CN109689870A - 用于治疗自身免疫疾病的抗体 - Google Patents

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Abstract

提供了新型抗体。提供了结合人LAG‑3的结构域3的单克隆抗体或其结合片段，并具有以下(ii)至(v)中所述的性质中一种或多种，以及(i)至(vi)中所述的性质：(i)具有体外ADCC活性；(ii)以低岩藻糖形式减少体内LAG‑3阳性细胞的数量；(iii)以低岩藻糖形式抑制体内实验性自身免疫性脑脊髓炎；(iv)与人活化的T细胞结合；(v)在所述抗体或其结合片段存在下，人LAG‑3与人II型主要组织相容性复合体分子结合；和(vi)所述抗体或其结合片段的存在允许人LAG‑3发挥人T细胞抑制功能。

Description

用于治疗自身免疫疾病的抗体
技术领域
本发明涉及抗体，其结合片段，包含抗体或其结合片段的分子，多核苷酸，载体，细胞，用于产生抗体或其结合片段的方法，通过所述产生方法获得的抗体或结合片段，包含抗体或其结合片段的组合物，包含抗体或其结合片段的药物组合物，用于治疗或预防与LAG-3阳性细胞相关的疾病(例如自身免疫疾病)的药物组合物，抗体或其结合片段用于治疗或预防这些疾病的用途，以及治疗这些疾病的方法，所述方法包括施用抗体或其结合片段的步骤。
背景技术
T淋巴细胞(T细胞)是在免疫反应中起重要作用的细胞，并且因此体内存在具有各种抗原特异性的T细胞，据称其为1000万至100亿个克隆，以处理多种抗原。当抗原侵入体内时，这些巨大的T细胞储库中，只有非常有限数量的抗原特异性克隆增殖并被激活，以通过细胞因子产生和细胞毒性活性等发挥身体防御作用。在自身免疫疾病中，各种病理状况被认为是由对某些自身抗原的异常免疫反应引发的。即使在这种情况下，其他大多数没有这种抗原特异性的克隆也没有增殖并激活，而是保持静止状态。因此，仅选择性去除活化的T细胞可以特异性地抑制免疫，而不影响大多数具有其他抗原特异性的T细胞，并且因此可以是对抗自身免疫疾病、移植物排斥、过敏性疾病等的有用的治疗或预防方法。同时，在主要激活负调节免疫***的T细胞(如调节性T细胞)的情况下，去除这些细胞可以是针对恶性肿瘤、慢性感染等的有用的治疗或预防方法。
LAG-3 (CD223)是属于免疫球蛋白超家族的单次跨膜分子，并且已知选择性地在活化的T细胞中表达(非专利文献1)。据报道，在向大鼠同种异体心脏移植模型施用具有针对大鼠LAG-3分子的补体依赖性细胞毒性(CDC)活性的兔抗血清时，移植物中的LAG-3阳性细胞减少，从而使得产生移植物排斥的时期稍微延长(非专利文献2)。还报道，具有与狒狒的交叉反应并表现出抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性的抗人LAG-3嵌合抗体A9H12抑制狒狒的迟发型超敏反应，尽管其剂量反应尚不清楚(非专利文献3)，并且制备了其人源化抗体(专利文献2)。
已知LAG-3与II型主要组织相容性复合体(或主要组织相容性基因复合物)(MHC)分子结合，从而向T细胞传递一些抑制信号以负调节T细胞功能(非专利文献1)。对于LAG-3与II型MHC分子的结合，LAG-3的四个细胞外免疫球蛋白样结构域之中的N-末端结构域1和2被认为是重要的(非专利文献4)，并且还报道了利用通过PD-1分子等抑制T细胞功能的其他信号，合作展示了这样的通过LAG-3的T细胞功能抑制(非专利文献5)。实际上，近年来已经积极地开发了通过抑制LAG-3的T细胞抑制功能来激活免疫细胞功能以攻击癌细胞的新型癌症治疗方法(非专利文献6和7)。因此，在对自身免疫疾病应用通过ADCC活性等耗尽LAG-3阳性细胞的LAG-3抗体情况下，认为不具有抑制LAG-3固有的T细胞抑制功能的活性的抗体是更理想的，因为没有由于免疫***的异常激活而使自身免疫疾病更加恶化的风险。在上述具有CDC活性的抗大鼠LAG-3兔抗血清和表现出ADCC活性的抗人LAG-3嵌合抗体A9H12(IMP731：专利文献1和2)中，LAG-3阳性细胞未完全耗尽(非专利文献2和3)，因此假定由于尚未耗尽的剩余T细胞的异常反应而产生副反应以及对自身免疫疾病抑制的负面影响的可能性。
引用列表
专利文献
专利文献1：US 2011/0070238 A1
专利文献2：WO 2014/140180
[非专利文献]
非专利文献1：Triebel, F., LAG-3: a regulator of T-cell and DC responsesand its use in therapeutic vaccination., Trends Immunol., Dec. 2003; Vol. 24(No. 12): p. 619-22
非专利文献2：Haudebourg, T.等人，Depletion of LAG-3 positive cells incardiac allograft reveals their role in rejection and tolerance.,Transplantation, Dec. 2007; Vol. 84 (No. 11): p. 1500-06
非专利文献3：Poirier, N.等人，Antibody-mediated depletion of lymphocyte-activation gene-3 (LAG-3 (+))-activated T lymphocytes prevents delayed-typehypersensitivity in non-human primates, Clin. Exp. Immunol., May 2011; Vol.164 (No. 2): p. 265-74
非专利文献4：Huard, B.等人，Characterization of the majorhistocompatibility complex class II binding site on LAG-3 protein, Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A., May 27, 1997; Vol. 94 (No. 11): p. 5744-49
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非专利文献6：Nguyen, L.T.和Ohashi, P.S., Clinical blockade of PD1 andLAG3--potential mechanisms of action, Nat. Rev. Immunol., Jan. 2015; Vol. 15(No. 1): p. 45-56
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非专利文献8：Huard, B.等人，T cell major histocompatibility complex classII molecules down-regulate CD4+ T cell clone responses following LAG-3binding, Eur. J. Immunol., May 1996; Vol. 26 (No. 5): p. 1180-06
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非专利文献10：Li, M.等人，Reconstitution of human Fc gamma RIII cell typespecificity in transgenic mice, J. Exp. Med., May 1, 1996; Vol. 183 (No. 3):p. 1259-63
非专利文献11：Miller, Stephen D.等人，Experimental AutoimmuneEncephalomyelitis in the Mouse, Current Protocols in Immunology, UNIT 15.1,Wiley, 2010: p. 15.1.1-15.1.20。
发明概述
技术问题
本发明旨在提供新型抗LAG-3抗体等，其中与已知的抗LAG-3抗体相比，各种性质得到改善或者风险被消除或降低。
解决问题的技术方案
本发明涉及：
(1) 单克隆抗体或其结合片段，其结合人LAG-3的结构域3并具有以下(ii)至(v)中描述的性质中一种或多种，以及(i)和(vi)中描述的性质：
(i) 具有体外ADCC活性；
(ii) 以低岩藻糖形式减少体内LAG-3阳性细胞的数量；
(iii) 以低岩藻糖形式抑制体内实验性自身免疫性脑脊髓炎；
(iv) 与人活化的T细胞结合；
(v) 在所述抗体或其结合片段的存在下，人LAG-3与II型人主要组织相容性复合体分子结合；和
(vi) 所述抗体或其结合片段的存在允许人LAG-3发挥人T细胞抑制功能；
(2) 根据(1)的抗体或其结合片段，其具有(ii)和/或(iii)中所述的性质；
(3) 根据(1)或(2)的抗体或其结合片段，其具有(ii)-(v)中所述的全部性质；
(4) 根据(1)-(3)中任一项的抗体或其结合片段，其为嵌合抗体，人源化抗体或人抗体；
(5) 根据(1)至(4)中任一项的抗体或其结合片段，其包含轻链和重链，所述轻链包含具有SEQ ID NO: 50或图65所示的氨基酸序列的CDRL1，具有SEQ ID NO: 51或图66所示的氨基酸序列的CDRL2，和具有SEQ ID NO: 52或图67所示的氨基酸序列的CDRL3；并且所述重链包含具有SEQ ID NO: 47或图62所示的氨基酸序列的CDRH1，具有SEQ ID NO: 48或图63所示的氨基酸序列的CDRH1，和具有SEQ ID NO: 49或图64所示的氨基酸序列的CDRH3；
(6) 根据(4)或(5)的抗体或其结合片段，其为人源化抗体；
(7) 根据(6)的抗体或其结合片段，其包含重链和轻链，所述重链包含源自SEQ ID NO:28或图43所示的氨基酸序列的氨基酸序列，其中对应于68位的氨基酸为Gly或者被Ala取代，并且对应于103位的氨基酸是Asn或被Asp取代，并且轻链包含源自SEQ ID NO: 32或图47所示的氨基酸序列的氨基酸序列，其中对应于21位的氨基酸为Asp或被Asn取代，对应于31位的氨基酸为Leu或被Met取代，对应于33位的氨基酸为Ala或被Ile取代，对应于41位的氨基酸为Ile或被Met取代，对应于58位的氨基酸是Gln或被Lys取代，对应于63位的氨基酸是Ala或被Ser取代，对应于80位的氨基酸为Ser或被Asp取代，对应于85位的氨基酸为Ser或被Gly取代，对应于87位的氨基酸为Ser或被Tyr取代，对应于98位的氨基酸为Leu或被Val取代，对应于103位的氨基酸为Phe或被Ala取代，对应于105位的氨基酸为Thr或被Phe取代，对应于124位的氨基酸为Val或被Leu取代，并且对应126位的氨基酸为Ile或被Leu取代；
(8) 根据(6)或(7)的抗体或其结合片段，其包含轻链可变区氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列，所述轻链可变区氨基酸序列包含选自SEQ ID NO: 32、34、36、38和40的氨基酸序列的氨基酸21至氨基酸129；所述重链可变区氨基酸序列包含选自SEQ ID NO: 28和30的氨基酸序列的氨基酸20至氨基酸140；
(9) 根据(6)至(8)中任一项的抗体或其结合片段，其包含轻链氨基酸序列和重链氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列包含选自SEQ ID NO: 32、34、36、38和40的氨基酸序列的氨基酸21至氨基酸234；所述重链氨基酸序列包含选自SEQ ID NO: 28和30的氨基酸序列的氨基酸20至氨基酸470；
(10) 根据(6)-(9)中任一项的抗体或其结合片段，其选自下述[i]-[x]：
[i] 抗体或其结合片段，其包含重链和轻链，所述重链具有由SEQ ID NO: 30 (图45)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列；所述轻链具有由SEQ ID NO: 34 (图49)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列；
[ii] 抗体或其结合片段，其包含重链和轻链，所述重链具有由SEQ ID NO: 28 (图43)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列；所述轻链具有由SEQ ID NO: 32 (图47)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列；
[iii] 抗体或其结合片段，其包含重链和轻链，所述重链具有由SEQ ID NO: 30 (图45)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列；所述轻链具有由SEQ ID NO: 36 (图51)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列；
[iv] 抗体或其结合片段，其包含重链和轻链，所述重链具有由SEQ ID NO: 28 (图43)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列；所述轻链具有由SEQ ID NO: 34 (图49)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列；
[v] 抗体或其结合片段，其包含重链和轻链，所述重链具有由SEQ ID NO: 28 (图43)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列；所述轻链具有由SEQ ID NO: 36 (图51)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列；
[vi] 抗体或其结合片段，其包含重链和轻链，所述重链具有由SEQ ID NO: 28 (图43)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列；所述轻链具有由SEQ ID NO: 38 (图53)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列；
[vii] 抗体或其结合片段，其包含重链和轻链，所述重链具有由SEQ ID NO: 28 (图43)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列；所述轻链具有由SEQ ID NO: 40 (图55)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列；
[viii] 抗体或其结合片段，其包含重链和轻链，所述重链具有由SEQ ID NO: 30 (图45)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列；所述轻链具有由SEQ ID NO: 32 (图47)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列；
[ix] 抗体或其结合片段，其包含重链和轻链，所述重链具有由SEQ ID NO: 30 (图45)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列；所述轻链具有由SEQ ID NO: 38 (图53)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列；和
[x] 抗体或其结合片段，其包含重链和轻链，所述重链具有由SEQ ID NO: 30 (图45)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列；所述轻链具有由SEQ ID NO: 40 (图55)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列；
(11) 根据(1)的抗体或其结合片段，其包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和重链可变区包含分别与根据(10)的抗体或其结合片段的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列具有95％或更高同一性的氨基酸序列；
(12) 根据(1)的抗体或其结合片段，其包含由第二核酸分子的核苷酸序列编码的轻链可变区氨基酸序列和由第四核酸分子的核苷酸序列编码的重链可变区氨基酸序列，其中所述第二核酸分子在严格条件下与第一核酸分子杂交，所述第一核酸分子具有编码根据(10)的抗体或其结合片段的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列，和所述第四核酸分子在严格条件下与第三核酸分子杂交，所述第三核酸分子具有编码根据(10)的抗体或其结合片段的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列；
(13) 根据(1)的抗体或其结合片段，其具有以下(i)或(ii)中所述的性质：
(i) 结合人LAG-3的结构域3上的位点，所述位点被根据(10)的抗体或其结合片段识别；或
(ii) 与根据(10)的抗体或其结合片段竞争结合人LAG-3的结构域3；
(14) 根据(1)-(13)中任一项的抗体或其结合片段，其为低岩藻糖形式；
(15) 分子，其包含(1)-(14)中任一项的抗体或其结合片段；
(16) 包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列编码(1)-(14)中任一项的抗体或其结合片段的氨基酸序列；
(17) 载体，其包含根据(16)的核酸分子；
(18) 细胞，其包含根据(16)的核酸分子或根据(17)的载体；
(19) 细胞，其产生根据(1)-(14)中任一项的抗体或其结合片段；
(20) 产生根据(1)-(14)中任一项的抗体或其结合片段的方法，其包括培养根据(18)或(19)的细胞的步骤；
(21) 通过根据(20)的方法制备的抗体或其结合片段；
(22) 组合物，其包含根据(1)-(14)和(21)中任一项的抗体或其结合片段，或根据(15)的分子；
(23) 药物组合物，其包含根据(1)-(14)和(21)中任一项的抗体或其结合片段，或根据(15)的分子；
(24) 根据(23)的药物组合物，其用于治疗或预防自身免疫疾病；
(25) 根据(24)的药物组合物，其中所述自身免疫疾病是选自以下的一种或两种或更多种：***和肌肉骨骼***的自身免疫疾病、血液***的自身免疫疾病、消化***的自身免疫疾病、神经***疾病的自身免疫疾病、视觉***的自身免疫疾病、血管***的自身免疫疾病、表皮***的自身免疫疾病、呼吸***的自身免疫疾病、内分泌***的自身免疫疾病、自身免疫性肝炎和由免疫疾病引起的肾炎；
(26) 根据(25)的药物组合物，其中所述***和肌肉骨骼***的自身免疫疾病是选自类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、***性红斑狼疮、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、包涵体肌炎和特发性炎症性肌病(例如免疫介导的坏死性肌病)中的一种或两种或更多种；所述血液***的自身免疫疾病是选自再生障碍性贫血和特发性血小板减少性紫癜中的一种或两种或更多种；所述消化***的自身免疫疾病是选自克罗恩病(Crohn's disease)和溃疡性结肠炎中的一种或两种或更多种；所述神经***的自身免疫疾病是选自多发性硬化症和重症肌无力的一种或两种或更多种；所述视觉***的自身免疫疾病是选自葡萄膜炎、角膜炎和干燥综合征(Sjogren's syndrome)的一种或两种或多种；所述血管***的自身免疫疾病是选自贝切特氏病(Behcet's disease)和韦格纳肉芽肿病(Wegener'sgranulomatosis)中的一种或两种或更多种；所述表皮***的自身免疫疾病是选自牛皮癣、天疱疮、史-约综合征(Stevens-Johnson syndrome)和白癜风中的一种或两种或更多种；所述呼吸***的自身免疫疾病是选自慢性阻塞性肺病和间质性肺炎中的一种或两种或更多种；且所述内分泌***的自身免疫疾病是选自1型糖尿病、自身免疫性甲状腺炎、格雷夫斯病(Graves' disease)和桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)中的一种或两种或更多种；
(27) 根据(23)的药物组合物，其用于治疗或预防移植物排斥；
(28) 根据(27)的药物组合物，其中所述移植物排斥是在选自心脏、肾脏、肝脏、骨髓及其皮肤或组织的器官移植中的排斥和宿主抗移植物反应，和/或由选自以下的造血细胞移植引起的移植物抗宿主疾病：骨髓的移植；外周血的移植；和脐带血的移植；
(29) 根据(24)至(28)中任一项的药物组合物，其与选自以下的一种或两种或更多种组合：抗叶酸剂、钙依赖磷酸酶抑制剂、皮质类固醇、抗胸腺细胞球蛋白、核酸抗代谢物、核酸合成抑制剂、靶向细胞表面抗原的生物制剂、靶向细胞因子或细胞因子受体的生物制剂，静脉内免疫球蛋白和血浆置换；
(30) 根据(23)的药物组合物，其用于治疗或预防过敏性疾病，恶性肿瘤和/或慢性感染等。
本发明的有利效果
本发明提供的抗体、其结合片段、包含它们的分子、包含它们的药物组合物等具有如下特征，例如：允许人LAG-3与人II型主要组织相容性复合体分子结合，并即使在其存在下也允许LAG-3发挥人T细胞抑制功能，同时具有ADCC活性、LAG-3阳性细胞数减少活性、实验性自身免疫性脑脊髓炎抑制活性、人活化T细胞结合活性等，并且因此可用于治疗和/或预防与LAG-3阳性细胞相关的疾病，例如自身免疫疾病，其中抗体优选以低岩藻糖形式。
附图简述
[图1] 图1是显示通过流式细胞术测试大鼠抗LAG-3抗体(rLA204、rLA212、rLA225、rLA869和rLA1264)与表达LAG-3的人PHA母细胞(PHA blasts)的结合活性的结果的图。纵轴表示通过流式细胞术测量的平均荧光强度。
[图2] 图2是显示大鼠抗LAG-3抗体(rLA204、rLA212、rLA225、rLA869和rLA1264)的ADCC活性的图。使用表达人LAG-3的293T-lacZ细胞作为靶细胞，且使用人PBMC作为效应细胞。
[图3] 图3A是显示大鼠抗LAG-3抗体(rLA204、rLA212、rLA225、rLA869和rLA1264)在LAG-3/II型MHC结合测试中的抑制活性的图。使用大鼠IgG2b作为阴性对照，并且使用单独开发并识别LAG-3的结构域1的大鼠抗LAG-3抗体作为阳性对照。每种抗体以10μg/mL进行评估。
图3B是显示作为已知抗体的人嵌合抗LAG-3抗体IMP731在LAG-3/II型MHC结合测试中表现出抑制活性的图。商业可得的小鼠抗人LAG-3抗体17B4也显示出抑制活性。
[图4] 图4是显示大鼠抗LAG-3抗体(rLA204、rLA212、rLA225、rLA869和rLA1264)在293T-hLAG-3/Raji细胞粘附测试中的抑制活性的图。使用大鼠IgG2b作为阴性对照，且使用实施例2)-6中开发的且识别LAG-3的结构域1的大鼠抗LAG-3抗体(克隆6D7)作为阳性对照。每种抗体以10μg/mL进行评估。
[图5] 图5A是显示通过流式细胞术测试大鼠抗LAG-3抗体(rLA204、rLA212和rLA225)的人LAG-3结合表位的结果的图。纵轴表示通过流式细胞术测量的平均荧光强度。还显示了用作阳性对照的抗FLAG抗体的结合。每种抗体以10μg/mL进行评估。
图5B是显示通过流式细胞术测试作为引用列表中的常规抗体的人嵌合抗LAG-3抗体IMP731的人LAG-3结合表位的结果的图。纵轴表示通过流式细胞术测量的平均荧光强度。使用500倍稀释的在实施例1)-1中免疫的大鼠获得的抗血清作为抗血清。每种其他抗体以10μg/mL进行评估。6D7是在实施例2)-6中开发的大鼠抗LAG-3抗体，并识别LAG-3的结构域1。
[图6] 图6是显示通过流式细胞术测试人嵌合抗LAG-3抗体cLA212与表达人LAG-3的293T-lacZ细胞的结合活性的结果的图。纵轴表示通过流式细胞术测量的平均荧光强度。
[图7] 图7是显示作为解离常数的人源化抗LAG-3抗体的结合能力的表格。
[图8] 图8是显示通过流式细胞术测试10种人源化抗LAG-3抗体和人嵌合抗LAG-3抗体cLA212与表达人LAG-3的293T-lacZ细胞的结合活性的结果的图。纵轴表示通过流式细胞术测量的平均荧光强度。
[图9] 图9是显示10种人源化抗LAG-3抗体和人嵌合抗LAG-3抗体cLA212的ADCC活性的图。使用表达人LAG-3的293T-lacZ细胞作为靶细胞，且使用人PBMC作为效应细胞。
[图10] 图10是研究人源化抗LAG-3抗体hLA212_H3/L2和人嵌合抗LAG-3抗体IMP731对LAG-3的T细胞抑制功能的影响的图。当在每种抗体存在下用SEB刺激人PBMC 4天时，测量培养物上清液中的IL-2产生。每种抗体以10μg/mL进行评估。
[图11] 图11是显示通过流式细胞术测试人源化抗LAG-3抗体hLA212_H4/L2与表达人LAG-3的293T-lacZ细胞的结合活性的结果的图。纵轴表示通过流式细胞术测量的平均荧光强度。
[图12] 图12是显示人源化抗LAG-3抗体hLA212_H4/L2的ADCC活性的图。使用表达人LAG-3的293T-lacZ细胞作为靶细胞，且使用人PBMC作为效应细胞。
[图13] 图13是显示人LAG-3/人FcγRIIIA双转基因小鼠中的人LAG-3表达与小鼠LAG-3表达一致的图。通过流式细胞术(多重染色)研究活化T细胞上的人和小鼠LAG-3表达，其中通过使用Con A刺激从人LAG-3/人FcγRIIIA双转基因小鼠(Tg)和对照野生型小鼠(非Tg)的外周血获得的白细胞而获得活化T细胞。显示了对CD3阳性T细胞设门控用于分析时的结果。使用不含针对人和小鼠LAG-3的染色抗体的样品设定图的象限。
[图14] 图14是显示人源化抗LAG-3抗体hLA212_H4/L2在体内对LAG-3表达细胞的消耗活性的图。纵轴表示在施用所述抗体和Con A后两天，人LAG-3/人FcγRIIIA双转基因小鼠的外周血的T细胞中的人LAG-3阳性。所述抗体以30mg/kg的剂量腹膜内施用，随后立即施用Con A。
[图15] 图15是显示人源化抗LAG-3抗体hLA212_H4/L2具有在体内抑制自身免疫疾病模型的活性的图。显示了人LAG-3/人FcγRIIIA双转基因小鼠中随时间的EAE临床评分，其中在所述人LAG-3/人FcγRIIIA双转基因小鼠中诱导EAE并且施用人源化抗LAG-3抗体hLA212_H4/L2或对照抗体。在致敏当天以及此后7天以30 mg/kg的剂量静脉内施用每种抗体。
[图16] 图16是编码rLA204抗体的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(SEQID NO: 1)。
[图17] 图17是rLA204抗体的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO: 2)。
[图18] 图18是编码rLA204抗体的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(SEQID NO: 3)。
[图19] 图19是rLA204抗体的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO: 4)。
[图20] 图20是编码rLA212抗体的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(SEQID NO: 5)。
[图21] 图21是rLA212抗体的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO: 6)。
[图22] 图22是编码rLA212抗体的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(SEQID NO: 7)。
[图23] 图23是rLA212抗体的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO: 8)。
[图24] 图24是编码rLA225抗体的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(SEQID NO: 9)。
[图25] 图25是rLA225抗体的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO: 10)。
[图26] 图26是编码rLA225抗体的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(SEQID NO: 11)。
[图27] 图27是rLA225抗体的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO: 12)。
[图28] 图28是编码rLA869抗体的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(SEQID NO: 13)。
[图29] 图29是rLA869抗体的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO: 14)。
[图30] 图30是编码rLA869抗体的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(SEQID NO: 15)。
[图31] 图31是rLA869抗体的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO: 16)。
[图32] 图32是编码rLA1264抗体的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(SEQID NO: 17)。
[图33] 图33是rLA1264抗体的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO: 18)。
[图34] 图34是编码rLA1264抗体的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(SEQID NO: 19)。
[图35] 图35是rLA1264抗体的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO: 20)。
[图36] 图36是编码人轻链分泌信号和人κ链恒定区的氨基酸序列的核苷酸序列(SEQ ID NO: 21)。
[图37] 图37是编码人重链分泌信号和人IgG1恒定区的氨基酸序列的核苷酸序列(SEQ ID NO: 22)。
[图38] 图38是编码cLA212抗体的重链的氨基酸序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:23)。
[图39] 图39是cLA212抗体的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 24)。
[图40] 图40是编码cLA212抗体的轻链的氨基酸序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:25)。
[图41] 图41是cLA212抗体的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 26)。
[图42] 图42是编码hLA212抗体的重链H2的氨基酸序列的核苷酸序列(SEQ IDNO: 27)。
[图43] 图43是hLA212抗体的重链H2的氨基酸序列(SEQ ID NO: 28)。
[图44] 图44是编码hLA212抗体的重链H3的氨基酸序列的核苷酸序列(SEQ IDNO: 29)。
[图45] 图45是hLA212抗体的重链H3的氨基酸序列(SEQ ID NO: 30)。
[图46] 图46是编码hLA212抗体的轻链L1的氨基酸序列的核苷酸序列(SEQ IDNO: 31)。
[图47] 图47是hLA212抗体的轻链L1的氨基酸序列(SEQ ID NO: 32)。
[图48] 图48是编码hLA212抗体的轻链L2的氨基酸序列的核苷酸序列(SEQ IDNO: 33)。
[图49] 图49是hLA212抗体的轻链L2的氨基酸序列(SEQ ID NO: 34)。
[图50] 图50是编码hLA212抗体的轻链L3的氨基酸序列的核苷酸序列(SEQ IDNO: 35)。
[图51] 图51是hLA212抗体的轻链L3的氨基酸序列(SEQ ID NO: 36)。
[图52] 图52是编码hLA212抗体的轻链L4的氨基酸序列的核苷酸序列(SEQ IDNO: 37)。
[图53] 图53是hLA212抗体的轻链L4的氨基酸序列(SEQ ID NO: 38)。
[图54] 图54是编码hLA212抗体的轻链L5的氨基酸序列的核苷酸序列(SEQ IDNO: 39)。
[图55] 图55是hLA212抗体的轻链L5的氨基酸序列(SEQ ID NO: 40)。
[图56] 图56是rLA204抗体的重链CDRH1的氨基酸序列(SEQ ID NO: 41)。
[图57] 图57是rLA204抗体的重链CDRH2的氨基酸序列(SEQ ID NO: 42)。
[图58] 图58是rLA204抗体的重链CDRH3的氨基酸序列(SEQ ID NO: 43)。
[图59] 图59是rLA204抗体的轻链CDRL1的氨基酸序列(SEQ ID NO: 44)。
[图60] 图60是rLA204抗体的轻链CDRL2的氨基酸序列(SEQ ID NO: 45)。
[图61] 图61是rLA204抗体的轻链CDRL3的氨基酸序列(SEQ ID NO: 46)。
[图62] 图62是rLA212抗体的重链CDRH1的氨基酸序列(SEQ ID NO: 47)。
[图63] 图63是rLA212抗体的重链CDRH2的氨基酸序列(SEQ ID NO: 48)。
[图64] 图64是rLA212抗体的重链CDRH3的氨基酸序列(SEQ ID NO: 49)。
[图65] 图65是rLA212抗体的轻链CDRL1的氨基酸序列(SEQ ID NO: 50)。
[图66] 图66是rLA212抗体的轻链CDRL2的氨基酸序列(SEQ ID NO: 51)。
[图67] 图67是rLA212抗体的轻链CDRL3的氨基酸序列(SEQ ID NO: 52)。
[图68] 图68是rLA225抗体的重链CDRH1的氨基酸序列(SEQ ID NO: 53)。
[图69] 图69是rLA225抗体的重链CDRH2的氨基酸序列(SEQ ID NO: 54)。
[图70] 图70是rLA225抗体的重链CDRH3的氨基酸序列(SEQ ID NO: 55)。
[图71] 图71是rLA225抗体的轻链CDRL1的氨基酸序列(SEQ ID NO: 56)。
[图72] 图72是rLA225抗体的轻链CDRL2的氨基酸序列(SEQ ID NO: 57)。
[图73] 图73是rLA225抗体的轻链CDRL3的氨基酸序列(SEQ ID NO: 58)。
[图74] 图74是rLA869抗体的重链CDRH1的氨基酸序列(SEQ ID NO: 59)。
[图75] 图75是rLA869抗体的重链CDRH2的氨基酸序列(SEQ ID NO: 60)。
[图76] 图76是rLA869抗体的重链CDRH3的氨基酸序列(SEQ ID NO: 61)。
[图77] 图77是rLA869抗体的轻链CDRL1的氨基酸序列(SEQ ID NO: 62)。
[图78] 图78是rLA869抗体的轻链CDRL2的氨基酸序列(SEQ ID NO: 63)。
[图79] 图79是rLA869抗体的轻链CDRL3的氨基酸序列(SEQ ID NO: 64)。
[图80] 图80是rLA1264抗体的重链CDRH1的氨基酸序列(SEQ ID NO: 65)。
[图81] 图81是rLA1264抗体的重链CDRH2的氨基酸序列(SEQ ID NO: 66)。
[图82] 图82是rLA1264抗体的重链CDRH3的氨基酸序列(SEQ ID NO: 67)。
[图83] 图83是rLA1264抗体的轻链CDRL1的氨基酸序列(SEQ ID NO: 68)。
[图84] 图84是rLA1264抗体的轻链CDRL2的氨基酸序列(SEQ ID NO: 69)。
[图85] 图85是rLA1264抗体的轻链CDRL3的氨基酸序列(SEQ ID NO: 70)。
[图86] 图86是引物RG2AR3 (SEQ ID NO: 71)。
[图87] 图87是引物RKR5 (SEQ ID NO: 72)。
[图88] 图88是引物3.3-F1 (SEQ ID NO: 73)。
[图89] 图89是引物3.3-R1 (SEQ ID NO: 74)。
[图90] 图90是引物212H-F (SEQ ID NO: 75)。
[图91] 图91是引物212H-R (SEQ ID NO: 76)。
[图92] 图92是引物212L-F (SEQ ID NO: 77)。
[图93] 图93是引物212L-R (SEQ ID NO: 78)。
[图94] 图94是寡核苷酸LAG-3-H1 (SEQ ID NO: 79)。
[图95] 图95是寡核苷酸LAG-3-H2 (SEQ ID NO: 80)。
[图96] 图96是寡核苷酸LAG-3-H3 (SEQ ID NO: 81)。
[图97] 图97是寡核苷酸LAG-3-H4 (SEQ ID NO: 82)。
[图98] 图98是寡核苷酸LAG-3-H5 (SEQ ID NO: 83)。
[图99] 图99是寡核苷酸LAG-3-H6 (SEQ ID NO: 84)。
[图100] 图100是编码人LAG-3的氨基酸序列的核苷酸序列(SEQ ID NO: 85)。
[图101] 图101是人LAG-3的氨基酸序列(SEQ ID NO: 86)。
[实施方案描述]
1. 定义
在本发明中，术语“基因”是指包含编码蛋白质的氨基酸的核苷酸序列或其互补链的核酸分子。“基因”意在包括，例如，多核苷酸、寡核苷酸、DNA、mRNA、cDNA和cRNA，其包含编码蛋白质的氨基酸的核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列。这种基因是单链、双链或三链或更多链的核苷酸。“基因”还意在包括DNA和RNA链的结合，核糖核苷酸(RNA)和脱氧核糖核苷酸(DNA)在一条核苷酸链上的混合物，以及包含这种核苷酸链的双链或三链或更多链的核苷酸。本发明的“LAG-3基因”的实例可包括DNA、mRNA、cDNA和cRNA，其包含编码LAG-3蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列。
在本发明中，术语“核苷酸”具有与“核酸”和“核酸分子”相同的含义，并且还意在包括例如DNA、RNA、探针、寡核苷酸、多核苷酸和引物。这种核苷酸是单链，双链或三链或更多链的核苷酸。“核苷酸”还意在包括DNA和RNA链的结合，核糖核苷酸(RNA)和脱氧核糖核苷酸(DNA)在一条核苷酸链上的混合物，以及包含这种核苷酸链的两条链或三条或更多条链的结合。
在本发明中，术语“多肽”，“肽”和“蛋白质”具有相同的含义。
在本发明中，术语“抗原”具有与“免疫原”相同的含义。
在本发明中，术语“细胞”还包括，例如，衍生自个体动物、传代培养细胞、原代培养细胞、细胞系、重组细胞和微生物细胞的各种细胞。
在本发明中，结合LAG-3的抗体和识别LAG-3的抗体中的每一种可以被称为“抗LAG-3抗体”或缩写为“LAG-3抗体”。抗LAG-3抗体包括单克隆抗体、嵌合化抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体等。
本发明中的术语“抗体的结合片段”是指发挥原始抗体所发挥的至少一部分功能的抗体片段。“抗体的结合片段”的实例可包括但不限于Fab、F(ab')2、scFv、Fab'和单链免疫球蛋白。抗体的这种结合片段可以通过用酶如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理全长抗体蛋白分子来获得，或者可以是使用重组基因在合适的宿主细胞中产生的重组蛋白。
在本发明中，抗体结合的“位点”，即抗体识别的“位点”，是指抗体结合或识别的抗原上的部分肽或部分构象。在本发明中，这种位点也称为表位或抗体结合位点。由本发明的抗LAG-3抗体结合或识别的LAG-3蛋白上的位点的实例可包括LAG-3蛋白上的部分肽或部分构象。
已知抗体分子的重链和轻链各自具有三个互补决定区域(CDR)。互补决定区域也称为高可变结构域。这些区域位于抗体重链和轻链的可变区中。这些位点具有特别高度可变的一级结构且通常分离地位于在重链和轻链多肽链各自的一级结构上的三个位置。在本发明中，抗体的互补决定区域对于重链的互补决定区域而言，从重链氨基酸序列的氨基末端起称为CDRH1、CDRH2和CDRH3，且对于轻链的互补决定区域而言，从轻链氨基酸序列的氨基末端起称为CDRL1、CDRL2和CDRL3。这些位点在三维结构上彼此靠近且决定针对待结合抗原的特异性。重链可变区氨基酸序列中除CDRH1至CDRH3之外的部分称为框架(框架区：在下文中称作FR)，以及从氨基末端至CDRH1，但不包括CDRH1，刚刚从CDRH1后至CDRH2，但不包括CDRH2，刚刚从CDRH2后至CDRH3，但不包括CDRH3，以及从刚刚CDRH3到羧基末端的部分分别称为FRH1至FRH4。同样，轻链可变区氨基酸序列中除CDRL1至CDRL3之外的部分也是FR，以及从氨基末端至CDRL1，但不包括CDRL1，刚刚从CDRL1后至CDRL2，但不包括CDRL2，刚刚从CDRL2后至CDRL3，但不包括CDRL3，以及从CDRL3到羧基末端的部分分别称为FRL1至FRL4。也即，在重链和轻链可变区(的氨基酸序列)中，FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4和FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4以此顺序从氨基末端侧向羧基末端连续排列。
在本发明中，术语“抗体突变体”是指具有通过氨基酸的取代、缺失、添加和/或***(下文统称为氨基酸的“突变”)而从原始抗体的氨基酸序列衍生出的氨基酸序列，并且与本发明的LAG-3蛋白质结合的多肽。抗体突变体中突变氨基酸的数量为1、1至2、1至3、1至4、1至5、1至6、1至7、1至8、1至9、1至10、1至12、1至15、1至20、1至25、1至30、1至40或1至50个。抗体突变体也包括在本发明的“抗体”中。
在本发明中，“1至数个”中的术语“数个”是指3至10个。
由本发明的抗体发挥的活性或性质的实例可包括生物活性或物理化学性质，并且可具体包括各种生物活性，对抗原或表位的结合活性，生产或储存期间的稳定性，和热稳定性。
在本发明中，短语“在严格条件下杂交”是指在以下条件下的杂交，包括：在65℃在包含5×SSC的溶液中杂交，随后在65℃在包含2×SSC-0.1％SDS的水溶液中20分钟，在65℃在包含0.5×SSC-0.1％SDS的水溶液中20分钟，在65℃在包含0.2×SSC-0.1％SDS的水溶液中20分钟的洗涤，或在与其等同的条件下杂交。SSC是指150mM NaCl-15mM柠檬酸钠的水溶液，且n×SSC表示具有n倍浓度的SSC。
在本发明中，术语“细胞毒性”是指导致细胞的一些病理变化，并且不仅意在直接创伤，而且意在对细胞的每类结构或功能损伤，包括DNA切割、碱基二聚体的形成、染色体断裂、有丝***器的损伤，以及各种酶的活性降低。
在本发明中，术语“细胞毒性活性”是指引起上述细胞毒性的活性。
在本发明中，术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性活性”，也称为“抗体依赖性细胞的细胞毒性活性”或“ADCC活性”，是指NK细胞等经由抗体破坏靶细胞的作用或活性。
在本发明中，术语“宿主抗移植物反应”指在器官移植后观察到的受体的超免疫状态，和这种状态对移植器官的损伤。
在本发明中，术语“移植物抗宿主病”是指在移植造血细胞后，由移植细胞对受体的免疫攻击引起的症状。
2.抗原蛋白
(2-1) 性质
LAG-3蛋白(下文中可简称为“LAG-3”)是跨膜受体蛋白，并且由含有配体结合位点的细胞外区、I型单次跨膜区和细胞内区构成，其中所述细胞外区由免疫球蛋白样结构域(IgD1至4)构成。LAG-3与CD223具有相同的含义。
在本发明中，LAG-3源自脊椎动物，优选源自哺乳动物，更优选源自人。
LAG蛋白具有以下性质：
(i) 与抗原呈递细胞上的II型主要组织相容性复合体(MHC)分子结合；
(ii) 与II型MHC分子结合并向表达此类分子的T细胞传递抑制信号，以负调节T细胞功能；
(iii) 本发明的LAG-3蛋白质，其含有根据下述(a)-(d)中任一项的氨基酸序列(以下称为“LAG-3氨基酸序列”)，由包含LAG-3氨基酸序列的氨基酸序列组成，或由LAG-3氨基酸序列组成：
(a) SEQ ID NO: 86或图101所示的氨基酸序列，
(b) 显示与SEQ ID NO: 86 (图101)所示的氨基酸序列的80％或更高，82％或更高，84％或更高，86％或更高，88％或更高，90％或更高，92％或更高，94％或更高，96％或更高，98％或更高，或99％或更高的序列同一性，并且包含在具有II型MHC分子结合活性的多肽中的氨基酸序列；
(c) 通过取代、缺失、添加或***1至50、1至45、1至40、1至35、1至30、1至25、1至20、1至15、1至10、1至8、1至6、1至5、1至4、1至3、1或2或1个氨基酸而从SEQ ID NO: 86 (图101)所示的氨基酸序列衍生出的，并且包含在具有II型MHC分子结合活性的多肽中的氨基酸序列；和
(d) 由多核苷酸(核酸分子)的核苷酸序列编码，并且包含在具有II型MHC分子结合活性的多肽中的氨基酸序列；其中所述多核苷酸(核酸分子)的核苷酸序列在严格条件下杂交至具有下述核苷酸序列的多核苷酸(核酸分子)，所述核苷酸序列与编码SEQ ID NO: 86(图101)所示的氨基酸序列的核苷酸序列互补。
除了II型MHC分子结合活性之外，根据(b)至(d)中任一项的多肽可以具有LAG-3的其他活性。
(iv) 本发明的LAG-3蛋白质可以得自于脊椎动物，优选哺乳动物，更优选啮齿动物，如小鼠或大鼠和人，甚至更优选人，大鼠或小鼠的表达LAG-3的细胞，组织或癌组织，来自所述组织的细胞，细胞的培养物等。
在活化的T细胞和体内炎症部位等中观察到LAG-3的表达，并且在正常组织的细胞中几乎没有表达或可见非常低水平的表达。
本发明的LAG-3蛋白质可以是天然(非重组)或重组蛋白质。LAG-3蛋白质还意在包括与另一种肽或蛋白质(例如载体或标签)的融合产物。LAG-3蛋白质还意在包括具有化学修饰的形式，包括添加聚合物(如PEG)和/或具有生物修饰，包括糖链修饰。此外，本发明的LAG-3蛋白质意在包括LAG-3蛋白质片段。在LAG-3蛋白片段中，具有上述(i)和/或(ii)中描述的性质的那些被称为LAG-3蛋白结合片段。
(2-2)抗原基因
本发明中的LAG-3基因包含根据以下(a)至(c)中任一项的核苷酸序列(以下称为“LAG-3基因序列”)，由包含LAG-3基因序列的核苷酸序列组成，或由LAG-3基因序列组成：
(a) 编码SEQ ID NO: 86 (图101)所示的氨基酸序列的核苷酸序列；
(b) 多核苷酸(核酸分子)的核苷酸序列，所述多核苷酸(核酸分子)在严格条件下杂交至由下述核苷酸序列组成的多核苷酸(核酸分子)并且编码具有II型MHC分子结合活性的多肽的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码SEQ ID NO: 86 (图101)所示的氨基酸序列的核苷酸序列互补；和
(c) 编码通过取代、缺失、添加或***1至50、1至45、1至40、1至35、1至30、1至25、1至20、1至15、1至10、1至8、1至6、1至5、1至4、1至3、1或2或1个残基而从SEQ ID NO: 86 (图101)所示的氨基酸序列衍生出的氨基酸序列，并且编码具有II型MHC分子结合活性的多肽的氨基酸序列的多核苷酸序列。
除了II型MHC分子结合活性之外，具有由根据(b)或(c)的核苷酸序列编码的氨基酸序列的多肽还可具有LAG-3的其他活性。
可以用LAG-3基因转录物或LAG-3蛋白作为指标测定LAG-3基因的表达和表达水平。分别地，前一指标可通过RT-PCR，Northern印迹杂交等确定，而后一指标可通过免疫测定法测定，例如流式细胞术，Western印迹，免疫组织化学染色等。
(2-3) 抗原性蛋白的制备
本发明的LAG-3蛋白质可以通过从动物组织(包括体液)，来自组织的细胞或细胞培养物中纯化或分离、基因重组、体外翻译、化学合成等来制备。
(2-3-1) 非重组LAG-3的纯化或分离
可以从表达LAG-3的细胞中纯化或分离非重组LAG-3蛋白。表达LAG-3的细胞的实例可包括(2-1)的(iv)中描述的那些，但非重组LAG-3蛋白的来源不限于此。
从这些组织，细胞，细胞培养物等中纯化或分离可以通过本领域技术人员熟知的方法的组合进行，例如分级分离和色谱法。
(2-3-2) 重组LAG-3蛋白质的制备
本发明的LAG-3蛋白质也可以以重组形式制备。具体地，用编码LAG-3蛋白质或LAG-3蛋白质片段的氨基酸序列的基因转染宿主细胞，并且可以从细胞培养物中回收LAG-3蛋白质。此外，LAG-3蛋白不仅可以表达为具有与天然蛋白相同的氨基末端(N末端)和/或羧基末端(C末端)的分子，还可以表达为具有分泌信号、细胞内定位信号、亲和纯化标签或伴侣肽的融合蛋白。LAG-3蛋白可以通过适当组合的方法从这些重组细胞培养物中纯化或分离，例如“(2-3-1) 非重组LAG-3的纯化或分离”中所述的分级和色谱法。此外，可以使用凝胶过滤或浓缩器如Centriprep对含有LAG-3蛋白质的溶液进行缓冲液交换和/或浓缩。
(2-3-3) 体外翻译
本发明的LAG-3蛋白质也可以通过体外翻译制备。这种翻译方法没有特别限制，只要该方法使用包括转录和翻译所必需的酶、底物和能量物质的无细胞翻译***。其实例可包括使用由Roche Diagnostics K.K.制造的快速翻译***(RTS)的方法。
(2-3-4) 化学合成
本发明的LAG-3蛋白质也可以通过化学合成制备。化学合成方法的实例可包括固相肽合成方法，例如Fmoc和Boc合成方法。
3. 抗体
(3-1) 抗体的分类
本发明的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。本发明的单克隆抗体的实例可包括非人动物来源的抗体(非人动物抗体)，人源抗体(人抗体)，嵌合化抗体(嵌合抗体和人源化抗体)。
非人动物抗体的实例可包括源自脊椎动物如哺乳动物和鸟类的抗体。哺乳动物来源的抗体的实例可包括啮齿动物来源的抗体，例如小鼠抗体和大鼠抗体。鸟类来源抗体的实例可包括鸡抗体。抗人LAG-3大鼠单克隆抗体的实例可包括rLA204、rLA212、rLA225、rLA869和rLA1264。
嵌合化抗体的实例可包括但不限于包含与人抗体(人免疫球蛋白)恒定区结合的非人动物抗体来源的可变区的抗体。包含与人抗体恒定区结合的非人动物抗体来源的可变区的嵌合化抗体的实例可包括具有源自大鼠单克隆抗体rLA204、rLA212、rLA225、rLA869或rLA1264的重链和轻链可变区，并具有人重链和轻链恒定区(分别称为“cLA204”、“cLA212”、“cLA225”、“cLA869”或“cLA1264”)的那些。
人源化抗体的实例可包括但不限于用非人动物抗体的可变区中CDR移植的人抗体(人免疫球蛋白可变区)，用CDR以及非人动物抗体FR的部分序列移植的人抗体，和在任何这些人源化抗体中，将人抗体氨基酸或其他氨基酸取代为一种或两种或多种非人动物抗体来源的氨基酸的抗体。非人动物抗体可变区中的CDR的实例可包括源自上述rLA204、rLA212、rLA225、rLA869或rLA1264的重链可变区中的CDRH1至CDRH3和轻链可变区中的CDRL1至CDRL3。包含源自rLA212的重链可变区中的CDRH1至CDRH3和轻链可变区中的CDRL1至CDRL3的人源化抗体的实例可包括hLA212_H2/L1至H2/L5，hLA212_H3/L1至H3/L5和hLA212_H4/L2。
人抗体没有特别限制，只要抗体识别本发明的抗原，但其实例可包括与具有本发明抗体的CDR的抗体结合相同位点的人抗体，与非人动物抗体、嵌合抗体、人源化抗体等中的任一种结合LAG-3上的相同位点的人抗体，以及与任何一种此类抗体竞争结合LAG-3的抗体。
根据本发明的抗体可以包含源自多种不同抗体的部分，只要抗体具有LAG-3结合活性。这种抗体的实例可包括在多种不同抗体之间交换的重链和/或轻链的抗体，包含在其中交换的全长重链和/或轻链的抗体，包含在其中交换的可变区或恒定区的抗体，和包含在其中交换的全部或一些CDR的抗体。嵌合抗体的重链和轻链可变区可以源自本发明的不同抗体。人源化抗体的重链和轻链可变区中的CDRH1至CDRH3和CDRL1至CDRL3可以源自两种或更多种本发明的不同抗体。人抗体的重链和轻链可变区中的CDRH1至CDRH3和CDRL1至CDRL3可以是由两种或更多种本发明的不同抗体携带的CDR的组合。所述抗体或其结合片段由源自多种不同抗体的此类部分构成，所述多种不同抗体各自具有以下：(3-2)，(3-3)和(3-8)中描述的以下性质，功能，活性等，优选除上述之外还具有(3-4)至(3-7)中的一种或多种，更优选除上述之外还具有(3-4)和/或(3-5)，进一步优选除上述之外还具有(3-4)和(3-5)，进一步优选除上述之外还具有(3-4)和(3-5)，和(3-6)和/或(3-7)，最优选(3-2)至(3-8)的全部。
本发明的抗体的同种型的实例可以包括但不限于IgG (例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgM、IgA (例如IgA1和IgA2)、IgD和IgE，并且可优选地包括IgG和IgM。单克隆抗体的同种型和亚类可以通过例如Ouchterlony测试，酶联免疫吸附测定(以下称为“ELISA”)或放射免疫测定(以下称为“RIA”)来确定。还可以使用商购可得的试剂盒用于鉴定(例如，MouseTyper Kit; Bio-Rad Laboratories，Inc.和RAT MONOCLONAL ANTIBODY ISOTYPING TESTKIT: AbD Serotec)。
(3-2) 抗体的结合特异性
本发明的抗体识别LAG-3蛋白。换言之，本发明的抗体结合LAG-3蛋白。这种抗体也表达为“抗LAG-3抗体”。优选地，本发明的抗体特异性识别LAG-3蛋白。换言之，本发明的抗体优选特异性结合LAG-3蛋白(上述性质将统称为抗体的“LAG-3结合活性”)。更优选地，本发明的抗体特异性结合LAG-3蛋白的细胞外区域，更优选地，抗体特异性结合LAG-3蛋白质的免疫球蛋白样结构域(下文将称为“Ig样结构域”)，仍更优选地，抗体特异性结合Ig样结构域3。
在本发明中，“特异性识别”，即“特异性结合”，是指不是非特异性吸附的结合。用于确定结合是否特异的标准的实例可包括解离常数(下文称为“KD”)。优选地，本发明的抗体对LAG-3蛋白质具有1×10-5或更低，5×10-6或更低，2×10-6或更低，或1×10-6或更低，更优选5×10-7或更低，2×10-7或更低，或1×10-7或更低，甚至更优选5×10-8或更低，2×10-8或更低，或1×10-8或更低，进一步更优选5×10-9或更低，2×10-9或更低，或1×10-9或更低，最优选5×10-10或更低，2×10-10或更低，或1×10-10或更低的KD值。
在本发明中，抗体与抗原的结合可以通过ELISA，RIA，表面等离振子共振(下文称为“SPR”)分析等来测定或确定。SPR分析中使用的装置的实例可包括BIAcore (TM) (由GEHealthcare Bio-Sciences Corp.制造)、ProteOn (TM) (由Bio-Rad Laboratories，Inc.制造)、SPR-Navi (TM) (由BioNavis Oy Ltd.制造)、Spreeta (TM) (由TexasInstruments Inc.制造)、SPRi-Plex II (TM) (由Horiba，Ltd.制造)和Autolab SPR (TM)(由Metrohm Japan Ltd.制造)。可以通过流式细胞术、Cell-ELISA等测定抗体与细胞表面上表达的抗原的结合。
(3-3) 抗体的细胞毒性活性
根据一个方面，本发明的抗LAG-3抗体具有抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)活性，优选在体外具有ADCC活性，更优选具有针对表达LAG-3的T细胞的ADCC活性。除ADCC活性之外，本发明的抗LAG-3抗体可具有补体依赖性细胞毒性(CDC)活性和/或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)活性。
可以通过已知方法测定ADCC活性。表达目的抗原的细胞(靶细胞)和能够杀死靶细胞的效应细胞被用于ADCC活性测定。效应细胞经由Fcγ受体识别与靶细胞结合的抗体的Fc区。效应细胞通过从Fcγ受体转导的信号杀死靶细胞。在测定具有人源Fc区的抗体的ADCC活性的情况下，使用人NK细胞作为效应细胞。可以通过本领域已知的方法，从人外周血单核细胞(PBMC)制备人NK细胞。或者，PBMC可以直接用作效应细胞。
(3-4) 体内LAG-3阳性细胞数减少抗体活性
根据一个方面，本发明的抗体减少LAG-3阳性细胞的数量，优选减少体内LAG-3阳性细胞的数量，和更优选以低岩藻糖形式减少体内LAG-3阳性细胞的数量。
LAG-3阳性细胞包括被迫表达LAG-3的细胞和具有通过刺激诱导的LAG-3表达的细胞，但不限于此，只要它们是表达LAG-3的细胞。
可以通过常规方法，如流式细胞术，计数LAG-3阳性细胞的数量。
在本发明中，“低岩藻糖形式”是指如下的状态，其中(i) 在N-糖苷连接的复合型糖链中与抗体或其结合片段结合的岩藻糖(岩藻糖残基)的量小于在N-糖苷连接的复合型糖链中与原始(亲本)抗体或其结合片段结合的岩藻糖(岩藻糖残基)的量，(ii) 在N-糖苷连接的复合型糖链中与抗体或其结合片段结合的岩藻糖(岩藻糖残基)的量小于在N-糖苷连接的复合型糖链中与抗体或其结合片段天然结合的岩藻糖(岩藻糖残基)的量，或(iii)在N-糖苷连接的复合型糖链中与抗体或其结合片段结合的岩藻糖(岩藻糖残基)或包含岩藻糖(岩藻糖残基)的糖链的量等于或低于在物理或化学分析(优选质谱法)中的检测限。在N-糖苷连接的复合型糖链中与修饰抗体或其结合片段结合的岩藻糖(岩藻糖残基)的量小于修饰前的所述量的情况下，修饰的抗体或其结合片段被理解为“低岩藻糖形式”。作为是本发明的人源化抗体，下文描述的修饰形式hLA212_H4/L2是低岩藻糖形式的抗体的一个方面。低岩藻糖形式的抗体或结合片段相比不是低岩藻糖形式的抗体对于Fcγ受体IIIA具有更高的亲和力和更强的ADCC活性。
(3-5) 抗体的体内实验性自身免疫性脑脊髓炎抑制活性
根据一个方面，本发明的抗体具有脑脊髓炎抑制活性，优选具有体内实验性自身免疫性脑脊髓炎抑制活性，更优选以低岩藻糖形式具有体内实验性自身免疫性脑脊髓炎抑制活性。
在本发明中，实验性自身免疫性脑脊髓炎是指通过将源自MOG (髓鞘少突胶质细胞糖蛋白)的肽(其为中枢神经髓鞘组分蛋白质)与弗氏佐剂一起注射给小鼠而诱导的脑脊髓炎。
可以通过每日观察反映麻痹程度的临床评分，来测定实验性自身免疫性脑脊髓炎抑制活性。例如，可以设置临床评分如下：
分数0：无症状；
分数1：跛行尾；
分数2：步态异常或翻正反射丧失；
分数3：后肢麻痹；
分数4：前肢部分麻痹；和
分数5：死亡或安乐死。
(3-6) 抗体的人活化T细胞结合活性
根据一个方面，本发明的抗体结合人活化的T细胞，优选结合LAG-3阳性人活化的T细胞。可以例如通过流式细胞术测定或检测抗体与人活化T细胞的结合。
(3-7) 抗体的存在允许人LAG-3与人II型MHC分子结合
根据本发明的一个方面，人LAG-3可以在抗体存在下与人II型MHC分子结合，或者本发明的抗体不抑制人LAG-3与人II型MHC分子的结合。
LAG-3分子的细胞外区域和IgG的Fc部分的融合蛋白与内源性高表达II型MHC分子的Raji细胞的结合可以通过流式细胞术来评估，例如测定或检测。
(3-8) 抗体的存在允许人LAG-3发挥人T细胞抑制功能
根据另一方面，在本发明的抗体的存在下，人LAG-3发挥人T细胞抑制功能。
本发明中的术语“T细胞抑制功能”是指减少或抑制刺激T细胞后产生的细胞因子的量。
可以例如通过定量在刺激人T细胞以诱导LAG-3表达时产生的细胞因子来测定人LAG-3的T细胞抑制功能。
在本发明中，对人T细胞的刺激没有特别限制，但其实例可包括用特异性抗原、抗CD3抗体、抗CD3抗体和抗CD28抗体的组合、超抗原、来自其他供体的细胞刺激，优选用葡萄球菌肠毒素B，来自具有不同MHC的其他供体的细胞等刺激。
细胞因子的实例可包括由活化的T细胞产生的细胞因子，优选各种白细胞介素和干扰素，更优选白细胞介素2 (IL-2)和干扰素γ。
(3-9) 单克隆抗体
本发明提供抗LAG-3单克隆抗体及其结合片段。单克隆抗体包括源自非人动物的单克隆抗体，例如大鼠抗体、小鼠抗体、兔抗体、鸡抗体和鱼抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、其结合片段及其修饰形式。其中，大鼠单克隆抗体的实例可包括rLA204、rLA212、rLA225、rLA869和rLA1264。
rLA204是根据实施例1中描述的方法获得的抗人LAG-3大鼠单克隆抗体。rLA204的重链可变区的核苷酸序列描述于SEQ ID NO: 1 (图16)，并且其氨基酸序列描述于SEQ IDNO: 2 (图17)。rLA204的轻链可变区的核苷酸序列描述于SEQ ID NO: 3 (图18)，并且其氨基酸序列描述于SEQ ID NO: 4 (图19)。分别地，rLA204的CDRH1的氨基酸序列描述于SEQID NO: 41 (图56)，其CDRH2的氨基酸序列描述于SEQ ID NO: 42 (图57)，其CDRH3的氨基酸序列描述于SEQ ID NO: 43 (图58)，其CDRL1的氨基酸序列描述于SEQ ID NO: 44 (图59)，其CDRL2的氨基酸序列描述于SEQ ID NO: 45 (图60)，且其CDRL3氨基酸序列描述于SEQ ID NO: 46 (图61)。
rLA212是根据实施例1中描述的方法获得的抗人LAG-3大鼠单克隆抗体。rLA212的重链可变区的核苷酸序列描述于SEQ ID NO: 5 (图20)，并且其氨基酸序列描述于SEQ IDNO: 6 (图21)。rLA212的轻链可变区的核苷酸序列描述于SEQ ID NO: 7 (图22)，并且其氨基酸序列描述于SEQ ID NO: 8 (图23)。分别地，rLA212的CDRH1的氨基酸序列描述于SEQID NO: 47 (图62)，其CDRH2的氨基酸序列描述于SEQ ID NO: 48 (图63)，其CDRH3的氨基酸序列描述于SEQ ID NO: 49 (图64)，其CDRL1的氨基酸序列描述于SEQ ID NO: 50 (图65)，其CDRL2的氨基酸序列描述于SEQ ID NO: 51 (图66)，且其CDRL3氨基酸序列描述于SEQ ID NO: 52 (图67)。
rLA225是根据实施例1中描述的方法获得的抗人LAG-3大鼠单克隆抗体。rLA225的重链可变区的核苷酸序列描述于SEQ ID NO: 9 (图24)，并且其氨基酸序列描述于SEQ IDNO: 10 (图25)。rLA225的轻链可变区的核苷酸序列描述于SEQ ID NO: 11 (图26)，并且其氨基酸序列描述于SEQ ID NO: 12 (图27)。分别地，rLA225的CDRH1的氨基酸序列描述于SEQ ID NO: 53 (图68)，其CDRH2的氨基酸序列描述于SEQ ID NO: 54 (图69)，其CDRH3的氨基酸序列描述于SEQ ID NO: 55 (图70)，其CDRL1的氨基酸序列描述于SEQ ID NO: 56(图71)，其CDRL2的氨基酸序列描述于SEQ ID NO: 57 (图72)，且其CDRL3氨基酸序列描述于SEQ ID NO: 58 (图73)。
rLA869是根据实施例1中描述的方法获得的抗人LAG-3大鼠单克隆抗体。rLA869的重链可变区的核苷酸序列描述于SEQ ID NO: 13 (图28)，并且其氨基酸序列描述于SEQ IDNO: 14 (图29)。rLA869的轻链可变区的核苷酸序列描述于SEQ ID NO: 15 (图30)，并且其氨基酸序列描述于SEQ ID NO: 16 (图31)。分别地，rLA869的CDRH1的氨基酸序列描述于SEQ ID NO: 59 (图74)，其CDRH2的氨基酸序列描述于SEQ ID NO: 60 (图75)，其CDRH3的氨基酸序列描述于SEQ ID NO: 61 (图76)，其CDRL1的氨基酸序列描述于SEQ ID NO: 62(图77)，其CDRL2的氨基酸序列描述于SEQ ID NO: 63 (图78)，且其CDRL3氨基酸序列描述于SEQ ID NO: 64 (图79)。
rLA1264是根据实施例1中描述的方法获得的抗人LAG-3大鼠单克隆抗体。rLA1264的重链可变区的核苷酸序列描述于SEQ ID NO: 17 (图32)，并且其氨基酸序列描述于SEQID NO: 18 (图33)。rLA1264的轻链可变区的核苷酸序列描述于SEQ ID NO: 19 (图34)，并且其氨基酸序列描述于SEQ ID NO: 20 (图35)。分别地，rLA1264的CDRH1的氨基酸序列描述于SEQ ID NO: 65 (图80)，其CDRH2的氨基酸序列描述于SEQ ID NO: 66 (图81)，其CDRH3的氨基酸序列描述于SEQ ID NO: 67 (图82)，其CDRL1的氨基酸序列描述于SEQ IDNO: 68 (图83)，其CDRL2的氨基酸序列描述于SEQ ID NO: 69 (图84)，且其CDRL3氨基酸序列描述于SEQ ID NO: 70 (图85)。
本发明的抗体突变体优选表现出例如对蛋白质降解或氧化的敏感性降低，改善的生物活性，改善的与抗原结合的能力，或赋予其的物理化学或功能性质。这种抗体突变体的实例可包括通过1或2或更多个，优选1至数个氨基酸的保守氨基酸取代，而从原始抗体的氨基酸序列衍生出的氨基酸序列的抗体。保守氨基酸取代是在具有相关氨基酸侧链的氨基酸组中发生的取代。
优选的氨基酸组如下：酸性组，包括天冬氨酸和谷氨酸；碱性组，包括赖氨酸，精氨酸和组氨酸；非极性组，包括丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸和色氨酸；和不带电的极性家族，包括甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸。其他优选的氨基酸组如下：脂族羟基组，包括丝氨酸和苏氨酸；含有酰胺的组，包括天冬酰胺和谷氨酰胺；脂肪族的组，包括丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸；和芳香族的组，包括苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸。抗体突变体中的这种氨基酸取代优选在不降低原始(亲本)抗体的抗原结合活性的情况下进行。
当其在C末端侧连接的氨基酸具有小侧链时，蛋白质中含有的天冬氨酸易于通过异构化转化为异天冬氨酸。另一方面，天冬酰胺通过脱酰胺作用容易地转化为天冬氨酸，并且可以通过异构化进一步转化为异天冬氨酸。这种异构化或脱酰胺的进展可能影响蛋白质的稳定性。因此，蛋白质中的天冬氨酸或天冬酰胺或例如与其相邻的氨基酸，可以被不同的氨基酸取代，以避免这种异构化或脱酰胺作用。优选地，具有这种氨基酸取代的抗体突变体保持原始抗体的抗原结合活性。
本发明还包括，例如：具有通过保守氨基酸取代从本发明的rLA204、rLA212、rLA225、rLA869或rLA1264的氨基酸序列衍生出的氨基酸序列的抗体突变体；和小鼠抗体、大鼠抗体、嵌合化抗体、人源化抗体或人抗体、其包含具有氨基酸序列的CDR，其中在源自rLA204、rLA212、rLA225、rLA869或rLA1264的CDRH1至CDRH3和CDRL1至CDRL3中的任意的氨基酸序列中引入保守氨基酸突变。
本发明的抗体的突变体包括包含具有氨基酸序列的CDRH1至CDRH3和CDRL1至CDRL3的人LAG-3结合抗体突变体，其中在源自本发明的rLA204、rLA212、rLA225、rLA869或rLA1264的CDRH1至CDRH3和CDRL1至CDRL3中的任一个或两个或更多的氨基酸序列中，通过不同的氨基酸取代1至数个，优选1至3个，更优选1或2个，最优选1个氨基酸。
抗体突变体还包括具有源自多种抗体的CDRH1至CDRH3和CDRL1至CDRL3的抗体。这种突变体的实例可包括抗体突变体，其包含源自某种抗体的CDRH3和源自另一种抗体的CDRH1、CDRH2和CDRL1至CDRL3。
根据本发明的“抗体”还包括这些抗体突变体。
本发明的抗体的恒定区没有特别限制。优选地，源自人抗体的恒定区用于本发明的抗体中，用于治疗或预防人的疾病。人抗体的重链恒定区的实例可包括Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2和Cε。人抗体的轻链恒定区的实例可包括Cκ和Cλ。
(3-10) 嵌合抗体
本发明的抗LAG-3嵌合化抗体或其结合片段具有(3-2)、(3-3)和(3-8)，优选除上述之外还具有(3-4)至(3-7)中的一种或多种，更优选除上述之外还具有(3-4)和/或(3-5)，进一步优选除上述之外还具有(3-4)和(3-5)，进一步优选除上述之外还具有(3-4)和(3-5)，和(3-6)和/或(3-7)，最优选(3-2)至(3-8)的全部中描述的性质，功能，活性等。
作为本发明的大鼠-人嵌合抗体示例的cLA212的重链的核苷酸序列和氨基酸序列，及其轻链的核苷酸序列和氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO: 23、24、25和26中(图38、39、40和41)。重链的核苷酸序列中的核苷酸位置1至57和重链的氨基酸序列中的氨基酸位置1至19各自代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链的核苷酸序列和氨基酸序列中。同样地，轻链的核苷酸序列中的核苷酸位置1至60和轻链的氨基酸序列中的氨基酸位置1至20各自代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟轻链的核苷酸序列和氨基酸序列中。
大鼠-人嵌合抗体cLA204、cLA225、cLA869和cLA1264在别处描述。
(3-11) 抗体的结合片段
根据一个方面，本发明提供了本发明的抗LAG-3抗体的结合片段。抗体的结合片段是指维持抗体功能的至少一部分的片段。抗体的此类功能的实例通常可包括抗原结合活性，抗原活性调节活性和抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)活性。优选地，本发明的抗LAG-3抗体的结合片段具有(3-2)、(3-3)和(3-8)，优选除上述之外还具有(3-4)至(3-7)中的一种或多种，更优选除上述之外还具有(3-4)和/或(3-5)，进一步优选除上述之外还具有(3-4)和(3-5)，进一步优选除上述之外还具有(3-4)和(3-5)，和(3-6)和/或(3-7)，最优选(3-2)至(3-8)的全部中描述的性质，功能，活性等。
抗体的结合片段没有特别限制，只要抗体片段保持所述抗体的至少一部分活性。其实例可包括但不限于Fab、F(ab')2、Fv、包含通过适当的接头连接的重链和轻链Fv的单链Fv (scFv)、双抗体，线性抗体、由抗体形成的多特异性抗体片段和Fab'，它是通过在还原条件下处理F(ab')2获得的抗体可变区的单价片段。本发明的抗体的结合片段还意在包括包含本发明抗体片段以及其他部分的分子，例如保留接头部分的scFv。
通过在其氨基末端和/或羧基末端缺失1至数个或更多个氨基酸而从抗体蛋白衍生出的并保持抗体功能的至少一部分的分子也包括在抗体的结合片段的含义中。例如，已知由培养的哺乳动物细胞产生的抗体的重链在羧基末端缺乏赖氨酸残基(Journal ofChromatography A, 705: 129-134 (1995))。此外，已知这种抗体的重链在羧基末端缺少两个氨基酸残基(甘氨酸和赖氨酸)，而在羧基末端具有酰胺化的脯氨酸残基(AnalyticalBiochemistry, 360: 75-83 (2007))。然而，在这些重链序列中的缺失和修饰并不影响抗体结合抗原的能力或其效应子功能(补体活化、抗体依赖性细胞的细胞毒性作用等)。抗体结合片段的这种修饰形式也包括在本发明的抗体或其结合片段，或其修饰形式(后面描述)中。
本发明的抗体可以是具有对至少两种不同类型的抗原的特异性的多特异性抗体。多特异性抗体不限于结合2种不同抗原的双特异性抗体，并且具有对3种或更多种不同抗原的特异性的抗体也包含在本发明的“多特异性抗体”的含义中。
本发明的多特异性抗体可以是全长抗体或其结合片段(例如，双特异性F(ab')2抗体)。双特异性抗体也可以通过连接两种抗体的重链和轻链(HL对)来制备。或者，可以通过融合两种或更多种产生单克隆抗体的杂交瘤来制备产生双特异性抗体的融合细胞，从而获得双特异性抗体(Millstein等人，Nature (1983) 305, p. 537-539)。多特异性抗体也可以与上述相同的方式制备。
根据一个方面，本发明的抗体是单链抗体(单链Fv；下文称为“scFv”)。scFv通过经由多肽接头连接抗体的重链和轻链V区而获得(Pluckthun, The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies, 113, Rosenburg and Moore, ed., Springer Verlag, NewYork, p. 269-315 (1994)；和Nature Biotechnology (2005), 23, p. 1126-1136)。此外，包含通过多肽接头连接的两个scFv的bi-scFv可用作双特异性抗体。或者，包含三种或更多种scFv的多scFv可用作多特异性抗体。
本发明包括单链免疫球蛋白，其包含经由合适接头连接的抗体的全长重链和轻链序列(Lee, H-S等人，Molecular Immunology (1999), 36, p. 61-71；和Shirrmann, T.等人，mAbs (2010), 2 (1) p. 1-4)。此类单链免疫球蛋白可以二聚化以由此保持与原始为四聚体的抗体相似的结构和活性。而且，本发明的抗体可以是具有单个重链可变区且没有轻链序列的抗体。据报道，这种称为单结构域抗体(sdAb)或纳米抗体的抗体保持结合抗原的能力(Muyldemans S.等人，Protein Eng. (1994), 7 (9), 1129-35；和Hamers-Casterman C.等人，Nature (1993), 363 (6428), 446-8)。这些抗体也包括在根据本发明的抗体的功能片段的含义中。
(3-12) 人源化抗体和人抗体
根据一个方面，本发明提供了人源化抗体或其结合片段。
优选地，本发明的人源化抗LAG-3抗体或其结合片段具有(3-2)、(3-3)和(3-8)，优选除上述之外还具有(3-4)至(3-7)中的一种或多种，更优选除上述之外还具有(3-4)和/或(3-5)，进一步优选除上述之外还具有(3-4)和(3-5)，进一步优选除上述之外还具有(3-4)和(3-5)，和(3-6)和/或(3-7)，最优选(3-2)至(3-8)的全部中描述的性质，功能，活性等。
本发明的人源化抗体的优选实例可包括具有rLA204、rLA212、rLA225、rLA869或rLA1264的重链CDRH1至CDRH3和轻链CDRL1至CDRL3的人源化抗体，如下文A至E中所述。
(A. 具有rLA204抗体的重链CDRH1至CDRH3和轻链CDRL1至CDRL3的人源化抗体)
本发明的人源化抗LAG-3抗体或其结合片段的实例可包括人源化抗体，其由重链和轻链组成：所述重链具有可变区，其包含由SEQ ID NO: 41 (图56)所示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO: 42 (图57)所示的氨基酸序列组成的CDRH2，和由SEQ ID NO: 43 (图58)所示的氨基酸序列组成的CDRH3，所述轻链具有可变区，其包含由SEQ ID NO: 44 (图59)所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO: 45 (图60)所示的氨基酸序列组成的CDRL2，和由SEQ ID NO: 46 (图61)所示的氨基酸序列组成的CDRL3，并识别本发明的LAG-3蛋白，其结合片段或其突变体。
(B. 具有rLA212抗体的重链CDRH1至CDRH3和轻链CDRL1至CDRL3的人源化抗体)
所述人源化抗LAG-3抗体或其结合片段的可选实例可包括人源化抗体，其由重链和轻链组成：所述重链具有可变区，其包含由SEQ ID NO: 47 (图62)所示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO: 48 (图63)所示的氨基酸序列组成的CDRH2，和由SEQ ID NO: 49 (图64)所示的氨基酸序列组成的CDRH3，所述轻链具有可变区，其包含由SEQ ID NO: 50 (图65)所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO: 51 (图66)所示的氨基酸序列组成的CDRL2，和由SEQ ID NO: 52 (图67)所示的氨基酸序列组成的CDRL3，并识别本发明的LAG-3蛋白，其结合片段或其突变体。
(C. 具有rLA225抗体的重链CDRH1至CDRH3和轻链CDRL1至CDRL3的人源化抗体)
所述人源化抗LAG-3抗体或其结合片段的可选实例可包括人源化抗体，其由重链和轻链组成：所述重链具有可变区，其包含由SEQ ID NO: 53 (图68)所示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO: 54 (图69)所示的氨基酸序列组成的CDRH2，和由SEQ ID NO: 55 (图70)所示的氨基酸序列组成的CDRH3，所述轻链具有可变区，其包含由SEQ ID NO: 56 (图71)所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO: 57 (图72)所示的氨基酸序列组成的CDRL2，和由SEQ ID NO: 58 (图73)所示的氨基酸序列组成的CDRL3，并识别本发明的LAG-3蛋白，其结合片段或其突变体。
(D. 具有rLA869抗体的重链CDRH1至CDRH3和轻链CDRL1至CDRL3的人源化抗体)
所述人源化抗LAG-3抗体或其结合片段的可选实例可包括人源化抗体，其由重链和轻链组成：所述重链具有可变区，其包含由SEQ ID NO: 59 (图74)所示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO: 60 (图75)所示的氨基酸序列组成的CDRH2，和由SEQ ID NO: 61 (图76)所示的氨基酸序列组成的CDRH3，所述轻链具有可变区，其包含由SEQ ID NO: 62 (图77)所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO: 63 (图78)所示的氨基酸序列组成的CDRL2，和由SEQ ID NO: 64 (图79)所示的氨基酸序列组成的CDRL3，并识别本发明的LAG-3蛋白，其结合片段或其突变体。
(E. 具有rLA1264抗体的重链CDRH1至CDRH3和轻链CDRL1至CDRL3的人源化抗体)
所述人源化抗LAG-3抗体或其结合片段的可选实例可包括人源化抗体，其由重链和轻链组成：所述重链具有可变区，其包含由SEQ ID NO: 65 (图80)所示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO: 66 (图81)所示的氨基酸序列组成的CDRH2，和由SEQ ID NO: 67 (图82)所示的氨基酸序列组成的CDRH3，所述轻链具有可变区，其包含由SEQ ID NO: 68 (图83)所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO: 69 (图84)所示的氨基酸序列组成的CDRL2，和由SEQ ID NO: 70 (图85)所示的氨基酸序列组成的CDRL3，并识别本发明的LAG-3蛋白，其结合片段或其突变体。
本发明的人源化抗体的优选实例包括上述A至E中描述的那些。更优选的人源化抗体的实例可包括但不限于hLA212_H2/L1至hLA212_H2/L5，hLA212_H3/L1至hLA212_H3/L5和hLA212_H4/L2 (参见下文[i]至[x])。例如，本发明的人源化抗体的更优选实例还包括包含重链和轻链的抗体，所述重链包含人源化抗体hLA212_H2/L1至hLA212_H2/L5，hLA212_H3/L1至hLA212_H3 /L5和hLA212_H4/L2中的任一种的重链可变区，所述轻链包含人源化抗体hLA212_H2/L1至hLA212_H2/L5，hLA212_H3/L1至hLA212_H3/L5和hLA212_H4/L2中的任一种的轻链可变区。
[i]
[i-1] hLA212_H3/L2是实施例6中获得的人源化抗体。该抗体的重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 29 (图44)的核苷酸位置58至1410 (其中可变区为58至420)，并且其氨基酸序列包含SEQ ID NO: 30 (图45)的氨基酸位置20至470 (其中可变区域为20到140)。其轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 33 (图48)的核苷酸位置61至702 (其中可变区为61至387)，并且其氨基酸序列包含SEQ ID NO: 34 (图49)的氨基酸位置21至234 (其中可变区域为21到129)。可以通过实施例中描述的方法评估所述抗体具有适合用于本发明的药物组合物，治疗或预防方法，治疗或预防用途等的物理性质，具有(3-2)和(3-3)中描述的LAG-3结合活性和体外ADCC活性，(3-8)中描述的性质，即所述抗体的存在允许人LAG-3发挥人T细胞抑制功能(参见实施例)，以及具有(3-4)至(3-7)中所述的活性，性质等。
[i-2] hLA212_H4/L2是实施例8中获得的并且其糖链修饰被调整的人源化抗体，并且是hLA212_H3/L2的低岩藻糖形式。该抗体的重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 29(图44)的核苷酸位置58至1410 (其中可变区为58至420)，并且其氨基酸序列包含SEQ IDNO: 30 (图45)的氨基酸位置20至470 (其中可变区域为20到140)。其轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 33 (图48)的核苷酸位置61至702 (其中可变区为61至387)，并且其氨基酸序列包含SEQ ID NO: 34 (图49)的氨基酸位置21至234 (其中可变区域为21到129)。可以通过实施例中描述的方法评估抗体具有适合于本发明的药物组合物，治疗或预防方法，治疗或预防用途等的物理性质(数据未显示)，具有(3-2)至(3-5)中描述的LAG-3结合活性，体外ADCC活性，体内LAG-3阳性细胞数减少活性和体内实验性自身免疫性脑脊髓炎抑制活性(参见实施例)，具有(3-6)中描述的人活化的T细胞结合活性，和具有(3-7)和(3-8)中描述的性质，即所述抗体的存在允许人LAG-3发挥其给定活性。
[ii] hLA212_H2/L1是实施例6中获得的人源化抗体。该抗体的重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 27 (图42)的核苷酸位置58至1410 (其中可变区为58至420)，并且其氨基酸序列包含SEQ ID NO: 28 (图43)的氨基酸位置20至470 (其中可变区域为20到140)。其轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 31 (图46)的核苷酸位置61至702 (其中可变区为61至387)，并且其氨基酸序列包含SEQ ID NO: 32 (图47)的氨基酸位置21至234 (其中可变区域为21到129)。可以通过实施例中描述的方法评估所述抗体具有适合于本发明的药物组合物，治疗或预防方法，治疗或预防用途等的物理性质(数据未显示)，具有(3-2)和(3-3)中描述的LAG-3结合活性和体外ADCC活性(参见实施例)，以及具有(3-4)至(3-8)中描述的活性，性质等。
[iii] hLA212_H3/L3是实施例6中获得的人源化抗体。该抗体的重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 29 (图44)的核苷酸位置58至1410 (其中可变区为58至420)，并且其氨基酸序列包含SEQ ID NO: 30 (图45)的氨基酸位置20至470 (其中可变区域为20到140)。其轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 35 (图50)的核苷酸位置61至702 (其中可变区为61至387)，并且其氨基酸序列包含SEQ ID NO: 36 (图51)的氨基酸位置21至234 (其中可变区域为21到129)。可以通过实施例中描述的方法评估所述抗体具有适合于本发明的药物组合物，治疗或预防方法，治疗或预防用途等的物理性质(数据未显示)，具有(3-2)和(3-3)中描述的LAG-3结合活性和体外ADCC活性(参见实施例)，以及具有(3-4)至(3-8)中描述的活性，性质等。
[iv] hLA212_H2/L2是实施例6中获得的人源化抗体。该抗体的重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 27 (图42)的核苷酸位置58至1410 (其中可变区为58至420)，并且其氨基酸序列包含SEQ ID NO: 28 (图43)的氨基酸位置20至470 (其中可变区域为20到140)。其轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 33 (图48)的核苷酸位置61至702 (其中可变区为61至387)，并且其氨基酸序列包含SEQ ID NO: 34 (图49)的氨基酸位置21至234 (其中可变区域为21到129)。可以通过实施例中描述的方法评估所述抗体具有适合于本发明的药物组合物，治疗或预防方法，治疗或预防用途等的物理性质(数据未显示)，具有(3-2)和(3-3)中描述的LAG-3结合活性和体外ADCC活性(参见实施例)，以及具有(3-4)至(3-8)中描述的活性，性质等。
[v] hLA212_H2/L3是实施例6中获得的人源化抗体。该抗体的重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 27 (图42)的核苷酸位置58至1410 (其中可变区为58至420)，并且其氨基酸序列包含SEQ ID NO: 28 (图43)的氨基酸位置20至470 (其中可变区域为20到140)。其轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 35 (图50)的核苷酸位置61至702 (其中可变区为61至387)，并且其氨基酸序列包含SEQ ID NO: 36 (图51)的氨基酸位置21至234 (其中可变区域为21到129)。可以通过实施例中描述的方法评估所述抗体具有适合于本发明的药物组合物，治疗或预防方法，治疗或预防用途等的物理性质(数据未显示)，具有(3-2)和(3-3)中描述的LAG-3结合活性和体外ADCC活性(参见实施例)，以及具有(3-4)至(3-8)中描述的活性，性质等。
[vi] hLA212_H2/L4是实施例6中获得的人源化抗体。该抗体的重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 27 (图42)的核苷酸位置58至1410 (其中可变区为58至420)，并且其氨基酸序列包含SEQ ID NO: 28 (图43)的氨基酸位置20至470 (其中可变区域为20到140)。其轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 37 (图52)的核苷酸位置61至702 (其中可变区为61至387)，并且其氨基酸序列包含SEQ ID NO: 38 (图53)的氨基酸位置21至234 (其中可变区域为21到129)。可以通过实施例中描述的方法评估所述抗体具有适合于本发明的药物组合物，治疗或预防方法，治疗或预防用途等的物理性质(数据未显示)，具有(3-2)和(3-3)中描述的LAG-3结合活性和体外ADCC活性(参见实施例)，以及具有(3-4)至(3-8)中描述的活性，性质等。
[vii] hLA212_H2/L5是实施例6中获得的人源化抗体。该抗体的重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 27 (图42)的核苷酸位置58至1410 (其中可变区为58至420)，并且其氨基酸序列包含SEQ ID NO: 28 (图43)的氨基酸位置20至470 (其中可变区域为20到140)。其轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 39 (图54)的核苷酸位置61至702 (其中可变区为61至387)，并且其氨基酸序列包含SEQ ID NO: 40 (图55)的氨基酸位置21至234 (其中可变区域为21到129)。可以通过实施例中描述的方法评估所述抗体具有适合于本发明的药物组合物，治疗或预防方法，治疗或预防用途等的物理性质(数据未显示)，具有(3-2)和(3-3)中描述的LAG-3结合活性和体外ADCC活性(参见实施例)，以及具有(3-4)至(3-8)中描述的活性，性质等。
[viii] hLA212_H3/L1是实施例6中获得的人源化抗体。该抗体的重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 29 (图44)的核苷酸位置58至1410 (其中可变区为58至420)，并且其氨基酸序列包含SEQ ID NO: 30 (图45)的氨基酸位置20至470 (其中可变区域为20到140)。其轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 31 (图46)的核苷酸位置61至702 (其中可变区为61至387)，并且其氨基酸序列包含SEQ ID NO: 32 (图47)的氨基酸位置21至234 (其中可变区域为21到129)。可以通过实施例中描述的方法评估所述抗体具有适合于本发明的药物组合物，治疗或预防方法，治疗或预防用途等的物理性质(数据未显示)，具有(3-2)和(3-3)中描述的LAG-3结合活性和体外ADCC活性(参见实施例)，以及具有(3-4)至(3-8)中描述的活性，性质等。
[ix] hLA212_H3/L4是实施例6中获得的人源化抗体。该抗体的重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 29 (图44)的核苷酸位置58至1410 (其中可变区为58至420)，并且其氨基酸序列包含SEQ ID NO: 30 (图45)的氨基酸位置20至470 (其中可变区域为20到140)。其轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 37 (图52)的核苷酸位置61至702 (其中可变区为61至387)，并且其氨基酸序列包含SEQ ID NO: 38 (图53)的氨基酸位置21至234 (其中可变区域为21到129)。可以通过实施例中描述的方法评估所述抗体具有适合于本发明的药物组合物，治疗或预防方法，治疗或预防用途等的物理性质(数据未显示)，具有(3-2)和(3-3)中描述的LAG-3结合活性和体外ADCC活性(参见实施例)，以及具有(3-4)至(3-8)中描述的活性，性质等。
[x] hLA212_H3/L5是实施例6中获得的人源化抗体。该抗体的重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 29 (图44)的核苷酸位置58至1410 (其中可变区为58至420)，并且其氨基酸序列包含SEQ ID NO: 30 (图45)的氨基酸位置20至470 (其中可变区域为20到140)。其轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 39 (图54)的核苷酸位置61至702 (其中可变区为61至387)，并且其氨基酸序列包含SEQ ID NO: 40 (图55)的氨基酸位置21至234 (其中可变区域为21到129)。可以通过实施例中描述的方法评估所述抗体具有适合于本发明的药物组合物，治疗或预防方法，治疗或预防用途等的物理性质(数据未显示)，具有(3-2)和(3-3)中描述的LAG3结合活性和体外ADCC活性(参见实施例)，以及具有(3-4)至(3-8)中描述的活性，性质等。
在上述[i]至[x]中，(3-4)和(3-5)中描述的活性可以优选以低岩藻糖形式评估。本发明中的术语“物理性质”是指本发明的抗体及其结合片段作为物理体的稳定性，其可以使用已知的指标评估。作为物理体的稳定性的实例可包括热稳定性和储存稳定性，其指标的实例可包括从热谱图获得的Tm值和在储存条件或加速变质条件下的抗原结合活性的变化或随时间的变化。
此外，将hLA212抗体_H4/L2以单剂量施用于实施例10的人LAG-3/人FcγRIIIA双转基因小鼠，作为其结果，未观察到体重减轻和其他显着的毒性事件。因此，本发明的人源化抗体具有适用于治疗或预防与LAG-3阳性细胞相关的疾病(在别处定义)的方法，用于这种治疗或预防的用途，用于治疗或预防的药物组合物等的安全性。在上述本发明的人源化抗LAG-3抗体及其结合片段的更优选的实例中，hLA212_H3/L2、hLA212_H2/L1、hLA212_H3/L3、hLA212_H3/L6和hLA212_H4/L2是进一步优选的。
包含在本发明的人源化抗LAG-3抗体的更优选范围内的hLA212_H2/L1至H2/L5，hLA212_H3/L1至H3/L5，hLA212_H4/L2等可包含重链和轻链，所述重链由氨基酸序列组成，其中在重链氨基酸序列的FRH1至FRH4中，1至数个，优选1或2个氨基酸被其他氨基酸取代，所述轻链由氨基酸序列组成，其中在轻链氨基酸序列的FRL1至FRL4中，1个或多个，优选选自1至14的任何数目的氨基酸被其他氨基酸取代。
更优选地，在人源化抗体的轻链中，FRL1的氨基酸1，即成熟可变区中的氨基酸1(对应于SEQ ID NO: 32或图47的21位的氨基酸)是Asp或Asn；FRL1的氨基酸11，即成熟可变区的氨基酸11 (对应于SEQ ID NO: 32或图47的31位的氨基酸)是Leu或Met；FRL1的氨基酸13，即成熟可变区的氨基酸13 (对应于SEQ ID NO: 32或图47的33位的氨基酸)是Ala或Ile；FRL1的氨基酸21，即成熟可变区的氨基酸21 (对应于SEQ ID NO: 32或图47的41位的氨基酸)是Ile或Met；FRL2的氨基酸4，即成熟可变区的氨基酸38 (对应于SEQ ID NO: 32或图47的58位的氨基酸)是Gln或Lys，FRL2的氨基酸9，即成熟可变区的氨基酸43 (对应于SEQID NO: 32或图47的63位的氨基酸)是Ala或Ser；FRL3的氨基酸4，即成熟可变区的氨基酸60(对应于SEQ ID NO: 32或图47的80位的氨基酸)是Ser或Asp；FRL3的氨基酸9，即成熟可变区的氨基酸65 (对应于SEQ ID NO: 32或图47的85位的氨基酸)是Ser或Gly；FRL3的氨基酸11，即成熟可变区的氨基酸67 (对应于SEQ ID NO: 32或图47的87位的氨基酸)是Ser或Tyr；FRL3的氨基酸22，即成熟可变区的氨基酸78 (对应于SEQ ID NO: 32或图47的98位的氨基酸)是Leu或Val；FRL3的氨基酸27，即成熟可变区的氨基酸83 (对应于SEQ ID NO: 103或图47的103位的氨基酸)是PRL或Ala；FRL3的氨基酸29，即成熟可变区的氨基酸85 (对应于SEQ ID NO: 103或图47的105位的氨基酸)是Thr或Phe；FRL4的氨基酸7，即成熟可变区的氨基酸104 (对应于SEQ ID NO: 32或图47的124位的氨基酸)是Val或Leu；FRL4的氨基酸9，即成熟可变区的氨基酸106 (对应于SEQ ID NO: 32或图47的126的氨基酸)是Ile或Leu。
更优选地，在人源化抗体的重链中，FRH2的氨基酸14，即成熟可变区的氨基酸49(对应于SEQ ID NO: 28或图43的68位的氨基酸)是Gly或Ala；并且FRH3的氨基酸25，即成熟可变区的氨基酸84 (对应于SEQ ID NO: 28或图43的103位的氨基酸)是Asn或Asp。
本发明还包括包含重链和/或轻链并且结合LAG-3的抗体或其结合片段，所述重链和/或轻链包含与本发明的rLA204、rLA212、rLA225、rLA869、rLA1264、cLA204、cLA212、cLA225、cLA869和cLA1264抗体，以及人源化hLA212_H2/L1至hLA212_H2/L5，hLA212_H3/L1至hLA212_H3/L5和hLA212_H4/L2抗体中的任一种的重链和/或轻链的全长或可变区的氨基酸序列具有80％或更高，82％或更高，84％或更高，86％或更高，88％或更高，90%或更高，92％或更高，94％或更高，96％或更高，98％或更高，或99％或更高的同一性的氨基酸序列。这种序列同一性优选为94％或更高，更优选96％或更高，进一步优选98％或更高，最优选99％或更高。此外，所述抗体或其结合片段具有(3-2)、(3-3)和(3-8)，优选除上述之外还具有(3-4)至(3-7)中的一种或多种，更优选除上述之外还具有(3-4)和/或(3-5)，进一步优选除上述之外还具有(3-4)和(3-5)，进一步优选除上述之外还具有(3-4)和(3-5)，和(3-6)和/或(3-7)，最优选(3-2)至(3-8)的全部中描述的性质，功能，活性等。
两种氨基酸序列之间的同一性或同源性可以使用Blast算法2.2.2版的默认参数确定(Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, JinghuiZhang, Zheng Zhang, Webb Miller和David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST andPSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", NucleicAcids Res. 25: 3389-3402)。Blast算法也可以例如通过互联网访问http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/获得。
本发明还包括包含重链和/或轻链并且结合LAG-3的抗体或其结合片段，所述重链和/或轻链包含通过取代，缺失，添加和/或***1至50、1至45、1至40、1至35、1至30、1至25、1至20、1至15、1至10、1至8、1至6、1至5、1至4、1至3、1或2或1个氨基酸而从本发明的rLA204、rLA212、rLA225、rLA869、rLA1264、cLA204、cLA212、cLA225、cLA869和cLA1264抗体，以及hLA212_H2/L1至hLA212_H2/L5，hLA212_H3/L1至hLA212_H3/L5和hLA212_H4/L2抗体中的任一种的重链和/或轻链的全长或可变区氨基酸序列衍生出的氨基酸序列。这种氨基酸突变优选是取代。突变的氨基酸数优选为1至5，更优选为1至4，甚至更优选为1至3，进一步更优选为1或2，最优选为1个。此外，所述抗体或其结合片段具有(3-2)、(3-3)和(3-8)，优选除上述之外还具有(3-4)至(3-7)中的一种或多种，更优选除上述之外还具有(3-4)和/或(3-5)，进一步优选除上述之外还具有(3-4)和(3-5)，进一步优选除上述之外还具有(3-4)和(3-5)，和(3-6)和/或(3-7)，最优选(3-2)至(3-8)的全部中描述的性质，功能，活性等。
本发明还包括包含重链和/或轻链并且结合LAG-3的抗体或其结合片段，所述重链和/或轻链包含由核苷酸的核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸在严格条件下杂交至具有核苷酸序列的核苷酸，所述核苷酸序列与编码本发明的rLA204、rLA212、rLA225、rLA869、rLA1264、cLA204、cLA212、cLA225、cLA869和cLA1264抗体，以及hLA212_H2/L1至hLA212_H2/L5，hLA212_H3/L1至hLA212_H3/L5和hLA212_H4/L2抗体中的任一种的重链和/或轻链的全长或可变区氨基酸序列的核苷酸序列互补。所述抗体或其结合片段具有(3-2)、(3-3)和(3-8)，优选除上述之外还具有(3-4)至(3-7)中的一种或多种，更优选除上述之外还具有(3-4)和/或(3-5)，进一步优选除上述之外还具有(3-4)和(3-5)，进一步优选除上述之外还具有(3-4)和(3-5)，和(3-6)和/或(3-7)，最优选(3-2)至(3-8)的全部中描述的性质，功能，活性等。
根据另一方面，本发明提供了人抗体或其结合片段。本发明的人抗体或其结合片段没有特别限制，只要它是结合LAG-3的人源抗体或其结合片段，但具有(3-2)、(3-3)和(3-8)，优选除上述之外还具有(3-4)至(3-7)中的一种或多种，更优选除上述之外还具有(3-4)和/或(3-5)，进一步优选除上述之外还具有(3-4)和(3-5)，进一步优选除上述之外还具有(3-4)和(3-5)，和(3-6)和/或(3-7)，最优选(3-2)至(3-8)的全部中描述的性质，功能，活性等。
(3-13) 抗体与表位的结合
如同本发明提供的抗体的情况一样“结合相同位点的抗体”也包括在本发明的抗体中。如某种抗体的“结合相同位点的抗体”是指与抗体识别的抗原分子上的位点结合的不同抗体。如果第二抗体与第一抗体结合的抗原分子上的部分肽或部分三维结构结合，则确定第一和第二抗体与相同位点结合。或者，通过确认第二抗体与第一抗体竞争结合抗原，即第二抗体干扰第一抗体与抗原的结合，确定第一和第二抗体结合相同位点，即便未确定特异性结合位点的肽序列或三维结构。当第一和第二抗体结合相同位点，并且第一抗体具有本发明抗体的一个方面的作用特征，例如其存在允许LAG-3发挥T细胞抑制功能时，第二抗体也有非常高可能性具有与其相同的活性。因此，如果第二抗LAG-3抗体与第一抗LAG-3抗体结合的位点结合，则确定第一和第二抗体与LAG-3蛋白质上的相同位点结合。或者，通过确认第二抗LAG-3抗体与第一抗LAG-3抗体竞争结合LAG-3蛋白，确定第一和第二抗LAG-3抗体与LAG-3蛋白上的相同位点结合。
本发明还包括结合本发明的单克隆抗体识别的LAG-3蛋白上的位点的抗体。所述抗体及其结合片段具有(3-2)、(3-3)和(3-8)，优选除上述之外还具有(3-4)至(3-7)中的一种或多种，更优选除上述之外还具有(3-4)和/或(3-5)，进一步优选除上述之外还具有(3-4)和(3-5)，进一步优选除上述之外还具有(3-4)和(3-5)，和(3-6)和/或(3-7)，最优选(3-2)至(3-8)的全部中描述的性质，功能，活性等。
抗体结合位点可以通过本领域技术人员熟知的方法测定，例如免疫测定。例如，通过适当地从其C末端或N末端顺序切割抗原的氨基酸序列来制备一系列肽，并研究其抗体的反应性以确定识别位点。然后，合成较短的肽，并且可以研究抗体对这些肽的反应性，从而确定结合位点。可以使用诸如基因重组或肽合成的技术制备抗原片段肽。
当抗体结合或识别抗原的部分构象时，可以通过使用X射线结构分析鉴定与抗体相邻的抗原上的氨基酸残基来确定抗体的结合位点。例如，抗体或其片段和抗原或其片段可以彼此结合并结晶，然后通过结构分析以鉴定抗原上与抗体具有相互作用距离的每个氨基酸残基。相互作用距离为8埃或更短，优选为6埃或更短，更优选为4埃或更短。与抗体具有相互作用距离的一个或多个这样的氨基酸残基可以构成抗体结合的抗原上的位点(表位)。两个或更多个这样的氨基酸残基在一级序列上可以彼此不相邻。
本发明抗体的表位存在于人LAG-3或其氨基酸序列中。本发明的抗体或其结合片段或其修饰形式还包括与该表位结合，与本发明的抗体竞争结合表位，或与这些氨基酸残基具有相互作用距离的抗体，其结合片段或其修饰形式。
(3-14) 抗体的修饰形式
本发明提供了抗体或其结合片段的修饰形式。本发明的抗体或其结合片段的修饰形式是指具有化学或生物学修饰的本发明的抗体或其结合片段。化学修饰形式包括，例如，具有与化学部分缀合的氨基酸骨架的形式，和具有化学修饰的N-连接或O-连接的碳水化合物链的形式。生物学修饰形式包括，例如，经历翻译后修饰的形式(例如，N-连接或O-连接的糖基化，N-末端或C-末端加工，脱酰胺，天冬氨酸的异构化或蛋氨酸的氧化)，以及包含通过使用原核宿主细胞的表达而添加到N-末端的蛋氨酸残基的形式。这种修饰形式还意在包括经标记而允许检测或分离本发明的抗体或抗原的形式，例如酶标记形式，荧光标记形式或亲和标记形式。本发明的这种修饰形式的抗体或其结合片段可用于改善本发明的原始抗体或其原始结合片段的稳定性或血液保留，降低抗原性，检测或分离抗体或抗原等。
化学修饰形式中包含的化学部分的实例可包括水溶性聚合物，例如聚乙二醇，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖和聚乙烯醇。
生物学修饰形式的实例可包括通过酶处理，细胞处理等修饰的形式，与通过基因重组添加的另一种肽(例如标签)融合的形式，和由表达内源或外源糖链修饰酶的宿主细胞制备的形式。
本发明的抗体或其结合片段的抗体依赖性细胞的细胞毒性活性可以通过调整结合到抗体或结合片段的糖链的修饰(糖基化、脱岩藻糖基化等)来增强。例如，WO99/54342、WO00/61739和WO02/31140中描述的方法已知作为调整抗体的糖链修饰的此类技术，尽管该技术并不限于此。本发明的抗体的修饰形式还包括经过如此调节的糖链修饰的抗体。
可以在抗体或其结合片段中的任意位置或期望位置进行这种修饰。可以在其中的一个或两个或更多个位置处进行相同或两个或更多个不同的修饰。
在本发明中，“抗体片段的修饰形式”也意在甚至包括“抗体修饰形式的片段”。
在本发明中，抗体的修饰形式或其结合片段的修饰形式也简称为“抗体”或“抗体的结合片段”。
如上所述，hLA212_H4/L2是实施例8中获得的且其糖链修饰被调整人源化抗体。所述人源化抗体也包括在本发明的抗体中。
如上所述的本发明的抗体或其结合片段及其修饰形式优选具有适用于本发明的药物组合物，治疗或预防方法，治疗或预防的用途等的物理性质，药代动力学，血液保留，安全性等。
4. 产生抗体的方法
(4-1) 使用杂交瘤的方法
本发明的抗LAG-3抗体可根据Kohler和Milstein的方法制备(Kohler和Milstein,Nature (1975), 256, p. 495-497；和Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, p.365-367, Plenum Press, N.Y. (1980))。因此，从用LAG-3蛋白或其可溶形式免疫的动物的脾中分离产生抗LAG-3抗体的细胞，并将细胞与骨髓瘤细胞融合，从而建立杂交瘤。单克隆抗体可以从这些杂交瘤的培养物中获得。
(4-1-1) 抗原的制备
用于制备抗LAG-3抗体的抗原可以根据例如本发明其他段落中描述的制备天然或重组LAG-3蛋白的方法获得。可由此制备的抗原的实例可包括LAG-3蛋白，LAG-3蛋白片段（其包含具有LAG-3蛋白的至少6个连续氨基酸的部分序列），及其进一步包含向其添加的任意氨基酸序列或载体的衍生物(下文统称为“LAG-3抗原”)。
重组LAG-3抗原可以通过用包含编码LAG-3抗原的氨基酸序列的核苷酸序列的基因转染宿主细胞，并从细胞培养物中回收抗原来制备。这种重组抗原可以是与另一种蛋白质(如免疫球蛋白Fc区域)的融合蛋白质。在无细胞体外翻译***中，从包含编码LAG-3抗原的氨基酸序列的核苷酸序列的基因获得的LAG-3抗原也包括在重组LAG-3抗原中。可以从表达LAG-3的细胞等中纯化和分离非重组LAG-3抗原。
为了获得抗LAG-3单克隆抗体，其存在允许LAG-3发挥T细胞功能抑制功能或不阻止或抑制LAG-3的T细胞功能抑制功能，可以将例如缺失免疫球蛋白样结构域1和2的LAG-3突变体用作优选的免疫原。
(4-1-2) 抗LAG-3单克隆抗体的产生
单克隆抗体通常通过以下步骤产生：
(a) 制备抗原，
(b) 制备抗体产生细胞，
(c) 制备骨髓瘤细胞(以下称为“骨髓瘤”)，
(d) 将抗体产生细胞与骨髓瘤融合，
(e) 筛选产生目的抗体的杂交瘤组，和
(f) 获得单细胞克隆(克隆)。
该制备方法还包括以下步骤：(g) 培养杂交瘤，培育杂交瘤移植的动物等，和(h)如果需要，测定或确定单克隆抗体的生物活性等。
在下文中，将参考这些步骤详细描述制备单克隆抗体的方法。然而，制备抗体的方法不限于这些步骤，并且可以使用例如脾细胞以外的抗体产生细胞。
(a) 抗原的纯化
该步骤根据上述(2-3)中描述的制备LAG-3蛋白质的方法进行。
(b) 制备抗体产生细胞的步骤
将步骤(a)中获得的抗原与佐剂(例如完全或不完全弗氏佐剂或硫酸铝钾)混合，并用所得免疫原免疫实验动物。可以无限制地使用本领域已知的杂交瘤制备方法中使用的任何实验动物。具体地，例如，可以使用小鼠，大鼠，山羊，绵羊，牛或马。从容易获得待与分离的抗体产生细胞融合的骨髓瘤细胞等观点来看，待免疫的动物优选是小鼠或大鼠。
实际使用的小鼠或大鼠的品系没有特别限制。在小鼠的情况下，可以使用例如A、AKR、BALB/c、BALB/cAnNCrj、BDP、BA、CE、C3H、57BL、C57BL、C57L、DBA、FL、HTH、HT1、LP、NZB、NZW、RF、R III、SJL、SWR、WB或129。在大鼠的情况下，可以使用例如Wistar、Low、Lewis、Sprague-Dawley、ACI、BN或Fischer。
这些小鼠和大鼠可从实验动物育种者或分销商处获得，例如CLEA Japan，Inc.或Charles River Laboratories Japan Inc.。
在这些小鼠和大鼠中，考虑到后面描述的与骨髓瘤细胞的融合相容性，特别优选BALB/c小鼠品系或Wistar和Low大鼠品系作为待免疫的动物。
此外，考虑到人和小鼠抗原之间的同源性，还优选使用其去除自身抗体的生物学机制已经降低的小鼠，即自身免疫疾病小鼠。
在这种情况下，这些小鼠或大鼠在免疫时优选5至12周龄，更优选6至8周龄。
可以使用例如Weir, D.M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I.II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987)，Kabat, E. A.和Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas PublisherSpigfield, Illinois (1964)的方法，用LAG-3蛋白免疫动物。
用于确定抗体滴度的方法的实例可包括但不限于免疫测定，例如RIA和ELISA。
源自从免疫动物分离的脾细胞或淋巴细胞的抗体产生细胞可以根据本领域已知的方法制备，例如，Kohler等人，Nature (1975) 256, p. 496；Kohler等人，Eur. J.Immnol. (1977) 6, p.511；Milstein等人，Nature (1977), 266，p. 550；Walsh, Nature,(1977)266, p.495。
在脾细胞的情况下，可以采用一般方法，其包括切碎脾脏，通过不锈钢网过滤细胞，并且然后将所得细胞悬浮在Eagle's最低必需培养基(MEM)等中，以分离抗体产生细胞。
(c) 制备骨髓瘤的步骤
用于细胞融合的骨髓瘤细胞没有特别限制，并且可以从本领域已知的细胞系中适当选择使用。考虑到从融合细胞中选择杂交瘤的方便性，优选使用例如，其筛选方法已经建立的次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT)缺陷系，即小鼠来源的X63-Ag8 (X63)、NS1-ANS/1 (NS1)、P3X63-Ag8.U1 (P3U1)、X63-Ag8.653 (X63.653)、SP2/0-Ag14 (SP2/0)、MPC11-45.6TG1.7 (45.6TG)、FO、S149/5XXO或BU.1、大鼠来源的210.RSY3.Ag.1.2.3 (Y3)、或人来源的U266AR (SKO-007)、GM1500-GTG-A12 (GM1500)、UC729-6、LICR-LOW-HMy2(HMy2)或8226AR/NIP4-1 (NP41)等。这些HGPRT缺陷系可从例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。
将这些细胞系在适当的培养基中传代培养，例如，8-氮鸟嘌呤培养基[补充有谷氨酰胺、2-巯基乙醇、庆大霉素和胎牛血清(以下称为“FBS”)并进一步补充8-氮鸟嘌呤的RPMI-1640培养基]，Iscove改良的Dulbecco's培养基(以下简称“IMDM”)，或Dulbecco's改良的Eagle培养基(以下简称“DMEM”)，并在细胞融合前在正常培养基[例如，含有10％FBS的ASF104培养基(由Ajinomoto Co.，Inc.制造)]中传代培养3至4天，以确保细胞融合当天的细胞数量等于或大于2×107个细胞。
(d) 将抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合的步骤
根据本领域已知的任何方法(例如，Weir, D.M., Handbook of ExperimentalImmunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford(1987)，Kabat, E. A.和Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles CThomas Publisher Springfield, Illinois (1964))，可以在防止细胞活力极度降低的条件下，将抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合。例如，可以使用包括在聚合物(例如聚乙二醇)的高浓度溶液中混合抗体产生细胞与骨髓瘤细胞的化学方法，或使用电刺激的物理方法。
(e) 筛选产生目的抗体的杂交瘤组的步骤
选择通过细胞融合获得的杂交瘤的方法没有特别限制，并且通常使用次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)选择方法(Kohler等人，Nature (1975) 256，p.495；Milstein等人，Nature(1977) 266, p.550)。该方法对于使用HGPRT缺陷型骨髓瘤细胞系获得杂交瘤是有效的，所述HGPRT缺陷型骨髓瘤细胞系在氨基蝶呤的存在下不能存活。具体地，未融合细胞和杂交瘤可以在HAT培养基中培养，从而仅允许对氨基蝶呤具有抗性的杂交瘤选择性地生存和生长。
(f) 获得单细胞克隆的步骤(克隆)
杂交瘤可以使用本领域已知的任何方法克隆，例如甲基纤维素，软琼脂糖或有限稀释方法(参见例如Barbara, B.M.和Stanley, M.S.: Selected Methods in CellularImmunology, W. H. Freeman and Company, San Francisco (1980))。有限稀释方法是优选的。
(g) 培养杂交瘤的步骤和培育杂交瘤移植动物的步骤
可以培养选择的杂交瘤，从而产生单克隆抗体。优选地，克隆所需的杂交瘤，并且然后进行抗体产生。
可以从杂交瘤的培养物中回收由这种杂交瘤产生的单克隆抗体。而且，可以从引入单克隆抗体基因的细胞培养物中回收重组抗体。或者，可以将杂交瘤腹膜内注射到相同品系(例如，上述BALB/cAnNCrj)的小鼠或Nu/Nu小鼠中并使其生长。然后，可以从它们的腹水中回收单克隆抗体。
(h) 测定或确定单克隆抗体的生物活性的步骤
可以根据目的选择并应用各种生物测试。
(4-2) 细胞免疫方法
表达天然LAG-3蛋白的细胞，表达重组LAG-3蛋白或其片段的细胞等可用作免疫原，从而通过上述杂交瘤方法制备抗LAG-3抗体。
这些表达LAG-3的细胞以每次免疫注射1×105至1×109个细胞的量使用，优选1×106至1×108个细胞，更优选0.5至2×107个细胞，甚至更优选1×107个细胞。可以根据LAG-3蛋白的表达水平改变用于免疫的细胞数。免疫原通常通过腹膜内施用，并且可以通过皮内途径等施用。可以通过应用段落(4-1-2)中描述的方法制备杂交瘤。
(4-3) 基因重组
为了制备本发明的抗体，将包含编码其重链氨基酸序列的核苷酸序列的核苷酸(重链核苷酸)和包含编码其轻链氨基酸序列的核苷酸序列的核苷酸(轻链核苷酸)，或具有重链核苷酸***物的载体和具有轻链核苷酸***物的载体导入宿主细胞中，然后培养细胞，并且可以从培养物中回收抗体。重链核苷酸和轻链核苷酸可以***一个载体中。
原核或真核细胞可用作宿主细胞。在使用真核宿主细胞的情况下，可以使用动物细胞，植物细胞或真核微生物。
动物细胞的实例可包括哺乳动物来源的细胞，即猴来源的COS细胞(Gluzman, Y.Cell (1981), 23, p.175-182，ATCC CRL-1650)，小鼠成纤维细胞NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658)，小鼠NS0细胞系(ECACC)，中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞，ATCC CCL-61)，其二氢叶酸还原酶缺陷系(CHOdhfr-；Urlaub, G.和Chasin, L.A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(1980), 77, p. 4126-4220)，CHOK1SV (Lonza Biologics)，源自鸟类如鸡的细胞，和源自昆虫的细胞。
此外，经修饰以调节蛋白质(如抗体)的糖链修饰的细胞可用作宿主。例如，在抗体表达中，可以使用经修饰以使得从结合抗体Fc区的复合型N-糖苷连接的糖链减少或去除在糖链的还原末端与N-乙酰葡糖胺结合的岩藻糖的CHO细胞，由此制备低岩藻糖或去岩藻糖基化抗体(也称为抗体的修饰形式)(WO00/61739，WO02/31140等)。
真核微生物的实例可包括酵母。
原核细胞的实例可包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。
用于分泌本发明抗体(来自每种动物的单克隆抗体，大鼠抗体，小鼠抗体，嵌合抗体，人源化抗体，人抗体等)的信号肽不限于与本发明的抗体相同物种，相同类型和相同亚型的抗体的分泌信号，或本发明的抗体自身的分泌信号。可以选择和使用与其不同类型或亚型的抗体的任何分泌信号，或源自与其不同的真核物种或原核物种的蛋白质的任何分泌信号。
(4-4) 设计和制备人源化抗体的方法
人源化抗体的实例可包括但不限于：具有被非人动物抗体的CDR替换的CDR的人源抗体(参见Nature (1986), 321, p. 522-525)，通过CDR移植而移植有CD序列和框架区的一些氨基酸残基的人抗体(参见WO90/07861和US6972323)，和任何所述人源化抗体，其中一种或两种或多种源自非人动物抗体的氨基酸已被替换为源自人抗体的氨基酸。
(4-5) 制备人抗体的方法
本发明的抗体的其他实例可包括人抗体。抗LAG-3人抗体是指由人源抗体的氨基酸序列组成的抗LAG-3抗体。抗LAG-3人抗体可以通过使用产生人抗体的小鼠的方法获得，所述小鼠携带包含人抗体重链和轻链基因的人基因组DNA片段(参见例如，Tomizuka, K等人，Nature Genetics (1997) 16, p.133-143；Kuroiwa, Y. 等人，Nuc. Acids Res. (1998)26, p.3447-3448；Yoshida, H. 等人，Animal Cell Technology: Basic and AppliedAspects vol. 10, p.69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. and Iijima, S. eds.),Kluwer Academic Publishers, 1999；和Tomizuka, K.等人，Proc. Natl. Acad. Sci.USA (2000) 97, p.722-727)。
具体地，这种产生人抗体的动物可以是任何重组动物，其通过破坏非人哺乳动物的内源免疫球蛋白重链和轻链基因座，并且作为替代通过酵母人工染色体(YAC)载体等向其引入人免疫球蛋白重链和轻链基因座而获得，以及通过杂交这些动物而产生的重组动物。
或者，可以使用分别编码这种人抗体的重链和轻链的cDNA，优选用包含所述cDNA的载体，通过基因重组技术转染(转化)真核细胞。可以培养产生重组人单克隆抗体的转染(转化)细胞。该抗体可以从培养上清液获得。
在这种情况下，可以使用例如，真核细胞，优选哺乳动物细胞如CHO细胞，淋巴细胞或骨髓瘤，作为宿主。
此外，获得选自人抗体文库(参见例如Wormstone, I. M.等人，InvestigativeOphthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), p.2301-2308；Carmen, S.等人，Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), p.189-203；和Siriwardena, D.等人，Opthalmology (2002) 109 (3), p.427-431)的噬菌体展示来源的人抗体的方法是已知的。
例如，可以使用噬菌体展示方法(Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p.1105-1116)，其涉及允许人抗体的可变区在噬菌体表面上作为单链抗体(scFv)表达，并选择与抗原结合的噬菌体。
可以对基于其结合抗原的能力而选择的噬菌体进行基因分析，从而确定编码与抗原结合的人抗体可变区的DNA序列。
如果确定了与抗原结合的scFv的DNA序列，则可以制备具有该序列的表达载体并将其导入适当的宿主以使它们表达人抗体(WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213,WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438, WO95/15388, Annu. Rev. Immunol (1994) 12,p.433-455, and Nature Biotechnology (2005) 23 (9), p.1105-1116)。
(4-6) 制备抗体结合片段的方法
用于制备单链抗体的方法是本领域熟知的(参见例如美国专利号4,946,778、5,260,203、5,091,513和5,455,030)。在该scFv中，重链可变区和轻链可变区通过接头连接，所述接头阻止它们形成缀合物，优选多肽接头(Huston, J.S.等人，Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. (1988), 85, p. 5879-5883)。scFv中的重链可变区和轻链可变区可以源自相同抗体或可以源自不同抗体。
例如，由12-19个残基组成的任意单链肽用作连接这些可变区的多肽接头。
为了获得编码抗体的重链或重链可变区的DNA序列和编码其轻链或轻链可变区的DNA的编码scFv的DNA，使用编码完整或所需氨基酸序列的每个DNA部分作为模板，并使用侧接模板两端的引物对通过PCR扩增。随后，与侧接DNA的两个末端的引物对组合，进一步扩增编码多肽接头部分的DNA，从而获得可以在其末端分别连接重链DNA和轻链DNA的片段。
编码scFv的DNA由此可用于根据常规方法制备包含所述DNA的表达载体，和用所述表达载体转化的宿主细胞。另外，可以培养宿主细胞，并且可以根据常规方法从培养物中回收scFv。
另外，为了获得抗体的任何其他结合片段，根据上述方法获得编码结合片段的基因并将其引入细胞中。可以从细胞培养物中回收目标结合片段。
本发明的抗体可以多聚化以由此增强其对于抗原的亲和力。在这种情况下，相同类型的抗体可以多聚化，或者分别识别相同抗原的多个表位的多种抗体可以多聚化。用于多聚化这些抗体的方法的实例可以包括结合两个scFv至IgG CH3结构域，其结合至链霉抗生物素和引入螺旋-转角-螺旋基序。
本发明的抗体可以是作为氨基酸序列不同的多种类型的抗LAG-3抗体的混合物，即多克隆抗体。多克隆抗体的实例可以包括在部分或全部CDR中不同的多种类型抗体的混合物。可以从混合培养的不同抗体产生细胞的培养物中回收这种多克隆抗体(WO2004/061104)。或者，可以混合单独制备的抗体。抗血清是多克隆抗体的一个实施方案，可以通过用所需抗原免疫动物并根据标准方法从动物中回收血清来制备。
与多种分子(诸如聚乙二醇(PEG))缀合的抗体也可以用作抗体的修饰形式。
本发明的抗体可以进一步是由这些抗体与其他药物形成的缀合物(免疫缀合物)的任一种。此类抗体的实例可以包括缀合至放射性材料或具有药理作用的化合物的抗体(Nature Biotechnology (2005) 23, p. 1137-1146)。
如(3-11)，(3-14)，(4-6)等中例示或描述的，本发明的抗体或其结合片段，及其修饰形式，也称为“本发明的抗体或包含其结合片段的分子”。
(4-7) 抗体的纯化
所获得的抗体可以纯化直至均质。通常的蛋白质分离和纯化方法可用于分离和纯化抗体。
可以通过适当选择或组合的方法分离和纯化抗体，例如，色谱柱，过滤器，超滤，盐析，透析，制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳和/或等电聚焦(Strategies for ProteinPurification and Charcterization: A Laboratoy Course Manual, Daniel R.Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)；和Antibodies:A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但分离和纯化方法不限于此。
色谱的实例包括亲和色谱、离子交换色谱、疏水色谱、凝胶过滤、反相色谱和吸附色谱。
这些色谱方法可以使用液相色谱，诸如HPLC或FPLC进行。
用于亲和色谱中的柱的实例可以包括蛋白A柱、蛋白G柱和抗体柱。
蛋白A柱的实例包括Hyper D (由Pall Corp.制造)，POROS (由AppliedBiosystems，Inc.制造)和Sepharose F.F. (由GE Healthcare Bio-Sciences Corp.制造)。
此外，可以利用其针对抗原的结合活性，使用固定抗原的载体来纯化抗体。
(4-8) 编码抗体的核苷酸，重组载体和重组细胞
本发明还提供了编码本发明的抗体或其结合片段，或其修饰形式的核苷酸(下文中将该核苷酸称为“抗体基因”)，具有该基因***的重组载体，包含该基因或载体的细胞(下文中将该细胞称为“抗体基因转染的细胞”)，以及产生本发明的抗体或其结合片段，或其修饰形式的细胞(下文中将该细胞被称为“抗体产生细胞”)。
优选地，本发明的抗体基因包含以下(a)至(e)中任一项中描述的核苷酸序列(下文称为“抗体基因序列”)，由包含所述抗体基因序列的核苷酸序列组成，或由抗体基因序列组成：
(a) 编码大鼠抗体rLA204、rLA212、rLA225、rLA869和rLA1264，它们的嵌合抗体cLA204、cLA212、cLA225、cLA869和cLA1264 (其中重链和轻链恒定区被人抗体的重链和轻链恒定区取代)，及其人源化抗体hLA212_H2/L1至hLA212_H2/L5和LA212_H3/L1至hLA212_H3/L5中的任一种的重链的氨基酸序列的核苷酸序列，和编码其轻链的氨基酸序列的核苷酸序列的组合；
(b) 编码大鼠抗体rLA204、rLA212、rLA225、rLA869和rLA1264，它们的嵌合抗体cLA204、cLA212、cLA225、cLA869和cLA1264 (其中重链和轻链恒定区被人抗体的重链和轻链恒定区取代)，及其人源化抗体hLA212_H2/L1至hLA212_H2/L5和LA212_H3/L1至hLA212_H3/L5中的任一种的包含CDRH1至CDRH3的重链的氨基酸序列的核苷酸序列，和编码其包含CDRL1至CDRL3的轻链的氨基酸序列的核苷酸序列的组合；
(c) 编码大鼠抗体rLA204、rLA212、rLA225、rLA869和rLA1264，它们的嵌合抗体cLA204、cLA212、cLA225、cLA869和cLA1264 (其中重链和轻链恒定区被人抗体的重链和轻链恒定区取代)，及其人源化抗体hLA212_H2/L1至hLA212_H2/L5和LA212_H3/L1至hLA212_H3/L5中的任一种的包含重链可变区的氨基酸序列的重链的氨基酸序列的核苷酸序列，和编码其包含轻链可变区的氨基酸序列的轻链的氨基酸序列的核苷酸序列的组合；
(d) 在严格条件下与由与(a)-(c)中任一项的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的核苷酸杂交的核苷酸序列，并编码与LAG-3结合的抗体的氨基酸序列；
(e) 核苷酸序列，其编码通过1-50，1-45，1-40，1-30，1-25，1-20，1-15，1-10，1-8，1-6，1-5，1-4，1-3,1或2，或1个碱基的取代，缺失，添加和/或***而衍生自根据(a)至(c)中任一项的氨基酸序列的氨基酸序列，且编码与LAG-3结合的抗体的氨基酸序列，其中具有由根据(d)或(e)的核苷酸序列编码的氨基酸序列的抗体具有(3-2)、(3-3)和(3-8)，优选除上述之外还具有(3-4)至(3-7)中的一种或多种，更优选除上述之外还具有(3-4)和/或(3-5)，进一步优选除上述之外还具有(3-4)和(3-5)，进一步优选除上述之外还具有(3-4)和(3-5)，和(3-6)和/或(3-7)，最优选(3-2)至(3-8)的全部中描述的性质，功能，活性等，但本发明的抗体基因不限于上述(a)至(e)。
本发明还提供了产生抗体或其结合片段或其修饰形式的方法，包括培养本发明抗体基因的转化细胞，和从培养物回收抗体或其结合片段，或其修饰形式的步骤，或如(4-3)中所述。通过该制备方法获得的抗体或其结合片段或其修饰形式也包括在本发明中。
5. 药物组合物
本发明提供药物组合物，其包含抗LAG-3抗体或其结合片段或其修饰形式。
本发明的药物组合物可用于治疗和/或预防由LAG-3阳性的活化T细胞(即，效应T细胞，记忆T细胞或调节性T细胞)引发或加剧的各种疾病(下文中称为“与LAG-3阳性细胞相关的疾病”)，尤其是诸如自身免疫疾病，移植物排斥，过敏性疾病，恶性肿瘤和慢性感染。
待治疗或预防的这些疾病的起始或恶化的原因的实例可包括各种遗传因素和环境因素(包括药剂，饮食，光线等)，或这些因素的组合效应。
此类自身免疫疾病的实例包括：作为***/肌肉骨骼***的自身免疫疾病的类风湿性关节炎，强直性脊柱炎，***性红斑狼疮，硬皮病，多发性肌炎，皮肌炎，包涵体肌炎和特发性炎性肌病，包括免疫介导的坏死性肌病；作为血液***的自身免疫疾病的再生障碍性贫血和特发性血小板减少性紫癜；作为消化***的自身免疫疾病的克罗恩病和溃疡性结肠炎；作为神经***的自身免疫疾病的多发性硬化症和重症肌无力；作为视觉***的自身免疫疾病的葡萄膜炎，角膜炎和干燥综合征；作为血管***的自身免疫疾病的贝切特氏病和韦格纳肉芽肿病；作为表皮***的自身免疫疾病的牛皮癣，天疱疮，史-约综合征和白癜风；作为呼吸***的自身免疫疾病的慢性阻塞性肺病和间质性肺炎；作为内分泌***的自身免疫疾病的1型糖尿病，自身免疫性甲状腺炎，格雷夫斯病和桥本氏甲状腺炎，以及其他自身免疫疾病，如自身免疫性肝炎和免疫疾病引起的肾炎，优选在疾病部位和/或淋巴组织中存在LAG-3阳性细胞的此类疾病。
移植物排斥的实例可包括在诸如心脏、肾脏、肝脏、骨髓及其皮肤或组织的器官移植中的排斥和宿主抗移植物反应，以及通过移植骨髓，外周血和脐带血等中的造血细胞引起的移植物抗宿主疾病，优选地，在与排斥相关的位点和/或淋巴组织中存在LAG-3阳性细胞的这些反应，症状和疾病。
过敏性疾病的实例可包括特应性皮炎，哮喘，过敏反应，过敏样反应，食物过敏，鼻炎，中耳炎，药物反应，昆虫刺痛反应，植物反应，乳胶过敏，结膜炎，荨麻疹和接触性皮炎，优选地，在疾病部位和/或淋巴组织中存在LAG-3阳性细胞的此类疾病。
恶性肿瘤的实例可包括乳腺癌，肺癌，皮肤癌(包括黑素瘤)，白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤，骨髓增生异常综合征，神经胶质瘤，肝癌，结肠直肠癌，胃癌，胰腺癌，肾癌，***癌，头颈癌，***，子宫内膜癌，卵巢癌，骨肉瘤，软组织肉瘤和胃肠道间质瘤，优选地，具有LAG-3阳性细胞存在的此类癌症和此类恶性肿瘤。
慢性感染的实例可包括细菌，病毒，真菌和其他微生物的感染，优选具有LAG-3阳性细胞存在的此类疾病。
在本发明中，疾病的治疗或预防包括但不限于预防疾病的发作，优选表达LAG-3蛋白的个体的疾病，阻止或抑制其恶化或进展，减轻受该疾病影响的个体表现出的一种或两种或多种症状，抑制或缓解其恶化或进展，治疗或预防继发疾病等。
本发明的药物组合物可包含治疗或预防有效量的抗LAG-3抗体或抗体的结合片段，和药学上可接受的稀释剂，媒介物(载体)，增溶剂，乳化剂，防腐剂和/或添加剂。
“治疗或预防有效量”是指借助于特定剂型和给药途径对特定疾病发挥治疗或预防作用的量，并且具有与“药理学有效量”相同的含义。
本发明的药物组合物可包含用于改变，维持或保持组合物或其中包含的抗体的pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、无菌性、或稳定性、溶解性、持续释放、吸收性、渗透性、剂型、强度、性质、形状等的材料(下文中称为“药物材料”)。药物材料没有特别限制，只要所述材料是药理学上可接受的。例如，无毒性或低毒性是这些药物材料优选具有的性质。
药物材料的实例可包括但不限于氨基酸、例如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；抗菌剂、抗氧化剂如抗坏血酸、硫酸钠或亚硫酸氢钠；缓冲剂、例如磷酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐缓冲剂、碳酸氢钠和三盐酸(Tris-HCl)溶液；填充剂、例如甘露醇和甘氨酸；螯合剂、例如乙二胺四乙酸(EDTA)；络合剂、例如咖啡因、聚乙烯吡咯烷、β-环糊精和羟丙基-β-环糊精；增量剂、例如葡萄糖、甘露糖、或糊精、单糖、二糖、其他碳水化合物、如葡萄糖、甘露糖和糊精；着色剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、防腐剂如亲水聚合物、如聚乙烯吡咯烷、低分子量多肽、成盐抗衡离子、苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢；溶剂、例如甘油、丙二醇、聚乙二醇、糖醇、例如甘露醇或山梨糖醇、悬浮剂、表面活性剂如PEG、脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯、例如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80、氚核、氨丁三醇、卵磷脂或胆固醇；稳定性增强剂、如蔗糖和山梨糖醇；弹性增强剂如氯化钠、氯化钾、甘露醇和山梨糖醇；转运剂、稀释剂、赋形剂和/或药物添加剂。
这些药物材料的添加量是抗LAG-3抗体或其结合片段或其修饰形式的重量的0.001至1000倍，优选0.01至100倍，更优选0.1至10倍。
免疫脂质体也包括在本发明的药物组合物中，其包含包封在脂质体中的抗LAG-3抗体或其结合片段，或抗体或结合片段的修饰形式，或包含与脂质体缀合的抗体的修饰抗体(美国专利号6214388等)。
赋形剂或媒介物(载体)通常是液体或固体，并且没有特别限制，只要它们是用于口服或肠胃外施用的材料，例如可注射的水，盐水，人造脑脊髓液等。盐水的实例可包括中性盐水和含血清白蛋白的盐水。
缓冲剂的实例可包括Tris缓冲液，其经调节以使药物组合物的最终pH值达到7.0至8.5；乙酸盐缓冲液，其经调节以使其最终pH值达到4.0至5.5；柠檬酸盐缓冲液；其经调节以使其最终pH值达到5.0至8.0，和组氨酸缓冲液，其经调节以使其最终pH达到5.0至8.0。
本发明的药物组合物是固体、液体、悬浮液等。本发明的药物组合物的另一个实例可包括冷冻干燥的制剂。可以使用赋形剂如蔗糖形成冷冻干燥的制剂。
本发明的药物组合物的施用途径可以是肠内施用、局部施用和肠胃外施用中的任一种。其实例可包括静脉内施用、动脉内施用、肌内施用、皮内施用、皮下施用、腹膜内施用、透皮施用、骨内施用、关节内施用等。
药物组合物的组成可以根据施用方法，抗体对LAG-3蛋白的结合亲和力等来确定。本发明的抗LAG-3抗体或其结合片段，或对于LAG-3蛋白其具有更高亲和力(更低KD值)的修饰形式，可以以较低剂量发挥其功效。
本发明的抗LAG-3抗体的剂量不受限制，只要所述剂量是药理学有效的量。剂量可根据个体的物种、疾病类型、症状、性别、年龄、既往病症、抗体对LAG-3蛋白的结合亲和力或其生物学活性以及其他因素适当确定。通常0.01至1000mg/kg，优选0.1至100mg/kg的剂量可以每天至每180天施用一次，或每天施用两次或三次或更多次。
药物组合物形式的实例可包括注射剂(包括冷冻干燥制剂和滴剂)、栓剂、经鼻吸收制剂、透皮吸收制剂、舌下制剂、胶囊、片剂、软膏、颗粒剂、气雾剂、丸剂、粉剂、混悬剂、乳液、滴眼液和生物植入物制剂。
包含抗LAG-3抗体或其结合片段或其修饰形式作为活性成分的药物组合物可以与其他药物同时或分开施用。例如，包含抗LAG-3抗体或其结合片段作为活性成分的药物组合物可以在施用其他药物后施用，或者其他药物可以在施用药物组合物后施用。或者，药物组合物和其他药物可以同时施用。
与本发明的药物组合物组合使用的其他药物的实例可包括抗叶酸剂、钙依赖磷酸酶抑制剂、皮质类固醇、抗胸腺细胞球蛋白、核酸抗代谢物、核酸合成抑制剂、靶向细胞表面抗原的生物制剂和靶向细胞因子或细胞因子受体的生物制剂，并且这些优选用于治疗或预防自身免疫疾病和/或移植物排斥。其他药物的实例可包括作为抗叶酸剂的甲氨蝶呤，作为钙依赖磷酸酶抑制剂的环孢菌素和他克莫司，作为皮质类固醇的甲基强的松龙和***龙，作为核酸合成抑制剂的环磷酰胺和硫唑嘌呤，作为抗胸腺细胞球蛋白的霉菌素，淋巴球蛋白和胸腺球蛋白，作为核酸抗代谢物的霉酚酸酯，作为靶向细胞表面抗原的生物制剂的阿仑单抗，利妥昔单抗，阿巴西普和地诺单抗，作为靶向细胞因子或细胞因子受体的生物制剂的阿达木单抗、英夫利昔单抗、依那西普和托珠单抗。此外，本发明的药物组合物还可以与静脉内免疫球蛋白(IVIg)，血浆置换等组合，用于治疗或预防自身免疫疾病和/或移植物排斥。在治疗或预防除自身免疫疾病和移植物排斥之外的疾病中，也可以将这些其他药物和疗法与本发明的药物组合物组合。
可以与本发明的药物组合物组合用于治疗或预防恶性肿瘤的药物和疗法的实例可以包括抗癌剂，例如各种分子靶向药物、化学治疗剂、放射疗法和以抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和抗CTLA-4抗体为代表的各种癌症免疫治疗剂。
可以施用或接受这些其他药物和疗法中的一种或两种，三种或更多种。这些统称为“其他药物的组合使用”或“与其他药物的组合”。作为“其他药物的组合使用”或“与其他药物的组合”的方面，本发明还包括本发明的药物组合物，其除了本发明的抗体或其结合片段或其修饰形式之外，还包含这种其他药物或与另一种疗法组合使用。
本发明还提供了治疗或预防与LAG-3阳性细胞相关的疾病(如自身免疫疾病)的方法，本发明的抗体在制备用于治疗或预防疾病的药物组合物中的用途，以及本发明抗体的用途用于治疗或预防疾病的用途。本发明还包括用于治疗或预防的试剂盒，其包含本发明的抗体。
6. 试剂
本发明的抗体或其结合片段或其修饰形式也可用作试剂。如上所述，这种试剂用于如上文提及的测试或诊断，用于研究和用于任何其他用途。
实施例
在下文中，将参照实施例进一步描述本发明。然而，本发明并不限于此。
关于以下实施例中的基因操作的程序根据"Molecular Cloning" (Sambrook,J., Fritsch, E.F.和Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的方法，或本领域技术人员使用的其他实验手册中描述的方法，或根据市售产品的说明手册使用可商购的试剂或试剂盒来进行，除非另有说明。
实施例1：大鼠抗人LAG-3抗体的制备
1)-1 免疫
使用EndoFree Plasmid Giga Kit (Qiagen N.V.)，将从人LAG-3的四个细胞外免疫球蛋白样结构域中的N末端缺失第1和第2结构域(位置23至262的区域)的突变体(SEQ ID NO:86：图101)克隆到pcDNA3.1 (Life Technologies Corp.)中，以制备大量的表达质粒pcDNA3.1-hLAG-3_D3D4。在用透明质酸酶(Sigma-Aldrich)预处理雌性WKY/Izm大鼠(JapanSLC, Inc.)的两个下肢后，将pcDNA3.1-hLAG-3_D3D4肌内注射至相同位点。随后，使用ECM830 (BTX Global Logistics)，使用双针电极对相同位点进行体内电穿孔。两周一次重复相同的体内电穿孔，总共3或5次，且然后收集大鼠的***以用于杂交瘤的开发。
1)-2 杂交瘤制备
使用Hybrimune杂交瘤产生***(Cyto Pulse Sciences, Inc.制造)，将***细胞或脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0-ag14细胞电融合。用ClonaCell-HY选择培养基D (StemCellTechnologies Inc.制造)稀释融合细胞并培养。回收出现的杂交瘤集落以制备单克隆杂交瘤。将回收的每一杂交瘤集落培养，并将所获的杂交瘤培养上清液用于筛选产生抗人LAG-3抗体的杂交瘤。
1)-3 通过细胞-ELISA的抗体筛选
使用Lipofectamine 2000 (Life Technologies Corp.制造)，将通过将人或食蟹猴LAG-3克隆到pcDNA3.1或对照质粒中构建的表达质粒(pcDNA3.1/hLAG-3和pcDNA3.1/cynoLAG-3)导入HEK293细胞中，并且在37℃和5％CO2的条件下，在含有10％FBS的DMEM培养基中，将细胞在96孔微孔板(Corning Inc.制造)中培养过夜。除去培养上清液后，添加各杂交瘤培养上清液，将平板在4℃静置1小时。将孔中的细胞用含有5% FBS的PBS洗涤一次。随后，向其添加用含有5% FBS的PBS稀释500倍的兔中产生的抗大鼠IgG-过氧化物酶抗体(Sigma-Aldrich Corp.制造)，并将平板在4℃静置1小时。将孔中的细胞用含有5% FBS的PBS洗涤5次。随后，以25 μL/孔向其添加分别以0.4 mg/mL和0.6% (v/v)的浓度溶解在OPD溶剂(0.05 M柠檬酸三钠和0.1 M磷酸氢二钠十二水合物，pH 4.5))中的OPD显色溶液(将邻苯二胺二盐酸盐(Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.制造)和H2O2。通过偶尔搅拌进行显色反应，并通过添加25μL/孔的1M HCl终止。随后，使用酶标仪(ENVISION；PerkinElmer, Inc.)测量490 nm处的吸光度。为了选择产生特异性结合表达于细胞膜表面上的LAG-3的抗体的杂交瘤，选择相比于不含LAG-3基因的对照质粒转染的HEK293细胞，对于LAG-3表达载体转染的HEK293细胞产生更高吸光度的培养上清液的杂交瘤作为产生抗LAG-3抗体阳性杂交瘤。
1)-4 通过流式细胞术的抗体筛选
通过流式细胞术进一步证实，通过实施例1)-3中的细胞-ELISA确定为阳性的杂交瘤产生的抗体结合PHA (植物血凝素)活化的人T细胞(PHA母细胞)，更多表达LAG-3的生理细胞。向用2μg/mL PHA (Sigma-Aldrich制造)刺激3天的人PBMC，添加杂交瘤培养上清液进行悬浮，然后在4℃下反应30分钟。用FACS缓冲液(PBS，0.1％BSA和0.1％叠氮化钠)洗涤后，向其添加用FACS缓冲液(包含LIVE/DEAD可固定死细胞染色试剂盒 - 近红外荧光反应性染料(Invitrogen Corp.制造))稀释200倍的二抗(例如抗大鼠IgG PE缀合物(JacksonImmunoResearch Laboratories, Inc.制造)进行悬浮，然后于4℃静置30分钟。用FACS缓冲液洗涤后，将细胞重悬于含有1至2％多聚甲醛的PBS中，然后使用流式细胞仪(CantoII:Becton, Dickinson and Company制造，或FC500: Beckman Coulter Inc制造)检测。使用Flowjo (Tree Star Inc制造)分析数据。通过门控去除LIVE/DEAD可固定死细胞染色试剂盒 - 近红外荧光反应性染料阳性死细胞后，绘制活细胞荧光强度的直方图。
1)-5通过ADCC测定筛选
1)-5-1靶细胞的制备
根据所附方案，用pLenti6/V5-GW/lacZ和ViraPower TM Packaging Mix (InvitrogenCorp.)转染293FT细胞(Invitrogen Corp.)，以制备表达β-半乳糖苷酶基因的重组慢病毒。根据ViraPower 慢病毒表达***(Invitrogen Corp.)的方案，用获得的重组慢病毒感染293T细胞。使用10μ g/mL杀稻瘟菌素(Invitrogen Corp.)选择病毒感染的细胞，获得稳定表达β-半乳糖苷酶的品系。使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp.制造)，将全长人LAG-3的表达质粒引入稳定表达β-半乳糖苷酶的293T细胞(下文称为293T-lacZ)中，并将细胞培养1天，且然后使用TrypLExpress (Invitrogen Corp制造)解离和回收。用含有5％FBS的无酚红RPMI1640(下文称为“ADCC培养基”)洗涤细胞两次。通过台盼蓝染料排除测试计数活细胞数。将细胞在ADCC培养基中重悬至1×105个细胞/ml，并用作靶细胞。
1)-5-2效应细胞的制备
通过Ficoll离心从人外周血分离PBMC，并将在ADCC培养基中调节至活细胞密度为1.2×106个细胞/mL的悬浮液使用作为效应细胞。
1)-5-3 ADCC测定
向含有50μL/孔的杂交瘤培养上清液的96孔U型底微孔板添加的50μL/孔的1)-5-1的靶细胞，然后在4℃静置30分钟。在向其添加150μL/孔的用于ADCC培养基后，然后搅拌，将板在室温下以1200rpm离心5分钟以除去200μL/孔的上清液。然后，向其添加125μL/孔的1)-5-2的效应细胞，然后在室温下以1200rpm离心5分钟。此后，将细胞在37℃和5％CO2条件下培养过夜。次日，将50μL上清液回收到黑色平板(Corning Inc制造)中。向其添加50μL的β-Glo测定***(Promega Corp.制造)溶液。使用酶标仪(ENVISION; PerkinElmer, Inc制造)测量发光强度。根据以下公式计算通过ADCC活性裂解细胞百分比。
裂解细胞百分比(％)=(A - B)/(C - B)×100
A: 每个样本孔的计数
B: 平均自发释放(抗体未添加孔)计数(n = 3)。
添加抗体时，向其中添加50μL的ADCC培养基。除此之外，进行与样品孔相同的操作。
C: 平均最大释放(含有用表面活性剂裂解的靶细胞的孔)计数(n = 3)
添加抗体并添加效应细胞时，分别向其中添加50μL和75μL的ADCC培养基。对于测定，向含有靶细胞的每个孔中添加175μL的β-Glo测定***溶液，并与其混合。将其100μ的等分试样添加黑色平板中进行测定。
1)-6通过LAG-3/II型MHC结合测试筛选
根据先前的报告(非专利文献8)进行。也即，将用含有10％FBS的RPMI1640稀释至25nM的LAG-3-Fc (由R＆D Systems, Inc.制造)以20μL/孔添加到96孔U型底微孔板中，并向其添加20μL/孔的杂交瘤培养上清液，然后搅拌并在4℃静置20分钟。然后，以10μL/孔(2.5×105个细胞/孔)向其添加的内源性高表达II型MHC分子的Raji细胞，然后搅拌并于4℃再静置30分钟。用PBS或FACS缓冲液洗涤细胞两次，然后向其添加用FACS缓冲液稀释200倍的抗人IgG PE缀合物(由Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.制造)进行悬浮，然后在4℃静置20分钟。用PBS或FACS缓冲液洗涤后，将细胞重悬于含有1至2％多聚甲醛的PBS中，然后使用流式细胞仪(CantoII: Becton, Dickinson and Company制造或FC500: BeckmanCoulter Inc制造)检测。使用FlowJo (由Tree Star Inc.制造)分析数据，并通过以下公式计算抑制百分比。
抑制百分比(％)= 100 - (A - B)/(C - B)×100
A: 每个样品孔的平均荧光强度
B: 背景的平均荧光强度
当添加LAG-3-Fc和抗体时，每次添加20μL培养基。除此之外，进行与样品孔相同的操作。
C: 最大结合的平均荧光强度
添加抗体时，向其添加20μL培养基。
1)-7单克隆抗体的纯化
从杂交瘤培养上清液中纯化大鼠抗人Orai1单克隆抗体。也即，首先将杂交瘤培养上清液应用于用PBS平衡的ProteinG柱(GE Healthcare制造)。用PBS洗涤柱后，通过用0.1M甘氨酸/盐酸水溶液(pH2.7)洗脱收集含有抗体的级分。向收集的级分中添加1M Tris-HCl(pH9.0)以调节至pH7.0至7.5，并且此后使用离心机UF过滤装置VIVASPIN20 (级分分子量UF30K，Sartorius AG制造)用PBS替换缓冲液，并将抗体浓缩至2 mg/mL或更高。最后，用Minisart-Plus过滤器(Sartorius AG制造)进行过滤，得到纯化的样品。
实施例2：大鼠抗人LAG-3抗体(rLA204、rLA212、rLA225、rLA869和rLA1264)的体外评估
2)-1获得的大鼠抗LAG-3抗体(rLA204、rLA212、rLA225、rLA869和rLA1264)与人活化T细胞的结合活性
研究了通过实施例1)-7中描述的方法纯化的大鼠抗人LAG-3抗体rLA204、rLA212、rLA225、rLA869和rLA1264与人活化T细胞的结合活性。如图1所示，所有大鼠抗人LAG-3抗体以浓度依赖性方式结合作为体外活化的人T细胞制备的PHA母细胞。
2)-2获得的大鼠抗LAG-3抗体(rLA204、rLA212、rLA225、rLA869和rLA1264)的ADCC活性
通过以下方法研究纯化的大鼠抗人LAG-3抗体rLA204、rLA212、rLA225、rLA869和rLA1264的ADCC活性。向含有50μL/孔的抗体溶液的96孔U型底微孔板添加50μL/孔的实施例1)-5-1的靶细胞(下文称为293T-lacZ/hLAG-3细胞)，然后于4℃静置30分钟。然后，向其添加75μL/孔的如实施例1)-5-2中制备的效应细胞(但将其悬浮至2×106个细胞/mL)，然后在室温下以1200rpm离心5分钟，且然后将细胞在37℃和5％CO2条件下培养过夜。第二天，将50μ上清液回收到黑色平板(Corning Inc制造)中。以50μ/孔向其添加β-Glo测定***(Promega Corp.制造)的溶液。使用酶标仪(ENVISION；PerkinElmer, Inc制造)测量发光强度。根据以下公式计算通过ADCC活性裂解的细胞百分比。
裂解细胞百分比(％)=(A - B)/(C - B)×100
A: 每个样本孔的计数
B: 平均自发释放(抗体未添加孔)计数(n = 3)
添加抗体时，向其中添加50μL的ADCC培养基。除此之外，进行与样品孔相同的操作。
C: 平均最大释放(含有用表面活性剂裂解的靶细胞的孔)计数(n = 3)
添加抗体并添加效应细胞时，分别向其中添加50μL和75μL的ADCC培养基。对于测定，向含有靶细胞的每个孔中添加175μL的β-Glo测定***溶液，并与其混合。将其100μ的等分试样添加黑色平板中进行测定。
如图2所示，所有大鼠抗人LAG-3抗体对表达人LAG-3的细胞显示出浓度依赖性体外ADCC活性。相反，这些抗体对未转染人LAG-3基因的293T-lacZ细胞没有显示ADCC活性，因此该作用是特异性的。
2)-3获得的大鼠抗LAG-3抗体(rLA204、rLA212、rLA225、rLA869和rLA1264)在LAG-3/II型MHC结合测试中的抑制活性的研究
通过根据实施例1)-6的LAG-3/II型MHC结合测试研究纯化的抗LAG-3抗体(rLA204、rLA212、rLA225、rLA869和rLA1264)是否具有针对LAG-3与据报道是其配体的II型MHC分子的结合的抑制活性。如图3A所示，结果显示，所有5个抗体克隆在LAG-3/II型MHC结合测试中几乎没有抑制活性，并且对II型MHC分子的结合没有影响，这被认为是LAG-3发挥T细胞抑制功能所必需的。相反，如图3B所示，作为引用列表中的常规抗体的人嵌合抗LAG-3抗体IMP731 (专利文献1)在LAG-3/II型MHC结合测试中显示以浓度依赖性方式的强大抑制活性。
2)-4获得的大鼠抗LAG-3抗体(rLA204、rLA212、rLA225、rLA869和rLA1264)在293T-hLAG-3/Raji细胞粘附测试中的抑制活性的研究
在根据实施例2)-3的LAG-3/II型MHC结合测试中，用于检测LAG-3-Fc与Raji细胞的结合的二抗抗人IgG PE缀合物的结合可受到抗-LAG-3抗体与LAG-3-Fc结合引起的空间位阻的抑制，因此，尽管该抗体实际上并不直接抑制LAG-3/II型MHC的结合，但不能完全排除表观显示低荧光强度的可能性。因此，作为不使用二抗进行检测的评价***，构建以下293T-hLAG-3/Raji细胞粘附测试***以评价抗体。
使用Lipofectamine 2000 (Life Technologies Corp.制造)，将人LAG-3表达质粒pcDNA3.1/hLAG-3导入293T细胞中，并将细胞接种到BioCoat多聚-D-赖氨酸包被的96孔微孔板(Becton, Dickinson and Company制造)并培养过夜。同时，使用荧光染料BCECF-AM(DOJINDO LABORATORIES制造，以10μM使用)，在37℃标记培养基(包含10%FBS的RPMI1640)中的Raji细胞1小时，然后洗涤，且然后在培养基中悬浮至1.6×106个细胞/mL。转染后，除去培养过夜的细胞(293T-hLAG-3细胞)的培养基，并向其添加50μL/孔的培养基和25μL/孔的抗体溶液，然后在37℃预温育30分钟。此后，向其添加25μL/孔的BCECF-AM标记的Raji细胞，然后以900rpm离心30秒并在37℃温育1小时。反应后，将孔用培养基洗涤两次至三次以除去未粘附的细胞，并将细胞在100μl/孔的含有0.1％NP-40的Tris缓冲液(25mM，pH8.0)中裂解，以使用酶标仪(ENVISION: PerkinElmer Inc制造)测量孔的荧光强度。通过以下公式计算抑制百分比。
抑制百分比(％)= 100 - (A - B)/(C - B)×100
A: 每个样品孔的荧光强度
B: 背景的荧光强度
当添加Raji细胞和抗体时，向其添加培养基。除此之外，进行与样品孔相同的操作。
C: 最大结合的荧光强度
添加抗体时，向其添加培养基。
如图4所示，结果显示所有纯化的大鼠抗LAG-3抗体rLA204、rLA212、rLA225、rLA869和rLA1264在293T-hLAG-3/Raji细胞粘附测试中显示几乎没有抑制活性，进一步支持以下观点，即抗体对II型MHC分子的结合没有影响，这被认为是LAG-3发挥T细胞抑制功能所必需的。相反，作为引用列表中的常规抗体的人嵌合抗LAG-3抗体IMP731 (专利文献1)在该测试中显示出强大的抑制活性，在10μg/mL浓度下的抑制百分比为90％。
2)-5获得的大鼠抗LAG-3抗体(rLA204、rLA212、rLA225、rLA869和rLA1264)的表位的鉴定
基于大鼠抗LAG-3抗体rLA204、rLA212、rLA225、rLA869和rLA1264是使用从存在于LAG-3细胞外区域的四个免疫球蛋白样结构域中的N末端缺失第1和第2结构域(下文将分别称为结构域1和2)的突变体作为免疫原开发的抗体的事实，为了揭示这些抗体结合从N末端开始剩余的第3和第4结构域(下文中将分别称为结构域3和4)中的哪一个，通过流式细胞术研究所获得的大鼠抗LAG-3抗体与表达结构域3和4或仅结构域4的细胞的结合。
使用Lipofectamine 2000 (Life Technologies Corp.制造)，将在人LAG-3的结构域3 和之前(263-525)或结构域4和之前 (353-525)具有添加到N末端的FLAG标签序列(DYKDDDD)的每个表达质粒(克隆到pcDNA3.1中)引入至HEK293T细胞中，将细胞培养1天且随后回收，以根据实施例1)-4中记载的方法，通过流式细胞仪研究抗体的结合活性。结果，所有纯化的大鼠抗LAG-3抗体rLA204、rLA212和rLA225与表达含有结构域3和4的构建体的细胞结合，而它们都不结合表达仅含有结构域4的构建体的细胞，如图5A所示。这些结果显示，所有获得的大鼠抗LAG-3抗体rLA204、rLA212和rLA225都与存在于LAG-3细胞外区域的四个免疫球蛋白样结构域中的结构域3结合。
使用杂交瘤培养上清液的相同类型的实验显示，获得的大鼠抗LAG-3抗体rLA869和rLA1264也与结构域3结合。
图5B显示通过相同方法研究作为引用列表中的常规抗体的人嵌合抗人LAG-3抗体IMP731的结合结构域的结果。除了图5A中的两种类型的构建体之外，在人LAG-3的结构域2(SEQ ID NO: 86，图101中的人LAG-3氨基酸序列的氨基酸位置173-525)之后具有添加到N末端的FLAG标签序列(DYKDDDDK)和人LAG-3的全长的表达质粒(均使用pcDNA3.1构建；编码人LAG-3的氨基酸序列的核苷酸序列描述在SEQ ID NO: 85，图100)。IMP731和实施例2)-6中开发的大鼠抗人LAG-3抗体克隆6D7与表达人LAG-3全长的细胞结合但不结合结构域1缺失的突变体(FLAG-D2D3D4，FLAG-D3D4，和FLAG-D4)，从而揭示它们与结构域1结合。也就是说，它揭示了与存在于LAG-3细胞外区域的四个免疫球蛋白样结构域中的结构域3结合的所得大鼠抗LAG-3抗体rLA204、rLA212、rLA225、rLA869和rLA1264识别的表位与结合域1的IMP731不同。
2)-6使用纯化的LAG-3蛋白作为免疫原获得大鼠抗人LAG-3抗体
作为除实施例1)-1的可选免疫方法，使用纯化的LAG-3蛋白作为免疫原获得大鼠抗人LAG-3抗体。将通过(以1:2体积比)混合具有添加到人LAG-3的细胞外区域(1-450)的C末端的His标签的蛋白与弗氏完全佐剂(Wako Pure Chemical Industries，LTD.制造)而形成的乳液以200μg/小鼠的量施用于8周龄雌性WKY/Izm大鼠(Japan SLC, Inc.)的尾基部。三周后，仅将抗原蛋白以200μg/小鼠的量施用于尾基部，并且进一步两周后，收集***以通过实施例1)-2的方法产生杂交瘤。通过实施例1)-3和1)-4等的方法筛选，并通过实施例2)-5的方法分析获得的单克隆抗体表位，揭示了在存在于LAG-3的细胞外区域中的四个免疫球蛋白样结构域中，58％的评估克隆结合结构域1，且其26％结合结构域2，因此优先获得针对靠近N末端部分的单克隆抗体。其中，在流式细胞仪中与人活化T细胞(PHA母细胞)强烈结合的大多数克隆，包括克隆6D7，与LAG-3的结构域1结合，并且它们都在实施例2)-3描述的LAG-3/II型MHC结合测试中显示出强烈的抑制活性。这些结果与常规发现(非专利文献4)非常一致，即LAG-3的四个细胞外免疫球蛋白样结构域中N末端的结构域1和2对于LAG-3与II型MHC的结合是重要的，并且表明，为了获得不抑制LAG-3与II型MHC分子结合的抗体，即LAG-3的T细胞抑制功能，有必要通过设计例如实施例1)-1中的免疫方法开开发单克隆抗体。
实施例3：编码大鼠抗人LAG-3抗体(rLA204、rLA212、rLA225、rLA869和rLA1264)可变区的cDNA的核苷酸序列的测定
3)-1 编码rLA204可变区的cDNA的核苷酸序列的确定
3)-1-1从产生rLA204的杂交瘤制备总RNA
为了扩增包含rLA204可变区的cDNA，使用TRIzol试剂(Ambion/Thermo FisherScientific Inc.)从产生rLA204的杂交瘤制备总RNA。
3)-1-2 cDNA的合成(5'-RACE-Ready cDNA)
使用约1μg的实施例3)-1-1中制备的总RNA和SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech Laboratories, Inc)合成cDNA (5'-RACE-Ready cDNA)。
3)-1-3 编码rLA204的重链可变区的cDNA的5'-RACE PCR扩增和测序
用于rLA204的重链基因的可变区编码cDNA的PCR扩增的引物是具有UPM (通用引物A混合物；附于SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒)和5'-CTCCAGAGTTCCAGGTCACGGTGACTGGC-3'(RG2AR3: SEQ ID NO: 71)的序列的寡核苷酸。使用的UPM附于SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)，而RG2AR3则由数据库中的大鼠重链恒定区的序列设计。
使用该引物组和实施例3)-1-2中合成的cDNA (5'-RACE-Ready cDNA)作为模板，通过5'-RACE PCR扩增包含rLA204的重链可变区的cDNA。根据SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)的手册，使用聚合酶KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.)，在Touchdown PCR程序上进行该PCR。
使用MinElute PCR纯化试剂盒(Qiagen N.V.)纯化通过5'-RACE PCR扩增的包含重链可变区的cDNA，并且然后使用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(Invitrogen Corp.)克隆。通过测序分析克隆的包含重链可变区的cDNA。
使用的测序引物是具有由数据库中的大鼠重链恒定区的序列设计的序列5'-CTCCAGAGTTCCAGGTCACGGTGACTGGC-3' (RG2AR3；SEQ ID NO: 71)，和NUP (嵌套通用引物A：附于SMART RACE cDNA扩增试剂盒)的寡核苷酸。
编码rLA204的重链可变区的cDNA的确定的核苷酸序列显示在SEQ ID NO: 1中，并且其氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 2中。
3)-1-4 编码rLA204的轻链可变区的cDNA的5'-RACE PCR扩增和测序
用于rLA204的轻链基因的可变区编码cDNA的PCR扩增的引物是具有UPM (通用引物A混合物；附于SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒)和具有5'-TCAGTAACACTGTCCAGGACACCATCTC-3'(RKR5: SEQ ID NO: 72)的序列的寡核苷酸。使用的UPM附于SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)，而RKR5则由数据库中的大鼠轻链恒定区的序列设计。
使用该引物组和实施例3)-1-2中合成的cDNA (5'-RACE-Ready cDNA)作为模板，通过5'-RACE PCR扩增包含rLA204的轻链可变区的cDNA。根据SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)的手册，使用聚合酶KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.)，在Touchdown PCR程序上进行该PCR。
使用MinElute PCR纯化试剂盒(Qiagen N.V.)纯化通过5'-RACE PCR扩增的包含轻链可变区的cDNA，并且然后使用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(Invitrogen Corp.)克隆。通过测序分析克隆的编码轻链可变区的cDNA。
使用的测序引物是具有由数据库中的大鼠轻链恒定区的序列设计的序列5'-TCAGTAACACTGTCCAGGACACCATCTC-3' (RKR5；SEQ ID NO: 72)和NUP (嵌套通用引物A：附于SMART RACE cDNA扩增试剂盒)的寡核苷酸。
编码rLA204的轻链可变区的cDNA的确定的核苷酸序列显示在SEQ ID NO: 3中，并且其氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 4中。
3)-2 编码rLA212可变区的cDNA的核苷酸序列的确定
以与实施例3)-1中相同的方式测定序列。
编码rLA212的重链可变区的cDNA的确定的核苷酸序列显示在SEQ ID NO: 5中，并且其氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 6中。编码其轻链可变区的cDNA的核苷酸序列显示在SEQ ID NO: 7中，并且其氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 8中。
3)-3 编码rLA225可变区的cDNA的核苷酸序列的确定
以与实施例3)-1中相同的方式测定序列。
编码rLA225的重链可变区的cDNA的确定的核苷酸序列显示在SEQ ID NO: 9中，并且其氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 10中。编码其轻链可变区的cDNA的核苷酸序列显示在SEQ ID NO: 11中，并且其氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 12中。
3)-4 编码rLA869可变区的cDNA的核苷酸序列的确定
以与实施例3)-1中相同的方式测定序列。
编码rLA869的重链可变区的cDNA的确定的核苷酸序列显示在SEQ ID NO: 13中，并且其氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 14中。编码其轻链可变区的cDNA的核苷酸序列显示在SEQ ID NO: 15中，并且其氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 16中。
3)-5 编码rLA1264可变区的cDNA的核苷酸序列的确定
以与实施例3)-1中相同的方式测定序列。
编码rLA1264的重链可变区的cDNA的确定的核苷酸序列显示在SEQ ID NO: 17中，并且其氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 18中。编码其轻链可变区的cDNA的核苷酸序列显示在SEQ ID NO: 19中，并且其氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 20中。
实施例4：人嵌合抗人LAG-3抗体(cLA212)的开发
4)-1 构建嵌合和人源化抗体轻链表达载体pCMA-LK
用限制酶XbaI和PmeI消化质粒pcDNA3.3-TOPO/LacZ (Invitrogen Corp.)。使用In-Fusion Advantage PCR克隆试剂盒(Clontech Laboratories，Inc.)，将得到的约5.4kb的片段与包含SEQ ID NO: 21所示的DNA序列且编码人轻链分泌信号和人κ链恒定区的DNA片段连接，以制备pcDNA3.3/LK。
使用如下所示的引物组，以pcDNA3.3/LK作为模板进行PCR。将获得的约3.8kb的片段磷酸化，且然后自连接以构建嵌合和人源化抗体轻链表达载体pCMA-LK，其具有在CMV启动子下游的信号序列，克隆位点和人轻链恒定区。
引物组
5'-TATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGC-3' (3.3-F1: SEQ ID NO: 73)
5'-GCTATGGCAGGGCCTGCCGCCCCGACGTTG-3' (3.3-R1: SEQ ID NO: 74)。
4)-2 构建嵌合和人源化抗体IgG1型重链表达载体pCMA-G1
使用Fusion Advantage PCR克隆试剂盒(Clontech Laboratories，Inc.)，将获得的DNA片段(通过用XbaI和PmeI消化pCMA-LK而除去轻链分泌信号和人κ链恒定区)与包含SEQID NO: 22中所示且编码人重链信号序列和人IgG1恒定区的氨基酸的DNA序列的DNA片段结合，以构建嵌合和人源化抗体IgG1型重链表达载体pCMA-G1，其具有在CMV启动子下游的信号序列，克隆位点和人IgG1重链恒定区。
4)-3 cLA212重链表达载体的构建
使用实施例3)-2中获得的且包含rLA212的重链可变区的cDNA作为模板，用KOD-Plus-(Toyobo Co., LTD.)和下面所示的引物组扩增包含编码重链可变区的cDNA的DNA片段，并使用In-Fusion HD克隆试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)，将扩增的DNA片段***嵌合和人源化IgG1型重链表达载体pCMA-G1的限制酶BlpI的切割位点，以构建cLA212重链表达载体。所获得的表达载体命名为“pCMA-G1/cLA212”。cLA212重链的核苷酸序列如SEQ IDNO: 23所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 24所示。
用于cLA212重链的引物组
5'-CCAGATGGGTGCTGAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGG-3' (212H-F；SEQ ID NO:75)
5'-CTTGGTGGAGGCTGAGCTGACTGTGACCATGACTCCTTGGCCCCAG-3' (212H-R；SEQ ID NO:76)。
4)-4 hLA212轻链表达载体的构建
使用实施例3)-2中获得的且包含rLA212的轻链可变区的cDNA作为模板，用KOD-Plus-(Toyobo Co., LTD.)和下面所示的引物组扩增包含编码轻链可变区的cDNA的DNA片段，并使用In-Fusion HD克隆试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)，将扩增的DNA片段***嵌合和人源化轻链表达通用载体pCMA-LK的限制酶BsiWI的切割位点，以构建cLA212轻链表达载体。所获得的表达载体命名为“pCMA-LK/cLA212”。cLA212轻链的核苷酸序列如SEQ IDNO: 25所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 26所示。
用于cLA212轻链的引物组
5'-ATCTCCGGCGCGTACGGCAACATTGTGATGACCCAGTCTCCCAAATCC-3' (212L-F；SEQ ID NO:77)
5'-GGAGGGGGCGGCCACAGCCCGTTTCAGTTCCAGCTCGGTCCCAGC-3' (212L-R；SEQ ID NO:78)。
4)-5 cLA212的产生
根据手册，继代培养和培养FreeStyle 293F细胞(Life Technologies Corp.)。将对数生长期的1.2×109个的FreeStyle 293F细胞(Invitrogen Corp.)接种于3-L FernbachErlenmeyer烧瓶(Corning Inc.)，通过用FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen Corp.)稀释，调整至2.0×106个细胞/ml，且然后在8％CO2培养箱中，在37℃下以90rpm振荡培养1小时。将1.8mg聚乙烯亚胺(Polysciences＃24765)溶于20ml Opti-Pro SFM培养基(Invitrogen Corp.)中。随后，将使用NucleoBond Xtra (Takara Bio Inc.)制备的每种H链表达载体(0.24mg)和每种L链表达载体(0.36mg)添加20ml Opti-Pro SFM培养基(Invitrogen Corp.)中。将20ml表达载体/Opti-Pro SFM混合溶液添加到20ml聚乙烯亚胺/Opti-Pro SFM混合溶液中，并轻轻搅拌混合物，静置5分钟，且然后添加到FreeStyle 293F细胞。将细胞在8％CO2培养箱中，在37℃下以90rpm振荡培养4小时。然后，向其添加600mlEX-CELL VPRO培养基(SAFC Biosciences)，18ml GlutaMAX I (GIBCO/Thermo FisherScientific Inc.)和30ml Yeastolate Ultrafiltrate (GIBCO/Thermo FisherScientific Inc.)。将细胞在8％CO2培养箱中，在37℃下以90rpm振荡培养7天，并通过一次性胶囊过滤器(Advantec＃CCS-045-E1H)过滤所得培养上清液。
通过pCMA-G1/cLA212和pCMA-LK/cLA212的组合获得的rLA212人嵌合抗体命名为“cLA212”。
4)-6 cLA212的纯化
通过rProtein A亲和层析(在4-6℃)，从实施例4)-5中获得的培养上清液中纯化抗体。rProtein A亲和层析纯化后的缓冲液置换步骤在4-6℃下进行。首先，将培养上清液应用于用PBS平衡的填充有MabSelectSuRe (由GE Healthcare制造)的柱。在所有培养溶液进入柱后，使用柱体积至少两倍量的PBS洗涤柱。随后，通过用2 M的精氨酸盐酸盐水溶液(pH 4.0)洗脱，收集含抗体的级分。通过透析(Thermo Fisher Scientific Inc., Slide-A-LyzerDialysis Cassette)，用HBSor (25mM组氨酸和5％山梨糖醇，pH 6.0)对级分进行缓冲液置换。最后，将级分浓缩并使用离心机UF过滤装置VIVASPIN20 (分子量截止值：UF10K，Sartorius AG，4℃)，将IgG浓度调节至25mg/ml或更高，并用作纯化的样品。最后，用Minisart-Plus过滤器(Sartorius AG)进行过滤，得到纯化的样品。
4)-7 人嵌合抗LAG-3抗体(cLA212)的抗原结合活性
使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp.制造)，将人LAG-3的表达质粒pcDNA3.1-hLAG-3引入293T-lacZ细胞(描述于实施例1)-5-1))，并将细胞培养1天，且此后用于流式细胞术。根据实施例1)-4中描述的方法进行流式细胞术，除了使用用FACS缓冲液稀释200倍的抗人IgG PE缀合物(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.制造)作为二抗。如图6所示，显示了人嵌合抗LAG-3抗体cLA212以浓度依赖性方式与表达人LAG-3的293T-lacZ细胞结合，并且因此在嵌合化后也保持结合活性。
实施例5：大鼠抗人LAG-3抗体(rLA212)的人源化形式(hLA212)的设计
5)-1 人源化大鼠抗人LAG-3抗体rLA212的设计
5)-1-1 rLA212可变区的分子建模
rLA212可变区的分子建模通过已知为同源性建模的方法来进行(Methods inEnzymology, 203, 121-153, (1991))。将实施例3)-2中测定的rLA212可变区与ProteinData Bank中登记的人免疫球蛋白可变区的一级序列(源自X射线晶体结构的三维结构是获得的)进行比较(Nuc.Acid Res.35, D301-D303 (2007))。结果，选择2GHW和2ARJ作为与rLA212的重链和轻链可变区具有最高序列同源性。通过组合对应于rLA212的轻链和重链的2GHW和2ARJ的坐标，通过获得“框架模型”来开发框架区的三维结构。随后，将CDR的典型构象并入框架模型中。最后，进行能量计算用于排除不利的原子间接触，以在能量方面获得rLA212可变区的可能的分子模型。使用市售的蛋白质三维结构分析程序Discovery Studio(Accelrys, Inc制造)进行这些程序。
5)-1-2人源化抗人LAG-3抗体hLA212的氨基酸序列的设计
人源化抗人LAG-3抗体hLA212通过通常已知为CDR移植的方法来构建(Proc. Natl.Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989))。基于框架区中氨基酸的同源性选择受体抗体。
将rLA212的框架区的序列与人类亚组和KABAT等中定义的种系序列的共有序列的框架区进行比较(Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。结果，因为在框架区具有高序列同一性，所以分别选择重链的人γ链亚组3的共有序列和轻链的人κ链亚组1的共有序列作为受体。将受体框架区中的氨基酸残基与rLA212的氨基酸残基比对，以鉴定使用不同氨基酸的位置。使用实施例5)-1-1中构建的rLA212的三维模型来分析这些残基的位置。随后，根据Queen等人提供的标准选择待嫁接至受体上的供体残基(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989))。将由此选择的一些供体残基转移至受体抗体以构建人源化hLA212序列，如以下实施例中所述。
5)-2 rLA212重链的人源化
5)-2-1 人源化的hLA212_H2型重链
将人源化的hLA212重链命名为“人源化hLA212_H2型重链”(其也可称为“hLA212_H2”),其通过以下设计：在SEQ ID NO: 24中所示的嵌合cLA212的重链可变区中，用甘氨酸替换氨基酸位置16上的精氨酸，用精氨酸替换氨基酸位置19上的赖氨酸，用甘氨酸替换氨基酸位置42上的苏氨酸，用赖氨酸替换氨基酸位置43上的精氨酸，用甘氨酸替换氨基酸位置49上的丙氨酸，用天冬酰胺替换氨基酸位置84上的天冬氨酸，用丙氨酸替换氨基酸位置88上的丝氨酸，用缬氨酸替换氨基酸位置93上的苏氨酸，用苏氨酸替换氨基酸位置115上的缬氨酸，且用亮氨酸替换氨基酸位置116上的蛋氨酸。
人源化hLA212_H2型重链的氨基酸序列描述于序列表的SEQ ID NO: 28中。在SEQID NO: 28的氨基酸序列中，由氨基酸残基1至19组成的序列，由氨基酸残基20至140组成的序列和由氨基酸残基141至470组成的序列分别对应于信号序列、重链可变区和重链恒定区。编码SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的核苷酸序列描述于序列表的SEQ ID NO: 27中。在SEQ ID NO: 27的核苷酸序列中，由核苷酸1至57组成的序列，由核苷酸58至420组成的序列和由核苷酸421至1410组成的序列分别编码信号序列、重链可变区序列，和重链恒定区序列。SEQ ID NO: 27的核苷酸序列和SEQ ID NO: 28的氨基酸序列也分别在图42和43中描述。
5)-2-2 人源化的hLA212_H3型重链
将人源化的hLA212重链命名为“人源化hLA212_H3型重链”(其也可称为“hLA212_H3”),其通过以下设计:在SEQ ID NO: 24中所示的嵌合cLA212的重链可变区中,用甘氨酸替换氨基酸位置16上的精氨酸,用精氨酸替换氨基酸位置19上的赖氨酸，用甘氨酸替换氨基酸位置42上的苏氨酸，用赖氨酸替换氨基酸位置43上的精氨酸，用丙氨酸替换氨基酸位置88上的丝氨酸，用缬氨酸替换氨基酸位置93上的苏氨酸，用苏氨酸替换氨基酸位置115上的缬氨酸，且用亮氨酸替换氨基酸位置116上的蛋氨酸。
人源化hLA212_H3型重链的氨基酸序列描述于序列表的SEQ ID NO: 30中。在SEQID NO: 30的氨基酸序列中，由氨基酸残基1至19组成的序列，由氨基酸残基20至140组成的序列和由氨基酸残基141至470组成的序列分别对应于信号序列、重链可变区和重链恒定区。编码SEQ ID NO: 30的氨基酸序列的核苷酸序列描述于序列表的SEQ ID NO: 29中。在SEQ ID NO: 29的核苷酸序列中，由核苷酸1至57组成的序列，由核苷酸58至420组成的序列和由核苷酸421至1410组成的序列分别编码信号序列、重链可变区序列，和重链恒定区序列。SEQ ID NO: 29的核苷酸序列和SEQ ID NO: 30的氨基酸序列也分别在图44和45中描述。
5)-3 rLA212轻链的人源化
5)-3-1 人源化的hLA212_L1型轻链
将人源化hLA212轻链命名为“人源化hLA212_L1型轻链”(其也可称为“hLA212_L1”),其通过以下设计:在SEQ ID NO: 26中所示的嵌合cLA212的轻链可变区中，用天冬氨酸替换氨基酸位置1的天冬酰胺，用谷氨酰胺替换氨基酸位置3的缬氨酸，用丝氨酸替换氨基酸位置9的赖氨酸，用亮氨酸替换氨基酸位置11的蛋氨酸，用丙氨酸替换氨基酸位置13的异亮氨酸，用异亮氨酸替换氨基酸位置21的蛋氨酸，用苏氨酸替换氨基酸位置22的天冬酰胺，用谷氨酰胺替换氨基酸位置38的赖氨酸，用丙氨酸替换氨基酸位置43的丝氨酸，用丝氨酸替换氨基酸位置60的天冬氨酸，用丝氨酸替换氨基酸位置63的苏氨酸，用丝氨酸替换氨基酸位置65的甘氨酸，用丝氨酸替换氨基酸位置67的酪氨酸，用丝氨酸替换氨基酸位置76的天冬酰胺，用亮氨酸替换氨基酸位置78的缬氨酸，用丙氨酸替换氨基酸位置80的脯氨酸，用苯丙氨酸替换氨基酸位置83的丙氨酸，用苏氨酸替换氨基酸位置85的苯丙氨酸，用谷氨酰胺替换氨基酸位置100的丙氨酸，用赖氨酸替换氨基酸位置103的谷氨酸，用缬氨酸替换氨基酸位置104的亮氨酸，用异亮氨酸替换氨基酸位置106的亮氨酸，且用苏氨酸替换氨基酸位置109的丙氨酸。
人源化hLA212_L1型轻链的氨基酸序列描述于序列表的SEQ ID NO: 32中。在SEQID NO: 32的氨基酸序列中，由氨基酸残基1至20组成的序列，由氨基酸残基21至129组成的序列和由氨基酸残基130至234组成的序列分别对应于信号序列、轻链可变区和轻链恒定区。编码SEQ ID NO: 32的氨基酸序列的核苷酸序列描述于序列表的SEQ ID NO: 31中。在SEQ ID NO: 31的核苷酸序列中，由核苷酸1至60组成的序列，由核苷酸61至387组成的序列和由核苷酸388至702组成的序列分别编码信号序列、轻链可变区序列，和轻链恒定区序列。SEQ ID NO: 31的核苷酸序列和SEQ ID NO: 32的氨基酸序列也分别在图46和47中描述。
5)-3-2 人源化的hLA212_L2型轻链
将人源化hLA212轻链命名为“人源化hLA212_L2型轻链”(其也可称为“hLA212_L2”),其通过以下设计:在SEQ ID NO: 26中所示的嵌合cLA212的轻链可变区中，用天冬氨酸替换氨基酸位置1的天冬酰胺，用谷氨酰胺替换氨基酸位置3的缬氨酸，用丝氨酸替换氨基酸位置9的赖氨酸，用亮氨酸替换氨基酸位置11的蛋氨酸，用丙氨酸替换氨基酸位置13的异亮氨酸，用异亮氨酸替换氨基酸位置21的蛋氨酸，用苏氨酸替换氨基酸位置22的天冬酰胺，用谷氨酰胺替换氨基酸位置38的赖氨酸，用丝氨酸替换氨基酸位置60的天冬氨酸，用丝氨酸替换氨基酸位置63的苏氨酸，用丝氨酸替换氨基酸位置65的甘氨酸，用丝氨酸替换氨基酸位置76的天冬酰胺，用亮氨酸替换氨基酸位置78的缬氨酸，用丙氨酸替换氨基酸位置80的脯氨酸，用苯丙氨酸替换氨基酸位置83的丙氨酸，用苏氨酸替换氨基酸位置85的苯丙氨酸，用谷氨酰胺替换氨基酸位置100的丙氨酸，用赖氨酸替换氨基酸位置103的谷氨酸，用缬氨酸替换氨基酸位置104的亮氨酸，用异亮氨酸替换氨基酸位置106的亮氨酸，且用苏氨酸替换氨基酸位置109的丙氨酸。
人源化hLA212_L2型轻链的氨基酸序列描述于序列表的SEQ ID NO: 34中。在SEQID NO: 34的氨基酸序列中，由氨基酸残基1至20组成的序列，由氨基酸残基21至129组成的序列和由氨基酸残基130至234组成的序列分别对应于信号序列、轻链可变区和轻链恒定区。编码SEQ ID NO: 34的氨基酸序列的核苷酸序列描述于序列表的SEQ ID NO: 33中。在SEQ ID NO: 33的核苷酸序列中，由核苷酸1至60组成的序列，由核苷酸61至387组成的序列和由核苷酸388至702组成的序列分别编码信号序列、轻链可变区序列，和轻链恒定区序列。SEQ ID NO: 33的核苷酸序列和SEQ ID NO: 34的氨基酸序列也分别在图48和49中描述。
5)-3-3 人源化的hLA212_L3型轻链
将人源化hLA212轻链命名为“人源化hLA212_L3型轻链”(其也可称为“hLA212_L3”),其通过以下设计:在SEQ ID NO: 26中所示的嵌合cLA212的轻链可变区中，用谷氨酰胺替换氨基酸位置3的缬氨酸，用丝氨酸替换氨基酸位置9的赖氨酸，用亮氨酸替换氨基酸位置11的蛋氨酸，用丙氨酸替换氨基酸位置13的异亮氨酸，用异亮氨酸替换氨基酸位置21的蛋氨酸，用苏氨酸替换氨基酸位置22的天冬酰胺，用丝氨酸替换氨基酸位置63的苏氨酸，用丝氨酸替换氨基酸位置76的天冬酰胺，用亮氨酸替换氨基酸位置78的缬氨酸，用丙氨酸替换氨基酸位置80的脯氨酸，用苯丙氨酸替换氨基酸位置83的丙氨酸，用谷氨酰胺替换氨基酸位置100的丙氨酸，用赖氨酸替换氨基酸位置103的谷氨酸，用缬氨酸替换氨基酸位置104的亮氨酸，用异亮氨酸替换氨基酸位置106的亮氨酸，且用苏氨酸替换氨基酸位置109的丙氨酸。
人源化hLA212_L3型轻链的氨基酸序列描述于序列表的SEQ ID NO: 36中。在SEQID NO: 36的氨基酸序列中，由氨基酸残基1至20组成的序列，由氨基酸残基21至129组成的序列和由氨基酸残基130至234组成的序列分别对应于信号序列、轻链可变区和轻链恒定区。编码SEQ ID NO: 36的氨基酸序列的核苷酸序列描述于序列表的SEQ ID NO: 35中。在SEQ ID NO: 35的核苷酸序列中，由核苷酸1至60组成的序列，由核苷酸61至387组成的序列和由核苷酸388至702组成的序列分别编码信号序列、轻链可变区序列，和轻链恒定区序列。SEQ ID NO: 35的核苷酸序列和SEQ ID NO: 36的氨基酸序列也分别在图50和51中描述。
5)-3-4 人源化的hLA212_L4型轻链
将人源化hLA212轻链命名为“人源化hLA212_L4型轻链”(其也可称为“hLA212_L4”),其通过以下设计:在SEQ ID NO: 26中所示的嵌合cLA212的轻链可变区中，用天冬氨酸替换氨基酸位置1的天冬酰胺，用谷氨酰胺替换氨基酸位置3的缬氨酸，用丝氨酸替换氨基酸位置9的赖氨酸，用苏氨酸替换氨基酸位置22的天冬酰胺，用丝氨酸替换氨基酸位置60的天冬氨酸，用丝氨酸替换氨基酸位置63的苏氨酸，用丝氨酸替换氨基酸位置65的甘氨酸，用丝氨酸替换氨基酸位置67的酪氨酸，用丝氨酸替换氨基酸位置76的天冬酰胺，用丙氨酸替换氨基酸位置80的脯氨酸，用苯丙氨酸替换氨基酸位置83的丙氨酸，用苏氨酸替换氨基酸位置85的苯丙氨酸，用谷氨酰胺替换氨基酸位置100的丙氨酸，用赖氨酸替换氨基酸位置103的谷氨酸，且用苏氨酸替换氨基酸位置109的丙氨酸。
人源化hLA212_L4型轻链的氨基酸序列描述于序列表的SEQ ID NO: 38中。在SEQID NO: 38的氨基酸序列中，由氨基酸残基1至20组成的序列，由氨基酸残基21至129组成的序列和由氨基酸残基130至234组成的序列分别对应于信号序列、轻链可变区和轻链恒定区。编码SEQ ID NO: 38的氨基酸序列的核苷酸序列描述于序列表的SEQ ID NO: 37中。在SEQ ID NO: 37的核苷酸序列中，由核苷酸1至60组成的序列，由核苷酸61至387组成的序列和由核苷酸388至702组成的序列分别编码信号序列、轻链可变区序列，和轻链恒定区序列。SEQ ID NO: 37的核苷酸序列和SEQ ID NO: 38的氨基酸序列也分别在图52和53中描述。
5)-3-5 人源化的hLA212_L5型轻链
将人源化hLA212轻链命名为“人源化hLA212_L5型轻链”(其也可称为“hLA212_L5”),其通过以下设计:在SEQ ID NO: 26中所示的嵌合cLA212的轻链可变区中，用谷氨酰胺替换氨基酸位置3的缬氨酸，用丝氨酸替换氨基酸位置9的赖氨酸，用苏氨酸替换氨基酸位置22的天冬酰胺，用丝氨酸替换氨基酸位置63的苏氨酸，用丝氨酸替换氨基酸位置76的天冬酰胺，用丙氨酸替换氨基酸位置80的脯氨酸，用谷氨酰胺替换氨基酸位置100的丙氨酸，用赖氨酸替换氨基酸位置103的谷氨酸，且用苏氨酸替换氨基酸位置109的丙氨酸。
人源化hLA212_L5型轻链的氨基酸序列描述于序列表的SEQ ID NO: 40中。在SEQID NO: 40的氨基酸序列中，由氨基酸残基1至20组成的序列，由氨基酸残基21至129组成的序列和由氨基酸残基130至234组成的序列分别对应于信号序列、轻链可变区和轻链恒定区。编码SEQ ID NO: 40的氨基酸序列的核苷酸序列描述于序列表的SEQ ID NO: 39中。在SEQ ID NO: 39的核苷酸序列中，由核苷酸1至60组成的序列，由核苷酸61至387组成的序列和由核苷酸388至702组成的序列分别编码信号序列、轻链可变区序列，和轻链恒定区序列。SEQ ID NO: 39的核苷酸序列和SEQ ID NO: 40的氨基酸序列也分别在图54和53中描述。
5)-4 通过重链和轻链的组合设计人源化hLA212
设计由人源化hLA212_H2型重链和人源化hLA212_L1型轻链组成的抗体，并命名为“人源化hLA212_H2/L1”(其也可称为“hLA212_H2/L1”)。设计由人源化hLA212_H2型重链和人源化hLA212_L2型轻链组成的抗体，并命名为“人源化hLA212_H2/L2”(其也可称为“hLA212_H2/L2”)。设计由人源化hLA212_H2型重链和人源化hLA212_L3型轻链组成的抗体，并命名为“人源化hLA212_H2/L3”(其也可称为“hLA212_H2/L3”)。设计由人源化hLA212_H2型重链和人源化hLA212_L4型轻链组成的抗体，并命名为“人源化hLA212_H2/L4”(其也可称为“hLA212_H2/L4”)。设计由人源化hLA212_H2型重链和人源化hLA212_L5型轻链组成的抗体，并命名为“人源化hLA212_H2/L5”(其也可称为“hLA212_H2/L5”)。设计由人源化hLA212_H3型重链和人源化hLA212_L1型轻链组成的抗体，并命名为“人源化hLA212_H3/L1”(其也可称为“hLA212_H3/L1”)。设计由人源化hLA212_H3型重链和人源化hLA212_L2型轻链组成的抗体，并命名为“人源化hLA212_H3/L2”(其也可称为“hLA212_H3/L2”)。设计由人源化hLA212_H3型重链和人源化hLA212_L3型轻链组成的抗体，并命名为“人源化hLA212_H3/L3”(其也可称为“hLA212_H3/L3”)。设计由人源化hLA212_H3型重链和人源化hLA212_L4型轻链组成的抗体，并命名为“人源化hLA212_H3/L4”(其也可称为“hLA212_H3/L4”)。设计由人源化hLA212_H3型重链和人源化hLA212_L5型轻链组成的抗体，并命名为“人源化hLA212_H3/L5”(其也可称为“hLA212_H3/L5”)。如上设计的抗体可根据实施例6制造，并根据实施例7和实施例8评估。
实施例6：人嵌合抗LAG-3抗体cLA212的人源化抗体(hLA212)的表达和纯化
6)-1 hLA212重链表达载体的构建
6)-1-1 hLA212_H2型重链表达载体的构建
合成DNA片段，其包含编码hLA212_H2的可变区的DNA序列，如SEQ ID NO: 27的hLA212_H2的核苷酸序列的核苷酸位置36至437中所示(Strings DNA Fragments, Geneart AG)。使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)，将合成的DNA片段***通过限制酶BlpI切割的嵌合和人源化抗体IgG1型重链表达载体pCMA-G1的位点，以构建hLA212_H2表达载体。所获得的表达载体命名为“pCMA/hLA212_H2”。
6)-1-2 hLA212_H3型重链表达载体的构建
合成DNA片段，其包含编码hLA212_H2的可变区的DNA序列，如SEQ ID NO: 29的hLA212_H3的核苷酸序列的核苷酸位置36至437中所示(Strings DNA Fragments, Geneart AG)。以与实施例6)-1-1中相同的方式，构建hLA212_H3表达载体。所获得的表达载体命名为“pCMA/hLA212_H3”。
6)-2 hLA212轻链表达载体的构建
6)-2-1 hLA212_L1型轻链表达载体的构建
合成DNA片段，其包含编码hLA212_L1的可变区的DNA序列，如SEQ ID NO: 31的hLA212_L1的核苷酸序列的核苷酸位置37至402中所示(Strings DNA Fragments, Geneart AG)。使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.),将合成的DNA片段***通过限制酶BsiWI切割的嵌合和人源化抗体轻链表达载体pCMA-LK的位点，以构建hLA212_L1表达载体。所获得的表达载体命名为“pCMA/hLA212_L1”。
6)-2-2 hLA212_L2型轻链表达载体的构建
合成DNA片段，其包含编码hLA212_L2的可变区的DNA序列，如SEQ ID NO: 33的hLA212_L2的核苷酸序列的核苷酸位置37至402中所示(Strings DNA Fragments, Geneart AG)。以与实施例6)-2-1中相同的方式，构建hLA212_L2表达载体。所获得的表达载体命名为“pCMA/hLA212_L2”。
6)-2-3 hLA212_L3型轻链表达载体的构建
合成DNA片段，其包含编码hLA212_L3的可变区的DNA序列，如SEQ ID NO: 35的hLA212_L3的核苷酸序列的核苷酸位置37至402中所示(Strings DNA Fragments，Geneart AG)。以与实施例6)-2-1中相同的方式，构建hLA212_L3表达载体。所获得的表达载体命名为"pCMA/hLA212_L3"。
6)-2-4 hLA212_L4型轻链表达载体的构建
合成DNA片段，其包含编码hLA212_L4的可变区的DNA序列，如SEQ ID NO: 37的hLA212_L4的核苷酸序列的核苷酸位置37至402中所示(Strings DNA Fragments，Geneart AG)。以与实施例6)-2-1中相同的方式，构建hLA212_L4表达载体。所获得的表达载体命名为“pCMA/hLA212_L4”。
6)-2-5 hLA212_L5型轻链表达载体的构建
合成DNA片段，其包含编码hLA212_L5的可变区的DNA序列，如SEQ ID NO: 37的hLA212_L5的核苷酸序列的核苷酸位置37至402中所示(Strings DNA Fragments，Geneart AG)。以与实施例6)-2-1中相同的方式，构建hLA212_L5表达载体。所获得的表达载体命名为“pCMA/hLA212_L5”。
6)-3 制备hLA212 抗体
6)-3-1 产生hLA212 抗体
以与实施例4)-5中相同的方式测定序列。即，通过pCMA/hLA212_H2和pCMA/hLA212_L1的组合获得hLA212_H2/L1；通过pCMA/hLA212_H2和pCMA/hLA212_L2的组合获得hLA212_H2/L2；通过pCMA/hLA212_H2和pCMA/hLA212_L3的组合获得hLA212_H2/L3；通过pCMA/hLA212_H2和pCMA/hLA212_L4的组合获得hLA212_H2/L4；通过pCMA/hLA212_H2和pCMA/hLA212_L5的组合获得hLA212_H2/L5；通过pCMA/hLA212_H3和pCMA/hLA212_L1的组合获得hLA212_H3/L1；通过pCMA/hLA212_H3和pCMA/hLA212_L2的组合获得hLA212_H3/L2；通过pCMA/hLA212_H3和pCMA/hLA212_L3的组合获得hLA212_H3/L3；通过pCMA/hLA212_H3和pCMA/hLA212_L4的组合获得hLA212_H3/L4；且通过pCMA/hLA212_H3和pCMA/hLA212_L5的组合获得hLA212_H3/L5。
6)-3-2 hLA212抗体的纯化
以与实施例4)-6中相同的方式，将6)-3-1中获得的培养上清液应用于纯化。
实施例7：人源化抗人LAG-3抗体(hLA212)的体外评估
7)-1 使用Biacore的人源化抗人LAG-3抗体(hLA212)的抗原结合活性测定
应用FreeStyle 293F细胞(Invitrogen Corp.)以表达人LAG-3的四个细胞外免疫球蛋白样结构域外的N末端的第3和第4 (位置263-450区域) 结构域的C-末端His-标记的蛋白LAG-3_D3D4-His。将获得的培养上清液进行缓冲液置换(20mM HEPES，300mM NaCl和pH7.5)，以使用HisTrap HP柱(GE Healthcare)和Superdex75柱(GE Healthcare)纯化人LAG-3_D3D4-His蛋白。最终的缓冲液是PBS。
使用Biacore T200 (GE Healthcare)，通过捕获方法测定抗体对抗原(LAG-3_D3D4-His)的解离常数，其包括使用固定的抗人IgG(Fc)抗体上(人抗体捕获试剂盒，GEHealthcare)将抗体作为配体捕获，并用抗原作为分析物进行测定。通过胺偶联，将抗人IgG(Fc)抗体与传感器芯片CM5 (GE Healthcare)共价结合，靶向约1000RU。类似地，将该抗体固定在参照池上。使用的运行缓冲液是HBS-EP+ (10mM HEPES (pH7.4)，0.15M NaCl，3mMEDTA和0.05％表面活性剂P20)。在将每种抗体添加到抗人IgG(Fc)抗体固定的芯片上约1分钟后，以90μl/分钟的流速向其添加抗原的连续稀释液(0.06至20nM)，持续300秒，且随后监测解离阶段3600秒。以10μl/分钟的流速向其添加3M氯化镁溶液作为再生溶液，持续30秒。使用分析软件(Biacore T200评估软件，版本1.0)的1：1结合模型分析数据，以计算结合速率常数ka，解离速率常数kd和解离常数(KD；KD = kd/ka)。图7显示了解离常数。
7)-2通过流式细胞术研究人源化抗人LAG-3抗体(hLA212)与表达人LAG-3的细胞的结合活性
使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp.制造)，将人LAG-3表达质粒pcDNA3.1/hLAG-3引入293T-lacZ细胞(描述于实施例1)-5-1)，并将细胞培养1天且然后用于流式细胞术。根据实施例1)-4中描述的方法进行流式细胞术，但使用以FACS缓冲液稀释200倍的抗人IgG PE缀合物(Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.制造)作为二抗。如图8所示，显示人源化抗人LAG-3抗体的所有10个克隆(hLA212_H2/L1、hLA212_H2/L2、hLA212_H2/L3、hLA212_H2/L4、hLA212_H2/L5、hLA212_H3/L1、hLA212_H3/L2、hLA212_H3/L3、hLA212_H3/L4和hLA212_H3/L5)对表达人LAG-3的293T-lacZ细胞表现出与人嵌合抗LAG-3抗体cLA212相当的浓度依赖性结合活性，并且即使在人源化后也维持了所述结合活性。
7)-3 人源化抗人LAG-3抗体(hLA212)的ADCC活性
通过实施例2)-2中描述的方法研究人源化抗人LAG-3抗体(hLA212)的ADCC活性。如图9所示，显示人源化抗人LAG-3抗体的所有10个克隆(hLA212_H2/L1、hLA212_H2/L2、hLA212_H2/L3、hLA212_H2/L4、hLA212_H2/L5、hLA212_H3/L1、hLA212_H3/L2、hLA212_H3/L3、hLA212_H3/L4和hLA212_H3/L5)对表达人LAG-3的293T-lacZ细胞表现出与人嵌合抗LAG-3抗体cLA212几乎相当的浓度依赖性ADCC活性，并且因此即使在人源化后也维持了所述ADCC活性。
7)-4人源化抗人LAG-3抗体hLA212_H3/L2对LAG-3的T细胞抑制功能的影响的研究
已知LAG-3与II型MHC分子结合，从而向T细胞传递一些抑制信号以负调节T细胞功能(非专利文献1)。对于LAG-3与II型MHC分子的结合，LAG-3的四个细胞外免疫球蛋白样结构域的N-末端结构域1和2被认为是重要的(非专利文献4)。在实施例2中揭示，通过实施例1的方法获得的所有5个克隆的大鼠抗人LAG-3抗体(rLA204、rLA212、rLA225、rLA869和rLA1264)识别结构域3并且在该结构域中在LAG-3/II型MHC结合测试和293T-hLAG-3/Raji细胞粘附测试中显示没有抑制活性，而作为引用列表中的常规抗体的人类嵌合抗人LAG-3抗体IMP731识别出结构域1并在LAG-3/II型MHC结合测试和293T-hLAG-3/Raji细胞粘附测试中表现出强大的抑制活性。根据这些结果，假设通过实施例1的方法获得的克隆和由其衍生的人源化抗人LAG-3抗体对LAG-3固有的T细胞抑制功能没有影响，而IMP731则抑制它。为了实验证实这一点，根据先前的报道(非专利文献9)研究了人源化抗人LAG-3抗体hLA212_H3/L2对LAG-3的T细胞抑制功能的影响。以2×105个细胞/孔的量，将通过Ficoll离心从人外周血中分离的PBMC散布在96孔微量培养板中，并向其添加抗体，然后在37℃预温育30分钟。在向其添加SEB (葡萄球菌肠毒素B，Sigma-Aldrich制造)至终浓度为1ng/mL，且将细胞培养4天时，通过人IL-2免疫测定试剂盒(PerkinElmer Inc制造)定量的培养上清液中的IL-2浓度。结果，开发的人源化抗人LAG-3抗体hLA212_H3/L2对IL-2产生几乎没有影响，而IMP731增加IL-2产生，如图10所示。也即，如最初预测的那样，显示开发的人源化抗人LAG-3抗体hLA212_H3/L2对LAG-3的T细胞抑制功能没有影响，而IMP731抑制了这一点，因此反而具有激活免疫***的风险。
实施例8：调节其糖链修饰的人源化抗体的制备
根据已知方法，对包含重链和轻链的人源化抗体进行去岩藻糖基化，以调节与抗体蛋白结合的糖链修饰，并将获得的抗体命名为hLA212_H4/L2，其中所述重链包含SEQ ID NO:30 (图45)所示氨基酸序列的氨基酸位置20至470，所述轻链包含SEQ ID NO: 34 (图49)所示氨基酸序列的氨基酸位置21至234。将该修饰形式进行质谱分析。结果，源自含岩藻糖的H链的峰等于或低于检测限。在本发明中，其糖链修饰被调节的抗体，例如hLA212_H4/L2，也称为“抗体”或“抗体的修饰形式”。
实施例9：人源化抗人LAG-3抗体hLA212_H4/L2的体外评价
9)-1人源化抗人LAG-3抗体hLA212_H4/L2与表达LAG-3的细胞的结合活性
根据实施例7)-2中描述的方法，通过流式细胞术研究人源化抗人LAG-3抗体hLA212_H4/L2与表达人LAG-3的293T-lacZ细胞的结合。结果，观察到hLA212_H4/L2的浓度依赖性结合，如图11所示。
9)-2 人源化抗人LAG-3抗体hLA212_H4/L2的体外ADCC活性
通过实施例7)-2中描述的方法评估人源化抗人LAG-3抗体hLA212_H4/L2的体外ADCC活性。结果，hLA212_H4/L2表现出针对表达人LAG-3的293T-lacZ细胞的浓度依赖性ADCC活性，如图12所示。相反，它对不表达人LAG-3的293T-lacZ细胞没有表现出ADCC活性。
实施例10：人LAG-3/人FcγRIIIA双转基因小鼠的开发
已经揭示，人源化抗人LAG-3抗体hLA212_H4/L2与人LAG-3结合，如实施例9中所示，但不与啮齿动物的LAG-3交叉反应。因此，为了能够体内评估hLA212_H4/L2，开发了允许使用小鼠LAG-3的表达调节机制生理表达人LAG-3的BAC (细菌人工染色体)转基因小鼠。此外，人FcγIIIA是通过如hLA212_H4/L2中那样调节糖链修饰来增强ADCC活性所必需的(Junttila, T.T.,等人，Cancer Res., Vol.70 (No.11): pp4481-9 (2010))，因此，根据先前的报道(非专利文献10)另外引入了包含人FcγRIIIA基因的BAC。
10)-1使用Red/ET反应构建重组BAC表达载体
使用作为在大肠杆菌中的活性同源重组反应的Red/ET重组技术(Zhang Y等人，A newlogic for DNA engineering using recombination in E.Coli., Nature 20 (1998)123-128)，构建人LAG-3 RecBAC的重组BAC克隆。
获得BAC基因组克隆RP11-101F21和RP23-3001，其各自包含人LAG-3和小鼠LAG-3基因座。如以下列表中所示，使用人LAG-3基因的内含子5的序列，从人LAG-3基因的翻译起始密码子到终止密码子的基因组DNA序列两端的序列，以及从小鼠BAC克隆的LAG-3基因的翻译起始密码子到终止密码子的基因组DNA序列的3'末端和5'末端，作为大肠杆菌中活性同源重组反应的关键序列。
LAG-3-H1: 在人LAG-3基因的起始密码子附近的序列
[5'] ATGTGGGAGGCTCAGTTCCTGGGCTTGCTGTTTC [3'] (SEQ ID NO: 79)
LAG-3-H2: 在人LAG-3基因的终止密码子附近的序列
[5'] GCCCGAGCCCGAGCCCGAGCCGGAGCAGCTCTGA [3'] (SEQ ID NO: 80)
LAG-3-H3: Rpsl-kan***位点，5'侧
[5'] GAGTATGTGTTGACTGGTTGATAACTATCG [3'] (SEQ ID NO: 81)
LAG-3-H4: Rpsl-kan***位点，3'侧
[5'] GCCATGACAGATTAGCCATGTCTGCAGCAC [3'] (SEQ ID NO: 82)
LAG-3-H5: 小鼠LAG-3基因的5'UTR
[5'] CAGGACCTTTTTCTAACCTCCCTTGGAGGGCTGGGGAGGCCCGGGCCATAGAGGAG [3'] (SEQID NO: 83)
LAG-3-H6: 小鼠LAG-3基因的3'UTR
[5'] CCTGGAGCCGAGGCAGCCAGCAGGTCTCAGCAGCTCCGCCCGCCCGCCCGCCCGCC [3'](SEQ IDNO: 84)。
首先，为了将阳性/阴性选择标记盒(Rps1-kan)***人BAC克隆的LAG-3基因的内含子5中，使用LA-Taq (Takara Bio Inc.)，通过PCR构建串联连接LAG-3-H3序列、Rps1-kan和LAG-3-H4序列的DNA片段(LAG-3 Rps1-Kan***片段)。将含有LAG-3基因座的人BAC克隆和LAG-3 Rps1-Kan***片段引入具有Red/ET反应能力的大肠杆菌菌株中，以在宿主大肠杆菌中诱导Red/ET反应，并且挑出具有氯霉素抗性和卡那霉素抗性的菌落，从而筛选出其中LAG-3 Rps1-kan***片段被***到LAG-3基因座的内含子5中的重组BAC克隆(人LAG-3中间体)。然后，为了将其中***了Rps1-kan盒的人LAG-3基因的基因组DNA序列亚克隆到来自人LAG-3中间体的质粒载体中，构建了串联连接H2-H6-SacBpBluescript-H5-H1的DNA盒(LAG-3预转移质粒)。以与上述相同的方式，将线性化的LAG-3预转移质粒与人LAG-3中间体一起引入具有Red/ET反应能力的大肠杆菌菌株中，以在宿主大肠杆菌中诱导Red/ET反应，并且挑出氨苄青霉素和卡那霉素抗性菌落，从而筛选具有其中***Rpslkan盒的人LAG-3基因的基因组DNA序列的质粒(人LAG-3转移质粒)。
随后，通过限制酶反应，从人LAG-3转移质粒载体中切下在两个末端具有源自小鼠基因组序列的H5序列和H6序列且其中***Rpsl-kan盒的人LAG-3基因的基因组DNA序列(人LAG-3转移片段)。以与上述相同的方式，将人LAG-3转移片段与小鼠LAG-3 BAC克隆一起引入具有Red/ET反应能力的大肠杆菌菌株中，以在宿主大肠杆菌中诱导Red/ET反应，并挑出氯霉素和卡那霉素抗性菌落，从而筛选出小鼠LAG-3/人LAG-3基因重组BAC克隆(小鼠LAG-3/人LAG-3 RecBAC中间体)，其中从小鼠LAG-3基因的翻译起始密码子到终止密码子的基因组DNA序列被从人LAG-3转移片段的翻译起始密码子到终止密码子的基因组DNA序列准确地替换。
最后，通过PCR扩增人LAG-3基因座的内含子5序列并用作通过阴性选择去除***到人LAG-3基因的内含子5中的Rps1-Kan的DNA序列(人LAG-3修复片段)。以与上述相同的方式，将人LAG-3修复片段与小鼠LAG-3/人LAG-3 RecBAC中间体一起引入具有Red/ET反应能力的大肠杆菌菌株中，以在宿主大肠杆菌中诱导Red/ET反应，并挑出氯霉素和链霉素抗性菌落，从而构建小鼠LAG-3/人LAG-3基因重组BAC克隆(人LAG-3 RecBAC)，其中从小鼠LAG-3基因的翻译起始密码子到终止密码子的基因组DNA序列被从翻译起始密码子到终止密码子的人LAG-3基因的基因组DNA序列准确地替换。通过序列分析检查具有通过Red/ET反应连接的H1至H6的基因组DNA序列。
10)-2高纯度BAC DNA片段的纯化
将由重组BAC克隆(其为用于表达人LAG-3 RecBAC基因的构建体)转化的DH10B细胞克隆到含有氯霉素的LB琼脂培养基上，并挑出单个菌落并在液体培养基中振荡培养整天整夜。
根据具有部分改进的Abe等人的方法，使用质粒提取试剂盒(MACHEREY-NAGELGmbH&Co. KG, Nucleobond BAC100试剂盒)纯化人LAG-3 RecBAC重组BAC克隆(Exp Anim.2004 53 (4): 311-20. Establishment of an efficient BAC transgenesis protocoland its application to functional characterization of the mouse Brachyurylocus. Abe K, Hazama M, Katoh H, Yamamura K, Suzuki M)，然后添加PI-SceI，从而允许在37℃反应16小时进行消化。
将线性化的人LAG-3 RecBAC重组BAC克隆应用于1％SeaKem GTG琼脂糖凝胶(Takara Bio Inc.)，并在6v/cm，0.1至40秒，15小时和14℃的条件下，使用脉冲场电泳装置(CHEF DR-II, Bio-Rad Laboratories, Inc)进行电泳。通过使用UV透射仪将一部分样品可视化作为指导标记，在没有UV照射的情况下用剃刀切下在琼脂糖凝胶中分离的线性化的人LAG-3 RecBAC重组BAC克隆。通过电洗脱法从琼脂糖凝胶中提取获得的长链DNA片段，并在4℃用准备用于显微注射的TE缓冲液透析2小时。将纯化的DNA片段应用于脉冲场电泳，以确认长链DNA片段高度纯化而没有片段化，并使用NanoDrop分光光度计(AGC TECHNO GLASSCO., LTD)测定其DNA浓度。将DNA片段的溶液稀释至0.5ng/μl，以制备用于转基因小鼠产生的表达构建体的溶液。
10-3) C57BL/6J小鼠胚胎显微注射
将PMSG和hCG施用于雌性C57BL/6J小鼠以诱导超数***，然后与相同品系的雄性小鼠交配，并且然后收集受精卵。
使用显微操作器，将纯化的人LAG-3 RecBAC/人FcγR BAC表达构建体直接注射到C57BL/6J小鼠的原核期胚胎的雄核中。将注射DNA的胚胎移植到诱导假妊娠的受体雌性小鼠的输卵管中。
10-4) 创始小鼠的Southern筛选
通过从其中注射有人LAG-3 RecBAC/人FcγR BAC表达构建体的C57BL/6J小鼠受精卵的自发分娩获得的后代培育至断奶。人LAG-3 RecBAC/人FcγR BAC转基因小鼠创始候选个体在3周龄时断奶，并进行耳标记以鉴定个体。此后，对它们的尾部组织进行活组织检查并储存在-80℃直到分析。
将已储存于-80℃的人LAG-3 RecBAC/人FcγR BAC转基因小鼠的候选个体的尾部组织在室温下融化，并向其添加含有1％SDS (Wako Pure Chemical Industries, LTD.)，1mg/ml肌动蛋白酶E (KAKEN PHARMACEUTICAL CO., LTD.)和0.15mg/ml蛋白酶K (MerckKGaA)的裂解缓冲液，然后在55℃振荡16小时以溶解组织。通过苯酚提取和苯酚/氯仿提取除去与基因组DNA结合并从组织中溶解的蛋白质。用RNA酶A (Sigma-Aldrich)降解与基因组DNA混合的RNA，且然后通过异丙醇沉淀来沉淀聚合物基因组DNA。沉淀的基因组DNA用70％乙醇洗涤，空气干燥，且然后重新溶解于50μl的TE。
通过吸收光谱法测定从每个样本制备的基因组DNA溶液的DNA浓度，并且从每个样本的DNA浓度值计算等同于5μg的DNA的基因组DNA溶液的体积。
向从每个样本制备的基因组DNA，阳性对照DNA (添加了用于显微注射的表达构建体的对照小鼠的基因组DNA)和阴性对照DNA (对照小鼠的基因组DNA)，添加限制酶，然后在37℃反应16小时。产生的基因组DNA片段通过异丙醇沉淀而沉淀，用70％乙醇洗涤，空气干燥，且然后重新溶解于TE中。将基因组DNA片段应用于1.2％琼脂糖凝胶进行电泳，并使用UV透射仪观察琼脂糖凝胶中分离的基因组DNA片段并与比例尺拍照。
将琼脂糖凝胶浸入0.25N盐酸中并轻轻摇动10分钟。此后，将其进一步浸入0.4N氢氧化钠中并轻轻摇动10分钟。通过毛细管法，使用0.4N氢氧化钠，在室温下将在琼脂糖凝胶中分离的基因组DNA片段转移至尼龙膜(Hybond-XL；GE Healthcare)，进行16小时。将其中转移有基因组DNA片段的尼龙膜浸入2×SSC中，温和振荡10分钟，然后空气干燥，并在室温下储存直至用于杂交。
使用DNA标记试剂盒(Megaprime DNA标记***；GE Healthcare)，通过随机引物方法，对DNA片段进行[32P]标记。使用Sephadex离心柱(ProbeQuant G-50微柱；GEHealthcare)，纯化[32P]-标记的片段，得到[32P]-标记的探针。
将其中转移有基因组DNA片段的尼龙膜放入杂交缓冲液中，然后在65℃预温育1小时。此后，向其添加在95℃加热5分钟而变性并立即用冰冷却5分钟的[32P]-标记的探针，然后在65℃温育4小时。温育完成后取出尼龙膜，并用0.1％SDS和0.5×SSC在65℃洗涤约15分钟。用测量仪监测来自与膜结合的探针的放射性，并重复洗涤直至放射性变得近似恒定。
洗涤的膜用Saran Wrap覆盖，在暗室中与X射线胶片(BioMax MS；Eastman KodakCompany)层压，并放入放射自显影盒中。在4℃曝光1周后，X射线胶片显影。通过放射自显影检测来自人LAG-3 RecBAC/人FcγR BAC表达构建体的特异性信号，并且将给出与[32P]标记的探针杂交特异性的信号的个体鉴定为人LAG-3 RecBAC/人FcγR BAC转基因小鼠的创始个体。
10-5) F1小鼠的产生和增殖
获得创始个体的子代动物并进行基因分型以获得确定的Tg小鼠品系。通过Southern分析鉴定的Tg创始小鼠，并将野生型C57BL/6J小鼠体外受精或自然交配以产生F1个体。将通过基因分型证实转基因向F1个体转移的确定品系，通过与野生型C57BL/6J小鼠体外受精或自然交配而增殖，并且将通过基因分型而显示其中杂合引入人LAG-3和人FcγRIIIA二者的小鼠用于实验。
10-6) 人LAG-3/人FcγRIIIA双转基因小鼠的表型的确认
通过流式细胞术研究引入获得的人LAG-3/人FcγRIIIA双转基因小鼠中的基因的表达。从每只小鼠的尾静脉收集外周血至肝素化的血细胞比容毛细管中，并通过PharmLyse(Becton, Dickinson and Company制造)使红细胞溶血以获得白细胞。白细胞部分用于通过流式细胞术的人FcγRIIIA的表达分析，并且将剩余部分用含有2μg/mL伴刀豆球蛋白A(Con A：Sigma-Aldrich)培养基刺激3天，用于诱导LAG-3的表达以获得活化的T细胞。向后一细胞中添加PE标记的抗小鼠LAG-3抗体(Becton, Dickinson and Company制造)，ATTO647标记的抗人LAG-3抗体(Enzo Life Sciences, Inc.制造)，FITC标记的抗小鼠CD3抗体(Becton, Dickinson and Company制造)和LIVE/DEAD可固定死细胞染色试剂盒-近红外荧光反应性染料(Invitrogen Corp.制造)用于悬浮，然后在4℃静置30分钟。为了用于鉴定阴性群体的位置，还制备了不含PE标记的抗小鼠LAG-3抗体和ATTO647标记的抗人LAG-3抗体的对照，并以相同方式处理。用FACS缓冲液洗涤后，将细胞重悬于含有1％多聚甲醛的PBS中，然后用流式细胞仪(CantoII：Becton, Dickinson and Company制造)检测。使用Flowjo (Tree Star Inc.制造)分析数据。通过门控除去LIVE/DEAD可固定死细胞染色试剂盒-近红外荧光反应性染料阳性死细胞后，分析活细胞。结果，源自对照野生型小鼠的Con A活化T细胞上仅发现小鼠LAG-3的表达，并且未发现人LAG-3的表达，而在源自人LAG-3/人FcγRIIIA双转基因小鼠的Con A活化的T细胞上发现了小鼠LAG-3和人LAG-3二者的表达，并且在代表单个细胞的点图中的点几乎对角分布，如图13所示。在未被激活的静息T细胞上几乎没有发现小鼠LAG-3和人LAG-3二者的表达。这些结果显示，在开发的人LAG-3/人FcγRIIIA双转基因小鼠中，通过使用BAC转基因方法，人LAG-3根据小鼠LAG-3的内源表达模式表达，如最初计划的那样。此外，对于人FcγRIIIA，确认了与之前的报告(非专利文献10)相当的结果，其中在开发的人LAG-3/人FcγRIIIA双转基因小鼠的约47％的外周血NK细胞(CD3-DX5+)上观察到表达。
实施例11：人源化抗人LAG-3抗体hLA212_H4/L2的体内评价
11-1) 人源化抗人LAG-3抗体hLA212_H4/L2的LAG-3阳性细胞耗尽活性
使用实施例10的人LAG-3/人FcγRIIIA双转基因小鼠，研究了获得的人源化抗人LAG-3抗体hLA212_H4/L2是否具有在体内耗尽LAG-3阳性细胞的活性。在将人源化抗人LAG-3抗体hLA212_H4/L2 (30mg/kg)或溶剂腹膜内施用于人LAG-3/人FcγRIIIA双转基因小鼠后，立即以15mg/kg的剂量静脉内施用具有多克隆T细胞活化作用的Con A (Sigma-Aldrich制造)。用PharmLyse (Becton, Dickinson and Company制造)使来自在此后2天收集的血液的红细胞溶血以获得白细胞，并将白细胞用于流式细胞术。使白细胞与FcBlock (Becton,Dickinson and Company制造)反应，且然后向其添加PE标记的抗小鼠LAG-3抗体(Becton,Dickinson and Company制造)，ATTO647标记的抗人LAG- 3抗体(Enzo Life Sciences,Inc.制造)，FITC标记的抗小鼠CD3抗体(Becton, Dickinson and Company制造)和LIVE/DEAD可固定死细胞染色试剂盒-近红外荧光反应性染料(Invitrogen Corp.制造)用于悬浮，然后在4℃静置30分钟。为了用于鉴定阴性群体的位置，还制备了不含PE标记的抗小鼠LAG-3抗体和ATTO647标记的抗人LAG-3抗体的对照，并以相同方式处理。用FACS缓冲液洗涤后，将细胞重悬于含有1％多聚甲醛的PBS中，然后用流式细胞仪(CantoII：Becton,Dickinson and Company制造)检测。使用Flowjo (Tree Star Inc.制造)分析数据。通过门控除去LIVE/DEAD可固定死细胞染色试剂盒-近红外荧光反应性染料阳性死细胞后，分析活细胞。如图14所示，作为计算CD3阳性T细胞中人LAG-3阳性的结果，在未处理的人LAG-3/人FcγRIIIA双转基因小鼠的外周血T细胞中几乎未发现人LAG-3阳性细胞，而通过施用具有多克隆T细胞激活作用的Con A，抗体非施用组中平均24％的外周血T细胞变为人LAG-3阳性。相反，施用hLA212_H4/L2的Con A施用小鼠的外周血T细胞中的人LAG-3阳性显着降低。在施用Con A后一天获得的脾T细胞和外周血T细胞中观察到类似的趋势，并且对于小鼠LAG-3和作为另一种活化标记的CD69的阳性也获得了类似的结果。这些结果显示，获得的人源化抗人LAG-3抗体hLA212_H4/L2具有在体内耗尽LAG-3阳性细胞的活性。
11-2) 人源化抗人LAG-3抗体hLA212_H4/L2对T细胞依赖性自身免疫疾病模型的活性
为了揭示具有体内耗尽LAG-3阳性细胞活性的人源化抗人LAG-3抗体hLA212_H4/L2是否可用于治疗自身免疫疾病，研究了对抗作为典型的T细胞依赖性自身免疫疾病(多发性硬化)模型的EAE (实验性自身免疫性脑脊髓炎)模型(非专利文献11)的功效。
将通过以4mg/mL的浓度将源自作为中枢神经髓鞘成分蛋白之一的MOG (髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白)的肽(氨基酸35-55，PEPTIDE INSTITUTE，INC.)溶解在生理盐水中而获得的溶液与8mg/mL灭活的结核分枝杆菌H37Ra (Becton, Dickinson and Company制造)和弗氏不完全佐剂(Wako Pure Chemical Industries, LTD.制造)的混合物等量混合，得到乳液。在第0天，以各50 μ/L的量将该乳液皮下注射到人LAG-3/人FcγRIIIA双转基因小鼠的两个侧腹中，并且进一步向其静脉内施用以生理盐水稀释的0.2μg百日咳毒素，以诱导EAE。此后，如下所述每天观察EAE的临床评分。也即，分数0：无症状；分数1：跛行尾；分数2：步态异常或翻正反射丧失；分数3：后肢麻痹；分数4：前肢部分麻痹；和分数5：死亡或安乐死。在第0天和第7天，以各30mg/kg的剂量静脉内施用人源化抗人LAG-3抗体hLA212_H4/L2和对照抗体。结果，与对照抗体施用组相比，人源化抗人LAG-3抗体hLA212_H4/L2施用组的EAE临床评分的平均值在观察期间被抑制至50％或更低，如图15所示。此外，在hLA212_H4/L2施用组中，随EAE进展的体重减轻也被抑制。这些结果表明，具有在体内耗尽LAG-3阳性细胞活性的人源化抗人LAG-3抗体hLA212_H4/L2抑制作为典型的T细胞依赖性自身免疫疾病模型的EVE，并且可以作为人类自身免疫疾病的治疗药物。
工业实用性
本发明的抗体，其结合片段等可用于治疗和/或预防与LAG-3阳性细胞相关的疾病, 如自身免疫疾病。
序列表自由文本
SEQ ID NO: 1：编码rLA204抗体的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(图16)
SEQ ID NO: 2：rLA204抗体的重链可变区的氨基酸序列(图17)
SEQ ID NO: 3：编码rLA204抗体的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(图18)
SEQ ID NO: 4：rLA204抗体的轻链可变区的氨基酸序列(图19)
SEQ ID NO: 5：编码rLA212抗体的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(图20)
SEQ ID NO: 6：rLA212抗体的重链可变区的氨基酸序列(图21)
SEQ ID NO: 7：编码rLA212抗体的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(图22)
SEQ ID NO: 8：rLA212抗体的轻链可变区的氨基酸序列(图23)
SEQ ID NO: 9：编码rLA225抗体的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(图24)
SEQ ID NO: 10：rLA225抗体的重链可变区的氨基酸序列(图25)
SEQ ID NO: 11：编码rLA225抗体的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(图26)
SEQ ID NO: 12：rLA225抗体的轻链可变区的氨基酸序列(图27)
SEQ ID NO: 13：编码rLA869抗体的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(图28)
SEQ ID NO: 14：rLA869抗体的重链可变区的氨基酸序列(图29)
SEQ ID NO: 15：编码rLA869抗体的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(图30)
SEQ ID NO: 16：rLA869抗体的轻链可变区的氨基酸序列(图31)
SEQ ID NO: 17：编码rLA1264抗体的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(图32)
SEQ ID NO: 18：rLA1264抗体的重链可变区的氨基酸序列(图33)
SEQ ID NO: 19：编码rLA1264抗体的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(图34)
SEQ ID NO: 20：rLA1264抗体的轻链可变区的氨基酸序列(图35)
SEQ ID NO: 21：编码人轻链分泌信号和人κ链恒定区的氨基酸序列的核苷酸序列(图36)
SEQ ID NO: 22：编码人重链分泌信号和人IgG1恒定区的氨基酸序列的核苷酸序列(图37)
SEQ ID NO: 23：编码cLA212抗体的重链的氨基酸序列的核苷酸序列(图38)
SEQ ID NO: 24：cLA212抗体的重链的氨基酸序列(图39)
SEQ ID NO: 25：编码cLA212抗体的轻链的氨基酸序列的核苷酸序列(图40)
SEQ ID NO: 26：cLA212抗体的轻链的氨基酸序列(图41)
SEQ ID NO: 27：编码hLA212抗体的重链H2的氨基酸序列的核苷酸序列(图42)
SEQ ID NO: 28：hLA212抗体的重链H2的氨基酸序列(图43)
SEQ ID NO: 29：编码hLA212抗体的重链H3的氨基酸序列的核苷酸序列(图44)
SEQ ID NO: 30：hLA212抗体的重链H3的氨基酸序列(图45)
SEQ ID NO: 31：编码hLA212抗体的轻链L1的氨基酸序列的核苷酸序列(图46)
SEQ ID NO: 32：hLA212抗体的轻链L1的氨基酸序列(图47)
SEQ ID NO: 33：编码hLA212抗体的轻链L2的氨基酸序列的核苷酸序列(图48)
SEQ ID NO: 34：hLA212抗体的轻链L2的氨基酸序列(图49)
SEQ ID NO: 35：编码hLA212抗体的轻链L3的氨基酸序列的核苷酸序列(图50)
SEQ ID NO: 36：hLA212抗体的轻链L3的氨基酸序列(图51)
SEQ ID NO: 37：编码hLA212抗体的轻链L4的氨基酸序列的核苷酸序列(图52)
SEQ ID NO: 38：hLA212抗体的轻链L4的氨基酸序列(图53)
SEQ ID NO: 39：编码hLA212抗体的轻链L5的氨基酸序列的核苷酸序列(图54)
SEQ ID NO: 40：hLA212抗体的轻链L5的氨基酸序列(图55)
SEQ ID NO: 41：rLA204抗体的重链CDRH1的氨基酸序列(图56)
SEQ ID NO: 42：rLA204抗体的重链CDRH2的氨基酸序列(图57)
SEQ ID NO: 43：rLA204抗体的重链CDRH3的氨基酸序列(图58)
SEQ ID NO: 44：rLA204抗体的轻链CDRL1的氨基酸序列(图59)
SEQ ID NO: 45：rLA204抗体的轻链CDRL2的氨基酸序列(图60)
SEQ ID NO: 46：rLA204抗体的轻链CDRL3的氨基酸序列(图61)
SEQ ID NO: 47：rLA212抗体的重链CDRH1的氨基酸序列(图62)
SEQ ID NO: 48：rLA212抗体的重链CDRH2的氨基酸序列(图63)
SEQ ID NO: 49：rLA212抗体的重链CDRH3的氨基酸序列(图64)
SEQ ID NO: 50：rLA212抗体的轻链CDRL1的氨基酸序列(图65)
SEQ ID NO: 51：rLA212抗体的轻链CDRL2的氨基酸序列(图66)
SEQ ID NO: 52：rLA212抗体的轻链CDRL3的氨基酸序列(图67)
SEQ ID NO: 53：rLA225抗体的重链CDRH1的氨基酸序列(图68)
SEQ ID NO: 54：rLA225抗体的重链CDRH2的氨基酸序列(图69)
SEQ ID NO: 55：rLA225抗体的重链CDRH3的氨基酸序列(图70)
SEQ ID NO: 56：rLA225抗体的轻链CDRL1的氨基酸序列(图71)
SEQ ID NO: 57：rLA225抗体的轻链CDRL2的氨基酸序列(图72)
SEQ ID NO: 58：rLA225抗体的轻链CDRL3的氨基酸序列(图73)
SEQ ID NO: 59：rLA869抗体的重链CDRH1的氨基酸序列(图74)
SEQ ID NO: 60：rLA869抗体的重链CDRH2的氨基酸序列(图75)
SEQ ID NO: 61：rLA869抗体的重链CDRH3的氨基酸序列(图76)
SEQ ID NO: 62：rLA869抗体的轻链CDRL1的氨基酸序列(图77)
SEQ ID NO: 63：rLA869抗体的轻链CDRL2的氨基酸序列(图78)
SEQ ID NO: 64：rLA869抗体的轻链CDRL3的氨基酸序列(图79)
SEQ ID NO: 65：rLA1264抗体的重链CDRH1的氨基酸序列(图80)
SEQ ID NO: 66：rLA1264抗体的重链CDRH2的氨基酸序列(图81)
SEQ ID NO: 67：rLA1264抗体的重链CDRH3的氨基酸序列(图82)
SEQ ID NO: 68：rLA1264抗体的轻链CDRL1的氨基酸序列(图83)
SEQ ID NO: 69：rLA1264抗体的轻链CDRL2的氨基酸序列(图84)
SEQ ID NO: 70：rLA1264抗体的轻链CDRL3的氨基酸序列(图85)
SEQ ID NO: 71：引物RG2AR3 (图86)
SEQ ID NO: 72：引物RKR5 (图87)
SEQ ID NO: 73：引物3.3-F1 (图88)
SEQ ID NO: 74：引物3.3-R1 (图89)
SEQ ID NO: 75：引物RG2AR3 (图90)
SEQ ID NO: 76：引物RG2AR3 (图91)
SEQ ID NO: 77：引物RG2AR3 (图92)
SEQ ID NO: 78：引物RG2AR3 (图93)
SEQ ID NO: 79：寡核苷酸LAG-3-H1 (图94)
SEQ ID NO: 80：寡核苷酸LAG-3-H2 (图95)
SEQ ID NO: 81：寡核苷酸LAG-3-H3 (图96)
SEQ ID NO: 82：寡核苷酸LAG-3-H4 (图97)
SEQ ID NO: 83：寡核苷酸LAG-3-H5 (图98)
SEQ ID NO: 84：寡核苷酸LAG-3-H6 (图99)
SEQ ID NO: 85：编码人LAG-3的氨基酸序列的核苷酸序列(图100)
SEQ ID NO: 86：人LAG-3的氨基酸序列(图101)。

Claims (30)

1.单克隆抗体或其结合片段，其结合人LAG-3的结构域3并具有以下(ii)-(v)中所述的性质的一种或多种，以及(i)和(vi)中所述的性质：
(i) 具有体外ADCC活性；
(ii) 以低岩藻糖形式减少体内LAG-3阳性细胞的数量；
(iii) 以低岩藻糖形式抑制体内实验性自身免疫性脑脊髓炎；
(iv) 与人活化的T细胞结合；
(v) 在所述抗体或其结合片段的存在下，人LAG-3与II型人主要组织相容性复合体分子结合；和
(vi) 所述抗体或其结合片段的存在允许人LAG-3发挥人T细胞抑制功能。
2.根据权利要求1的抗体或其结合片段，其具有(ii)和/或(iii)中所述的性质。
3.根据权利要求1或2的抗体或其结合片段，其具有(ii)-(v)中所述的全部性质。
4.根据权利要求1-3中任一项的抗体或其结合片段，其为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
5.根据权利要求1-4中任一项的抗体或其结合片段，其包含：
轻链和重链，所述轻链包含具有SEQ ID NO: 50或图65所示的氨基酸序列的CDRL1，具有SEQ ID NO: 51或图66所示的氨基酸序列的CDRL2，和具有SEQ ID NO: 52或图67所示的氨基酸序列的CDRL3，和所述重链包含具有SEQ ID NO: 47或图62所示的氨基酸序列的CDRH1，具有SEQ ID NO: 48或图63所示的氨基酸序列的CDRH1，和具有SEQ ID NO: 49或图64所示的氨基酸序列的CDRH3。
6.根据权利要求4或5的抗体或其结合片段，其为人源化抗体。
7.根据权利要求6的抗体或其结合片段，其包含：
重链和轻链，所述重链包含源自SEQ ID NO: 28或图43所示的氨基酸序列的氨基酸序列，其中对应于68位的氨基酸为Gly或者被Ala取代，并且对应于103位的氨基酸是Asn或被Asp取代，所述轻链包含源自SEQ ID NO: 32或47所示的氨基酸序列的氨基酸序列，其中对应于21位的氨基酸为Asp或被Asn取代，对应于31位的氨基酸为Leu或被Met取代，对应于33位的氨基酸为Ala或被Ile取代，对应于41位的氨基酸为Ile或被Met取代，对应于58位的氨基酸是Gln或被Lys取代，对应于63位的氨基酸是Ala或被Ser取代，对应于80位的氨基酸为Ser或被Asp取代，对应于85位的氨基酸为Ser或被Gly取代，对应于87位的氨基酸为Ser或被Tyr取代，对应于98位的氨基酸为Leu或取代的对于Val，对应于103位的氨基酸是Phe或被Ala取代，对应于105位的氨基酸是Thr或被Phe取代，对应于124位的氨基酸是Val或被Leu取代，并且对应126位的氨基酸为Ile或被Leu取代。
8.根据权利要求6或7的抗体或其结合片段，其包含：
轻链可变区氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列，所述轻链可变区氨基酸序列包含选自SEQ ID NO: 32、34、36、38和40的氨基酸序列的氨基酸21至氨基酸129；所述重链可变区氨基酸序列包含选自SEQ ID NO: 28和30的氨基酸序列的氨基酸20至氨基酸140。
9.根据权利要求6-8中任一项的抗体或其结合片段，其包含：
轻链可变区氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列，所述轻链可变区氨基酸序列包含选自SEQ ID NO: 32、34、36、38和40的氨基酸序列的氨基酸21至氨基酸234；所述重链可变区氨基酸序列包含选自SEQ ID NO: 28和30的氨基酸序列的氨基酸20至氨基酸470。
10.根据权利要求6-9中任一项的抗体或其结合片段，其选自下述[i]-[x]：
[i] 抗体或其结合片段，其包含重链和轻链，所述重链具有由SEQ ID NO: 30 (图45)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列；所述轻链具有由SEQ ID NO: 34 (图49)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列；
[ii] 抗体或其结合片段，其包含重链和轻链，所述重链具有由SEQ ID NO: 28 (图43)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列；所述轻链具有由SEQ ID NO: 32 (图47)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列；
[iii]抗体或其结合片段，其包含重链和轻链，所述重链具有由SEQ ID NO: 30 (图45)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列；所述轻链具有由SEQ ID NO: 36 (图51)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列；
[iv] 抗体或其结合片段，其包含重链和轻链，所述重链具有由SEQ ID NO: 28 (图43)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列；所述轻链具有由SEQ ID NO: 34 (图49)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列；
[v] 抗体或其结合片段，其包含重链和轻链，所述重链具有由SEQ ID NO: 28 (图43)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列；所述轻链具有由SEQ ID NO: 36 (图51)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列；
[vi] 抗体或其结合片段，其包含重链和轻链，所述重链具有由SEQ ID NO: 28 (图43)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列；所述轻链具有由SEQ ID NO: 38 (图53)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列；
[vii] 抗体或其结合片段，其包含重链和轻链，所述重链具有由SEQ ID NO: 28 (图43)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列；所述轻链具有由SEQ ID NO: 40 (图55)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列；
[viii] 抗体或其结合片段，其包含重链和轻链，所述重链具有由SEQ ID NO: 30 (图45)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列；所述轻链具有由SEQ ID NO: 32 (图47)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列；
[ix] 抗体或其结合片段，其包含重链和轻链，所述重链具有由SEQ ID NO: 30 (图45)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列；所述轻链具有由SEQ ID NO: 38 (图53)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列；
[x] 抗体或其结合片段，其包含重链和轻链，所述重链具有由SEQ ID NO: 30 (图45)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列；所述轻链具有由SEQ ID NO: 40 (图55)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列。
11.根据权利要求1的抗体或其结合片段，其包含：
轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和重链可变区包含分别与根据权利要求10的抗体或其结合片段的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列具有95％或更高同一性的氨基酸序列。
12.根据权利要求1的抗体或其结合片段，其包含：
由第二核酸分子的核苷酸序列编码的轻链可变区氨基酸序列和由第四核酸的核苷酸序列编码的重链可变区氨基酸序列，其中所述第二核酸分子在严格条件下与第一核酸分子杂交，所述第一核酸分子具有编码根据权利要求10的抗体或其结合片段的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列，和所述第四核酸分子在严格条件下与第三核酸分子杂交，所述第三核酸分子具有编码权利要求10的抗体或其结合片段的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列。
13.根据权利要求1的抗体或其结合片段，其具有以下(i)或(ii)中所述的性质:
(i) 结合人LAG-3的结构域3上的位点，其中所述位点被根据权利要求10的抗体或其结合片段识别；或
(ii) 与根据权利要求10的抗体或其结合片段竞争结合人LAG-3的结构域3。
14.根据权利要求1-13中任一项的抗体或其结合片段，其为低岩藻糖形式。
15.分子，其包含权利要求1-14中任一项的抗体或其结合片段。
16.包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列编码权利要求1-14中任一项的抗体或其结合片段的氨基酸序列。
17.载体，其包含根据权利要求16的核酸分子。
18.细胞，其包含根据权利要求16的核酸分子或根据权利要求17的载体。
19.细胞，其产生根据权利要求1-14中任一项的抗体或其结合片段。
20.产生权利要求1-14中任一项的抗体或其结合片段的方法，其包括培养根据权利要求18或19的细胞的步骤。
21.通过根据权利要求20的方法制备的抗体或其结合片段。
22.组合物，其包含根据权利要求1-14和21中任一项的抗体或其结合片段，或根据权利要求15的分子。
23.药物组合物，其包含根据权利要求1-14和21中任一项的抗体或其结合片段，或根据权利要求15的分子。
24.根据权利要求23的药物组合物，其用于治疗或预防自身免疫疾病。
25.根据权利要求24所述的药物组合物，其中所述自身免疫疾病是选自以下一种或两种或更多种的疾病：***和肌肉骨骼***的自身免疫疾病、血液***的自身免疫疾病、消化***的自身免疫疾病、神经***疾病的自身免疫疾病、视觉***的自身免疫疾病、血管***的自身免疫疾病、表皮***的自身免疫疾病、呼吸***的自身免疫疾病、内分泌***的自身免疫疾病、自身免疫性肝炎和由免疫疾病引起的肾炎。
26.根据权利要求25所述的药物组合物，其中所述***和肌肉骨骼***的自身免疫疾病是选自类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、***性红斑狼疮、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、包涵体肌炎和特发性炎症性肌病，如免疫介导的坏死性肌病中的一种或两种或更多种；所述血液***的自身免疫疾病是选自再生障碍性贫血和特发性血小板减少性紫癜中的一种或两种或更多种；所述消化***的自身免疫疾病是选自克罗恩病和溃疡性结肠炎中的一种或两种或更多种；所述神经***的自身免疫疾病是选自多发性硬化症和重症肌无力的一种或两种或更多种；所述视觉***的自身免疫疾病是选自葡萄膜炎，角膜炎和干燥综合征的一种或两种或多种；所述血管***的自身免疫疾病是选自贝切特氏病和韦格纳肉芽肿病中的一种或两种或更多种；所述表皮***的自身免疫疾病是选自牛皮癣、天疱疮、史-约综合征和白癜风中的一种或两种或更多种；所述呼吸***的自身免疫疾病是选自慢性阻塞性肺病和间质性肺炎中的一种或两种或更多种；所述内分泌***的自身免疫疾病是选自1型糖尿病、自身免疫性甲状腺炎、格雷夫斯病和桥本氏甲状腺炎中的一种或两种或更多种。
27.根据权利要求23的药物组合物，其用于治疗或预防移植物排斥。
28.根据权利要求27的药物组合物，其中所述移植物排斥是在选自心脏、肾脏、肝脏、骨髓及其皮肤或组织的器官移植中的排斥和宿主抗移植物反应，和/或由选自以下的造血细胞移植引起的移植物抗宿主疾病：骨髓的移植；外周血的移植；和脐带血的移植。
29.根据权利要求24-28中任一项的药物组合物，其与选自以下的一种或两种或更多种组合：抗叶酸剂、钙依赖磷酸酶抑制剂、皮质类固醇、抗胸腺细胞球蛋白、核酸抗代谢物、核酸合成抑制剂、靶向细胞表面抗原的生物制剂、靶向细胞因子或细胞因子受体的生物制剂、静脉内免疫球蛋白和血浆置换。
30.根据权利要求23的药物组合物，用于治疗或预防过敏性疾病、恶性肿瘤和/或慢性感染。
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