CN114216982A - 维生素b12的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种维生素B12的检测方法。本发明提供了乳制品中四种维生素B12的检测方法，所述的检测方法包括：样品前处理的步骤：采用蛋白酶对待测乳制品样品进行酶解反应，获得初提取液；二维液相色谱分离的步骤：使用二维高效液相色谱进行色谱分离，使所述四种维生素B12从所述初提取液中分离；所述二维高效液相色谱包括一维液相尺寸排阻色谱和二维液相反相色谱；质谱检测的步骤：将二维高效液相色谱分离后的四种维生素B12进行质谱检测。
Description
技术领域
本发明涉及食品领域，具体涉及一种食品领域汇总营养物质的分析检测技术领域，更具体而言涉及乳制品中四种维生素B12的检测方法。
背景技术
维生素B12(Vitamin B12，简称VB12)，又称为钴胺素，通常指具有相同生物活性的钴胺素族，也是唯一含金属元素的水溶性维生素。维生素B12是人体必须的一个重要的营养素，其在单碳(甲基)代谢中作为几种关键酶的辅酶发挥作用；在诸多生化反应中都起到了协同作用，它是DNA合成过程中重要的辅酶，对红细胞的形成和生长有促进作用，参与了神经***和免疫***的调节以及人体内细胞的代谢等生理活动，对人类生长发育至关重要。
维生素B12仅在微生物中产生(甲钴胺、腺苷钴胺和羟钴)，因此它的食物来源仅限于非植物来源，如肉类或其他动物来源。理论上，维生素B12缺乏症在正常健康人群中很少见，但纯素食者、孕妇、婴儿和饮食失调患者由于其特殊的饮食习惯要求和生理需求，容易出现维生素B12缺乏症。在缺乏维生素B12的情况下，增加叶酸供应可以治愈贫血，但不能治愈神经***症状。若缺乏维生素B12，可以导致周围神经炎和儿童贫血，也会影响婴幼儿的发育等，但是维生素B12的过量补充也会引发过敏反应等不良影响。所以维生素B12是婴幼儿配方食品营养的重要指标，检测要求也更要准确。
另外，已知的是，维生素B12存在形式是羟钴胺素、5’-脱氧腺苷钴胺素、甲钴胺素以及氰钴胺素。氰钴胺素相对容易大量生产，具有较高的稳定性，所以它是在食品加工中使用最多的维生素B12的形式，然而，氰钴胺素在氰化物基团被酶促去除之前没有生物活性，氰钴胺素只有在体内转化为甲钴胺素和5’-脱氧腺苷钴胺素后，才能发挥作用。
维生素B12合成形式的生物利用度与所给量成反比，在接受预防性或治疗性补充剂的人和动物中低于4％。羟钴胺素、5’-脱氧腺苷钴胺素、甲钴胺素是维生素B12的天然存在形式。5’-脱氧腺苷钴胺素和甲钴胺素在哺乳动物细胞中具有辅酶活性并且具有生物活性，而羟钴胺素是它们光解的产物。Matte等在2012年(J.J.Matte,M.Britten,C.L.Girard,Animal Frontiers,Volume 4,Issue 2,April 2014,Pages 32–37)的一项使用猪作为人类的动物模型的实验中指出，与每天摄入维生素补充剂中使用的合成形式(氰钴胺素)相比，每天摄入天然形式的维生素B12带来的吸收更有效。
另外，评估不同形式的维生素B12的肠道吸收的可用性也是评估其来源质量的重要因素，维生素B12缺乏，实质上是体内甲钴胺和腺苷钴胺缺乏。因此，随着膳食补充剂和婴幼儿配方奶粉市场的发展以及消费者的需求，越来越多的新产品含有甲钴胺等“天然形式的维生素B12”，为响应这一市场趋势，单独测定所有四种维生素B12的检测方法至关重要。
目前，测定VB12的方法有GB 5413.14-2010食品安全国家标准《婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定》，所采用的方法为微生物法。美国分析化学家协会(AOAC)官方法2016.017，此方法利用氰化物将所有的VB12形式改变为氰钴胺素，并在每次分析中使用一次性使用的专用免疫柱，虽然提高了方法的灵敏度，但增加了额外的成本。还有利用钴元素简介定量的ICP-MS方法，酶联免疫方法等。这些方法均只能测定VB12的总量，无法区分不同形式的VB12。
可见，已经有很多方法对食品、强化食品和膳食补充剂中维生素B12的含量测定进行了研究。由于维生素B12强化量低，大多数方法只能测量总的VB12水平。由于氰钴胺素是所有四种VB12中最稳定的形式。因此，目前检测食品和膳食补充剂中VB12的许多方法都是利用氰化物将所有VB12形式改变为氰钴胺，通过氰钴胺素的含量反映出总体的含量水平。
目前而言，这些方法在测定VB12的总量是成功的，然而，在实验室中使用氰化物存在安全问题。微生物检测法是常用的维生素B12检测方法，微生物通常选用利什曼乳杆菌。这个方法拥有高灵敏性，但是由于一些无活性的钴胺素前体(咕啉(Corrin)，C19H22N4)会干扰微生物的生长而使其缺失特异性，导致选择性较差，有时会导致高估。无活性的钴胺素前体会干扰活性VB12的检测，高估了总的VB12水平。
因此，开发出可以区分无活性的钴胺素前体，并且可以区分四种VB12的方法至关重要。
发明内容
发明要解决的问题
为解决现有维生素B12检测方法中，无法区分四种维生素B12的问题，以及存在氰化物使用，以及钴胺素前体的存在干扰检测结果等问题，本发明提供了一种乳制品中四种维生素B12的检测方法，其采用二维高效液相色谱-质谱联用技术，样品预先用胃蛋白酶消化，使与蛋白质结合维生素B12被释放，初提取液通过一维色谱使用尺寸排组色谱柱使大分子蛋白先于4种维生素B12被洗脱，4种维生素B12由于分子量相对蛋白质小，被后洗脱，根据洗脱时间，切换洗脱液于二维反相分析柱，使4种维生素B12被分离，质谱检测选择147.1(m/z)作为定量离子，能有效的避免无活性的钴胺素前体的干扰，提高了方法的准确性。
用于解决问题的方案
经过发明人潜心研究，发现通过以下方案能够解决上述技术问题：
[1].本发明提供了一种乳制品中四种维生素B12的检测方法，其中，所述的检测方法包括：
样品前处理的步骤：采用蛋白酶对待测乳制品样品进行酶解反应，获得初提取液；
二维液相色谱分离的步骤：使用二维高效液相色谱进行色谱分离，使所述四种维生素B12从所述初提取液中分离；所述二维高效液相色谱包括一维液相尺寸排阻色谱和二维液相反相色谱；
质谱检测的步骤：将二维高效液相色谱分离后的四种维生素B12进行质谱检测。
[2].根据[1]所述的检测方法，其中，所述蛋白酶选自胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶中的一种或多种。
[3].根据[1]或[2]所述的检测方法，其中，所述四种维生素B12的定量离子均为147.1m/z；和/或所述四种维生素B12为羟钴胺素、5’-脱氧腺苷钴胺素、甲钴胺素和氰钴胺素。
[4].根据[1]～[3]中任一项所述的检测方法，其中，所述一维液相尺寸排阻色谱的条件为：流动相为体积百分比为5～15％极性溶剂的水溶液。
[5].根据[1]～[4]中任一项所述的检测方法，其中，所述二维液相反相色谱的条件为：流动相包括A相和B相，并进行梯度洗脱，其中，A相为缓冲溶液相，B相为极性溶剂相。
[6].根据[5]所述的检测方法，其中，以体积百分比计的所述梯度洗脱包括：
0min：A相80％～95％，B相5％～20％；
1min：A相80％～95％，B相5％～20％；
10min：A相40％～60％，B相40％～60％；
12min：A相40％～60％，B相40％～60％；
12.1min：A相5％～20％，B相80％～95％；
15min：A相5％～20％，B相80％～95％；
16min：A相80％～95％，B相5％～20％；
18min：A相80％～95％，B相5％～20％。
[7].根据[1]～[6]中任一项所述的检测方法，其中，所述质谱检测的条件包括：采用带电喷雾离子源，正离子扫描模式。
[8].根据[7]所述的检测方法，其中，所述质谱检测中采集定量离子对如下：
氰钴胺素的母离子m/z 678.29，定量离子m/z 147.1；
甲钴胺素的母离子m/z 672.80，定量离子m/z 147.1；
羟钴胺素的母离子m/z 673.79，定量离子m/z 147.1；
5’-脱氧腺苷钴胺素的母离子m/z 790.34，定量离子m/z 147.1。
[9].根据[1]～[8]中任一项所述的检测方法，其中，所述的检测方法还包括标准曲线的构建的步骤，其包括：分别采用四种维生素B12的标准物质经由所述所述二维液相色谱和质谱检测制作标准曲线。
[10].根据[1]～[9]中任一项所述的检测方法，其中，在进行所述二维液相色谱分离的步骤前，还包括加入稳定同位素内标物的步骤。
发明的效果
通过以上技术方案的实施，本发明能够获得如下的技术效果：
(1)本发明提供的乳制品中四种维生素B12的检测方法可以对维生素B12的四种形式进行准确的检测。
(2)本发明提供的乳制品中四种维生素B12的检测方法避免了使用氰化物而带来的安全性、环保问题。
(3)本发明提供的乳制品中四种维生素B12的检测方法相比于现有使用的微生物法，可以避免无活性的钴胺素前体干扰微生物的生长而导致的选择性差，高估维生素B12含量的问题。
附图说明
图1为采用本发明的乳制品中四种维生素B12的检测方法检测4种维生素B12的二维高效液相色谱-质谱图。其中，图1种的A为总离子流图；图1中的B为5’-脱氧腺苷钴胺素；图1中的C为氰钴胺素；图1中的D为甲钴胺素；图1中的E为羟钴胺素。
图2A-图2C为本发明的乳制品中四种维生素B12的检测方法中二维高效液相色谱-质谱中采用的六通阀切换控制仪器流路状态的示意图；其中，图2A为一维色谱柱净化；图2B为阀切换至富集环，4种维生素B12被富集到环内；图2C为阀切换至分析柱，4种维生素B12通过分析柱分离，被质谱检测。
图3A-图3D为4种维生素B12离子扫描图；其中图3A为5’-脱氧腺苷钴胺素；图3B为甲钴胺素；图3C为羟钴胺素；图3D为氰钴胺素。
图4为对比例中未进行一维液相尺寸排阻色谱，前处理后进行二维液相反相色谱及质谱检测的示意图。其中，图4中的A为5’-脱氧腺苷钴胺素；图4中的B为氰钴胺素；图4中的C为甲钴胺素；图4中的D为羟钴胺素。
具体实施方式
以下，针对本发明的内容进行详细说明。以下所记载的技术特征的说明基于本发明的代表性的实施方案、具体例子而进行，但本发明不限定于这些实施方案、具体例子。需要说明的是：
本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。
本说明书中，使用“基本上”或“实质上”表示与理论模型或理论数据的标准偏差在5％、优选为3％、更优选为1％范围以内。
本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
本说明书中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。
本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。
本发明的检测方法采用二维高效液相色谱-质谱联用技术，待测乳制品样品预先用蛋白酶消化，使待测乳制品样品中与蛋白质结合维生素B12被释放，所获得的初提取液通过使用尺寸排组色谱柱的一维色谱使大分子蛋白(多肽)先于四种维生素B12被洗脱，四种维生素B12由于分子量相对蛋白质(多肽)小，被后洗脱，根据洗脱时间，切换洗脱液于二维色谱，即反相分析柱，使四种维生素B12被分离，并通过质谱检测，其中质谱检测针对四种维生素B12对应的荷质比，能有效的避免无活性的钴胺素前体的干扰，提高了方法的准确性，并且无需采用氰化物。
四种维生素B12及无活性的钴胺素前体的具体信息见下表1。
表1：
以下将对本发明的乳制品中四种维生素B12的检测方法做出具体说明。
<样品来源以及前处理>
在本发明的检测方法中，待测样品为乳制品。
本发明中对于“乳制品”或者测试样品来源没有特别的限制，其可以是指由动物如牛、山羊、绵羊、牦牛、马、骆驼以及其他哺乳动物生产的食物产品。
乳制品的示例是低脂乳(例如，0.1％、0.5％或1.5％的脂肪)、无脂乳、乳粉、全脂乳、全脂乳制品、黄油、酪乳、酪乳制品、脱脂乳、脱脂乳制品、高乳脂产品、炼生乳、鲜奶油、奶酪、冰淇淋和甜食产品、益菌饮料或益生菌酸奶型饮料。其中，“乳粉”是指通过蒸发奶至干燥而制成的人造乳制品。在本发明一些优选的实施方案中，本发明的检测方法中的样品来源于牛或羊的乳粉制品。
进一步，由于维生素B12是婴幼儿配方食品(尤其是配方乳制品)营养的重要指标。因此，本发明的乳制品中四种维生素B12的检测方法尤其适用于婴幼儿配方乳制品。在本发明的一些具体实施方案中，四种维生素B12包括羟钴胺素、5’-脱氧腺苷钴胺素、甲钴胺素和氰钴胺素。
在本发明的一些实施方案中，在进行二维高效液相色谱-串联质谱检测前，待测乳制品样品需进行前处理步骤，以使得样品适合于检测且将被检测物初步的富集。
具体地，样品前处理步骤采用蛋白酶对待测乳制品样品进行酶解反应，离心取上清液，即获得初提取液。通过本发明的样品前处理步骤，使用缓冲液和蛋白酶的共同作用，使待测乳制品样品中与蛋白质结合维生素B12被释放，以进行后续二维高效液相色谱分离，及质谱检测，使得检测更为准确。
在本发明的一些具体实施方案中，所述蛋白酶选自胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶中的一种或多种。在本发明的一些优选的实施方案中，所述的蛋白酶为胃蛋白酶。在本发明的一些具体实施方案中，酶的用量可以根据所添加的待测乳制品样品的量进行调整，例如5～10g待测乳制品样品添加50000～100000U蛋白酶。
酶解反应通常在缓冲液中进行，缓冲液可以选择乙酸钠缓冲液。在本发明的一些优选的实施方案中，所述缓冲液为乙酸钠缓冲液。所述乙酸钠缓冲液浓度为40～60mmol/L，优选为40～55mmol/L，更优选为45～55mmol/L，进一步优选为50mmol/L。在本发明的一些优选的实施方案中，乙酸钠缓冲液的pH值为4.0±0.5，优选为4.0±0.4、4.0±0.3、4.0±0.2，进一步优选为4.0±0.1。在本发明的一些实施方案中，缓冲液的量可以根据所添加的待测乳制品样品的量进行调整，例如在每100mL缓冲液中，添加5～10g待测乳制品样品。在本发明的其他的实施方案中，缓冲液也可以选择磷酸缓冲液或者柠檬酸缓冲液，且缓冲液的离子强度与pH值与上述的乙酸钠缓冲液相当即可。
在本发明的一些优选的实施方案中，可以在小于缓冲液所使用的终体积(定容体积)的缓冲液中进行酶解反应后，再添加缓冲液将反应液稀释至终体积(定容体积)。在较小体积下，蛋白酶可以更充分的与待测乳制品样品接触，以发挥酶解作用，提高检测效率。例如，在缓冲液终体积为100mL的情况下，可以先将待测乳制品样品和蛋白酶加入30mL、40mL、50mL、60mL或70mL的缓冲液中进行酶解反应，之后定容至100mL。
酶解反应的温度及时间，可以根据所选择的蛋白酶的种类进行调整，例如，在本发明的一些实施方案中，酶解的反应条件为35～39℃条件下，反应15～50min。优选地，在37℃水浴加热15～50min；更优选为37℃水浴加热20～40min，进一步优选为37℃水浴加热30min。其中，加热的方式没有特殊的限制，例如可以通过水浴加热等加热方式。
在本发明的一些实施方案中，酶解反应后，还包括离心的步骤。在本发明的一些具体的实施方案中，将酶解反应产物摇匀后离心，离心条件为7000～15000转/分钟下离心5～15min。优选地，离心条件为10000转/分钟下离心10min。离心后，取上清，作为维生素B12的初提取液。
在本发明的一些实施方案中，缓冲液中还添加有稳定同位素内标物。在本发明的另一些实施方案中，也可以在进行二维高效液相色谱分离步前添加稳定同位素内标物。稳定同位素内标物添加的量为每5～10g待测乳制品样本中添加5～20ng稳定同位素内标物。稳定同位素内标物的使用可以避免在后续行二维高效液相色谱-串联质谱检测中潜在的基质效应。
<二维液相色谱分离>
本发明中，使用二维液相色谱对样品中的维生素B12的各个组分进行分离。本发明中，二维液相色谱也可称为二维高效液相色谱。
在本发明的一些实施方案中，将样品前处理步骤中获得的所述初提取液使用二维高效液相色谱进行色谱分离，使所述四种维生素B12从所述初提取液中分离，减小质谱干扰。其中，二维高效液相色谱包括一维液相尺寸排阻色谱和二维液相反相色谱，二者可以通过阀切换而实现联动，并且该阀门可以为手动阀门，也可以为自动切换阀门，优选为自动切换六通阀。
在本发明中，一维色谱使用尺寸排组色谱柱使初提取液中的大分子蛋白(多肽)先于4种维生素B12被洗脱(液相尺寸排除法净化)，4种维生素B12由于分子量相对蛋白质(多肽)小，被后洗脱，根据洗脱时间，切换洗脱液于二维液相反相分析柱(例如采用六通阀切换的在线流分切换法)，使4种维生素B12被分离。
在本发明中，一维液相尺寸排阻色谱所采用的色谱柱可以为适合于分离蛋白/多肽与维生素的尺寸排阻色谱柱，优选为水溶性的尺寸排阻色谱柱，如孔径为
的尺寸排阻色谱柱，优选为
更优选为
孔径过小不能分离，容易堵塞，孔径过大容易导致维生素B12和蛋白/多肽同步流出，增加干扰。尺寸排阻色谱柱可以通过商购获得，例如可以使用市售的Agilent Bio SEC-5：5190-2523色谱柱，其内径为4.6mm，长度为300mm，颗粒尺寸为5μm，孔径为
在本发明的一些具体实施方案中，一维液相尺寸排阻色谱的色谱条件包括：流动相为体积百分比为5～15％的极性溶剂水溶液，从与反相色谱兼容和洗脱净化的角度考虑，优选极性溶剂为乙腈。在一些优选的实施方案中，流动相为体积百分比为5～10％的乙腈水溶液，更优选为体积百分比为10％的乙腈水溶液；流速为0.4±0.2mL/min，优选为0.4±0.1mL/min，更优选为0.4mL/min。色谱柱柱温为40±3℃，优选为40±2℃、40±1℃。一维液相尺寸排阻色谱中进样体积为500±100μL，优选为500±50μL，更优选为500±20μL、500±10μL。
在本发明的一些具体实施方案中，在一维液相尺寸排阻色谱中采用的检测波长为550nm。在本发明的一些更具体实施方案中，可以通过紫外检测器检测流动相550nm处波长，以确定一维液相尺寸排阻色谱的保留时间，以及检测漏接、迁移时间漂移。
在本发明中，二维液相反相色谱可以采用任何适于分离维生素的反相色谱柱，例如非极性色谱柱，典型地可以为C18反相色谱柱。反相色谱柱可以通过商购获得，例如市售的Zorbax Plus-C18 RRHD，其内径为2.1mm，长度为150mm，颗粒尺寸为1.8μm。
在本发明的一些具体实施方案中，二维液相反相色谱的色谱条件包括：流动相包括A相和B相，其中A相为缓冲溶液相，一方面可以提高反相色谱的分离性，另一方面与质谱兼容增加电喷雾时的可电离性。一些具体实施方案中，A相可以为7～15mmol/L甲酸铵水溶液，优选为9～12mmol/L甲酸铵水溶液，更优选为10mmol/L甲酸铵水溶液；B相为极性溶剂，优选与一维色谱中的极性溶剂相同，可以为乙腈，以增加自动检测的操作便利性。二维液相反相色谱采用梯度洗脱，流速：0.4±0.2mL/min，优选为0.4±0.1mL/min。色谱柱柱温为35±3℃，优选为35±2℃、35±1℃。
在本发明的一些更具体实施方案中，所述梯度洗脱包括：
0min：A相80％～95％，B相5％～20％；
1min：A相80％～95％，B相5％～20％；
10min：A相40％～60％，B相40％～60％；
12min：A相40％～60％，B相40％～60％；
12.1min：A相5％～20％，B相80％～95％；
15min：A相5％～20％，B相80％～95％；
16min：A相80％～95％，B相5％～20％；
18min：A相80％～95％，B相5％～20％。
在本发明的一些优选的实施方案中，所述梯度洗脱包括：
0min：A相90％，B相10％；
1min：A相90％，B相10；
10min：A相50％，B相50％；
12min：A相50％，B相50％；
12.1min：A相10％，B相90％；
15min：A相10％，B相90％；
16min：A相90％，B相10％；
18min：A相90％，B相10％。
<质谱检测>
在本发明的一些实施方案中，将二维高效液相色谱分离后的四种维生素B12进行质谱检测。
所述质谱检测的条件包括：采用带电喷雾离子源，正离子扫描模式，毛细管温度：300±50℃；毛细管电压：+3.5±0.5KV。
质谱检测采集定量离子对如下：
氰钴胺素的母离子m/z 678.29，定量离子m/z 147.1；
甲钴胺素的母离子m/z 672.80，定量离子m/z 147.1；
羟钴胺素的母离子m/z 673.79，定量离子m/z 147.1；
5’-脱氧腺苷钴胺素的母离子m/z 790.34，定量离子m/z 147.1。
本发明认为将在定量测试中，将维生素B12各组分的定量离子均确定为147.1m/z，更容易避免干扰峰的干扰，尤其能够避免无活性的钴胺素前提的干扰，进而有效提高提高定量分析的精度。
<标准曲线的构建>
通过标准曲线的建立以确定定量分析对比的依据，同时也可以确定检测体系或检测方法的检出限和定量限。
本发明的乳制品中四种维生素B12的检测方法还包括标准曲线的构建的步骤，具体地，分别采用四种维生素B12的标准物质制备一系列不同浓度的标准物质工作溶液，经历上述的二维高效液相色谱分离的步骤和质谱检测的步骤，根据检测的标准物质工作溶液的各自目标化合物(即四种维生素B12)的母离子色谱峰的峰面积对应浓度作图，得到标准曲线回归方程。
此外，在进行标准曲线的建立时，优选地通过同位素内标法对标准曲线的精度进行验证。
本发明中标准曲线的R值(线性相关系数)应当为0.99以上。
进一步地，根据构建的标准曲线回归方程，分别得到待测乳制品样品中四种维生素B12的浓度，进而计算四种维生素B12的在待测乳制品样品中的含量。
本发明以上提供的维生素B12各组分的检测方法，可以用于乳制品终端商品的检测，也可以通过自动化设置而作为乳制品生产在线检测监控方法。
实施例
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
一、试剂和材料
1.1试剂
除非另有规定，仅使用分析纯试剂。
1.1.1水，GB/T 6682，一级。
1.1.2乙腈(CH3CN，色谱纯)。
1.1.3甲醇(CH3OH，色谱纯)。
1.1.4甲酸(HCOOH，色谱纯)。
1.1.5乙酸(CH3COOH，色谱纯)。
1.1.6乙酸钠(CH3COONa)。
1.1.7甲酸铵(HCOONH4，色谱纯)。
1.1.8胃蛋白酶(活力，38U/mg)。
1.1.9氰钴胺素-二甲基苯并咪唑-13C7同位素内标：纯度≥95％，1μg/mL。
1.2试剂配制
1.2.1乙酸钠缓冲液(50mmol/L)：称取4.1g无水乙酸钠(1.1.6)，用950mL水溶解并用乙酸(1.1.5)调pH值至4.0±0.1后用水定容至1000mL。
1.2.2乙腈-水溶液(10％，体积比)：准确量取100mL乙腈(1.1.2)，用水溶解并定容至1000mL。
1.2.3甲酸铵水溶液(10mmol/L)：称取0.63g甲酸铵(1.1.7)，用950mL水溶解，用甲酸(1.1.4)调pH至4.0±0.1后用水定容至1000mL。
1.3标准物质
所使用的标准物质均来自Sigma-Aldrich，详细信息见表2所示。
表2：本发明实施例中使用的标准物质信息
1.4标准溶液的配制
1.4.1标准储备液(1mg/mL)：分别称取10mg(精确至0.01mg)4种VB12标准品，用水溶解后，移至10mL容量瓶中，加入5mL甲醇(1.1.3)后，用水定容至刻度，溶液每份0.5mL分装转移至1mL钳口进样瓶中密封，在-20℃条件下避光保存，备用。
1.4.2标准工作液(1μg/mL)：分别准确吸取10μL(1.4.1)4种VB12标准储备液于10mL容量瓶中，用水定容刻度，在4℃下避光保存。
1.4.3同位素内标工作液：取VB12同位素内标溶液0.5mL(1μg/mL)，用水稀释至10mL，此溶液浓度为50ng/mL。在4℃下避光保存。
1.4.4标准系列工作溶液：分别准确移取标准工作液(1.4.2)5μL、10μL、20μL、50μL、80μL、100μL、200μL，并同时分别加入200μL同位素内标溶液(1.4.3)，用10％乙腈水溶液(1.2.2)定容至10mL。其浓度分别为：0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、8ng/mL、10ng/mL、20ng/mL，同位素内标浓度为1ng/mL。此标准系列溶液使用前配制。
1.5材料
1.5.1微孔滤膜：水相，0.22μm。
1.5.2尺寸排阻色谱柱(一维色谱)：4.6×300mm,5μm，
Agilent Bio SEC-5：5190-2523。
1.5.3反相色谱柱(二维色谱)：Zorbax Plus-C18 RRHD，2.1×150mm，1.8μm。
二、仪器和设备
2.1二维高效液相色谱-高分辨质谱联用仪：带电喷雾离子源。
2.2天平：感量0.01g、0.1mg。
2.3离心机：转速不低于10000转/min。
2.4定量移液器：10μL～1mL。
2.5离心管：15mL。
2.6恒温水浴摇床。
三、样品前处理
在150mL棕色锥形瓶中准确称取试样5～10g(准确到0.01g)，依次加入200μL同位素内标溶液(1.4.3)、50mL乙酸钠缓冲液(1.2.1)、2g胃蛋白酶(1.1.8)，充分混合使样品充分溶解，37℃水浴30min。冷却至室温后，将样品溶液移至100mL容量瓶中，用乙酸钠缓冲液(1.2.1)定容至刻度，摇匀后10000转/分钟下离心10min，吸取上清液5mL待用。
四、液相色谱-串联质谱参考条件
图2A至图2C为本发明一种具体的液相色谱与质谱联合使用的装置连接***示意图。
4.1液相色谱参考条件
4.1.1一维色谱色谱参考条件
色谱柱：4.6×300mm,5μm，
或相当者。
流动相：10％乙腈水溶液(1.2.2)。
流速：0.4mL/min。
检测波长：550nm。
色谱柱柱温：40℃；
进样体积：500μL；
六通阀切换控制示意图见图2A至图2C，切换时间根据紫外检测器检测情况设置。
4.1.2二维色谱(梯度泵)色谱参考条件
色谱柱：2.1×150mm，1.8μm。
流动相：A相，10mmol/L甲酸铵水溶液(1.2.3)；B相，乙腈(1.1.2)
流速：0.4mL/min。
色谱柱柱温：35℃。
梯度洗脱：见表3。
表3：梯度洗脱条件
| 序号 | 时间(min) | A(％) | B(％) | 曲线 |
| 1 | 0 | 90 | 10 | 6 |
| 2 | 1 | 90 | 10 | 6 |
| 3 | 10 | 50 | 50 | 6 |
| 4 | 12 | 50 | 50 | 6 |
| 5 | 12.1 | 10 | 90 | 6 |
| 6 | 15 | 10 | 90 | 6 |
| 7 | 16 | 90 | 10 | 6 |
| 8 | 18 | 90 | 10 | 6 |
4.2质谱参考条件(ESI+)
4种维生素B12的质谱参考条件见表4所示。仪器条件为：扫描模式：正离子；毛细管温度：300℃；毛细管电压：+3.5KV。
表4：4种维生素B12的质谱参考条件
| 序号 | 化合物名称 | 离子化形式 | 母离子(m/z) | 定量离子1(m/z) |
| 1 | CN-Cbl | [M+2H]<sup>2+</sup> | 678.29 | 147.1 |
| 2 | <sup>13</sup>C<sub>7</sub>-CN-Cbl | [M+2H]<sup>2+</sup> | 681.80 | 154.1 |
| 3 | Me-Cbl | [M+2H]<sup>2+</sup> | 672.80 | 147.1 |
| 4 | OH-Cbl | [M+2H]<sup>2+</sup> | 673.79 | 147.1 |
| 5 | ADO-Cbl | [M+2H]<sup>2+</sup> | 790.34 | 147.1 |
其中，4种维生素B12离子扫描图参见图3A至图3D。
4.3定性测定
试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较，变化范围应在±2.5％之内。
每种化合物的质谱定性离子应出现，至少包括一个母离子和两个子离子，而且同一检验批次，对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不应超过表5规定的范围。
表5：定性时相对离子丰度的最大允许偏差
| 相对离子丰度 | >50％ | 20％～50％ | 10％～20％ | ≤10％ |
| 允许的相对偏差 | ±20％ | ±25％ | ±30％ | ±50％ |
4.4标准曲线的制作
在4.1和4.2的液相色谱-质谱条件下，将标准系列溶液(1.4.4)由低到高浓度进样检测，以各目标化合物的母离子色谱峰的峰面积对应浓度作图，得到标准曲线回归方程，其线性相关系数大于0.99。
4.5试样溶液的测定
取“经样品前处理”中得到的待测溶液进样，查标准曲线得到测试液中4种维生素B12的浓度，按照“试验数据处理”计算样品中待测物的含量。试液中待测物的响应值应在标准曲线的线性范围内，超过线性范围应适当稀释后重新测定。
五、试验数据处理
试样中4种维生素B12的质量分数X计，数值以微克每千克(μg/kg)表示，按下列公式计算：
式中：
X——样品中待测组分的含量，单位为微克每千克(μg/kg)。
C——标准溶液中待测组分的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)。
Ci——测定液中待测组分的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)。
A——测定液中待测组分的峰面积。
Asi——标准溶液中内标物质的峰面积。
V——定容体积，单位为毫升(mL)。
Csi——标准溶液中内标物质的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)。
Ai——测定液中内标物质的峰面积。
As——标准溶液中待测组分的峰面积。
m——样品称样量，单位为克(g)。
计算结果保留两位有效数字。
六、精密度
在重现性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于算术平均值的10％。
实施例1
按照本发明实测结果如下：
其中，实际测试含量＝本底值+理论添加量，误差范围符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测本标准》中附表F1的相关要求。可见本发明的方法的实测结果符合标准，可以准确检测四种维生素B12。
对比例1
此对比例中，样品未进行一维色谱，前处理后直接进行二维色谱及质谱检测(条件同实施例)，其检测结果如图4所示。如图4的质谱图所示，检测结果干扰大，无法区分四种维生素B12。
综上，本发明提供的乳制品中四种维生素B12的检测方法在避光条件下，使用乙酸钠缓冲液(pH＝4.0)和胃蛋白酶的共同作用下，从样品中提取4种维生素B12。提取液经一维液相尺寸排除法净化，净化后样液用在线流分切换法经由二维液相反相分离，采用质谱法测定4种维生素B12的含量。本发明尤其适用于婴幼儿配方乳粉中4种维生素B12的测定。本发明婴幼儿配方乳粉中4种维生素B12的检出限0.2μg/Kg、定量限0.5μg/Kg。
以上示例性实施方式所呈现的描述仅用以说明本发明的技术方案，并不想要成为毫无遗漏的，也不想要把本发明限制为所描述的精确形式。显然，本领域的普通技术人员根据上述教导做出很多改变和变化都是可能的。选择示例性实施方式并进行描述是为了解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的其它技术人员便于理解、实现并利用本发明的各种示例性实施方式及其各种选择形式和修改形式。本发明的保护范围意在由所附权利要求书及其等效形式所限定。
产业上的可利用性
本发明提供的乳制品中四种维生素B12的检测方法可以应用于乳制品、尤其是婴幼儿乳制品中四种维生素B12的含量的检测、鉴定。
Claims (10)
1.一种乳制品中四种维生素B12的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括：
样品前处理的步骤：采用蛋白酶对待测乳制品样品进行酶解反应，获得初提取液；
二维液相色谱分离的步骤：使用二维高效液相色谱进行色谱分离，使所述四种维生素B12从所述初提取液中分离；所述二维高效液相色谱包括一维液相尺寸排阻色谱和二维液相反相色谱；
质谱检测的步骤：将二维高效液相色谱分离后的四种维生素B12进行质谱检测。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述蛋白酶选自胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述四种维生素B12的定量离子均为147.1m/z；和/或所述四种维生素B12为羟钴胺素、5’-脱氧腺苷钴胺素、甲钴胺素和氰钴胺素。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述一维液相尺寸排阻色谱的条件为：流动相为体积百分比为5～15％极性溶剂的水溶液。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述二维液相反相色谱的条件为：流动相包括A相和B相，并进行梯度洗脱，其中A相为缓冲溶液相，B相为极性溶剂相。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，以体积百分比计的所述梯度洗脱包括：
0min：A相80％～95％，B相5％～20％；
1min：A相80％～95％，B相5％～20％；
10min：A相40％～60％，B相40％～60％；
12min：A相40％～60％，B相40％～60％；
12.1min：A相5％～20％，B相80％～95％；
15min：A相5％～20％，B相80％～95％；
16min：A相80％～95％，B相5％～20％；
18min：A相80％～95％，B相5％～20％。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述质谱检测的条件包括：采用带电喷雾离子源，正离子扫描模式。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述质谱检测中采集定量离子对如下：
氰钴胺素的母离子m/z 678.29，定量离子m/z 147.1；
甲钴胺素的母离子m/z 672.80，定量离子m/z 147.1；
羟钴胺素的母离子m/z 673.79，定量离子m/z 147.1；
5’-脱氧腺苷钴胺素的母离子m/z 790.34，定量离子m/z 147.1。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述的检测方法还包括标准曲线的构建的步骤，其包括：分别采用四种维生素B12的标准物质经由所述二维液相色谱和质谱检测制作标准曲线。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的检测方法，其特征在于，在进行所述二维液相色谱分离的步骤前，还包括加入稳定同位素内标物的步骤。
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