：将所需量的本发明的抗体、抗体片段或抗体缀合物掺入合适的溶剂中，然后通过微滤技术进行灭菌。可使用水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等以及它们的组合作为溶剂或媒介物。在许多情况下，优选的是组合物中包含等渗剂，诸如糖、多元醇或氯化钠。这些组合物还可含有辅助剂，尤其是润湿剂、等渗剂、乳化剂、分散剂和稳定剂。用于肠胃外施用的无菌组合物也可制备成无菌固体组合物的形式，其在使用时可溶解于无菌水或任何其它可注射的无菌介质中。
多特异性抗体或抗体片段也可口服施用。作为用于口服施用的固体组合物，可使用片剂、丸剂、粉剂(明胶胶囊、小药囊)或颗粒剂。在这些组合物中，根据本发明的活性成分与一种或多种惰性稀释剂(诸如淀粉、纤维素、蔗糖、乳糖或二氧化硅)在氩气流下混合。这些组合物还可包含除稀释剂之外的物质，例如一种或多种润滑剂(诸如硬脂酸镁或滑石)、着色剂、包衣(糖衣片)或釉料。
作为用于口服施用的液体组合物，可使用含有惰性稀释剂(诸如水、乙醇、甘油、植物油或石蜡油)的药学上可接受的溶液、混悬剂、乳剂、糖浆剂和酏剂。这些组合物可包含除稀释剂之外的物质，例如润湿、增甜、增稠、矫味或稳定产品。
这些物质的剂量取决于期望的效应、治疗持续时间和所用的施用途径；对于成人来说，通常每日口服5mg和1000mg之间的这些物质，单位剂量在1mg至250mg活性物质范围内。一般来讲，医生将根据年龄、体重和待治疗的受治疗者特有的任何其它因素来确定合适的剂量。
本文还提供了通过向对其此需要的患者施用结合所述GPRC5D并能够募集T细胞来杀伤所述GPRC5D+细胞(即T细胞重定向)的多特异性抗体来杀伤GPRC5D+细胞的方法。本发明的多特异性抗体或抗体片段中的任一种可以治疗方式使用。例如，在一个实施方案中，GPRC5D×CD3多特异性抗体可以治疗方式用于治疗受治疗者的癌症。
在一个优选的实施方案中，本发明的多特异性抗体或抗体片段用于治疗哺乳动物中的过度增殖性障碍。在一个更优选的实施方案中，含有本发明的多特异性抗体或抗体片段的上文所公开的药物组合物之一用于治疗哺乳动物中的过度增殖性障碍。在一个实施方案中，该障碍是癌症。具体地讲，所述癌症为GPRC5D表达型癌症，包括(但不限于)以下癌症：GPRC5D表达型B细胞癌症，诸如多发性骨髓瘤(MM)；以及其中表达GPRC5D的其它尚待确定的癌症。在优选的实施方案中，多特异性抗体为如本文所述的GPRC5D×CD3多特异性抗体或其多特异性抗原结合片段，更优选为如本文所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或其GPRC5D×CD3双特异性抗原结合片段。
因此，本发明的药物组合物可用于治疗或预防多种癌症，这些癌症包括(但不限于)以下：GPRC5D表达型癌症，包括(但不限于)以下癌症：GPRC5D表达型B细胞/浆细胞癌症，诸如急性多发性骨髓瘤(MM)或癌变前骨髓瘤如MGUS(意义不明的单克隆丙球病)和SMM(郁积型多发性骨髓瘤)以及浆细胞瘤；以及其中表达GPRC5D的其它尚待确定的癌症。
类似地，本文还提供了用于抑制所选细胞群的生长的方法，该方法包括在外周血单核细胞(PBMC)的存在下使GPRC5D表达型靶细胞或含有此类靶细胞的组织与有效量的本发明的多特异性抗体或抗体片段单独接触，或使GPRC5D表达型靶细胞或含有此类靶细胞的组织接触有效量的本发明的多特异性抗体或抗体片段与其它细胞毒性剂或治疗剂的组合。在优选的实施方案中，多特异性抗体为如本文所述的GPRC5D×CD3多特异性抗体或其多特异性抗原结合片段，更优选为如本文所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或其GPRC5D×CD3双特异性抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，另外的治疗剂为阿糖胞苷、蒽环霉素、组胺二盐酸盐、或白介素2。在一个优选的实施方案中，另外的治疗剂为化学治疗剂。用于抑制所选细胞群的生长的方法能够在体外、体内或离体执行。
体外使用的示例包括在移植到同一患者中之前处理自体骨髓以杀伤患病细胞或恶性细胞；在移植之前处理骨髓以杀伤感受态T细胞并预防移植物抗宿主病(GVHD)；处理细胞培养物以杀伤除不表达靶抗原的所需变体之外的所有细胞；或杀伤表达不期望抗原的变体。本领域的普通技术人员易于确定非临床体外使用的条件。
临床离体使用的示例是在癌症治疗中在自体移植之前除去骨髓中的肿瘤细胞。处理可按照下列步骤进行。从患者或其它个体中采集骨髓，然后在含有向其中加入本发明的细胞毒性剂的血清的培养基中温育。浓度范围为约10μM至1μM，在约37℃下温育约30分钟至约48小时。本领域的普通技术人员易于确定浓度和温育时间的确切条件，即剂量。温育后，用含有血清的培养基洗涤骨髓细胞，并且将这些骨髓细胞根据已知方法通过静脉内输注返回患者身上。在患者接受其它治疗(诸如在骨髓采集时间和处理过的细胞再输注时间之间的消融化疗或全身放疗的过程)的情况下，使用标准医疗设备将处理过的骨髓细胞冷冻保存在液氮中。
对于临床体内使用，将治疗有效量的多特异性抗体或抗原结合片段施用于对其有需要的受治疗者。例如，GPRC5D×CD3多特异性抗体及其多特异性抗原结合片段可用于治疗对其有需要的受治疗者中的GPRC5D表达型癌症。在一些实施方案中，GPRC5D表达型癌症为B细胞癌症，诸如多发性骨髓瘤(MM)。在优选的实施方案中，多特异性抗体为如本文所述的GPRC5D×CD3多特异性抗体或其多特异性抗原结合片段，更优选为如本文所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或其GPRC5D×CD3双特异性抗原结合片段。在一些实施方案中，受治疗者是哺乳动物，优选是人。在一些实施方案中，多特异性抗体或抗原结合片段将以经测试其无菌性的溶液形式施用。
调节上述治疗方法和用途中的剂量方案以提供最佳的期望响应(例如治疗响应)。例如，可施用单次推注，可随着时间推移施用若干分份剂量，或如由治疗情况的紧急指示可按比例减少或增加剂量。肠胃外组合物可配制成易于施用且剂量一致的剂量单位形式。
多特异性抗体和片段的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病症，并且可由本领域技术人员确定。本发明的化合物的治疗有效量的示例性、非限制性范围为约0.001-10mg/kg，诸如约0.001-5mg/kg(如约0.001-2mg/kg)，诸如约0.001-1mg/kg(例如约0.001mg/kg、约0.01mg/kg、约0.1mg/kg、约1mg/kg或约10mg/kg)。
本领域中具有普通技能的医师或兽医可容易地确定和开出所需药物组合物的有效量。例如，医师或兽医开始在药物组合物中采用的多特异性抗体或片段的剂量的水平可以低于为了达到期望的治疗效果所需的水平，然后逐渐增加剂量直至达到所需的效果。通常，本发明的双特异性抗体的合适日剂量将是有效产生治疗效果的最低剂量的化合物的量。施用方式可为例如肠胃外施用，诸如静脉内、肌内或皮下。在一个实施方案中，多特异性抗体或片段可通过以mg/m2计算的每周剂量输注来施用。根据下式：剂量(mg/kg)×70:1.8，这样的剂量可例如基于以上提供的mg/kg剂量。这样的施用可重复如1至8次，诸如3至5次。可通过在2至24小时(诸如2至12小时)的时间段内连续输注进行施用。在一个实施方案中，多特异性抗体或片段可通过长时间(诸如多于24小时)的缓慢连续输注来施用，以便减少毒副作用。
在一个实施方案中，多特异性抗体或片段可以作为固定剂量计算的每周剂量方式施用多达八次，诸如当每周施用一次时为四至六次。这样的方案可根据需要例如在六个月或十二个月后重复一次或多次。这样的固定剂量可例如基于以上提供的mg/kg剂量，其中体重估计为70kg。可通过测量本发明的双特异性抗体在通过例如取出生物样品施用时在血液中的量并且使用靶向本发明的多特异性抗体的GPRC5D抗原结合区的抗独特型抗体来测定或调节剂量。
在一个实施方案中，多特异性抗体或片段可通过维持疗法施用，诸如例如每周一次，持续六个月或更长时间。
还可预防性地施用多特异性抗体或片段，以便降低罹患癌症的风险、延迟癌症进展中事件的发作和/或在癌症缓解后降低复发的风险。
如本文所述的多特异性抗体及其片段还可以组合疗法施用，即与待治疗的疾病或病症相关的其它治疗剂组合。因此，在一个实施方案中，含抗体的药物用于与一种或多种另外的治疗剂(诸如化学治疗剂)组合。在一些实施方案中，其它治疗剂为阿糖胞苷、蒽环霉素、组胺二盐酸盐、或白介素2。此类组合施用可以任何顺序同时、分开或顺序进行。对于同时施用，这些治疗剂可作为一种组合物施用或作为单独的组合物施用，视情况而定。
在一个实施方案中，提供了一种用于治疗受治疗者中涉及表达GPRC5D的细胞的障碍的方法，该方法包括向对其有需要的受治疗者施用治疗有效量的多特异性抗体或片段(诸如本文所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体)以及放射疗法。在一个实施方案中，提供了一种用于治疗或预防癌症的方法，该方法包括向对其有需要的受治疗者施用治疗有效量的多特异性抗体或片段(诸如本文所述的GPRC5D×CD3抗体)以及放射疗法。放射疗法可包括辐射或向患者施用相关放射性药物。辐射源可在被治疗患者的外部或内部(辐射治疗可为例如体外放射治疗(EBRT)或短距离放射治疗(BT)的形式)。可用于实施此类方法的放射性元素包括例如镭、铯-137、铱-192、镅-241、金-198、钴-57、铜-67、锝-99、碘-123、碘-131和铟-111。
试剂盒
本文还提供了试剂盒，该试剂盒包括例如所述的多特异性抗体或其抗原结合片段以及使用所述抗体或片段杀伤特定类型细胞的说明书。在优选的实施方案中，多特异性抗体为如本文所述的GPRC5D×CD3多特异性抗体或其多特异性抗原结合片段，更优选为如本文所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或其GPRC5D×CD3双特异性抗原结合片段。说明书可包括在体外、体内或离体使用多特异性抗体或其抗原结合片段的说明。
通常，试剂盒将具有包含多特异性抗体或其抗原结合片段的隔室。多特异性抗体或其抗原结合片段可为冻干形式、液体形式或适于包括在试剂盒中的其它形式。试剂盒也可包括实施试剂盒中说明书上所述方法所需的其它元件，例如用于复原冻干粉末的无菌溶液、用于在施用于患者之前与多特异性抗体或其抗原结合片段组合的其它试剂以及有助于向患者施用多特异性抗体或其抗原结合片段的工具。
诊断用途
本文所述的多特异性抗体和片段也可用于诊断目的。因此，还提供了包含如本文定义的多特异性抗体或片段的诊断组合物及其用途。在优选的实施方案中，多特异性抗体为如本文所述的GPRC5D×CD3多特异性抗体或其多特异性抗原结合片段，更优选为如本文所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或其GPRC5D×CD3双特异性抗原结合片段。在一个实施方案中，本发明提供了用于诊断癌症的试剂盒，该试剂盒包括容纳双特异性GPRC5D×CD3抗体和用于检测抗体与GPRC5D的结合的一种或多种试剂的容器。试剂可包括例如荧光标签、酶标签或其它可检测标签。试剂还可包括用于酶反应的二级或三级抗体或试剂，其中酶反应生成能够可视化的产物。例如，本文所述的多特异性抗体或其抗原结合片段可用放射标记物、荧光标记物、表位标签、生物素、发色团标记物、ECL标记物、酶、钌、111In-DOTA、111In-二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶，或者聚组氨酸或本领域已知的类似此类标记物进行标记。
实施方案
本文所提供的公开还提供了以下非限制性实施方案。
1.一种特异性地结合至GPRC5D的分离抗体或其抗原结合片段，所述分离抗体或其抗原结合片段包含：
a.具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR3；
b.具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR3；
c.具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3；
d.具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链CDR3；
e.具有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链CDR3；
f.具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的重链CDR3；
g.具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链CDR3；
h.具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3；
i.具有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的重链CDR3；
j.具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的重链CDR3；
k.具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链CDR3；
l.具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的重链CDR3；或
m.具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的重链CDR3。
2.根据实施方案1所述的分离抗体或抗原结合片段，其中
a.包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的所述重链CDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的所述重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的所述重链CDR3的所述抗体还包含具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链CDR3；
b.包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的所述重链CDR1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的所述重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的所述重链CDR3的所述抗体还包含具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链CDR3；
c.包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的所述重链CDR1、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的所述重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的所述重链CDR3的所述抗体还包含具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链CDR3；
d.包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的所述重链CDR1、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的所述重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的所述重链CDR3的所述抗体还包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链CDR3；
e.包含具有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的所述重链CDR1、具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的所述重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的所述重链CDR3的所述抗体还包含具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的轻链CDR3；
f.包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的所述重链CDR1、具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的所述重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的所述重链CDR3的所述抗体还包含具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链CDR3；
g.包含具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的所述重链CDR1、具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的所述重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的所述重链CDR3的所述抗体还包含具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链CDR3；
h.包含具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的所述重链CDR1、具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的所述重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的所述重链CDR3的所述抗体还包含具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链CDR3；
i.包含具有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的所述重链CDR1、具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的所述重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的所述重链CDR3的所述抗体还包含具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链CDR3；
j.包含具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的所述重链CDR1、具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的所述重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的所述重链CDR3的所述抗体还包含具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的轻链CDR3；
k.包含具有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的所述重链CDR1、具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的所述重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的所述重链CDR3的所述抗体还包含具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的轻链CDR3；
l.包含具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的所述重链CDR1、具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的所述重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的所述重链CDR3的所述抗体还包含具有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO:81的氨基酸序列的轻链CDR3；或
m.包含具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的所述重链CDR1、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的所述重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的所述重链CDR3的所述抗体还包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链CDR3。
3.一种分离抗体或其抗原结合片段，所述分离抗体或其抗原结合片段特异性地结合至GPRC5D并且包含选自SEQ ID NO:52、53、54、55、82、83、84、85、86、87、88、89、或91的可变重(VH)链区。
4.根据实施方案3所述的抗体，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ IDNO:56、57、58、92、93、或94的可变轻(VL)链区。
5.根据实施方案3所述的抗体，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ IDNO:52、53、54、55、82、83、84、85、86、87、88、89、或91的VH区以及选自SEQ ID NO:56、57、58、92、93、或94的VL区。
6.根据实施方案5所述的抗体，其中所述VH链区包含与包含SEQ ID NO:56的VL链区配对的SEQ ID NO:52、53、或83。
7.根据实施方案5所述的抗体，其中所述VH链区包含与包含SEQ ID NO:57的VL链区配对的SEQ ID NO:54、84、85、86、或90。
8.根据实施方案5所述的抗体，其中所述VH链区包含与包含SEQ ID NO:58的VL链区配对的SEQ ID NO:55或88。
9.根据实施方案5所述的抗体，其中所述VH链区包含与包含SEQ ID NO:92的VL链区配对的SEQ ID NO:82或87。
10.根据实施方案5所述的抗体，其中所述VH链区包含与包含SEQ ID NO:93的VL链区配对的SEQ ID NO:89。
11.根据实施方案5所述的抗体，其中所述VH链区包含与包含SEQ ID NO:94的VL链区配对的SEQ ID NO:91。
12.根据实施方案1至11中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合至具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的多肽。
13.根据实施方案1至12中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是人抗体或抗原结合片段。
14.根据实施方案1至13中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是重组的。
15.根据实施方案1至14中任一项所述的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是Fab片段、Fab2片段或单链抗体。
16.根据实施方案1至15中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
17.根据实施方案1至9中任一项所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段为IgG1或IgG4同种型。
18.根据实施方案17所述的抗体，其中所述IgG1在其Fc区中具有K409R置换。
19.根据实施方案17所述的抗体，其中所述IgG1在其Fc区中具有F405L置换。
20.根据实施方案20所述的抗体，其中所述IgG4在其Fc区中具有F405L置换和R409K置换。
21.根据实施方案16所述的抗体，所述抗体还在其Fc区中包含S228P置换、L234A置换和L235A置换。
22.根据实施方案1至14中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合人GPRC5D并与食蟹猴GPRC5D交叉反应。
23.根据实施方案17中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段以小于约28nM的EC50体外诱导ADCC。
24.一种分离细胞，所述细胞表达根据实施方案1至11中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
25.根据实施方案24所述的细胞，其中所述细胞是杂交瘤。
26.根据实施方案24所述的细胞，其中所述抗体是重组产生的。
27.一种分离GPRC5D×CD3双特异性抗体或其GPRC5D×CD3双特异性结合片段，所述分离GPRC5D×CD3双特异性抗体或其GPRC5D×CD3双特异性结合片段包含：
a)第一重链(HC1)；
b)第二重链(HC2)；
c)第一轻链(LC1)；以及
d)第二轻链(LC2)，
其中所述HC1和所述LC1配对形成特异性地结合CD3的第一抗原结合位点，并且所述HC2和所述LC2配对形成特异性地结合GPRC5D的第二抗原结合位点。
28.根据实施方案27所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中HC1包含SEQ ID NO:25并且LC1包含SEQ ID NO:26。
29.根据实施方案28所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中HC2包含SEQ ID NO:52并且LC2包含SEQ ID NO:56。
30.根据实施方案28所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中HC2包含SEQ ID NO:53并且LC2包含SEQ ID NO:56。
31.根据实施方案28所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中HC2包含SEQ ID NO:54并且LC2包含SEQ ID NO:57。
32.根据实施方案28所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中HC2包含SEQ ID NO:55并且LC2包含SEQ ID NO:58。
33.根据实施方案28所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中HC2包含SEQ ID NO:82并且LC2包含SEQ ID NO:92。
34.根据实施方案28所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中HC2包含SEQ ID NO:83并且LC2包含SEQ ID NO:56。
35.根据实施方案28所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中HC2包含SEQ ID NO:84并且LC2包含SEQ ID NO:57。
36.根据实施方案28所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中HC2包含SEQ ID NO:85并且LC2包含SEQ ID NO:57。
37.根据实施方案28所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中HC2包含SEQ ID NO:86并且LC2包含SEQ ID NO:57。
38.根据实施方案28所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中HC2包含SEQ ID NO:87并且LC2包含SEQ ID NO:92。
39.根据实施方案28所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中HC2包含SEQ ID NO:88并且LC2包含SEQ ID NO:58。
40.根据实施方案28所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中HC2包含SEQ ID NO:89并且LC2包含SEQ ID NO:93。
41.根据实施方案28所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中HC2包含SEQ ID NO:91并且LC2包含SEQ ID NO:94。
42.根据实施方案28所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中HC2包含SEQ ID NO:85并且LC2包含SEQ ID NO:57。
43.根据实施方案27至42中任一项所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中所述抗体或双特异性结合片段为IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同种型。
44.根据实施方案43所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中所述抗体或双特异性结合片段为IgG4同种型。
45.根据实施方案27至42所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中所述抗体或其双特异性结合片段结合人骨髓瘤细胞的表面上的GPRC5D。
46.根据实施方案27至42所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中所述抗体或其双特异性结合片段结合人多发性骨髓瘤细胞的表面上的GPRC5D。
47.根据实施方案27至42所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中所述抗体或双特异性结合片段以小于约0.22nM的EC50诱导人T细胞体外活化。
48.根据实施方案27至42所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中所述抗体或双特异性结合片段以小于约0.89nM的EC50诱导GPRC5D表达型细胞在体外的T细胞依赖性细胞毒性。
49.一种分离细胞，所述分离细胞表达根据实施方案27至42中任一项所述的抗体或双特异性结合片段。
50.根据实施方案49所述的细胞，其中所述细胞是杂交瘤。
51.根据实施方案49所述的细胞，其中所述抗体或双特异性结合片段是重组产生的。
52.一种用于治疗患有癌症的受治疗者的方法，所述方法包括：
向对其有需要的患者施用治疗有效量的根据实施方案27至42中任一项所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段足以治疗所述癌症的时间。
53.一种用于抑制癌细胞的生长或增殖的方法，所述方法包括：
施用治疗有效量的根据实施方案27至42中任一项所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段以抑制癌细胞的生长或增殖。
54.一种使T细胞重定向GPRC5D表达型癌细胞的方法，所述方法包括：
施用治疗有效量的根据实施方案27至42中任一项所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段以使T细胞重定向癌症。
55.根据实施方案52、53或54所述的方法，其中所述癌症为血液学癌症。
56.根据实施方案55所述的方法，其中所述血液学癌症为GPRC5D表达型B细胞癌症。
57.根据实施方案56所述的方法，其中所述GPRC5D表达型B细胞癌症为多发性骨髓瘤。
58.根据实施方案52所述的方法，所述方法包括施用第二治疗剂。
59.根据实施方案58所述的方法，其中所述第二治疗剂为化学治疗剂或靶向抗癌疗法。
60.根据实施方案59所述的方法，其中所述化学治疗剂为阿糖胞苷、蒽环霉素、组胺二盐酸盐、或白介素2。
61.根据实施方案59所述的方法，其中所述第二治疗剂与所述双特异性抗体同时、顺序或分开施用于所述受治疗者。
62.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据实施方案27至42中任一项所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段以及药学上可接受的载体。
63.一种方法，所述方法用于通过培养根据实施方案49至51中任一项所述的细胞来生成根据实施方案27至42中任一项所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段。
64.一种分离合成多核苷酸，所述分离多核苷酸编码根据实施方案27至42中任一项所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段的HC1、HC2、LC1或LC2。
65.一种试剂盒，所述试剂盒包括如根据实施方案27至42中任一项所定义的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段和/或如根据实施方案63所定义的多核苷酸及其包装。
实施例
提供了以下实施例以补充现有公开并提供对本文所述主题的更好理解。不应将这些实施例视为限制所描述的主题。而应当理解，本文所述的实施例和实施方案只是为了进行示意性的说明，根据其的各种变型或改变对于本领域技术人员将是显而易见的并且包括在本发明真实范围内，并可在不脱离本发明真实范围的情况下进行各种变型或改变。
实施例1：抗原
由于难以产生重组的GPRC5D抗原，使用标准方法产生显示GPRC5D[人(SEQ ID NO:22)、cyno(SEQ ID NO:23)和小鼠(SEQ ID NO:24)]的转染细胞系，以用作全细胞抗原用于抗体产生和表征研究(表4)。
表4：GPRC5D表达型细胞系
蛋白质 细胞系 启动子 抗性
人GPRC5D HEK293T CMV 新霉素
CynoGPRC5D HEK293F CMV 杀稻瘟菌素
实施例2：利用噬菌体展示产生GPRC5D抗体
采取两种不同的方法，通过噬菌体产生GPRC5D抗体：标准细胞淘选(负选择)和FACS细胞噬菌体淘选(竞争选择)。
标准细胞噬菌体淘选(负选择)：
内部新创噬菌体库(In-house de novo)详述于(Shi等人(2010)J.Mol.Biol.397:385-396；国际专利公布WO09/085462中所述。这些库以三个人VH胚系基因(IGHV1-69、3-23、5-51)和四个人VL胚系基因(A27、B3、L6、O12)为基础构建，被设计成具有较高的CDR-H3多样性。使噬菌体外壳蛋白pIX上显示Fab变体的三种新创噬菌体库(DNP00004 -169HC/LC混合物，DNP00005 -323HC/LC混合物和DNP00006 -551HC/LC混合物)针对GPRC5D-表达型HEK293G5稳定细胞(靶细胞)淘选第1、3、5轮，并且对于第2和4轮，将前一轮扩增的Fab-pIX噬菌体施加于HEK293背景细胞(负选择)(参见表5)。将结合靶细胞的第1轮新创Fab-pIX噬菌体回收以扩增过夜。对于第2轮，将所选的第1轮噬菌体施加于背景细胞，此处回收未结合的Fab-pIX噬菌体以使负选择的噬菌体扩增过夜。实施另一组阳性和阴性轮次淘选——第3轮和第4轮。实施最终一轮，将上一轮负选择的扩增噬菌体分成两个淘选样本，一个用于靶细胞且一个用于背景细胞淘选。
表5：标准细胞噬菌体淘选流程表-负选择
标准细胞噬菌体淘选(背景选择)：
依据如此前所提及的标准细胞淘选过程所实施的类似环境和温育时间，将Fab-pIX噬菌体展示文库加入HEK293细胞(表6)。在三轮之后，对应于HEK293结合的Fab-pIX噬菌体的DNA用于产生PCR扩增子以进行NGS。这些NGS结果将用于NGS2.0软件内的附加动态消减分析，以助于辨别可能的靶特异性Fab候选。
表6：标准细胞噬菌体淘选流程表-背景选择
淘选轮次 用作抗原的细胞
1 HEK293
2 HEK293
3 HEK293
FACS细胞噬菌体淘选(竞争选择)
通过将Fab-pIX噬菌体同时施加于靶细胞和背景细胞的混合物进行三轮淘选(表7)。对于第1和第2轮，通过使用GFP信号来分选Fab-pIX噬菌体结合的靶细胞。为了从分选的细胞捕获结合的Fab-pIX噬菌体，应用酸性细胞裂解，之后进行大肠杆菌感染。在最终轮中，将第2轮扩增的Fab-pIX噬菌体和细胞混合物分选成GFP靶细胞门化和非GFP背景细胞门化的两个群体。通过酸裂解和大肠杆菌感染来捕集两种细胞群结合的Fab-pIX噬菌体。
表7：FACS细胞噬菌体淘选流程表-竞争选择
淘选轮 用作抗原的细胞
1 人GPRC5D_GFP&HEK293
2 人GPRC5D_GFP&HEK293
3 人GPRC5D_GFP&HEK293
噬菌体淘选的新一代测序(NGS)
使最后一轮淘选的六个样品在葡萄糖抑制下生长过夜。这些培养物用于制备小量制备的DNA(Qiagen QIAspin DNA试剂盒)。将六个DNA样品用作PCR模板，生成从HCDR1到HCDR3测量的扩增子。对六种扩增子进行凝胶纯化，并且通过保持2.1、3.0型式分开而对于标准细胞淘选汇集并对于FACS细胞淘选完全汇集。将这些汇集的经凝胶纯化扩增子提供给Genewiz NGS服务以通过MiSeq 1x300技术处理。文件经Genewiz传送并上传到本地服务器(nas2.0)。在该服务器内，使用NGS2.0软件应用程序加载、读取和分析序列文件。根据拷贝数(>50)以及靶细胞(+)与背景细胞(-)序列的比率(比率>5:1)的排名前88个序列被选择用于IgG转化。因为仅可变重链序列由NGS测定，全重链构建体必须以电子方式构建成适当的框架。此外，因为仅重链序列是已知的，使各候选与四种亲本轻链(A27，B3，L6，O12)配对。候选最终转化为人IgG4PAA。
ELISA筛选和标准测序
由用于NGS的相同DNA制备物进行限制性酶消化和自身连接，以切除基因pIX使得可溶性Fab表达。通过ELISA对三个淘选样品各自挑选的九十二个克隆评估Fab表达，并且通过桑格方法测序来测定重链和轻链。将LCDR内具有多样化序列的最终候选克隆进哺乳动物表达质粒中。
实施例4：通过噬菌体展示技术获得的GPRC5D抗体的初始表征
GPRC5D结合：
如上所述，使用人GPRC5D细胞作为抗原完成全细胞噬菌体淘选。根据NGS分析，仅各个候选的重链序列是已知的。因此，各重链必须与4种亲本轻链(A27，B3，L6，O12)配对，从而由用NGS鉴定的87个Hc序列产生348种mAb。使用FACS，初始评价这些mAb与cyno GPRC5D的结合。cyno GPRC5D细胞系被选择用于初始筛选以使潜在结合信号最大化，原因是cynoGPRC5D细胞系具有比人GPRC5D细胞系更高的表达水平。简而言之，FACS筛选通过使蛋白质浓度归一化为1ug/mL来进行，并且将100ul的蛋白质与每孔200,000个细胞混合。使mAb与细胞在4℃温育下1小时。然后用PBS和0.2％FBS将细胞洗涤三次。随后，加入缀合有PE的抗人第二mAb(Jackson目录号709-116-149)作为检测剂。使细胞与第二抗体在4℃温育下1小时。然后用PBS和0.2％FBS将细胞洗涤三次。将细胞用PBS和0.2％FBS再次洗涤并随后在FACSarry上进行分析。
观察到大量结合cyno GPRC5D的命中，包括MFI大于100,000的15种mAb，MFI小于100,000但大于10,000的23种mAb，以及MFI小于10,000但大于1000的63种mAb(表8)。
表8：源于NGS的mAb与cyno GPRC5D的FACS结合数据使由NGS分析所鉴定的重链序列与如所示的各亲本Lc进行配对。将GC5M29用作对照(PH9L3轻链)。突出显示的mAb的MFI>1000。
选择结合亲和力最高的40种mAb进行附加表征，所述表征包括：重复进行对cynoGPCR5D细胞的结合研究，以及使用FACS评估与人GPRC5D表达型细胞的结合(表9)。分析这些数据，选择出17种mAb进行纯化和产生GPRC5D×CD3双特异性抗体(突出显示)。用于选择mAb进行纯化和产生GPRC5D×CD3双特异性抗体的因素包括结合人GPRC5D的特异性、对cynoGPRC5D的交叉反应性以及Hc序列多样性。例如，使GC5H36与三种不同的轻链配对并分析结合(GC5B162、GC5B163、GC5B164)。仅GC5B164较为先进，原因是观察到相比于GC5B162或GC5B163，该mAb对人GPRC5D的MFI更高。
表9：源于NGS的mAb与cyno GPRC5D和人GPRC5D表达型HEK293F细胞的FACS结合数据未转染的HEK293F细胞用于评价对GPRC5D的结合特异性。TF7M1636用作同种型对照。突出显示的mAb被选择用于进一步分析。
各个所选的mAb对人GPRC5D表达型HEK293细胞和未转染的HEK293细胞的浓度依赖性结合特征使用FACS进行测定(图1)。观察到所有mAb以剂量依赖性方式结合人GPRC5D。三种mAb即GC5B36、GC5B168和GC5B205也被观察到结合未转染的(GPRC5D空白)HEK293细胞，并且由于与细胞的该非特异性相互作用而不优先考虑。
剩余的14种mAb被选择用于产生具有抗CD3臂CD3B219和抗RSV空白臂B23M46的双特异性抗体(表10)。
表10：GPRC5D mAb ID与双特异性ID之间的关系
一种双特异性抗体GCDB38在重组期间沉淀，并且另一种GCDB36包含>10％的聚集体。所有其它双特异性抗体均通过标准释放判据，并且分析空白臂双特异性抗体对人GPRC5D表达型HEK293细胞的浓度依赖性结合(图2)。
观察到所有双特异性抗体均以剂量依赖性方式结合。为了理解二价mAb与单价双特异性抗体之间的结合差异，GC5B320作为结合比较物包括在内。为了理解抗CD3双特异性抗体与抗RSV空白臂mAb之间的结合差异，GCDB44作为结合比较物包括在内。当比较mAbGC5B320与双特异性抗体GCDB30和GCDB44时，观察到表观结合亲和力预期的减小。此外，观察到相比于GCDB30(抗RSV空白臂双特异性Ab)，GCDB44(抗CD3双特异性Ab)对抗人GPRC5D细胞的结合亲和力稍微较高，这表明抗CD3臂积极地影响与该细胞系的结合。
还概要分析了双特异性抗体组针对内源性表达GPRC5D的MM1R和H929细胞的结合(图3)。利用FACS，将双特异性抗体对MM1R和H929细胞的结合特征与过表达的人GPCR5DHEK293细胞和未转染的HEK293细胞进行比较。观察到双特异性抗体以一定范围的亲和力结合内源性地表达于MM1R和H929细胞的GPRC5D。观察到对人GPRC5D HEK细胞的结合最高，该细胞作为过表达的稳定细胞系具有比MM1R或H929细胞高得多的受体密度。GCDB37、GCDB38、GCDB39和GCDB41不太有利，因为观察到对H929和MM1R细胞的结合亲和力较低。
体外T-细胞依赖性细胞毒性
然后使用H929和MM1R靶细胞，概要分析双特异性抗体组在T-细胞介导的细胞毒性测定中的效力(图4A和B，表11)。简而言之，对靶细胞(H929，MM1.R，OPM2，LP-1和Daudi或HEK亲本和HEK+GPRC5D细胞)进行计数，将1千万个细胞以1350rpm离心3分钟并使细胞沉淀重悬于1mL的经稀释CFSE溶液(CellTrace CFSE增殖染色剂重构于18μL的无菌DMSO中，并将1μL的溶液用10mL的无菌PBS稀释)中并且在室温下于暗处温育8分钟。温育后，将1mL的HI FBS加入细胞悬浮液中以淬灭多余的CFSE。将细胞在含有10％FBS的RPMI-1640中洗涤两次。在10mL的RPMI中复原后，对细胞进行计数并将细胞活力记录在电子表格中。将细胞稀释至2.2×10^5/mL并在37℃下温育直至使用。
使得自正常供体的泛T细胞在37℃水浴中解冻，然后将细胞以1350rpm于4℃离心3分钟。弃去上清液并以1.1×10^6/mL浓度重构于培养基中。将2×10^5个靶细胞加入96孔U形底板的孔中，然后加入Fc阻断剂(至最终浓度为2mg/mL)。将所有细胞系在室温下温育10分钟以阻断Fc受体活性。向孔中加入1×10^5个T细胞(5:1的效应子:靶比率)。在混合靶细胞和T细胞后，将20μl的GPRC5D×CD3双特异性抗体稀释液加入每个孔中。将GPRC5D×CD3双特异性抗体用PBS稀释至800μg/mL(10×)。在96孔U形底板中用PBS中的4倍系列稀释度制备滴定液。最后一列留为单独的PBS(载体对照)。将平板在37℃和5％CO2下温育48小时。
两天之后(48小时)，使平板离心并将100μL的上清液于-80℃储存以供细胞因子释放测定。将细胞在200μl的PBS中洗涤并在室温下在50μl的近红外Live/Dead染色剂(1:200稀释度)和抗-CD25PE抗体(1:50稀释度)中温育20分钟。然后，将细胞在200μl的FACS缓冲液中洗涤一次，最后在150μl的FACS缓冲液中复原。使用FACSCanto II和FlowJo 7.6分析细胞的靶细胞毒性(靶％)和T细胞活化CD25+(活T细胞％)。使用具有可变斜率(四个参数)函数的非线性回归并使用最小二乘法在GraphPadPrism 6中完成数据的作图和拟合。
表11：使用H929和MM1R靶细胞对GPRC5D×CD3双特异性抗体的T-细胞介导的细胞毒性评估所计算的平均EC50。
所有双特异性抗体在T-细胞介导的H929细胞杀伤中呈活性，并且观察到一定范围的效力(表11)。对于两种细胞系观察到类似的等级次序。然而，在MM1R细胞中观察到较低的EC50。令人感兴趣地，结合亲和力不一定与T-细胞介导的细胞毒性测定中的效力相关。例如，GCDB44以最高亲和力结合双特异性抗体，但在细胞毒性测定中效力却最低。而具有类似(尽管略微较低)结合亲和力的GCDB43在细胞毒性测定中的效力最强。
为了评估与cyno GPRC5D的功能交叉反应性，然后使用cyno GPRC5D HEK293细胞概要分析双特异性抗体组的T-细胞介导的细胞毒性和T细胞活化(图5A和B)。所有双特异性抗体在该测定中均呈活性，但观察到针对cyno GPRC5D+表达型细胞的一定范围的效力。
体内功效
为了解这些GPRC5D×CD3双特异性抗体的体内效力，然后完成体内研究的基准化分析。选择GCDB32和GCDB35(图5A&B)在H929预防肿瘤模型中进行测试。在注射人PBMC后一周，将H929细胞植入NSG小鼠中。在植入H929细胞的同时开始双特异性抗体处理，并且每隔2天或3天(q2d或q3d)以10ug、1ug和0.1ug/动物剂量持续处理，共五次处理。每组中使用十只小鼠，并且PBS作为载体对照包括在内。在第11天停止处理，并且在第25天(图6A和B)或第26天(图12A-D)终止研究。除GCDB35示出在1ug/动物剂量下约80％的抑制肿瘤生长之外，该预防模型中测试的所有GPRC5D×CD3抗体均示出在10ug和1ug/动物剂量下100％的抑制肿瘤生长。在低十倍的剂量(0.1ug/动物)下，这些双特异性抗体示出10％至80％肿瘤生长抑制范围内的不同程度的功效。
Fc阻断剂存在下体外T-细胞依赖性细胞毒性
为了获得对GPRC5D靶向臂特异性的理解，然后在Fc阻断剂存在下，在T-细胞重定向细胞毒性测定中评估GPRC5D×CD3双特异性抗体组。该实验对理解如双特异性抗体对靶细胞的特异性是体外测定中表达Fcγ受体的B-细胞与双特异性抗体的Fc部分相互作用的能力很关键。在T-细胞介导的细胞毒性测定中观察到多个双特异性抗体的效力偏移，并且观察到GCDB40和GCDB34的偏移最大(图7A-7B)。
然后，完成四种最有效的双特异性抗体(GCDB32、GCDB35、GCDB40和GCDB43)与Fcγ受体之间的结合相互作用的直接测量(图8A-8D)。对各Fcγ受体和以上所列双特异性抗体进行一轮Alpha Screen分析。将所有样本一式两份进行分析。在FcγRI上，四种双特异性抗体表现得类似于B21M hIgG4 PAA。也就是说，它们的竞争性不超过匹配的同种型对照。还在FcγRIIIa上观察到hIgG1 WT对照与四种双特异性抗体之间的差异类似，并且GCD43最类似于IgG4PAA同种对照，其它双特异性抗体对FcγRIIIa具有稍微较高的亲和力。在FcγRIIa和FcγRIIb上，四种双特异性抗体按以下次序竞争：GCDB40>GCDB32>GCDB43>GCDB35。GCDB40最具竞争性或以最高亲和力结合FcγRIIa和FcγRIIb。事实上，GCDB40以与hIgG1WT相同的程度在FcγRIIa和FcγRIIb上竞争，证实了当包括Fc阻断剂时在T-细胞介导的细胞毒性测定中所观察到的效力偏移。由于与FcγRIIa和FcγRIIb意料不到的交互作用，GCDB40不太有利。
竞争结合测定
评估抗GPRC5D mAb彼此对人GPCR5D细胞的竞争性结合。简而言之，将细胞以50,000个细胞/孔平板接种于50uL培养基中并允许在37C下沉降90分钟。然后将孔用3％BSA在室温下封闭1小时。根据标准程序，用钌(II)三-联吡啶、N-羟基琥珀酰亚胺(Ru-标签)标记mAb。在独立的96孔板中，将5uM的竞争者mAb与50nM的Ru-标记的mAb一起温育。从细胞平板移除阻断溶液并添加25uL的mAb溶液。将平板在振荡下于室温温育1小时。在用PBS洗涤平板三次之后，添加150uL的MSD读取缓冲液(不含表面活性剂)并用MSD读板机检测Ru-标记的抗体的结合。
所有的mAb属于同一个竞争组，仅GC5B420和GC5B421未完全受到GC5B81、GC5B285和/或GC5B332竞争(阻断<70％)(表12)。假设两种mAb与GPRC5D的结合可能在空间上不能给出相比于mAb的尺寸而言较小尺寸的GPRC5D细胞外结构域。
表12：抗GPRC5D mAb的竞争性结合表位分箱评估抗GPRC5D mAb彼此对人GPCR5D细胞的竞争性结合(+/-＝阻断<70％)。
mAb ID GC5B81 GC5B164 GC5B285 GC5B332 GC5B420 GC5B421
GC5B81 + + + + +/- +/-
GC5B164 + + + + + +
GC5B285 + + + + + +/-
GC5B332 + + + + +/- +
GC5B420 + + + + + +
GC5B421 + + + + + +
GC5B243 + + + + + +
实施例4：用杂交瘤技术产生GPRC5D抗体
在第0、10和20天，三只Balb/c小鼠用表达全长人GPRC5D的pCMV6-neo(CMV启动子)质粒DNA在尾根部经皮内注射进行免疫。在第59天，小鼠接受最终腹膜内注射和静脉注射过表达全长人GPRC5D的大鼠嗜碱性白血病(RBL)细胞进行免疫。在第63天，收获得到***和脾，进行B细胞富集，并使用细胞产生约3500种mAb分泌性杂交瘤。
实施例5：通过杂交瘤技术获得的GPRC5D抗体的初始表征
GPRC5D结合
用FACS筛选同时结合RBL和人GPRC5D表达型RBL细胞的杂交瘤。计算结合GPRC5D_RBL细胞的每种mAb相对于未转染RBL细胞的经背景调节的MFI比率，并且结合比率大于3的任何样品均被视为潜在阳性。九十九种杂交瘤具有大于3的比率并且对于V区克隆有利。对三十一种mAb序列进行鉴定，合成，表达和纯化。31种mAb中有两种表现出结合RBL_GPRC5D细胞超出背景(图9A和8B)。GCDB390和GCDB396被选择用于表达、纯化和产生具有抗CD3臂CD3B219的双特异性抗体，以分别产生双特异性抗体GCDB46和GCDB47。
T-细胞依赖性细胞毒性
将GCDB46和GCDB47在T-细胞介导的细胞毒性测定中进行评估(图10A和10B)。观察到这两种双特异性抗体是有效的，所报告的EC50分别为0.67nM和0.1nM。在这些数据的基础上，对这两种mAb连同三种源于噬菌体的mAb进一步先导最优化。
实施例6：命中评价、选择和优化
基于表13所汇总的结合、功能、交叉反应性和选择性数据，选择五种GPRC5D双特异性抗体进行先导最优化(GCDB32、GCDB43、GCDB35、GCDB46、GCDB47)。
表13：GPRC5D×CD3双特异性抗体的先导最优化数据：评估双特异性抗体的结合、功能、交叉反应性和选择性。
先导最优化旨在解决如表14所概述的GCDB32(GC5B81亲本mAb)、GCDB43(GC5B285亲本mAb)和GCDB35(GC5B164亲本mAb)的潜在翻译后修饰(PTM)序列的风险。
表14：对源于噬菌体的命中消除PTM序列的潜在可能性示出Hc CDR序列，并且潜在PTM序列可能性标有下划线。
(每个列出的序列的SEQ ID NO在括号中提供)
对GC5B81分析的所有PTM变体具有显著减小的结合亲和力，表明了该残基(HCW102)对于互补位的关键性(表15)。
表15：GC5B81PTM文库的CDR序列和结合数据：突变位点标有下划线。结合分类为MFI>10,000＝++；MFI>1,000＝+；MFI<1,000
(每个列出的序列的SEQ ID NO在括号中提供)
结合研究鉴定了GC5B285和GC5B164两者的突变数，它们保持对人GPRC5D结合(表16和17)。
表16：GC5B164PTM文库的CDR序列和结合数据：突变位点标有下划线。结合分类为MFI>10,000＝++；MFI>1,000＝+；MFI<1,000.
(每个列出的序列的SEQ ID NO在括号中提供)
表17：GC5B285PTM文库的CDR序列和结合数据：突变位点标有下划线。结合分类为MFI>10,000＝++；MFI>1,000＝+；MFI<1,000。
(每个列出的序列的SEQ ID NO在括号中提供)
在该结合数据的基础上，所选的mAb作为GPRC5D×CD3双特异性抗体产生，并且评估H929细胞的T-细胞介导的细胞毒性(表18)。
表18：GCDB164和GCDB285的所选GPRC5D PTM变体的功能活性
观察到一定范围的效力，T-细胞介导的细胞毒性测定不一定由所观察的结合亲和力预测。例如，GC5B465和GC5B463以类似的亲和力结合人GPRC5D，差别仅在于序列的2个氨基酸(表17)，并且观察到它们作为GPRC5D×CD3双特异性Ab的效力有12.5倍的差异(表18)。在功能数据的基础上，GC5B465和GC5B483被选择为GC5B285(GCDB43作为CD3双特异性)和GC5B164(GCDB35作为CD3双特异性)的最优化序列。
对小鼠杂交瘤衍生的GPCR5D mAb(GC5B390和GC5B396、或GCDB46和47分别作为CD3双特异性)完成人框架适应。结合研究鉴定了保持结合人GPRC5D的GC5B396的多个框架和GC5B390的一个框架(表19)。
表19：杂交瘤衍生的抗GPRC5D mAb文库的人框架适应的结合和功能数据：结合分类为MFI>10,000＝+++；MFI>5,000＝++；MFI>1,000＝+；MFI<1,000。
在结合数据的基础上，几种抗GPCR5D mAb作为CD3双特异性抗体产生，并且评估H929细胞的T-细胞介导的细胞毒性(表18)。功能分析将GCDB63、GCDB67和GCDB69鉴定为有效的完全人源化GPRC5D×CD3双特异性抗体。在这些数据的基础上，对应的抗GPRC5D mAb即GC5B515、GC5B532和GC5B540被选择为GC5B390和GC5B391的完全人源化序列。
然后，完成完全人源化序列的附加先导最优化，目的在于解决GC5B515、GC5B532和GCDB540的潜在翻译后修饰序列的风险。G56S突变产生在重链序列中，以除去GC5B515的潜在脱酰胺风险(表20)。
表20：GC5B532、GC5B540和GCDB515的所选GPRC5D PTM变体的结合和功能活性：
GC5B532和GC5B540的重链包含潜在异构化和氧化风险。产生M64K和G99A突变以改善该风险(表20)。具有G99A突变的被测试所有变体具有结合亲和力的显著下降，而M64K和G56A变体不受影响。基于结合数据，仅GC5B596继续进行功能评估，并在T-细胞介导的细胞毒性测定中展示作为CD3双特异性分子(GCDB72)的效力。
因此，四种GPRC5D双特异性mAb被选择用于附加表征：GCDB32、GCDB53、GCDB61和GCDB72。下表21和22示出用于产生双特异性分子的GPRC5D mAb的CDR以及重链和轻链序列。
表21：示出针对人和cyno GPRC5D结合且作为CD3双特异性分子产生时具功能性的4种GPRC5D mAb候选的CDR序列：
表22:示出针对人和cyno GPRC5D结合且作为CD3双特异性分子产生时具功能性的4种GPRC5D mAb候选的重链和轻链可变区序列：
实施例7：在IgG4S228P、L234A、L235A中以双特异性形式制备GPRC5D和CD3抗体
四种单特异性GPRC5D抗体(参见表21)表示为IgG4，具有Fc置换S228P、L234A和L235A或S228P、L234A、L235A、F405L和R409K(CD3臂)(根据EU索引进行编号)。还产生了单特异性抗CD3抗体CD3B219，其包含具有SEQ ID NO:25的重链和SEQ ID NO:26的轻链的VH和VL区，以及具有S228P、L234A、L235A、F405L和R409K置换的IgG4恒定区。
使用蛋白A柱(HiTrap MabSelect SuRe柱)使用标准方法纯化单特异性抗体。洗脱后，将收集物透析至D-PBS(pH 7.2)。
通过在体外Fab臂交换中组合单特异性CD3mAb和单特异性GPRC5D mAb来生成双特异性GPRC5D×CD3抗体(如WO2011/131746中所述)。简而言之，将约1-20mg/mL的抗GPRC5D/抗CD3抗体的PBS溶液(pH 7-7.4)和75mM 2-巯基乙醇胺(2-MEA)以摩尔比1.08:1混合在一起并在25-37℃下温育2-6小时，然后采用标准方法通过透析、渗滤、切向流过滤和/或旋转细胞过滤除去2-MEA。
GPRC5D×CD3双特异性抗体的重链和轻链示于下表23中。
表23：双特异性Ab IgG4-PAA的重链和轻链序列
实施例8：GCDB32、GCDB53、GCDB61和GCDB72的功能表征
评估GCDB32、GCDB53、GCDB61和GCDB72对小鼠GPRC5D的结合(表24)。所有四种双特异性抗体以所观察的一定范围的结合亲和力结合小鼠GPRC5D。
表24：抗GPCR5D×CD3抗体与小鼠GPRC5D的结合：
另外使用过表达的人和cyno GPRC5D细胞系的T-细胞重定向细胞毒性测定，评估与cyno GPRC5D的交叉反应性(表25)。一种GPRC5D×CD3双特异性抗体针对人和cynoGPRC5D等效(GCDB32)，而测试的其它双特异性分子诱导cyno GPRC5D的细胞毒性的效力低于人GPRC5D。
表25：先导GPRC5D×CD3抗体针对人和cyno GPRC5D-表达型HEK细胞的功能活性：
附加的表征旨在理解体外结合(图11A-11E)和效力(表26)。
表26：先导GPRC5D×CD3抗体对几种人GPRC5D-表达型B细胞系的T-细胞介导的细胞毒性：
虽然观察到一定范围的结合亲和力，GCDB61为最强的结合物且GCDB72&GCDB32为最弱的结合物，在体外的效力极类似于双特异性抗体组。然而，根据等级次序分析，GCDB72在所分析的各种B细胞系中最有效。使用源于患者的MNC的体外结合和效力实验得到与体外测定更类似的结果(表27以及图15A和15B)。
表27：源于MM患者的MNC的GPCR5D×CD3双特异性抗体结合、T-细胞介导的细胞毒性和T-细胞活化：
GCDB61与患者MNC具有最高的结合亲和力，而GCDB72&GCDB32为最弱的结合物。同样，即使观察到结合亲和力差异，所有双特异性抗体在T-细胞重定向的细胞毒性测定中展示出亚纳摩尔功效。分子实际上在体内和体外效力的基础上不可区分，然而，体内数据提供了分化(图12A-12D)。
在注射人PBMC后一周，将H929细胞植入NSG小鼠中。在植入H929细胞的同时开始双特异性抗体处理，并且每隔2天或3天(q2d或q3d)以10ug、1ug和0.1ug/动物剂量持续处理，共五次处理。每组中使用十只小鼠，并且PBS作为载体对照包括在内。在第11天停止处理，并且在第26天(图12A-D)终止研究。该预防模型中测试的所有GPRC5D×CD3双特异性抗体示出在10ug和1ug/动物剂量下100％的抑制肿瘤生长。在0.1ug/动物的最低剂量下观察到分化，并且GCDB72展示出优于所测的其它双特异性抗体，观察到80％的抑制肿瘤生长。
实施例9：GPRC5D抗体对GPRC5D+MM1.R细胞系的结合特征
使用FACS测量GPRC5D抗体对GPRC5D+人MM细胞系(MM1.R，购自ATCC(美国典型培养物保藏中心))的结合亲和力。图13示出所有先导抗体以剂量依赖性方式结合GPRC5D表达型MM.1R细胞，EC50值范围为0.10nM至135nm，除GC5B602之外全部都显著低于获得121.7nM的EC50值的商业抗体FAB6300(R&D Systems，目录号FAB6300A，克隆号571961)的值。
将GPRC5D+MM1.R细胞系用各种浓度前导抗体染色60分钟，以测量表面结合特征(n＝3)。藻红蛋白标记的人IgG4Fc用作第二抗体来捕获信号(Southern Biotech，克隆HP6025，目录号9200-09)。结合表示为归一化几何平均荧光强度，如由FACS所测。使用具有可变斜率(四个参数)的非线性回归和最小二乘拟合法在GraphPad Prism 6中完成数据的作图和拟合。
此外，相比于商业抗体，使用三种GPRC5D+(JIM3、OPM-2和MM.1R；细胞系，购自ATCC)多发性骨髓瘤细胞系评估GPRC5D mAb GC5M481的结合特征(图14A)。另外，使用cyno-GPRC5D表达型Daudi细胞概要分析GPRC5D mAb(GC5M481)的cyno交叉反应性，其相比于亲本细胞示出较强结合(图14A)。另外，五种GPRC5D×CD3双特异性抗体(GCDB32、GCDB48、GCDB53、GCDB61和GCDB72)在用GPRC5D+(JIM3、OPM-2和MM1.R)细胞系评价结合潜能时(图14B)示出显著的结合，如由相比于同种型对照(灰色填充的虚线)的柱状图偏移(黑色实线)所证实。
实施例10：GCDB72在PBMC-人源化NSG小鼠中针对皮下MM.1S人多发性骨髓瘤异种 移植物的抗肿瘤功效
该体内研究实施成在PBMC人源化NSG小鼠中测定GCDB72针对所建立的MM.1S人多发性骨髓瘤(MM)异种移植物的功效。在研究第0天，将类似体重和年龄的雌性NSG小鼠于右背后肋侧经皮下(sc)植入MM.1S人MM细胞(每小鼠200μL PBS中1×107个细胞)。肿瘤细胞移植后第7天，经由侧尾静脉经静脉内注射1×107个人PBMC(溶于200μL PBS)。处理起始于第15天，当平均肿瘤体积为约72–78mm3时，使每只小鼠以0.1μg(0.005mg/kg)、1μg(0.05mg/kg)、10μg(0.5mg/kg)和50μg(2.5mg/kg)接受静脉内(iv)施用的PBS或GCDB72 DuoBody抗体。空白DuoBody对照、CD3×空白和空白×GPRC5D各自以每小鼠10μg给予。处理约每隔三天(q3d)施用，共七次剂量。观察到两种高剂量(10μg和50μg)GCDB72强健的抗肿瘤功效，其中在研究结束时MM.1S sc肿瘤在100％(每组10只中有10只)动物中完全消退(图16)。此外，相比于PBS处理的肿瘤，每小鼠1μg剂量显著抑制65％(p≤0.0001)肿瘤生长，而0.1μg剂量具有较小的效应(TGI＝19.3％，p＝0.0023)。CD3×空白的效应不被视为有效(TGI＝28％，p≤0.0001)，并且空白×GPRC5D具有3.1％TGI(p＝0.9971)的可忽略影响。在第36天测定TGI，此时每组有至少80％的存活动物。由于GVHD，显著的体重减轻和/或死亡率在第36天后开始显现(图17)。在第43天终止研究，此时有60％或更少的动物留存在组中。
实施例11：GPRC5D抗体的抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性(ADCC)
抗人GPRC5D mAb组作为IgG1mAb生成。此外，新的抗人GPRC5D mAb组如实施例2所述生成。下表28和29示出新GPRC5D mAb的CDR以及重链和轻链可变区序列。这些新抗体用于如实施例7所述产生双特异性CD3分子，并且还作为IgG1mAb引入以供ADCC活性评估。
表28：新GPRC5D抗体组的CDR序列
表29：新GPRC5D抗体组的重链和轻链可变区序列
针对H929细胞的ADCC活性(表30和31)。简而言之，将多发性骨髓瘤细胞用钙黄绿素-AM在室温下标记30分钟并在两次PBS洗涤后以0.2×106/mL重悬于RPMI+10％HI FBS中。将PBMC解冻并在PBS洗涤后以每mL 3×106个细胞重悬于RPMI生长培养基中。使10000或50000个靶细胞与100000或2500000个PBMC在抗体存在下混合，并在CO2培养箱中于37℃温育3小时。在温育之后，将平板以200g离心4分钟，将100ul的上清液转移到新96孔板中，在485/535nM处测量荧光强度。对RFU值作图以计算裂解百分比。
表30：具有IgG1 Fc的抗GPRC5D mAb对H929细胞的抗体依赖性细胞毒性：
表31：H929细胞的抗体依赖性细胞毒性和T-细胞介导的细胞毒性的比较
观察到一定范围的效力，该范围在2pM至27.7nM内。结合亲和力不一定能预测ADCC测定中的功效。例如，GC5B382和GC5B379具有与人GPRC5D细胞类似的结合亲和力，但在ADCC测定中针对H929细胞的细胞毒性有15×差异。相似地，如GPRC5D×CD3双特异性分子的细胞毒性诱导不能预测ADCC测定中的效能，如由GC5B370和GC5B602所例示。当格式化为CD3双特异性分子时，GC5B602(GCDB63)具有针对H929细胞的亚纳摩尔效力，而GC5B370作为CD3双特异性分子(GCDB41)基本上失活。相同的v区在格式化为IgG1mAb时导致ADCC测定中的相反观察，GC5B370观察为相比于GC5B602更有效(约1100×倍)。
序列表简述

Claims (65)

1.一种特异性地结合至GPRC5D的分离抗体或其抗原结合片段，所述分离抗体或其抗原结合片段包含：
a.具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的重链互补决定区1（CDR1）、具有SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的重链CDR3；
b.具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的重链CDR3；
c.具有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的重链CDR3；
d.具有SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的重链CDR3；
e.具有SEQ ID NO: 61的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO: 67的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 72的氨基酸序列的重链CDR3；
f.具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 30的氨基酸序列的重链CDR3；
g.具有SEQ ID NO: 27的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO: 29的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 73的氨基酸序列的重链CDR3；
h.具有SEQ ID NO: 27的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO: 29的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的重链CDR3；
i.具有SEQ ID NO: 62的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 74的氨基酸序列的重链CDR3；
j.具有SEQ ID NO: 63的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO: 69的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 75的氨基酸序列的重链CDR3；
k.具有SEQ ID NO: 64的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO: 70的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的重链CDR3；
l.具有SEQ ID NO: 65的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 76的氨基酸序列的重链CDR3；或
m.具有SEQ ID NO: 66的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO: 71的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 77的氨基酸序列的重链CDR3。
2.根据权利要求1所述的分离抗体或抗原结合片段，其中
a.包含具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的所述重链CDR1、具有SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的所述重链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的所述重链CDR3的所述抗体还包含具有SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 19的氨基酸序列的轻链CDR3；
b.包含具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的所述重链CDR1、具有SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的所述重链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的所述重链CDR3的所述抗体还包含具有SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 19的氨基酸序列的轻链CDR3；
c.包含具有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的所述重链CDR1、具有SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的所述重链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的所述重链CDR3的所述抗体还包含具有SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的轻链CDR3；
d.包含具有SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的所述重链CDR1、具有SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的所述重链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的所述重链CDR3的所述抗体还包含具有SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 21的氨基酸序列的轻链CDR3；
e.包含具有SEQ ID NO: 61的氨基酸序列的所述重链CDR1、具有SEQ ID NO: 67的氨基酸序列的所述重链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 72的氨基酸序列的所述重链CDR3的所述抗体还包含具有SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO: 78的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 80的氨基酸序列的轻链CDR3；
f.包含具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的所述重链CDR1、具有SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的所述重链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 30的氨基酸序列的所述重链CDR3的所述抗体还包含具有SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 19的氨基酸序列的轻链CDR3；
g. 包含具有SEQ ID NO: 27的氨基酸序列的所述重链CDR1、具有SEQ ID NO: 29的氨基酸序列的所述重链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 73的氨基酸序列的所述重链CDR3的所述抗体还包含具有SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的轻链CDR3；
h.包含具有SEQ ID NO: 27的氨基酸序列的所述重链CDR1、具有SEQ ID NO: 29的氨基酸序列的所述重链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的所述重链CDR3的所述抗体还包含具有SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的轻链CDR3；
i.包含具有SEQ ID NO: 62的氨基酸序列的所述重链CDR1、具有SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的所述重链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 74的氨基酸序列的所述重链CDR3的所述抗体还包含具有SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的轻链CDR3；
j.包含具有SEQ ID NO: 63的氨基酸序列的所述重链CDR1、具有SEQ ID NO: 69的氨基酸序列的所述重链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 75的氨基酸序列的所述重链CDR3的所述抗体还包含具有SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO: 78的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 80的氨基酸序列的轻链CDR3；
k.包含具有SEQ ID NO: 61的氨基酸序列的所述重链CDR1、具有SEQ ID NO: 67的氨基酸序列的所述重链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 72的氨基酸序列的所述重链CDR3的所述抗体还包含具有SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO: 78的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 80的氨基酸序列的轻链CDR3；
l.包含具有SEQ ID NO: 65的氨基酸序列的所述重链CDR1、具有SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的所述重链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 76的氨基酸序列的所述重链CDR3的所述抗体还包含具有SEQ ID NO: 95的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO: 79的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 81的氨基酸序列的轻链CDR3；或
m.包含具有SEQ ID NO: 66的氨基酸序列的所述重链CDR1、具有SEQ ID NO: 71的氨基酸序列的所述重链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 77的氨基酸序列的所述重链CDR3的所述抗体还包含具有SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO: 21的氨基酸序列的轻链CDR3。
3. 一种分离抗体或其抗原结合片段，所述分离抗体或其抗原结合片段特异性地结合至GPRC5D并且包含选自SEQ ID NO: 52、53、54、55、82、83、84、85、86、87、88、89、或91的可变重（VH）链区。
4. 根据权利要求3所述的抗体，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NO:56、57、58、92、93、或94的可变轻（VL）链区。
5. 根据权利要求3所述的抗体，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NO:52、53、54、55、82、83、84、85、86、87、88、89、或91的VH区以及选自SEQ ID NO: 56、57、58、92、93、或94的VL区。
6. 根据权利要求5所述的抗体，其中所述VH链区包含与包含SEQ ID NO: 56的VL链区配对的SEQ ID NO: 52、53、或83。
7. 根据权利要求5所述的抗体，其中所述VH链区包含与包含SEQ ID NO: 57的VL链区配对的SEQ ID NO: 54、84、85、86、或90。
8. 根据权利要求5所述的抗体，其中所述VH链区包含与包含SEQ ID NO: 58的VL链区配对的SEQ ID NO: 55或88。
9. 根据权利要求5所述的抗体，其中所述VH链区包含与包含SEQ ID NO: 92的VL链区配对的SEQ ID NO: 82或87。
10. 根据权利要求5所述的抗体，其中所述VH链区包含与包含SEQ ID NO: 93的VL链区配对的SEQ ID NO: 89。
11. 根据权利要求5所述的抗体，其中所述VH链区包含与包含SEQ ID NO: 94的VL链区配对的SEQ ID NO: 91。
12. 根据权利要求1至11中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合至具有SEQ ID NO: 22的氨基酸序列的多肽。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段为人抗体或抗原结合片段。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是重组的。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段为Fab片段、Fab2片段或单链抗体。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
17.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段为IgG1或IgG4同种型。
18.根据权利要求17所述的抗体，其中所述IgG1在其Fc区中具有K409R置换。
19.根据权利要求17所述的抗体，其中所述IgG1在其Fc区中具有F405L置换。
20.根据权利要求20所述的抗体，其中所述IgG4在其Fc区中具有F405L置换和R409K置换。
21.根据权利要求16所述的抗体，所述抗体还在其Fc区中包含S228P置换、L234A置换和L235A置换。
22.根据权利要求1至14中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合人GPRC5D并与食蟹猴GPRC5D交叉反应。
23. 根据权利要求17中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段以小于约28 nM的EC50体外诱导ADCC。
24.一种分离细胞，所述分离细胞表达根据权利要求1至11中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
25.根据权利要求24所述的细胞，其中所述细胞为杂交瘤。
26.根据权利要求24所述的细胞，其中所述抗体是重组产生的。
27.一种分离GPRC5D×CD3双特异性抗体或其GPRC5D×CD3双特异性结合片段，所述分离GPRC5D×CD3双特异性抗体包含：
a) 第一重链(HC1)；
b)第二重链(HC2)；
c)第一轻链(LC1)；以及
d)第二轻链(LC2)，
其中所述HC1和所述LC1配对形成特异性地结合CD3的第一抗原结合位点，并且所述HC2和所述LC2配对形成特异性地结合GPRC5D的第二抗原结合位点。
28. 根据权利要求27所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中HC1包含SEQ ID NO: 25并且LC1包含SEQ ID NO: 26。
29. 根据权利要求28所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中HC2包含SEQ ID NO: 52并且LC2包含SEQ ID NO: 56。
30. 根据权利要求28所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中HC2包含SEQ ID NO: 53并且LC2包含SEQ ID NO: 56。
31. 根据权利要求28所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中HC2包含SEQ ID NO: 54并且LC2包含SEQ ID NO: 57。
32. 根据权利要求28所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中HC2包含SEQ ID NO: 55并且LC2包含SEQ ID NO: 58。
33. 根据权利要求28所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中HC2包含SEQ ID NO: 82并且LC2包含SEQ ID NO: 92。
34. 根据权利要求28所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中HC2包含SEQ ID NO: 83并且LC2包含SEQ ID NO: 56。
35. 根据权利要求28所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中HC2包含SEQ ID NO: 84并且LC2包含SEQ ID NO: 57。
36. 根据权利要求28所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中HC2包含SEQ ID NO: 85并且LC2包含SEQ ID NO: 57。
37. 根据权利要求28所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中HC2包含SEQ ID NO: 86并且LC2包含SEQ ID NO: 57。
38. 根据权利要求28所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中HC2包含SEQ ID NO: 87并且LC2包含SEQ ID NO: 92。
39. 根据权利要求28所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中HC2包含SEQ ID NO: 88并且LC2包含SEQ ID NO: 58。
40. 根据权利要求28所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中HC2包含SEQ ID NO: 89并且LC2包含SEQ ID NO: 93。
41. 根据权利要求28所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中HC2包含SEQ ID NO: 91并且LC2包含SEQ ID NO: 94。
42. 根据权利要求28所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中HC2包含SEQ ID NO: 85并且LC2包含SEQ ID NO: 57。
43.根据权利要求27至42中任一项所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中所述抗体或双特异性结合片段为IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同种型。
44.根据权利要求43所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中所述抗体或双特异性结合片段为IgG4同种型。
45.根据权利要求27至42所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中所述抗体或其双特异性结合片段结合人骨髓瘤细胞的表面上的GPRC5D。
46.根据权利要求27至42所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中所述抗体或其双特异性结合片段结合人多发性骨髓瘤细胞的表面上的GPRC5D。
47.根据权利要求27至42所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中所述抗体或双特异性结合片段以小于约0.22nM的EC50诱导人T细胞体外活化。
48.根据权利要求27至42所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中所述抗体或双特异性结合片段以小于约0.89nM的EC50诱导GPRC5D表达型细胞在体外的T细胞依赖性细胞毒性。
49.一种分离细胞，所述细胞表达根据权利要求27至42中任一项所述的抗体或双特异性结合片段。
50.根据权利要求49所述的细胞，其中所述细胞为杂交瘤。
51.根据权利要求49所述的细胞，其中所述抗体或双特异性结合片段是重组产生的。
52.一种用于治疗患有癌症的受治疗者的方法，所述方法包括：
向对其有需要的患者施用治疗有效量的根据权利要求27至42中任一项所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段足以治疗所述癌症的时间。
53.一种用于抑制癌细胞的生长或增殖的方法，所述方法包括：
施用治疗有效量的根据权利要求27至42中任一项所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段以抑制癌细胞的生长或增殖。
54.一种使T细胞重定向GPRC5D表达型癌细胞的方法，所述方法包括：
施用治疗有效量的根据权利要求27至42中任一项所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段以使T细胞重定向癌症。
55.根据权利要求52、53或54所述的方法，其中所述癌症为血液学癌症。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述血液学癌症为GPRC5D表达型B细胞癌症。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述GPRC5D表达型B细胞癌症为多发性骨髓瘤。
58.根据权利要求52所述的方法，所述方法包括施用第二治疗剂。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述第二治疗剂为化学治疗剂或靶向抗癌疗法。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述化学治疗剂为阿糖胞苷、蒽环霉素、组胺二盐酸盐、或白介素2。
61.根据权利要求59所述的方法，其中所述第二治疗剂与所述双特异性抗体同时、顺序或分开施用于所述受治疗者。
62.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求27至42中任一项所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段以及药学上可接受的载体。
63.一种方法，所述方法用于通过培养根据权利要求49至51中任一项所述的细胞来生成根据权利要求27至42中任一项所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段。
64.一种分离合成多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求27至42中任一项所述的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段的HC1、HC2、LC1或LC2。
65.一种试剂盒，所述试剂盒包括如根据权利要求27至42中任一项所定义的GPRC5D×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段和/或如根据权利要求63所定义的多核苷酸及其包装。
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