KR20150013935A - 트랜스포터에 대한 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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다카시 마수코
신이치로 니와
히데미 하야시
다이 오구라
다카유키 신도우
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갓코 호진 긴키 다이가쿠
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Abstract

본 발명은, 인간 LAT1/CD98에 결합할 수 있고, 암 세포에 대해 특이적으로 항체 의존성 세포장해를 유발하는 신규 항체를 유효성분으로 함유하는, 현재 치료 곤란한 고형 종양을 비롯한 각종 악성종양의 예방 또는 치료제를 제공한다.

Description

트랜스포터에 대한 항체 및 이의 용도{ANTIBODY AGAINST TRANSPORTER AND USE THEREOF}
본 발명은, LAT1/CD98복합체의 세포외 영역에 특이적으로 결합하고, 직접적으로 아미노산 수송 활성을 억제 또는 림파구와 공동으로 간접적으로 세포장해성 인자를 유도함으로서, 종양세포를 세포사로 이끄는 항LAT1/CD98 단일클론 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항체 및/또는 면역복합체(immunoconjugate)조성물 및 종양을 치료하는 것, 예방하는 것 및/또는 진단하는 것에 있어서 이들의 사용에 관한 것이다.
생물은 생명의 유지활동에 필요한 영양소와 시그널 전달물질 등을 취득하기 위해 다양한 메커니즘을 가지고 있으며, 개개의 세포막상에 다양하게 존재하는 수송체와 수용체는 그 하나의 예이다. 그 중에서도, 생체를 구성하는 주요요소인 아미노산의 수송에 대해서는, 1960년대부터 연구가 이루어져 왔다. 1990년에 들어서부터 아미노산 수송을 담당하는 분자가 동정되기 시작하여, 현재에는 약 30종류 정도 지배유전자가 동정되어 있다. 이들 수송체는 수송하는 아미노산의 성질에 따라, 염기성 아미노산 수송체, 중성 아미노산 수송체, 산성 아미노산 수송체의 3종류로 크게 나눠지나, CD98과의 헤테로이량체형 아미노산 수송체는 이하에서 설명하는 LAT1을 포함하여 6종류이다.
LAT1은 다른 수송체에 비해 비교적 넓은 기질특이성을 갖고, 나트륨 비의존적인 중성 아미노산 수송체이다. 1998년에 클로닝된 12회 막관통형 단백질로, 세포막 표면에 존재한다. 6종류의 CD98Ic 중 하나이며, 1회 막관통 단백질인 4F2hc(CD98)과 디술피드 결합함으로서 헤테로이량체를 형성하고, 아미노산 수송의 활성을 나타낸다. 4F2hc는 특정 수송체에 연결하여 세포막까지 이행시키는 샤페론 유사 분자이다(예를 들어, 카나이 요시카즈, 단백질 핵산 효소 Vol. 46, No. 5, pp. 629-637, 2001).
현재까지 LAT1/CD98복합체가 종양세포에 있어서 고발현하고 있다는 사례가 다수 보고되고 있다(Yanagida et al., Biochimica et Biophysica Acta Vol. 1514, pp. 291-302, 2001, Ohno et al., Cancer Sci. Vol. 99, No. 5, pp. 1000-1007, 2008, Kaira et al., Cancer Sci. Vol. 99, No. 12, pp. 2380-2386, 2008, Kaira et al., Cancer Sci. Vol. 100, No. 2, pp. 249-354, 2009). 아미노산은 세포증식에 있어서 불가결한 물질이고, 무질서하게 증식을 반복하는 종양세포는 통상보다 많은 아미노산을 필요로 한다고 생각된다. 그 때문에, 정상세포보다도 종양세포에서 아미노산 수송의 발현량이 증가하고 있는 것으로 추측된다. 따라서 LAT1/CD98복합체는 종양 치료의 표적 분자로서 유용함을 시사한다.
LAT1/CD98복합체에 대해 특이적으로 결합하여 활성을 저해하는, 또는 세포장해를 유도하는 단일클론 항체는 분자 표적 약으로서 유망하다고 생각되지만, 항체 의약의 성질상, LAT1/CD98복합체의 세포외 영역을 인식하는 항체일 필요가 있다. 지금까지, CD98을 특이적으로 인식하는 항체는 몇몇 보고되고 있지만(Haynes et al., J Immunol. 1981 Apr; 126(4):1409-14. Masuko et al., Jpn J Cancer Res. 1985 May;76(5):386-94), LAT1/CD98복합체의 세포외 영역을 에피토프로 하는 항체로서 유일하게 보고가 있을 뿐이다(특개 2011-24537). 그러나, 특개 2011-24537에 개시된 항체는 인간을 치료하기 위해서는 항체 역가가 충분하지 않고, 항종양제로서 실용화하기에는 불충분하다.
따라서, LAT1/CD98복합체의 세포외 영역을 에피토프로 인식하는 항체(「항LAT1/CD98항체」)로서 보다 뛰어난 것이 요구되고 있다.
이와 같은 상황에 비추어, 본 발명은, 종양세포 특이적으로 고발현을 보이는 LAT1/CD98복합체의 세포외 영역을 인식하고, 그 활성을 저해 또는 세포장해성 인자를 유도함으로서 종양세포를 세포사로 유도하는 단일클론 항체를 제공한다. 또한, 본 발명의 항체를 생산하는 하이브리도마, 본 발명의 항체와 세포파괴 활성 및/또는 항종양 활성을 갖는 화합물 또는 방사성 동위체와의 복합체(면역복합체)를 제공한다.
본 발명자들은 특개 2011-24537에 개시된 항LAT1/CD98항체의 CDR의 아미노산 서열과는 다른 CDR아미노산 서열을 갖고, LAT1/CD98복합체의 세포외 영역에 대한 결합성이 현저하게 보다 뛰어난 항LAT1/CD98항체의 제작에 성공하였다. 또한 해당 항체가 현저한 세포장해 유도활성 및 내재화(internalization) 활성을 갖는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 이하를 제공한다.
〔1〕LAT1/CD98을 발현하는 세포의 LAT1/CD98복합체의 세포외 영역에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원결합 단편으로,
(1)경쇄 상보성 결정영역 1(CDRL1), 경쇄 상보성 결정영역 2(CDRL2) 및 경쇄 상보성 결정영역 3(CDRL3)으로서, 각각 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 아미노산 서열, 또는 서열번호 7, 서열변호 8 및 서열번호 9의 아미노산 서열에 1개 또는 수개의 아미노산 잔기의 변이를 각각 갖는 아미노산 서열을 포함하고,
중쇄 상보성 결정영역 1(CDRH1), 중쇄 상보성 결정영역 2(CDRH2) 및 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3)으로서, 각각 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12의 아미노산 서열, 또는 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12의 아미노산 서열에 1개 또는 수개의 아미노산 잔기의 변이를 각각 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원결합 단편,
(2)CDRL1, CDRL2 및 CDRL3으로서, 각각 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호15의 아미노산 서열, 또는 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15의 아미노산 서열에 1개 또는 수개의 아미노산 잔기의 변이를 각각 갖는 아미노산 서열을 포함하고,
CDRH1, CDRH2 및 CDRH3으로서, 각각 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18의 아미노산 서열, 또는 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18의 아미노산 서열에 1개 또는 수개의 아미노산 잔기의 변이를 각각 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원결합 단편,
(3)CDRL1, CDRL2 및 CDRL3으로서, 각각 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21, 또는 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21의 아미노산 서열에 1개 또는 수개의 아미노산 잔기의 변이를 각각 갖는 아미노산 서열을 포함하고,
CDRH1, CDRH2 및 CDRH3으로서, 각각 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24의 아미노산 서열, 또는 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24의 아미노산 서열에 1개 또는 수개의 아미노산 잔기의 변이를 갖는 각 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원결합 단편, 또는
(4)CDRL1, CDRL2 및 CDRL3으로서, 각각 서열번호 25, 서열번호 26 및 서열번호 27의 아미노산 서열, 또는 서열번호 25, 서열번호 26 및 서열번호 27의 아미노산 서열에 1개 또는 수개의 아미노산 잔기의 변이를 각각 갖는 아미노산 서열을 포함하고,
CDRH1, CDRH2 및 CDRH3으로서, 각각 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30의 아미노산 서열, 또는 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30의 아미노산 서열에 1개 또는 수개의 아미노산 잔기의 변이를 각각 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원결합 단편.
〔2〕LAT1/CD98을 발현하는 세포의 LAT1/CD98복합체의 세포외 영역에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원결합 단편으로,
(1)X1ASQX2VGNNVA(서열번호 1)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정영역 1(CDRL1),
(2)YASX3RX4T(서열번호 2)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정영역 2(CDRL2),
(3)QRX5YKSPYT(서열번호 3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정영역 3(CDRL3),
(4)GFSLPTSSVS(서열번호 4)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정영역 1(CDRH1),
(5)VIWSNGNTDYSSX6X7KS(서열번호 5)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정영역 2(CDRH2) 및
(6)NFRNX8PGVMDA(서열번호 6)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3)
(단, X1 내지 X8은, 임의의 천연에 존재하는 아미노산 잔기이다)
를 포함하는, 항체 또는 이의 항원결합 단편.
〔3〕X1이 R 또는 K 이고,
X2가 N 또는 T 이고,
X3이 S 또는 N 이고,
X4가 H 또는 N 이고,
X5가 V 또는 I 이고,
X6이 A 또는 R 이고,
X7이 I 또는 F 이고,
X8이 D 또는 N 인, 항〔2〕에 기재된 항체 또는 이의 항원결합 단편.
〔4〕(1)X1이 R, X2가 N, X3이 N, X4가 N, X5가 I, X6이 A, X7이 I, X8이 D이거나,
(2)X1이 K, X2가 N, X3이 S, X4가 H, X5가 V, X6이 R, X7이 F, X8이 D이거나,
(3)X1이 K, X2가 T, X3이 S, X4가 H, X5가 V, X6이 R, X7이 F, X8이 D이거나 또는,
(4)X1이 K, X2가 N, X3이 S, X4가 H, X5가 V, X6이 R, X7이 I, X8이 N인, 항〔2〕에 기재된 항체 또는 이의 항원결합 단편.
〔5〕항〔1〕내지〔4〕중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 이의 항원결합 단편으로,
(1)서열번호 31의 아미노산 서열과 90%이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역(LH) 및
서열번호 31의 아미노산 서열과 90%이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역(VL),
(2)서열번호 33의 아미노산 서열과 90%이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역(LH) 및
서열번호 34의 아미노산 서열과 90%이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역(VL),
(3)서열번호 35의 아미노산 서열과 90%이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역(LH) 및
서열번호 36의 아미노산 서열과 90%이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역(VL) 또는
(4)서열번호 37의 아미노산 서열과 90%이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역(LH) 및
서열번호 38의 아미노산 서열과 90%이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역(VL),
을 함유하는, 항체 또는 이의 항원결합 단편.
〔6〕항〔1〕내지〔5〕중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 이의 항원결합 단편으로,
(1)서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역(VL) 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역(VH),
(2)서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역(VL) 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역(VH),
(3)서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역(VL) 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역(VH), 또는
(4)서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역(VL) 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역(VH),
을 함유하는, 항체 또는 이의 항원결합 단편.
〔7〕LAT1/CD98을 발현하는 세포에 대한 세포장해 활성 및/또는 내재화 활성을 갖는, 항〔1〕내지〔6〕중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 이의 항원결합 단편.
〔8〕아형(subclass)이 IgG인, 항〔1〕내지〔7〕중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 이의 항원결합 단편.
〔9〕상기IgG가, IgG2a 또는 IgG1인 항〔8〕에 기재된 항체 또는 이의 항원결합 단편.
〔10〕상기항원결합 단편이 Fab, Fab’, F(ab’)2, scFv, dsFv, ds-scFv, 이들의 이량체, 미니바디(minibodies), 디아바디(diabodies) 및 다량체(multimer) 또는 이중특이성 항체 단편인, 항〔1〕내지〔9〕중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 이의 항원결합 단편.
〔11〕단일클론 항체인, 항〔1〕내지〔10〕중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 이의 항원결합 단편.
〔12〕래트, 마우스, 영장류 또는 인간 항체인, 항〔1〕내지〔11〕중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 이의 항원결합 단편.
〔13〕키메라 항체 또는 인간화 항체인, 항〔1〕내지〔11〕중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 이의 항원결합 단편.
〔14〕항〔1〕내지〔13〕중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 이의 항원결합 단편과 적어도 한 개의 세포독성 약, 항종양제 및 방사성 동위체를 포함하여 이루어진 면역복합체.
〔15〕항〔1〕내지〔14〕중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 이의 항원결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산분자.
〔16〕항〔15〕에 기재된 핵산분자를 포함하는 발현 벡터.
〔17〕항〔15〕에 기재된 핵산분자를 포함하거나 또는 해당 핵산분자를 도입한, 항 〔1〕내지〔13〕중 어느 한 항에 기재된 항체를 생산하는, 하이브리도마 세포 또는 유전자 도입 세포.
〔18〕항〔17〕에 기재된 세포를 배양하여 얻어진 배양물로부터 LAT1/CD98복합체에 특이적으로 결합하는 항체를 채취하는 것을 포함하는, LAT1/CD98복합체의 세포외 영역에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체의 제조방법.
〔19〕항〔17〕에 기재된 세포로부터 항LAT1/CD98단일클론 항체를 코딩하는 유전자를 단리하고, 해당 유전자를 포함하는 발현 벡터를 구축하고, 해당 발현 벡터를 숙주에 도입하여 상기 단일클론 항체를 발현시켜, 얻어진 숙주, 숙주의 배양상청 또는 숙주의 분비물로부터 LAT1/CD98의 세포외 영역에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 채취하는 것을 포함하는, LAT1/CD98의 세포외 영역에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체의 제조방법.
〔20〕상기숙주가 대장균, 효모세포, 곤충세포, 포유동물세포, 식물세포 또는 포유동물인, 항〔19〕에 기재된 제조방법.
〔21〕항〔1〕내지〔14〕중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 이의 항원결합 단편 또는 면역복합체를 포함하는 조성물로, LAT1/CD98을 발현하는 세포에 적용하여 해당 세포의 아포토시스를 유도하기 위해 사용하는, 조성물.
〔22〕항〔1〕내지〔14〕중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 이의 항원결합 단편 또는 면역복합체를 함유하는, 종양의 예방 또는 치료를 위한 의약.
〔23〕항〔1〕내지〔14〕중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 이의 항원결합 단편 또는 면역복합체를 함유하는 조성물로, LAT1/CD98을 발현하는 세포를 검출하기 위해 사용하는, 조성물.
〔24〕항〔23〕의 조성물과 생체로부터 채취된 시료를 반응시켜, 반응한 시그널을 검출하는 것을 특징으로 하는, 종양의 검출방법.
〔25〕항〔23〕의 조성물을 암세포와 접촉하는 공정을 포함하는 시험관 내의 종양의 면역검출 방법.
〔26〕항〔23〕의 조성물을 개체에 투여하는 공정 및 근적외광 이미징, PET, MRI 또는 초음파 이미징에 의해 얻어진 검출 영상을 얻는 공정을 포함하는 생체 내에서의 종양의 영상화 방법.
〔27〕항〔1〕내지〔14〕중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 이의 항원결합 단편 또는 면역복합체를 함유하는, 종양의 진단을 위한 의약.
〔28〕상기종양이, 대장암, 결장직장암, 폐암, 유방암, 뇌종양, 흑색종, 신장세포암, 방광암, 백혈병, 림프종, T세포 림프종, 다발성 골수종, 위암, 췌장암, 자궁경암, 자궁내막암, 난소암, 식도암, 간암, 두경부 편평 상피암, 피부암, 요로암, 전립선암, 융모암, 인두암, 후두암, 설암, 구강암, 담낭암, 갑상선암, 중피종, 흉막종, 남성배세포종, 자궁내막 과형성, 자궁내막증, 배아종, 섬유육종, 카포지육종, 혈관종, 해면상 혈관종, 혈관아세포종, 망막아종, 성상세포종, 신경섬유종, 희돌기교종, 수아종, 신경아종, 신경교종, 횡문근육종, 교아종, 골원성육종, 평활근육종, 갑상선육종 및 윌름 종양으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1개 인, 항〔22〕또는 항〔27〕에 기재된 의약.
〔29〕이하의 (1) 내지 (6)으로 이루어진 군에서 선택되는 상보성 결정영역(CDR):
(1)서열번호 7, 13, 19 또는 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정영역 1(CDRL1),
(2)서열번호 8, 14, 20 또는 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정영역 2(CDRL2),
(3)서열번호 9, 15, 21 또는 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정영역 3(CDRL3),
(4)서열번호 10, 16, 22 또는 28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정영역 1(CDRH1),
(5)서열번호 11, 17, 23 또는 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정영역 2(CDRH2) 및
(6)서열번호 12, 18, 24 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3)
본 발명의 항체 또는 이의 항원결합 단편은, LAT1/CD98복합체의 세포외 영역을 특이적으로 인식하고, LAT1/CD98복합체의 활성을 저해 또는 LAT1/CD98복합체 발현세포에 있어서 세포장해성 인자를 유도하여 이의 세포사를 일으킬 수 있다. 또한, 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합 단편에 세포파괴 활성 및/또는 항종양 활성을 갖는 화합물 또는 방사성 동위체를 결합시킨 면역복합체에 의해, LAT1/CD98복합체 발현세포에 있어서, 세포사를 일으킬 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합 단편은, LAT1/CD98복합체의 세포외 영역을 특이적으로 인식할 수 있기 때문에, 항암항체 의약으로서 특히 유용하다. 본 발명은, 지금까지 보고되어 있는 LAT1/CD98복합체의 세포외 영역을 특이적으로 인식하는 항체에 비해 특히 현저한 효과를 나타낸다.
〔도 1〕도 1은 (A)인간 대장암 세포주(HCT116), 인간 폐암 세포주(NCI-H1944, A549), 인간 자궁경부암 세포주(HeLa)에 대한 LG9111단일클론 항체, LG9112단일클론 항체, LG9113단일클론 항체, LG9114단일클론 항체 및 LG tra01-01단일클론 항체의 결합성을 나타내는 도면이다. 붉은 선은 각 단일클론 항체를 반응시켰을 때의 히스토그램, 파란 선은 컨트롤로서 래트 IgG를 반응시켰을 때의 히스토그램을 나타낸다. (B) (A)에 기재된 히스토그램을 그래프에 의해 나타낸다. 값은, 항체반응시의 MFI(mean fluorescence intensity)로부터 컨트롤의 MFI를 뺀 값(△MFI)을 나타낸다.
〔도 2〕도 2는 (A)LG9111 인간 키메라 항체, LG9113 인간 키메라 항체를 이용한 ADCC활성을 나타내는 도면이다. 각 인간 키메라 활성을 각각, 1.25㎍/mL, 5㎍/mL, 20㎍/mL를 첨가한 상태 및 컨트롤로서 항체를 포함하지 않고, 효과기 세포와 표적 세포 만의 상태에서의 세포장해율(%)을 나타낸다. (B)LG9111 인간 키메라 항체, LG9113 인간 키메라 항체의 인간 대장암 세포주(HCT116), 인간 폐암 세포주(NCI-H1944)에 대한 ADCC 활성을 나타내는 도면이다.
〔도 3〕도 3은 (A)LG9111단일클론 항체, LG9112단일클론 항체, LG9113단일클론 항체, LG9114단일클론 항체의 내재화 활성을 나타내는 도면이다. (B) (A)에서 나타내는 내재화 활성이, 단일클론 항체가 벗겨진 것으로 인한 의양성이 아님을 나타내는 도면이다. 값은 37℃(내재화가 유도되는 온도) 및 4℃(내재화가 유도되지 않는 온도)의 각 조건하에서 단일클론 항체를 반응시켰을 때의 MFI로부터 래트 IgG를 반응시킨 컨트롤 MFI를 뺀 값(△MFI)을 나타낸다.
1. LAT1 / CD98 복합체의 세포외 영역을 특이적으로 인식하는 항체
본 발명은, 일 실시형태에 있어서, LAT1/CD98복합체의 세포외 영역에 특이적으로 결합하는 항체(본 명세서 중,「항LAT1/CD98항체」라고 부를 수도 있다.) 및 이의 항원결합 단편을 제공한다. 즉, 본 발명은, LAT1/CD98복합체의 세포외 영역의 아미노산 서열의 일부 또는 전부를 에피토프로 하는 항체 및 이의 항원결합 단편을 제공한다.
아미노산 수송계L의 첫번째 아이소폼인「인간 LAT1(L-type amino acid transporter 1)」은, 507개의 아미노산 잔기로 이루어진 12회 막관통형 막 단백질이다. 인간 LAT1의 아미노산 서열, mRNA서열 등의 정보는, 각각 AAD20464, AF104032 등의 취득번호로 GenBank 등의 공개적으로 접근가능한 데이터베이스로부터 입수할 수 있다. 또한, 마우스와 다른 포유동물(예를 들어, 래트, 소 등)의 LAT1도 동일하게, 공개적으로 접근가능한 데이터베이스로부터 입수할 수 있다.
인간 LAT1과 세포막상에서 복합체를 형성하는「인간 CD98」은, 630개의 아미노산 잔기로 이루어진 1회 막관통II형 막단백질이다. 인간 CD98의 아미노산 서열, mRNA 서열 등의 정보는, 각각 NP_002385, NM_002394 등의 취득번호로 GenBank 등의 공개적으로 접근 가능한 데이터베이스로부터 입수할 수 있다. 또한, 마우스와 다른 포유동물(예를 들어, 래트, 소 등)의 CD98도 동일하게, 공개적으로 접근가능한 데이터베이스로부터 입수할 수 있다.
본 명세서 중, 단지「LAT1/CD98」이라고 할 경우, LAT1/CD98복합체 단백질을 가리키는 것으로 한다. 경우에 따라서는, LAT1단백질 및 CD98단백질을 코딩하는 각각의 유전자(또는 단지 LAT1유전자 및 CD98유전자)를 단지 LAT1 및 CD98이라고 부르는 경우도 있을 수 있지만, 이 경우에는 당업자에게 있어서는 문백으로부터 LAT1유전자 및 CD98유전자를 가리키는 것이 명백하다. 본 명세서 중, LAT1 및 CD98은, 전형적으로는 인간 LAT1 및 인간 CD98이지만, 인간 이외의 포유동물(예를 들어, 마우스, 래트, 소 등)의 LAT1 및 CD98일 수 있다.
본 명세서 중,「LAT1/CD98의 세포외 영역」이란, 세포 표면에 LAT1/CD98이 발현된 경우에, 세포막의 세포질과는 반대 측(즉, 세포 외 측)의 세포 표면에 노출하는 LAT1/CD98의 영역을 말한다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합 단편이 LAT1/CD98의 세포외 영역에 결합해 있는지 아닌지는, 예를 들어, 본원 명세서의 실시예 2에 기재된 바와 같이, 인간 종양 세포주를 이용한 FCM(Flow Cytometry의 약기)해석에 의해 확인할 수 있다. 또한 LAT1의 세포외 영역으로서, UniProt 등의 공개적으로 접근가능한 데이터베이스에서는, 예를 들어, 71 내지 83번 위치의 아미노산 잔기, 141 내지 145번 위치의 아미노산 잔기, 191 내지 198번 위치의 아미노산 잔기, 264 내지 273번 위치의 아미노산 잔기, 340 내지 395번 위치의 아미노산 잔기, 452 내지 457번 위치의 아미노산 잔기에 걸친 영역이 아미노산 서열로부터 예측되고 있다.
본 명세서 중, 항체 또는 이의 항원결합 단편이, LAT1/CD98의 세포외 영역에「특이적으로 결합한다」란, 이 항체 또는 항원결합 단편이 다른 아미노산 서열에 대한 이의 친화성보다도, 이들 영역의 특정 아미노산 서열에 대해서 실질적으로 높은 친화성으로 결합하는 것을 의미한다. 여기서,「실질적으로 높은 친화성」이란, 원하는 측정장치에 의해 그 특정 아미노산 서열을 다른 아미노산 서열로부터 구별하여 검출하는 것이 가능할 정도로 높은 친화성을 의미하고, 전형적으로는, 결합 정수(Ka)가 적어도 107M-1, 바람직하게는 적어도 108M-1, 더 바람직하게는 109M-1, 보다 더 바람직하게는 1010M-1, 1011M-1, 1012M-1 또는 이보다 높은, 예를 들어, 최고로 1013M-1 또는 이보다 높은 것과 같은 결합 친화성을 의미한다.
본 명세서 중,「항체」는, 무처리의 면역 글로불린의 모든 형(class) 및 아형을 포함하는 것으로 한다. 바람직하게는 본 발명의 항체는, IgG 아형이고, 더 바람직하게는 인간 IgG1 아형이다.「항체」는 특히 단일클론 항체를 포함한다.
본 명세서 중,「항원결합 단편」은 무처리인 및/또는 인간화된 및/또는 키메라인 항체의 항원결합 영역 또는 가변영역을 갖는 단편, 예를 들어, 상기항체의 Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, ScFv 단편을 포함한다. 종래, 이런 단편은 무처리의 항체의 단백질 분해에 의해, 예를 들어, 파파인 분해에 의해(예를 들어, 국제공개WO94/29348을 참조)제작되고 있지만, 유전자 조작에 의한 형질전환 숙주세포로부터 직접 생산시킬 수도 있다. ScFv의 제작에 대해서는, Bird 등, (1988) Science, 242, 423-426에 기재된 방법을 사용할 수 있다. 또한, 항체 단편은 하기의 다양한 유전자공학 기술을 이용하여 제작할 수 있다.
Fv 단편은 이 2개의 사슬의 상호작용 에너지가 Fab 단편보다 낮다고 생각된다. VH 및 VL 도메인의 결합을 안정화하기 위해서, 이들의 도메인은 펩티드(Bird 등, (1988) Science 242, 423-426, Huston 등, PNAS, 85, 5879-5883), 디술피드 가교(Glockshuber 등, (1990) Biochemistry, 29, 1362-1367) 및 「knob in hole」변이 (Zhu 등, (1997), Protein Sci., 6, 781-788)에 의해 연결되어 있다. ScFv 단편은, 당업자에게 잘 알려져 있는 방법에 의해 제작할 수 있다(Whitlow 등, (1991) Methods companion Methods Enzymol, 2, 97-105 및 Huston 등, (1993) Int. Rev. Immuol 10, 195-217을 참조). ScFv는 대장균(E. coli)등의 세균 세포 내에서 생산시킬 수 있지만, 진핵세포 내에서 생산시키는 것이 바람직하다. ScFv의 불리한 점은 산물이 1가인 것, 그 때문에, 다가 결합에 의한 결합력의 증가가 불가능하게 되는 것, 및 반감기가 짧다는 것이다. 이러한 문제를 극복하기 위한 시도로는, 2가(ScFv’)2가 있지만, 이것은, 추가적인 C말단의 시스테인을 함유하는 ScFv로부터, 화학적 커플링에 의해(Adams 등, (1993) Can. Res 53, 4026-4034 및 McCartney 등, (1995) Protein Eng. 8, 301-314) 또는 짝을 안 지은 C말단 시스테인 잔기를 함유하는 ScFv의, 자연발생적인 부위 특이적 이량체화에 의해(Kipriyanov 등, (1995) Cell. Biophys 26, 187-204를 참조)제작된다. 또는, 펩티드 링커를 3 내지 12 잔기로 단축시켜「디아바디(diabody)」를 형성하게 함으로서, ScFv에 다량체를 형성시킬 수 있다. Holliger 등, PANS (1993), 93, 6444-6448을 참조. 링커를 더 작게 함으로서, ScFv 삼량체(「트리아바디」, Kortt 등, (1997) Protein Eng, 10, 423-433을 참조) 및 사량체(「테트라바디」, LeGall 등, (1999) FEBS Lett, 453, 164-168을 참조)를 가져올 수 있다. 2가 ScFv 분자의 구축은,「미니항체(miniantibody)」(Pack 등, (1992) BioChemistry 31, 1579-1584를 참조) 및 「미니바디」(Hu 등, (1996), Cancer Res. 56, 3055-3061을 참조)를 형성할 수 있는 단백질 이량체화 모티프와의 유전자 융합에 의해서도 달성할 수 있다. ScFv-ScFv 탠덤((ScFv)2)은 제3의 펩티드 링커에 의해 2개의 ScFv 단위를 연결함으로서 제작할 수도 있다(Kurucz 등, (1995) J. Immol. 154, 4576-4582를 참조). 이중특이성 디아바디는, 어느 항체의 VL 도메인에 짧은 링커로 연결된 다른 항체 유래의 VH 도메인으로 이루어진, 2개의 단일사슬 융합 산물의 비공유결합에 의해 제작할 수 있다(Kipriyanov 등, (1998), Int. J. Can 77, 763-772를 참조). 이와 같은 이중특이성 디아바디의 안정성은, 디술피드 가교 또는 상기의「knob in hole」변이를 도입함으로서 또는 2개의 하이브리드 ScFv 단편이 펩티드 링커를 통해 연결되는 단일사슬 디아바디(ScDb)를 형성하게 함으로서 높일 수 있다(Kontermann 등, (1999) J. Immunol. Methods 226 179-188을 참조). 4가의 이중특이성 분자는, 예를 들어, ScFv 단편을 IgG 분자의 CH3 도메인에 또는 힌지 영역을 통한 Fab 단편에, 융합시킴으로서 얻어진다(Coloma 등, (1997) Nature Biotechnol. 15, 159-163을 참조). 또는, 4가의 이중특이성 분자는 이중특이성 단일사슬 디아바디의 융합에 의해 제작되고 있다(Alt 등, (1999) FEBS Lett 454, 90-94를 참조). 보다 작은 4가의 이중특이성 분자는, 헬릭스-루프-헬릭스 모티프 함유 링커에 의한 ScFv-ScFv 탠덤의 이량체화(DiBi 미니항체, Muller 등, (1998) FEBS Lett 432, 45-49를 참조), 또는 분자 내 접합을 방해하는 배향으로 4개의 항체 가변영역(VH 및 VL)을 포함하는 단일사슬 분자의 이량체화(탠덤 디아바디, Kipriyanov 등, (1999) J. Mol. Biol. 293, 41-56을 참조)의 어느 하나에 의해 제작할 수도 있다. 이중특이성 F(ab’)2 단편은, Fab’단편의 화학적 커플링에 의해 또는 류신지퍼에 의한 헤테로 이량체에 의해 제작할 수 있다(Shalaby 등, (1992) J. Exp. Med. 175, 217-225 및 Kostelny 등, (1992), J. Immunol. 148, 1547-1553을 참조). 또한, 단리된 VH 및 VL 도메인(Domantis plc)도 이용할 수 있다.
본 명세서 중,「단일클론 항체」는, 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 얻을 수 있는 항체(또는 항체 단편)를 의미하는, 즉, 집단을 구성하는 개개의 항체가, 소량 존재할 수 있는 자연스럽게 생겨나는 가능한 돌연변이를 제외하고 동일하다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이고, 단일 항원 부분에 대한 것이다. 대체로 다른 결정기(에피토프)에 대한 다른 항체를 포함하는 다클론 항체 조제물과는 대조적으로, 각 단일클론 항체는, 항원상의 단일 결정기에 대한 것이다. 이들의 특이성 외에, 하이브리도마 배양에 의해 합성되고, 다른 면역글로불린으로 의한 혼입이 없다는 점에서, 단일클론 항체는 유리하다.「단일클론」이라는 수식어는, 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 얻어지는 항체의 특징을 나타내는 것으로, 어떤 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것을 의미하기 위한 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 다클론 항체는 Kohler 등, Nature, 256: 495〔1975〕에 최초로 기재된 하이브리도마법에 의해 작성할 수 있고, 제조합 DNA법(예를 들어, 미국특허 제4,816,567호 참조)에 의해 작성할 수 있다. 또한「단일클론 항체」는, 예를 들어, Clackson 등, Nature, 352: 624-628 〔1991〕및 Marks 등, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)에 기재된 기술을 이용하여, 파지항체 라이브러리로부터 단리한 항체 단편(Fv 클론)을 포함하는 항원 인식 및 결합부위의 클론을 포함한다.
「단일클론 항체」는「키메라」항체(면역글로불린)를 포함하고, 이는, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 종으로부터 유도된 또는 특정한 항체 형(class) 또는 아형에 속하는 항체에 대응하는 서열과 동일 또는 상동이지만, 사슬의 남은 부분은 다른 종으로부터 유도된 또는 다른 항체 형(class) 또는 아형에 속하는 항체 및 이들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 이들의 항체의 단편에 대응하는 서열과 동일 또는 상동하다(Morrison 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855〔1984〕).
비 인간(예를 들어, 마우스)항체의「인간화」형은, 비 인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 함유하는, 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이들의 단편(예를 들어, Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2 또는 항체의 다른 항원 결합성 서열)이다. 대부분에 있어서, 인간화 항체는, 인간 면역글로불린(수용 (recipient)항체)로, 이 수용의 CDR 유래의 잔기가, 마우스, 래트, 토끼, 영장류(예를 들어, 원숭이) 등의 인간 이외의 종의 CDR(도너(donor)항체)에 유래하는 원하는 특이성, 친화성 및 용량을 갖는 잔기로 치환되어 있다. 어떤 경우는, 인간 면역글로불린의 Fv 구조영역(FR)의 잔기가 대응하는 비 인간 잔기로 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체에서도, 이식된 CDR 또는 구조 서열에서도 볼 수 없는 잔기를 포함할 수 있다. 이들의 수식은, 항체의 성능을 더 정밀 또한 최적화하기 위해 마련된다. 일반적으로 인간화 항체는, CDR 영역의 모든 또는 실질적으로 모든 비 인간 면역글로불린인 것에 대응하고, FR영역의 모든 또는 실질적으로 모든 인간 면역글로불린 서열의 것인, 적어도 1개, 전형적으로는 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 함유할 수 있다. 또한, 최적의 인간화 항체는 면역글로불린 정상영역(Fc), 전형적으로는 인간 면역글로불린의 적어도 일부도 함유할 수 있다.
본 명세서 중,「LAT1/CD98의 활성」이란, 중성 아미노산 수송 활성, 아미노산 유사 약물 수송활성 등을 의미한다. LAT1/CD98의 아미노산 수송 활성은, 예를 들어, 표식 아미노산의 세포 내 흡수에 의해 측정할 수 있다.「LAT1/CD98의 활성을 저해한다」란, 상기의 LAT1/CD98의 활성을 현저하게 저하시키거나 또는 제거하는 것을 의미한다.「LAT1/CD98의 활성을 현저하게 저하시키거나 또는 저해한다」란, LAT1/CD98의 생물학적 활성의 적어도 5% 또는 그 이상 저하시키는 것을 의미한다.
본 명세서 중,「세포장해 활성」이란, 세포에 대해서 세포장해를 일으키는 능력을 의미하고, 본 발명의 경우, LAT1/CD98발현 세포에 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합 단편이 특이적으로 결합하여 해당 세포에 세포장해성 원인을 유도하고, 해당 세포를 세포사 또는 아포토시스에 이르게 하는 능력을 말하는 것으로 한다. 세포장해 활성은, 예를 들어, 본 발명의 실시예 2에 기재된 방법으로 측정하고, 세포장해율로서 평가할 수 있다.
본 명세서 중,「세포사」는,「아포토시스」를 의미한다.「아포토시스」는, 개체 발생의 프로그램, 데스인자(death factor)자극, 방사선 등에 의한 염색체 DNA의 중도의 손상, 이상 단백질의 축적 등에 의한 중도의 처방체 스트레스 등 다양한 생리적, 병리적 요인에 의해 유도되는 기능적, 능동적인 세포사의 전형이고, 세포체와 핵의 팽윤을 동반하는 괴사(네크로시스)와 반대로, 세포체와 핵의 수축과 단편화가 일어난다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원결합 단편의 예로서는,
(1)서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정영역 1(CDRL1)
(2)서열번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정영역 2(CDRL2)
(3)서열번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정영역 3(CDRL3)
(4)서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정영역 1(CDRH1)
(5)서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정영역 2(CDRH2) 및,
(6)서열번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3)중, 적어도 1개를 포함하는, LAT1/CD98을 발현하는 세포의 LAT1/CD98복합체의 세포외 영역에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원결합 단편을 들 수 있다.
본 명세서 중,「1개 또는 수개의 아미노산 잔기의 변이」란, 원래의 아미노산 서열 중의 1개 또는 수개(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개)의 아미노산 잔기가, 결실, 치환, 삽입 또는 첨가되어 있는 것을 의미한다. 이와 같은 변이의 존재에 의해, 대상 아미노산 서열은, 원래의 아미노산 서열에 대해서, 예를 들어 90%이상, 91%이상, 92%이상, 93%이상, 94%이상, 95%이상 96%이상, 97%이상, 98%이상 또는 99%이상의 동일성(%)을 가질 수 있다. 본 명세서 중, 이와 같은 변이를 원래의 아미노산 서열 중의 대응하는 위치에 있는 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 이의 항원결합 단편은, 원래의 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 이의 항원결합 단편과 동등한 생물학적 활성을 갖는다. 여기서,「동등한 생물학적 활성」으로서는, (i)원래의 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 이의 항원결합 단편이 특이적으로 결합하는 항원에 대해서 특이성을 가지고 결합하는 능력, (ii)LAT1/CD98의 아미노산 수송체 활성에 대한 저해능력, (iii)LAT1/CD98발현 세포상의 LAT1/CD98에 결합한 경우에, 해당 세포에 대한 세포장해 활성 또는 (iv)이들의 어느 2개 이상 또는 모두를 들 수 있다. 가장 바람직하게는,「동등한 생물학적 활성」이란, 상기(iv)를 의미한다. 또한 상기의「1개 또는 수개의 아미노산 잔기의 변이」에서 변이한 아미노산 잔기 수의 최고 한도는, 이와 같은 동등한 특이성을 유지할 수 있느냐 하는 기준(criteria)에 의해 제한된다.
일반적으로는, 천연에 존재하는 단백질을 구성하고 있는 아미노산은, 이들의 측쇄의 특성에 의해 군 분류가 가능하고, 예를 들어, 동일한 특성을 갖는 아미노산 군으로서는, 방향족 아미노산(티로신, 페닐알라닌, 트립토판), 염기성 아미노산(리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 아미노산(아스파라긴산, 글루타민산), 중성 아미노산(세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민), 탄산수소쇄를 갖는 아미노산(알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린) 및 그 외(글리신, 메티오닌, 시스테인)의 군 등으로 분류할 수 있다.
비 천연형의 아미노산도 포함시킨 서로 치환 가능한 아미노산 잔기의 예로서는, 하기와 같은 군 분류도 있으며, 동일 군에 포함되는 아미노산 잔기는 서로 치환 가능하다. A군: 류신, 이소류신, 노르로이신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, o-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 시클로헥실알라닌; B군: 아스파라긴산, 클루타민산, 이소아스파라긴산, 이소글루타민산, 2-아미노아디프산, 2-아미노수베르산; C군: 아스파라긴, 글루타민; D군: 리신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산, 2,3-디아미노프로피온산; E군: 프롤린, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린; F군: 세린, 스레오닌, 호모세린; G군: 페닐알라닌, 티로신, 트립토판.
또한, 아미노산 서열과 염기서열의 동일성은, 컬린 및 아서에 의한 알고리즘 BLAST(PNAS, 1990 (vol. 87) p2264; PNAS, 1993 (vol. 90) p5873)를 이용하여 결정할 수 있다. BLAST의 알고리즘에 의거한 BLASTN과 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(J Mol Biol, 1990 (vol. 215) p403). BLASTN을 이용하여 염기서열을 해석할 경우, 파라미터는, 예를 들어, 스코어=100, 단어길이=12로 한다. 또한, BLASTX를 이용하여 아미노산 서열을 해석하는 경우는, 파라미터는, 예를 들어 스코어=50, 단어길이=3으로 한다. BLAST와 Gapped BLAST 프로그램을 이용하는 경우는, 각 프로그램의 디폴트파라미터를 이용한다. 또는, 단백질의 아미노산 서열의 동일성을 구할 때, 비교하는 2종류의 단백질의 아미노산 서열을 배열하여, 육안으로 같은 아미노산 잔기인 부분의 수를 세는 것「(동일한 아미노산 잔기 수/단백질 전장의 아미노산 잔기 수)×100(%)」에 의해 구할 수도 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원결합 단편의 바람직한 예로서는,
(1)경쇄 상보성 결정영역 1(CDRL1), 경쇄 상보성 결정영역 2(CDRL2) 및 경쇄 상보성 결정영역 3(CDRL3)으로서, 각각 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 아미노산 서열, 또는 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 아미노산 서열에 1개 또는 수개의 아미노산 잔기의 변이를 각각 갖는 아미노산 서열을 포함하고,
중쇄 상보성 결정영역 1(CDRH1), 중쇄 상보성 결정영역 2(CDRH2) 및 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3)으로서, 각각 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12의 아미노산 서열, 또는 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12의 아미노산 서열에 1개 또는 수개의 아미노산 잔기의 변이를 각각 갖는 아미노산 서열을 포함하는, LAT1/CD98을 발현하는 세포의 LAT1/CD98복합체의 세포외 영역에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원결합 단편,
(2)CDRL1, CDRL2 및 CDRL3으로서, 각각 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15의 아미노산 서열, 또는 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15의 아미노산 서열에 1개 또는 수개의 아미노산 잔기의 변이를 각각 갖는 아미노산 서열을 포함하고,
CDRH1, CDRH2 및 CDRH3으로서, 각각 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18의 아미노산 서열, 또는 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18의 아미노산 서열에 1개 또는 수개의 아미노산 잔기의 변이를 각각 갖는 아미노산 서열을 포함하는, LAT1/CD98을 발현하는 세포의 LAT1/CD98복합체의 세포외 영역에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원결합 단편,
(3)CDRL1, CDRL2 및 CDRL3으로서, 각각 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21, 또는 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21의 아미노산 서열에 1개 또는 수개의 아미노산 잔기의 변이를 각각 갖는 아미노산 서열을 포함하고,
CDRH1, CDRH2 및 CDRH3으로서, 각각 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24의 아미노산 서열, 또는 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24의 아미노산 서열에 1개 또는 수개의 아미노산 잔기의 변이를 갖는 각 아미노산 서열을 포함하는, LAT1/CD98을 발현하는 세포의 LAT1/CD98복합체의 세포외 영역에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원결합 단편, 또는
(4)CDRL1, CDRL2 및 CDRL3으로서, 각각 서열번호 25, 서열번호 26 및 서열번호 27의 아미노산 서열, 또는 서열번호 25, 서열번호 26 및 서열번호 27의 아미노산 서열에 1개 또는 수개의 아미노산 잔기의 변이를 각각 갖는 아미노산 서열을 포함하고,
CDRH1, CDRH2 및 CDRH3으로서, 각각 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30의 아미노산 서열, 또는 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30의 아미노산 서열에 1개 또는 수개의 아미노산 잔기의 변이를 각각 갖는 아미노산 서열을 포함하는, LAT1/CD98을 발현하는 세포의 LAT1/CD98복합체의 세포외 영역에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원결합 단편을 들 수 있다.
또는, 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합 단편의 바람직한 예로서는,
(1)서열번호 31의 아미노산 서열과 90%이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역(LH) 및
서열번호 31의 아미노산 서열과 90%이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역(VL),
(2)서열번호 33의 아미노산 서열과 90%이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역(LH) 및
서열번호 34의 아미노산 서열과 90%이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역(VL),
(3)서열번호 35의 아미노산 서열과 90%이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역(LH) 및
서열번호 36의 아미노산 서열과 90%이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역(VL), 또는
(4)서열번호 37의 아미노산 서열과 90%이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역(LH) 및
서열번호 38의 아미노산 서열과 90%이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역(VL),
을 함유하는, LAT1/CD98을 발현하는 세포의 LAT1/CD98복합체의 세포외 영역에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원결합 단편을 들 수 있다.
또한, 상기 동일성의 퍼센테이지는, 구체적으로는, 예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%일 수 있다.
2. 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산
본 발명은, 다른 실시형태에 있어서, LAT1/CD98의 세포외 영역에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 핵산 분자는, RNA 또는 DNA이다. 본 발명의 핵산 분자는, 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합 단편을 제작하기 위해서 사용할 수 있다.
따라서, 이에 관련하는 본 발명의 다른 실시형태에서는, 본 발명의 하이브리도마 세포로부터 항LAT1/CD98단일클론 항체를 코딩하는 유전자를 단리하고 해당 유전자를 포함하는 발현 벡터를 구축하고, 해당 발현벡터를 숙주에 도입하여 상기단일클론 항체를 발현시켜, 얻어지는 숙주, 숙주의 배양상청 또는 숙주의 분비물로부터 LAT1/CD98의 세포외 영역에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 채취하는 것을 포함하는, LAT1/CD98의 세포외 영역에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원결합 단편을 코딩하는 DNA는, 통상의 방법을 이용하여(예를 들어, 마우스 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하고 있는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로서)간단하게 분리되어 서열결정된다. 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는, 이와 같은, DNA의 바람직한 공급원이 된다. 일단 분리되면, 제조합 숙주세포에서 단일클론 항체를 합성하기 위해서, 이 DNA를 발현 벡터에 삽입하고, 이를, 이 상황 이외에서는 항체 단백질을 생산하지 않는 대장균 세포, 인간 HEK293 태아신장 유래 세포, 원숭이COS 세포, 차이니즈헴스터 난소(CHO)세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주세포로 형질주입할 수 있다. 예를 들어, 상동적인 마우스 서열을 인간 중쇄 및 경쇄 정상 도메인의 서열로 치환함으로서(Morrison 등, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81: 6851〔1984〕), 또는 면역글로불린 코드화 서열에 비 면역글로불린 폴리펩티드의 코딩 서열의 전부 또는 일부를 공유결합하게 함으로서, 이 DNA를 수식할 수 있다. 본 발명의 항LAT1/CD98단일클론 항체의 결합 특이성을 갖도록,「키메라」또는「하이브리드」항체는 조제된다.
3. 본 발명의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포
본 발명은 또 다른 실시형태에 있어서, LAT1/CD98의 세포외 영역에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원결합 단편을 생산하는 하이브리도마 세포를 제공한다. 본 발명은 또한, LAT1/CD98의 세포외 영역에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원결합 단편을 코딩하는 핵산분자를 함유하는 하이브리도마를 제공한다.
본 발명의 하이브리도마 세포의 조제는, 구체적으로는, 이하와 같이 수행할 수 있지만, 이 방법에 한정되는 것은 아니다.
(1)항원의 조제
항LAT1/CD98단일클론 항체를 제작하기 위해 필요한 항원으로서는, LAT1/CD98을 생산하는 세포 또는 이의 세포분획 등을 이용할 수 있다.
(2)동물의 면역과 항체생산 세포의 조제
6 내지 24주령의 마우스 또는 래트에, (1)에서 나타낸 방법으로 제작된 항원을 면역하여, 이 동물의 비장, 림프절, 말초혈에서 항체생산 세포를 채취한다. 면역은 동물의 피하 또는 정맥 내 또는 복강 내에, 적당한 보조제〔예를 들어, 프로인트 완전 보조제 또는 수산화 알루미늄겔과 백일해균 백신 등〕와 함께 항원을 투여함으로서 수행한다. 항원의 투여는, 1회째의 투여 후, 2 내지 3주 간격으로 3 내지 7회 수행한다. 각 투여 후, 5 내지 10일째에 안저정맥총으로부터 채혈하여, 이 혈청이 항원과 반응하는 것을 효소면역 측정법〔효소면역 측정법(ELISA 법): 의학서원간 1976년〕등으로 조사한다. 항원에 대해서, 이 혈청에 있어서 충분한 항체가를 나타낸 마우스 또는 래트를, 항체 생산세포의 공급원으로서 제공한다. 비장 세포를 골수종 세포와의 융합에 이용함에 있어서, 항원물질의 최종 투여 후, 3 내지 4일째에 면역한 마우스 또는 래트로부터 비장을 적출하고, 비장 세포를 채취한다. 비장을 혈청 무첨가의 기초 배지(이하 세척용 배지라고 한다.) 안에서 작게 자르고, 원심분리하여 세포를 회수 후, 트리스 염화 암모늄 완충액(pH 7.65)으로 2내지 3분간 처리하여 적혈구의 제거를 수행하고, 세척용 배지로 세척한 후에 융합용 비장 세포로서 제공한다.
(3)골수종 세포의 조제
골수종 세포로서는, 마우스로부터 얻어진 주화세포를 사용한다. 예를 들어, 8-아자구아닌 내성 마우스(BALB/c 유래)골수종 세포주 P3-X63Ag8-U1(P3-U1)〔Current Topics in Microbiology and immunology-1, European J. Immunology, 6, 511-519 (1976)〕, SP2/0-Ag14(SP-2)〔Nature 276, 269-270 (1978)〕, P3-X63-Ag8653 (653) 〔J. Immunology 123, 1548-1550 (1979)〕, P3-X63-Ag8(X63)〔Nature 256, 495-497 (1975)〕등이 이용된다. 이들 세포주는, 8-아자구아닌 배지〔RPMI-1640 배지에 글루타민(1.5 mM), 2-메르캅토에탄올(5×10-5M), 겐타마이신(10㎍/ml) 및 소태아혈청(FCS)을 10%첨가한 배지(이하, 정상 배지라고 한다.) 에, 8-아자구아닌(15㎍/ml)을 더 첨가한 배지〕로 계대하지만, 세포융합의 3 내지 4일 전에 정상 배지로 계대하여, 융합 당일 2×107개 이상의 세포 수를 확보한다.
(4)세포 융합
(2)에서 면역한 항체 생산 세포와 (3)에서 얻어진 골수종 세포를 세척용 배지 또는 PBS(인산이나트륨 1.83g, 인산일칼륨 0.21g, 식염 7.65g, 증류수 1리터, pH 7.2)로 잘 세척하고, 세포 수가, 항체 생산 세포: 골수종 세포=5 내지 10:1이 되도록 혼합시킨다. 세포 회수 후, 세포를 잘 풀어 교반하면서, 37℃에서, 폴리에틸렌 글리콜-1.500(PEG-1500)2 g, 세척용 배지 2 ml 및 디메틸술폭시드 0.7 mL의 혼합액 0.2 내지 1 ml/108항체 생산 세포를 첨가하고, 1 내지 2분간마다 세척용 배지 1 내지 2 ml를 수회 첨가하여 전량이 50 ml가 될 때까지 세척한다. 세포회수 후, 천천히 세포를 풀면서 HAT 배지〔정상 배지에 하이포크산틴(10-4M), 티미딘(1.5×10-5M) 및 아미놉테린(4×10-7M)을 첨가한 배지〕100 ml 중에 현탁한다. 이 현탁액을 96웰 배양용 플레이트에 100㎕/웰 씩 분배하고, 5% CO2 인큐베이터 안, 37℃에서 7 내지 14일간 배양한다. 배양 후, 배양상청의 일부를 덜어, 예를 들어, FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorting의 약기)등을 이용하여, LAT1/CD98단백질에 특이적으로 반응하는 항체를 선택한다. 그 다음에, 한계희석법에 의해 클로닝을 2회 반복하여〔1회째는, HT배지(HAT배지로부터 아미노프테린을 제거한 배지), 2회째는, 정상 배지를 사용한다〕, 안정되고 강한 항체가가 인정된 것을 항LAT1/CD98단일클론 항체 생산 하이브리도마주로 선택한다.
따라서, 이에 관련하는 본 발명의 다른 실시형태에서는, 하이브리도마 세포를 배양하고, 얻어진 배양물로부터 LAT1/CD98에 특이적으로 결합하는 항체를 채취하는 것을 포함하는, LAT1/CD98의 세포외 영역에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체의 제조방법이 제공된다.
4. 본 발명의 항체 면역복합체
본 발명은 또한, 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체 및 이의 항원결합 단편에 세포 파괴 활성 및/또는 항종양 활성을 갖는 화합물 또는 방사성 동위체를 결합시킨 면역복합체를 제공한다.
본 발명의 항체는, LAT1/CD98을 발현하는 표적 종양 세포내로의 내재화 활성에 뛰어나다. 그 때문에, 세포 파괴 활성 및/또는 항종양 활성을 갖는 화합물을 결합시킨 면역복합체는, 이들 화합물을 종양세포에 직접 또한 선택적으로 작용시킬 수 있다.
5. 의약조성물
본 발명은 또한, 또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합 단편, 또는 이들과의 면역복합체를 유효성분으로서 함유하는, 종양의 예방 또는 치료 또는 진단을 위한 의약 조성물을 제공한다. 본 발명의 의약 조성물은 또한 의약적으로 허용할 수 있는 담체를 함유한다.
후술의 실시예에서 나타내는 바와 같이, 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합 단편은, LAT1/CD98을 발현하는 세포(예: 종양세포)의 LAT1/CD98의 세포외 영역에 특이적으로 결합하여 LAT1/CD98의 활성을 저해하거나, 또는 세포장해 인자를 유도하여 해당 세포를 세포사로 이르게 할 수 있다. 또한, 내재화 활성을 갖기 때문에, 세포 파괴 활성 및/또는 항종양 활성을 갖는 화합물을 결합시킨 면역복합체는, 이들의 화합물을 종양세포에 직접 또한 선택적으로 작용시킬 수 있다. 이와 같은 화합물로서는, 예를 들어, 세포독성 약, 항종양제 또는 방사성 동위체를 들 수 있다. 따라서 본 발명의 의약 조성물은, LAT1/CD98을 세포 표면에 발현하는 종양세포를 사멸시키기 때문에, 또는 그와 같은 세포에서 특징지어진 종양 및 동일한 기전에 의해 발생하는 질환의 예방 또는 치료를 위해 사용할 수 있다.
상기「종양」의 예로서는, 대장암, 결장직장암, 폐암, 유방암, 뇌종양, 흑색종, 신장세포암, 방광암, 백혈병, 림프종, T세포 림프종, 다발성 골수종, 위암, 췌장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 식도암, 간암, 두경부 편평 상피암, 피부암, 요로암, 전립선암, 융모암, 인두암, 후두암, 설암, 구강암, 담낭암, 갑상선암, 중피종, 흉막종, 남성배세포종, 자궁내막 과형성, 자궁내막증, 배아종, 섬유육종, 카포지육종, 혈관종, 해면상 혈관종, 혈관아세포종, 망막아종, 성상세포종, 신경섬유종, 희돌기교종, 수아종, 신경아종, 신경교종, 횡문근육종, 교아종, 골원성육종, 평활근육종, 갑상선육종 및 윌름 종양 등을 들 수 있다. 더 바람직하게는, 대장암, 결장직장암, 폐암, 유방암, 뇌종양, 방광암, 림프종, 위암, 췌장암, 간장암 및 전립선암을 들 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합 단편을 의약으로서 사용할 경우는, 일반적으로 사용되는 수단에 따라 제제화할 수 있다. 예를 들어, 해당 항체 또는 이의 항원결합 단편은, 수용액 또는 그 이외의 약학적으로 허용할 수 있는 액체와의 무균성 용액 또는 현탁액제 등의 주사제의 형태로 비 경구적으로 사용할 수 있고, 또한 해당 항체를 IgA화 하여, 분비 성분을 결합시킨 후에 필요에 따라, 당의를 입힌 정제, 캡슐제, 엘릭시르제, 마이크로 캡슐제 등으로서 경구적으로, 예를 들어, 해당 항체 또는 이의 항원결합 단편을 생리학적으로 인정된 공지의 담체, 향미제, 부형제, 베히클, 방부제, 안정제, 결합제 등과 함께 일반적으로 인정된 제제 실시에 요구되는 단위용량 형태로 혼합함으로서 제조할 수 있다. 이들 제제의 유효 성분량은 지시된 범위의 적당한 용량을 얻을 수 있도록 하는 것이다.
「의약적으로 허용할 수 있는」이라는 용어는, 정상적인 의약적 판단의 범위 내에서, 합리적인 수혜/위험 비율을 갖고, 과도의 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 그 외의 문제 또는 합병증을 나타내지 않는, 인간 및 동물의 조직과 접촉시켜서 사용하는데 적합한, 화합물, 재료, 조성물 및/또는 제형을 가리키기 위해, 본 명세서에서 이용된다.
본 발명의 종양의 예방 또는 치료를 위한 의약 조성물의 투여 경로는, 주지의 방법, 예를 들어, 정맥 내, 복막 내, 뇌 내, 피하, 근육 내, 안(구)내, 동맥 내, 뇌내 척수 또는 병소내 경로로의 주사 및 주입, 또는 서방계에 따른다. 또한, 해당 항체 또는 이의 항원결합 단편을 직접 종양 부위로 투여하는 수단으로서, 카테터 등에 의한 투여 등도 가능하다.
또한, 본 발명의 종양의 예방 또는 치료를 위한 의약은, 예를 들어, 완충제(예를 들어, 인산염 완충액, 아세트산 나트륨 완충액), 무통화제(예를 들어, 염화 벤잘코늄, 염산 프로카인 등), 안정제(예를 들어, 인간 혈청 알부민, 폴리에틸렌 글리콜 등), 보존제(예를 들어, 벤질알콜, 페놀 등), 산화방지제 등과 배합할 수 있다. 조제된 주사액은 통상, 적당한 앰플에 충진된다. 이와 같이 하여 얻어진 제제는 안전하고 저 독성이기 때문에, 인간을 포함한 포유동물에게 투여할 수 있다. 해당 항체 또는 이의 항원결합 단편, 또는 이 염의 투여량은, 투여대상, 병세, 투여방법 등에 따라 차이가 있지만, 경구투여의 경우, 일반적으로, 예를 들어, 자궁내막증 환자 또는 자궁샘근증 환자(60 kg 으로서)에 있어서, 1일에 약 0.1 내지 100 mg, 바람직하게는 약 1.0 내지 50 mg, 더 바람직하게는 약 0 내지 20 mg이다. 비경구적으로 투여할 경우는, 그 투여량은 투여대상, 병세, 투여방법에 따라도 다르지만, 예를 들어, 주사제의 형태로는, 통상 예를 들어, 60 kg의 환자에게, 1일에 약 0.01 내지 30 mg정도, 바람직하게는 약 0.1 내지 20 mg정도, 더 바람직하게는 약 0.1 내지 10 mg정도를 정맥 주사에 의해 투여할 수 있다.
6. 본 발명의 종양의 진단방법
본 발명은 또한, 또 다른 실시형태에 있어서, 상기의 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합 단편에 적어도 1개의 진단 또는 검출제를 결합시킨 진단용 면역복합체에 의해, 종양을 검출하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 진단 또는 검출제는, 방사성핵종, 조영제, 형광제, 화학발광제, 생물발광제, 상자성 이온, 효소 및 광활성 진단제로 이루어진 군에서 선택된다. 1개의 실시형태에서는, 진단용 면역복합체와 생체로부터 채취된 시료, 예를 들어, 조직 절편 또는 혈액 등과 반응시켜, 시그널을 검출함으로서 종양을 검출할 수 있다. 측정법으로서는, 예를 들어, ELISA법, EI법, RIA법, 형광면역측정법, 화학발광면역측정법 등을 들 수 있다. 또 다른 실시형태에서는, 진단용 방사성 핵종을 결합시킨 진단용 면역복합체에 의한 PET이미징에 사용할 수 있다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더 구체적으로 기재하지만, 본 발명의 범위는 이들의 실시예에 한정되지 않는다.
실시예
〔실시예 1〕
(1)동물의 면역과 항체생산 세포의 조제
항LAT1/CD98단일클론 항체를 제작하기 위해, 래트에 LAT1/CD98을 고발현하는 세포주(예를 들어, 인간 대장암 세포주 (HCT116))을 면역하여, 그 췌장으로부터 항체생산 세포를 채취하였다. 면역은, 래트의 피하, 복강 또는 정맥 내에 항원으로서 세포 3×106개를 투여함으로서 수행하였다. 항원의 투여는, 1회째 투여의 3주 후, 및 6주 후에, 2회 수행하였다. 비장 세포를 골수종 세포와의 융합에 이용함에 있어서, 항원의 최종 투여 후, 3일 후에 면역한 래트로부터 비장을 적출하여 비장 세포를 채취하였다. 비장을 혈액 무첨가의 기초 배지(이하 세척용 배지라고 한다.)안에서 작게 자르고, 원심분리하여 세포를 회수 후, 트리스-염화 암모늄 완충액(pH7.65)으로 2 내지 3분간 처리하여 적혈구를 제거하고, 세척용 배지로 세척한 후에 융합용 비장 세포로서 이용하였다.
(2)하이브리도마의 제작
실시예 1(2)에서 얻어진 마우스 또는 래트 비장 세포와 마우스 골수종 세포주×63을 4:1의 비율로 혼합하고, 1,200 rpm으로 5분간 원심한 후, 상청을 버리고, 침전된 세포군을 잘 풀어준 후, 교반하면서, 37℃에서, 폴리에틸렌 글리콜-1500(PEG-1500)2g, DMEM배지 2 ml 및 디메틸술폭시드 0.7 ml의 혼합액을 0.2 내지 1 ml/108개 마우스 비장 세포의 비율로 첨가하고, 또한 1 내지 2분간 마다 DMEM배지 1 내지 2 ml를 수회 첨가한 후, DMEM배지를 첨가하여 전량이 50 ml가 되도록 하였다. 900 rpm으로 5분간 원심하고, 상청을 버리고 HAT배지 100 ml 중에 세포를 천천히 한탁하였다. 이 현탁액을 96웰 배양용 플레이트에 100㎕/웰 씩 분배하고, 5% CO2 인큐베이터 안, 37℃에서 10 내지 14일간 배양하였다.
(3)항체 스크리닝
실시예 1(3)에서 얻어진 하이브리도마 배양상청을 LAT1/CD98을 고발현하고 또한 항원에 이용한 세포주와는 다른 세포주(예를 들어, 인간 폐암 세포주(NCI-H1944))와 반응시켜 FCM해석을 수행함으로서, LAT1/CD98특이적인 항체를 생산하고 있는지의 1차 스크리닝을 수행하였다.
FCM의 반응은, 96웰 플레이트로 수행하였다. LAT1/CD98 고발현 세포주를 PBS로 2.5×105 내지 3×106개/웰이 되도록 50㎕씩 튜브에 분배하였다. 이 세포 부유액에 하이브리도마의 배양상청 50㎕를 첨가하여 4℃에서 45분 반응시켰다. 0.1% BSA-PBS 100㎕를 첨가하고, 500g으로 3분간, 4℃에서 원심하는 세척을 3회 수행하고, 세포 펠렛에 200배 희석한 PE-라벨된 항래트 IgG(Jackson Immuno Research)를 50㎕첨가하여 차광상태에서 4℃로 45분간 반응시켰다. 0.1% BSA-PBS 100㎕를 첨가하고, 500g으로 3분간, 4℃에서 원심하는 세척을 3회 수행하고, PBS 500㎕에 현탁하여 FCM튜브에 옮겼다. 죽은 세포를 제거하기 위해 측정직전에 PI 100㎕를 첨가하고, FACSCalibur(Becton Dickinson)로 측정하였다. 양성반응을 얻은 클론을 선별하여 4종의 항LAT1/CD98항체 생산 하이브리도마주(LG9111, LG9112,LG9113 및 LG9114)를 수립하였다.
(4) 단일클론 항체의 정제
프리스탄을 처리한 8주령 누드 마우스(KSN)에, 실시예 1(4)에서 얻어진 하이브리도마주를 1×107세포/마리를 각각 복강내 주사하였다. 1 내지 15일 후에, 하이브리도마는 복수암화하였다. 복수가 찬 마우스로부터 복수를 채취하고, 2000 rpm에서 5분간, 4℃에서 원심하고, 50%포화황산 암모늄으로 염석하고 침전물을 녹여, 10000g로 10분간, 4℃에서 수행하였다. 전치필터, 멤브레인 필터(0.22μm)를 투과시킨 후, Protein G Sepharose(GE헬스케어 바이오사이언스)를 이용하여 정제한 후, PBS로 투석(3시간 이상×4회)을 수행하였다. 그 결과 얻어진 4종류의 항LAT1/CD98단일클론 항체를 LG9111단일클론 항체, LG9112단일클론 항체, LG9113단일클론 항체 및 LG9114 단일클론 항체로 하였다.
〔실시예 2〕
종양 세포주에 대한 단일클론 항체의 결합성의 검토
인간 종양 세포주 4종류를 이용하여 항LAT1/CD98단일클론 항체의 결합성을 FCM해석에 의해 측정하였다. 인간 종양 세포주를 PBS로 1×105세포/웰이 되도록 조정하고, 50㎕씩 튜브에 분배하였다. 이 세포 부유액에 40㎍/mL로 조제한 각 단일클론 항체 50㎕를 첨가하여 4℃에서 45분 반응시켰다. 0.1% BSA-PBS 100㎕를 첨가하고, 500g으로 3분간, 4℃에서 원심하는 세척을 3회 수행하고, 세포 펠렛에 200배 희석한 PE-라벨된 항래트 IgG(Jackson Immuno Research)를 50㎕ 첨가하여 차광상태로, 4℃에서 45분간 반응시켰다. 0.1% BSA-PBS 100㎕를 첨가하고, 500g으로 3분간, 4℃에서 원심하는 세척을 3회 수행하고, PBS 500㎕에 현탁하여 FCM튜브에 옮겼다. 죽은 세포를 제거하기 위해 측정 직전에 PI 100㎕를 첨가하여 FACSCalibur(Becton Dickinson)로 측정하였다. 도 1에서 나타내는 바와 같이, 취득한 4종류의 단일클론 항체는 각종 암 세포주에 대해 결합활성을 나타내고, 특히, 대장암 세포주 HCT116에 대해, 보다 높은 결합활성이 확인되었다. 또한, LGtra01-01단일클론 항체(특개2011-24537에 개시된 항체)에 비해, 10배 이상 높은 결합활성이 확인되었다.
〔실시예 3〕
인간 키메라 항체의 제작
수립한 항LAT1/CD98항체 생산 하이브리도마주로부터 총RNA를 분리하고, SMARTerTM RACE cDNA. Amplification 키트(Clontech)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 얻어진 cDNA로부터 polymerase chain reaction(PCR)법에 의해 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 cDNA를 증폭하고, 클로닝 백터에 서브클로닝하였다. 얻어진 cDNA의 염기서열을 해석하고, 통상의 방법(＜http://www.bioinf.org.uk/abs/＞에 기입)에 의해 각 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변영역의 아미노산 서열(서열번호 31 내지 38) 및 Complimentarity determining region(CDR)의 아미노산 서열(서열번호 7 내지 30)을 결정하였다. CDR서열 특이적인 프라이머를 합성하고, 이를 이용하여 추출한 플라스미드 DNA로부터 CDR을 증폭하고, 인간 키메라 항체 중쇄 발현 벡터 또는 인간 키메라 항체 경쇄 발현 벡터에 삽입하였다. 얻어진 플라스미드는 리가아제를 이용하여 결합시키고, 인간 키메라 항체 생산 플라스미드를 제작하였다. FreeStyleTM MAX Reagent(invitrogen)을 이용하여, 인간 키메라 항체 생산 플라스미드를 FreeStyle 293F 세포(invitrogen)에 유전자 도입하고, 96시간 선회 배양(FreeStyleTM 293배지, 37℃, 8% CO2, 135 rpm)후의 배양상청을 회수하였다. 배양상청은 Protein G Sepharose(GE헬스케어 바이오사이언스)를 이용하여 정제한 후, PBS로 투석(3시간 이상×4회)하여, 인간 키메라 LAT1/CD98항체를 취득하였다.
〔실시예 4〕
인간 키메라 항체에 의한 항체 의존성 세포장해 활성의 검토
인간으로부터의 혈액을 헤파린 채혈관(TERUMO VP-H100K)에 채취하였다. PBS를 첨가하여 2배로 희석하고, 희석한 헤파린 혈액 18mL를 lymphoseparI(IBL 23010)12mL에 대해 차분히 중층하였다. 400g으로 30분간 원심 후, 상층의 혈장 층을 차분히 제거하여 중간층의 단핵구 분획을 분취하였다. PBS를 첨가하여 2배로 희석하고, 200g으로 10분간 원심하여 상청을 제거하였다. PBS 10mL를 첨가하고, 200g으로 10분간 원심하는 세척을 2회 수행하고, 5% FBS-RPMI1640에 현탁한 세포를 효과기 세포 현탁액으로 하였다. 반면, 표적 세포로서 인간 종양세포를 2×105세포/mL가 되도록 5% FBS-RPMI1640으로 현탁하고, U형 바닥의 96웰 플레이트에 1×104세포/웰이 되도록 50㎕씩 분배하였다. 인간 키메라 항체 50㎕를 첨가하고, 4℃에서 15분간 배양 후, 원심하여 상청을 버렸다. 효과기 세포 현탁액 100㎕을 첨가하고(동시에 컨트롤로서, 효과기 세포만 있는 웰(Effector Spontaneous), 표적 세포만 있는 웰(Target Spontaneous)을 제작), 37℃, 5% CO2에서 4시간 배양(동시에 컨트롤로서, 종료 45분 전에, 표적 세포에 10×Lysis buffer를 첨가한 웰(Target Max)을 제작)하였다. 배양 후, 가볍게 섞고, 200g으로 5분간 원심하여 상청 50㎕를 평평한 바닥의 96웰 플레이트에 옮겼다. Cytoto×96 Non-Radioactive cytotoxicity assay(Promega G1 780)를 이용하여, 키트에 첨가된 프로토콜에 따라 반응시키고, 플레이트 리더(TECAN Infinite M200)를 이용해 490nm 형광 파장을 측정하여 다음 식으로 세포장해율을 산출하였다. 세포장해율(%)=(Experimental-Effector Spontaneous-Target Spontaneous)/(Target Max-Target Spontaneous)×100. 도 2에서 나타내는 바와 같이, LG9111 인간 키메라 항체 및 LG9113 인간 키메라 항체에 있어서, 항체 농도 의존적인 ADCC활성이 검출되고, 인간 대장암 세포주(HCT116)에 대한 항체 농도 20㎍/mL에서 각각 79%, 46%의 세포장해율이 확인되었다. 또한, 인간 폐암 세포주(NCI-H1944)에 대해 35%이상의 세포장해율이 확인되었다.
〔실시예 5〕
단일클론 항체의 내재화 활성의 검토
인간 종양 세포주를 이용하여 항LAT1/CD98단일클론 항체의 내재화의 활성을 FCM해석에 의해 측정하였다. 인간 대장암 세포주 HCT116을 0.1% BSA-PBS로 현탁하고, U형 바닥의 96웰 플레이트에 1×105세포/웰이 되도록 50㎕씩 분배하였다. 이 세포 부유액에 20㎍/mL로 조제한 각 단일클론 항체 50㎍/mL를 첨가하여 4℃에서 45분간 반응시켰다. 0.1% BSA-PBS 150㎕를 첨가하고, 500g으로 3분간, 4℃에서 원심하는 세척을 3회 수행하여 단일클론 항체를 결합시킨 세포 펠렛을 얻었다. 이 세포 펠렛에 0.1% BSA-PBS 100㎕를 첨가하고, 37℃(내재화가 유도된 온도) 또는 4℃(내재화가 유도되지 않은 온도)에서, 각각 1시간 배양하였다. 0.1% BSA-PBS 150㎕를 첨가하고, 500g으로 3분간, 4℃에서 원심하는 세척을 3회 수행하였다. 200배 희석한 PE-라벨된 항래트 IgG(Jackson Immuno Research)를 50㎕ 첨가하여 차광상태에서 4℃로 30분간 반응시켰다. 0.1% BSA-PBS 150㎕를 첨가하고, 500g으로 3분간, 4℃에서 원심하는 세척을 3회 수행하고, PBS 500㎕에 현탁하여 FCM튜브에 옮겼다. 죽은 세포를 제거하기 위해 측정 직전에 PI 100㎕를 첨가하여 FACSCalibur(Becton Dickinson)로 측정하였다. 도 3(A)에서 나타내는 바와 같이, 4℃에서 배양 한 경우에 비해, 37℃에서 배양한 경우에서 단일클론 항체의 결합에 의한 형광강도의 감소가 확인되었다.
또한, 형광강도의 감소의 원인이, 배양 중에 항원과 결합한 단일클론 항체가 항원으로부터 벗겨진 것이 아니라는 것을 확인하기 위해, 상기 세포 펠렛에 동일한 방법으로 PE-라벨된 항래트 IgG를 반응시키고, 세척 후, 37℃(내재화가 유도되는 온도) 또는 4℃(내재화가 유도되지 않는 온도)에서, 각각 1시간 배양하였다. 세척 후, 동일하게 FACSCalibur로 측정하였다. 도 3(B)에서 나타내는 바와 같이, 4℃에서 배양한 경우와 37℃에서 배양한 경우에서 형광강도의 차이는 확인되지 않았다.
이와 같은 결과로부터, 단일클론 항체가 항원에 결합함으로서, 세포 표면상의 항원-항체 복합체가 감소, 즉, 내재화가 일어난 것으로 나타났다.
실시예 2 내지 4에서 나타내는 바와 같이, 본 발명의 항LAT1/CD98항체는, 지금까지 보고되어 있는 항LAT1/CD98항체와 비교해 LAT1/CD98복합체의 세포외 영역에 대해 현저하게 보다 뛰어난 결합성을 갖고, LAT1/CD98복합체를 발현하는 세포에 대한 세포장해 활성도 뛰어나다.
산업상의 이용분야
본 발명은, LAT1/CD98을 고발현하는 종양세포의 아포토시스 유도 또는 LAT1/CD98을 고발현하는 종양 세포로 특징지어진 종양의 병태해석, 예방, 치료 등에 유용하다.
서열목록에 대한 설명
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Leu Thr Gly Tyr 85 90 95 Leu Arg Asn <210> 108 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> CARBOHYD <222> (32)..(32) <223> disialo(alpha 2-6) oligosaccharide <220> <221> BINDING <222> (93)..(93) <223> Acm <400> 108 Cys Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln 1 5 10 15 Asn Ile Phe Cys Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 20 25 30 Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Cys Asn Val Tyr His Gln Ile Asn 35 40 45 His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr 50 55 60 Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 65 70 75 80 Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr 85 90 95 Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu 100 105 110 Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 115 <210> 109 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> CARBOHYD <222> (79)..(79) <223> disialo(alpha 2-6) oligosaccharide <220> <221> BINDING <222> (30)..(30) <223> Acm <220> <221> BINDING <222> (140)..(140) <223> Acm <400> 109 Cys Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln Ser 1 5 10 15 Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Cys Leu Glu Tyr Cys Leu Lys 20 25 30 Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Cys 35 40 45 Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln Asn 50 55 60 Ile Phe Cys Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu 65 70 75 80 Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Cys Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His 85 90 95 Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg 100 105 110 Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile 115 120 125 Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile 130 135 140 Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr 145 150 155 160 Gly Tyr Leu Arg Asn 165 <210> 110 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> disialo(alpha 2-6) oligosaccharide <220> <221> CARBOHYD <222> (26)..(26) <223> disialo(alpha 2-6) oligosaccharide <220> <221> CARBOHYD <222> (48)..(48) <223> disialo(alpha 2-6) oligosaccharide <220> <221> CARBOHYD <222> (67)..(67) <223> disialo(alpha 2-6) oligosaccharide <220> <221> CARBOHYD <222> (79)..(79) <223> disialo(alpha 2-6) oligosaccharide <220> <221> CARBOHYD <222> (88)..(88) <223> disialo(alpha 2-6) oligosaccharide <220> <221> BINDING <222> (30)..(30) <223> Acm <220> <221> BINDING <222> (140)..(140) <223> Acm <400> 110 Cys Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln Ser 1 5 10 15 Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Cys Leu Glu Tyr Cys Leu Lys 20 25 30 Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Cys 35 40 45 Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln Asn 50 55 60 Ile Phe Cys Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu 65 70 75 80 Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Cys Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His 85 90 95 Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg 100 105 110 Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile 115 120 125 Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile 130 135 140 Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr 145 150 155 160 Gly Tyr Leu Arg Asn 165 <210> 111 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> disialo(alpha 2-6) oligosaccharide <220> <221> CARBOHYD <222> (26)..(26) <223> disialo(alpha 2-6) oligosaccharide <220> <221> CARBOHYD <222> (48)..(48) <223> disialo(alpha 2-6) oligosaccharide <220> <221> CARBOHYD <222> (67)..(67) <223> disialo(alpha 2-6) oligosaccharide <220> <221> CARBOHYD <222> (79)..(79) <223> disialo(alpha 2-6) oligosaccharide <220> <221> CARBOHYD <222> (88)..(88) <223> disialo(alpha 2-6) oligosaccharide <400> 111 Cys Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln Ser 1 5 10 15 Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Cys Leu Glu Tyr Cys Leu Lys 20 25 30 Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Cys 35 40 45 Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln Asn 50 55 60 Ile Phe Cys Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu 65 70 75 80 Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Cys Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His 85 90 95 Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg 100 105 110 Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile 115 120 125 Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile 130 135 140 Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr 145 150 155 160 Gly Tyr Leu Arg Asn 165

Claims (29)

  1. LAT1/CD98을 발현하는 세포의 LAT1/CD98복합체의 세포외 영역에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원결합 단편이며,
    (1) 경쇄 상보성 결정영역 1(CDRL1), 경쇄 상보성 결정영역 2(CDRL2) 및 경쇄 상보성 결정영역 3(CDRL3)으로서, 각각 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 아미노산 서열, 또는 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 아미노산 서열에 1개 또는 수개의 아미노산 잔기의 변이를 각각 갖는 아미노산 서열을 포함하고,
    중쇄 상보성 결정영역 1(CDRH1), 중쇄 상보성 결정영역 2(CDRH2) 및 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3)으로서, 각각 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12의 아미노산 서열, 또는 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12의 아미노산 서열에 1개 또는 수개의 아미노산 잔기의 변이를 각각 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원결합 단편,
    (2) CDRL1, CDRL2 및 CDRL3으로서, 각각 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15의 아미노산 서열, 또는 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15의 아미노산 서열에 1개 또는 수개의 아미노산 잔기의 변이를 각각 갖는 아미노산 서열을 포함하고,
    CDRH1, CDRH2 및 CDRH3으로서, 각각 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18의 아미노산 서열, 또는 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18의 아미노산 서열에 1개 또는 수개의 아미노산 잔기의 변이를 각각 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원결합 단편,
    (3) CDRL1, CDRL2 및 CDRL3으로서, 각각 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21, 또는 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21의 아미노산 서열에 1개 또는 수개의 아미노산 잔기의 변이를 각각 갖는 아미노산 서열을 포함하고,
    CDRH1, CDRH2 및 CDRH3으로서, 각각 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24의 아미노산 서열, 또는 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24의 아미노산 서열에 1개 또는 수개의 아미노산 잔기의 변이를 갖는 각 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원결합 단편 또는
    (4) CDRL1, CDRL2 및 CDRL3으로서, 각각 서열번호 25, 서열번호 26 및 서열번호 27의 아미노산 서열, 또는 서열번호 25, 서열번호 26 및 서열번호 27의 아미노산 서열에 1개 또는 수개의 아미노산 잔기의 변이를 각각 갖는 아미노산 서열을 포함하고,
    CDRH1, CDRH2 및 CDRH3으로서, 각각 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30의 아미노산 서열, 또는 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30의 아미노산 서열에 1개 또는 수개의 아미노산 잔기의 변이를 각각 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원결합 단편.
  2. LAT1/CD98을 발현하는 세포의 LAT1/CD98복합체의 세포외 영역에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원결합 단편으로,
    (1) X1ASQX2VGNNVA(서열번호 1)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정영역 1(CDRL1),
    (2) YASX3RX4T(서열번호 2)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정영역 2(CDRL2),
    (3) QRX5YKSPYT(서열번호 3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정영역 3(CDRL3),
    (4) GFSLPTSSVS(서열번호 4)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정영역 1(CDRH1),
    (5) VIWSNGNTDYSSX6X7KS(서열번호 5)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정영역 2(CDRH2), 및
    (6) NFRNX8PGVMDA(서열번호 6)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3)
    (단, X1 내지 X8은, 임의의 천연에 존재하는 아미노산 잔기이다)
    를 포함하는, 항체 또는 이의 항원결합 단편.
  3. 제2항에 있어서,
    X1이 R 또는 K이고,
    X2가 N 또는 T이고,
    X3이 S 또는 N이고,
    X4가 H 또는 N이고,
    X5가 V 또는 I이고,
    X6이 A 또는 R이고,
    X7이 I 또는 F이고,
    X8이 D 또는 N인, 항체 또는 이의 항원결합 단편.
  4. 제2항에 있어서,
    (1) X1이 R, X2가 N, X3이 N, X4가 N, X5가 I, X6이 A, X7이 I, X8이 D이거나,
    (2) X1이 K, X2가 N, X3이 S, X4가 H, X5가 V, X6이 R, X7이 F, X8이 D이거나,
    (3) X1이 K, X2가 T, X3이 S, X4가 H, X5가 V, X6이 R, X7이 F, X8이 D이거나, 또는
    (4) X1이 K, X2가 N, X3이 S, X4가 H, X5가 V, X6이 R, X7이 I, X8이 N인, 항체 또는 이의 항원결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    (1) 서열번호 31의 아미노산 서열과 90%이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역(LH), 및
    서열번호 31의 아미노산 서열과 90%이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역(VL),
    (2) 서열번호 33의 아미노산 서열과 90%이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역(LH), 및
    서열번호 34의 아미노산 서열과 90%이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역(VL),
    (3) 서열번호 35의 아미노산 서열과 90%이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역(LH), 및
    서열번호 36의 아미노산 서열과 90%이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역(VL), 또는
    (4) 서열번호 37의 아미노산 서열과 90%이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역(LH), 및
    서열번호 38의 아미노산 서열과 90%이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역(VL),
    을 함유하는, 항체 또는 이의 항원결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    (1) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역(VL) 및
    서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역(VH),
    (2) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역(VL) 및
    서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역(VH),
    (3) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역(VL) 및
    서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역(VH), 또는
    (4) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역(VL) 및
    서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역(VH),
    을 함유하는, 항체 또는 이의 항원결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    LAT1/CD98을 발현하는 세포에 대한 세포장해 활성 및/또는 내재화(internalization) 활성을 갖는, 항체 또는 이의 항원결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    아형(subclass)이 IgG인, 항체 또는 이의 항원결합 단편.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 IgG가 IgG2a 또는 IgG1인, 항체 또는 이의 항원결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원결합 단편이, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, dsFv, ds-scFv, 이들의 이량체, 미니바디(minibodies), 디아바디(diabodies) 및 다량체(multimer) 또는 이중 특이성 항체 단편인, 항체 또는 이의 항원결합 단편.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    단일클론 항체인, 항체 또는 이의 항원결합 단편.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    랫트, 마우스, 영장류 또는 인간 항체인, 항체 또는 이의 항원결합 단편.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    키메라 항체 또는 인간화 항체인, 항체 또는 이의 항원결합 단편.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원결합 단편과 적어도 1개의 세포독성 약, 항종양제 또는 방사성 동위체를 포함하여 이루어진 면역복합체(immunoconjugate).
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산분자.
  16. 제15항의 핵산분자를 포함하는 발현 벡터.
  17. 제15항의 핵산분자를 포함하거나 또는 해당 핵산분자를 도입한, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포 또는 유전자 도입 세포.
  18. 제17항의 세포를 배양하여, 얻어진 배양물로부터 LAT1/CD98복합체에 특이적으로 결합하는 항체를 채취하는 것을 포함하는, LAT1/CD98복합체의 세포외 영역에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체의 제조방법.
  19. 제17항의 세포로부터 항LAT1/CD98단일클론 항체를 코딩하는 유전자를 단리하고, 해당 유전자를 포함하는 발현 벡터를 구축하고, 해당 발현 벡터를 숙주에 도입하여 상기 단일클론 항체를 발현시켜, 얻어진 숙주, 숙주의 배양상청 또는 숙주의 분비물로부터 LAT1/CD98의 세포외 영역에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 채취하는 것을 포함하는, LAT1/CD98의 세포외 영역에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체의 제조방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 숙주가, 대장균, 효모세포, 곤충세포, 포유동물세포, 식물세포 또는 포유동물인, 제조방법.
  21. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원결합 단편 또는 면역복합체를 함유하는 조성물로서, LAT1/CD98을 발현하는 세포에 적용하여 해당 세포의 아포토시스를 유발하기 위해 사용하는, 조성물.
  22. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원결합 단편 또는 면역복합체를 함유하는, 종양의 예방 또는 치료를 위한 의약.
  23. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원결합 단편 또는 면역복합체를 함유하는 조성물로서, LAT1/CD98을 발현하는 세포를 검출하기 위해 사용하는, 조성물.
  24. 제23항의 조성물과 생체로부터 채취한 시료를 반응시켜, 반응한 시그널을 검출하는 것을 특징으로 하는, 종양의 검출방법.
  25. 제23항의 조성물을 암세포와 접촉하는 공정을 포함하는 시험관 내의 종양의 면역 검출방법.
  26. 제23항의 조성물을 개체에 투여하는 공정 및 근적외광 이미징, PET, MRI 또는 초음파 이미징에 의해 얻어진 검출 영상을 얻는 공정을 포함하는, 생체 내에서의 종양의 영상화 방법.
  27. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원결합 단편 또는 면역복합체를 함유하는, 종양의 진단을 위한 의약.
  28. 제22항 또는 제27항에 있어서,
    상기 종양이, 대장암, 결장직장암, 폐암, 유방암, 뇌종양, 흑색종, 신장세포암, 방광암, 백혈병, 림프종, T세포 림프종, 다발성 골수종, 위암, 췌장암, 자궁 경부암, 자궁내막암, 난소암, 식도암, 간암, 두경부 편평 상피암, 피부암, 요로암, 전립선암, 융모암, 인두암, 후두암, 설암, 구강암, 담낭암, 갑상선암, 중피종, 흉막종, 남성배세포종, 자궁내막 과형성, 자궁내막증, 배아종, 섬유육종, 카포시육종, 혈관종, 해면상 혈관종, 혈관아세포종, 망막아종, 성상세포종, 신경섬유종, 희돌기교종, 수아종, 신경아종, 신경교종, 횡문근육종, 교아종, 골원성육종, 평활근육종, 갑상선 육종, 윌름 종양으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1개인, 의약.
  29. 이하의 (1) 내지 (6)으로 이루어진 군에서 선택되는 상보성 결정영역(CDR):
    (1) 서열번호 7, 13, 19 또는 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정영역 1(CDRL1),
    (2) 서열번호 8, 14, 20 또는 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정영역 2(CDRL2),
    (3) 서열번호 9, 15, 21 또는 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정영역 3(CDRL3),
    (4) 서열번호 10, 16, 22 또는 28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정영역 1(CDRH1),
    (5) 서열번호 11, 17, 23 또는 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정영역 2(CDRH2), 및
    (6) 서열번호 12, 18, 24 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3).
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