CN105136957B

CN105136957B - 一种同时测定人血浆中oxc以及代谢产物mhd和mhd-g的检测方法

Info

Publication number: CN105136957B
Application number: CN201510580239.5A
Authority: CN
Inventors: 黄凯; 蔡建美; 过湘云; 华颖; 贺晴
Original assignee: Wuxi Peoples Hospital
Current assignee: Wuxi Peoples Hospital
Priority date: 2015-09-11
Filing date: 2015-09-11
Publication date: 2017-01-11
Anticipated expiration: 2035-09-11
Also published as: CN105136957A

Abstract

本发明涉及一种同时测定人血浆中OXC以及代谢产物MHD和MHD‑G的检测方法，属于生物检测技术领域。本实验以硝基安定为内标，蛋白沉淀法预处理后，采用高效液相色谱‑串联质谱法可同时检测3种化合物的血药浓度。本发明方法时间短、特异性强、灵敏度高、操作简便，已成功运用于人血浆中奥卡西平及其代谢产物的分析研究。

Description

一种同时测定人血浆中OXC以及代谢产物MHD和MHD-G的检测方法

技术领域

本发明涉及一种同时测定人血浆中OXC以及代谢产物MHD和MHD-G的检测方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

癫痫(Epilepsy)是一种世界范围内常见的神经***疾病，其临床特征为脑神经细胞反复发作的异常放电引起的大脑功能失调，因其病程长，致残率高，成为儿科神经***中发病率最高、危害最为严重的疾病。如不能很好的控制，将会对脑神经造成不可逆的损伤，严重影响儿童的生长发育，给患儿、家庭和社会带来沉重的心理负担和经济压力。

奥卡西平(Oxcarbazepine，OXC)是一种新型的治疗癫痫局部发作和全身强直阵挛性发作的药物。奥卡西平(OXC)进入机体后，肝细胞溶质酶(AKR1C1,AKR1C2,AKR1C3,AKR1C4，CBR1和CBR3)能够迅速将其转化为活性代谢物10,11-二氢,10-羟基卡马西平(MHD)，并发挥药理作用，MHD在UGT催化下又进一步与葡萄糖醛酸结合排出体外，小部分MHD被氧化成无药理活性的10,11-二羟基卡马西平(DHD)，90％以上的药物以代谢产物形式通过尿液排出：葡萄糖醛酸结合物(49％)、MHD(27％)、DHD(3％)、其他代谢产物(13％)，OXC少于1％；不到4％原药从粪便中排出。由此可见，代谢是OXC体内消除的主要形式，MHD与UGT的Ⅱ相结合反应，是OXC在体内进行生物转化最重要的途径，影响UGT活性将会干扰MHD体内代谢，从而改变MHD血药浓度，导致治疗失败甚至引发严重不良反应，将对患者用药安全造成极大危害。

高效液相-串联质谱法(HPLC-MS/MS)是检测药物浓度最常用的方法，具有灵敏度高、特异性强等特点，可以对多种微量化合物同时进行检测。因此，通过同时检测人体内OXC、MHD、MHD-G的血药浓度，可以更加准确的监测OXC在体内动态的代谢变化情况，以及判断是否由于OXC代谢减少或UGT基因突变导致MHD治疗药物浓度的降低。

目前，经过***验证的HPLC-MS/MS方法只能同时检测OXC和MHD，但也具有缺陷：如走样时间较长(10min)(High-performance liquid chromatography-tandem massspectrometry method for simultaneousquantification ofcarbamazepine,oxcarbazepine,and their main metabolites in human serum.Ther Drug Monit.2012，34(1):53-58)、处理方法复杂(提取法)(Simultaneous quantitative analysis of

oxcarbazepine and 10,11-dihydro-10-hydroxycarbamazepine inhumanplasma by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry.J PharmBiomed Anal.2007，45(2):304-311)。对于MHD-G的检测方法未查到相关文献，也未见同时检测OXC、MHD、MHD-G的文献报道，本发明首次建立了OXC、MHD、MHD-G人血浆内的HPLC-MS/MS测定方法，为OXC的临床血药浓度的检测奠定了坚实的方法学基础。

发明内容

本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种同时测定人血浆中OXC以及代谢产物MHD和MHD-G的检测方法。

按照本发明提供的技术方案，一种同时测定人血浆中OXC以及代谢产物MHD和MHD-G的检测方法，步骤为：

(1)血浆样品预处理：取血浆样品，加入内标硝基安定，再加入乙腈沉淀蛋白，速度离心取上清液，得到预处理后的血浆样品；

(2)色谱：将步骤(1)预处理后的血浆样品进行液相色谱分离：色谱条件中色谱柱：Phenomenex kinetex XB-C18柱；流动相：乙腈:水体积比为50:50，水中含有质量浓度为0.1％的甲酸；流速：250～300μL/min；柱温：30～40℃；进样量：10μL；

(3)质谱：离子源：电喷雾离子化ESI离子源，方式扫描：选择反应检测扫描SRM，喷雾电压：3500～4000V，鞘气：20～50psi，辅助气：10～20arb，毛细管温度：350℃，离子源温度：300℃；

(4)计算：采用内标法，以OXC、MHD、MHD-G和内标硝基安定的峰面积比值代入标准曲线方程，计算OXC、MHD、MHD-G的血药浓度。

步骤(1)具体为：取血浆样品150μL，加入1000ng/mL内标硝基安定溶液15μL，再加入乙腈285μL，涡旋混匀5～10min，13000rpm离心10～15min，离心后取上清液。

步骤(1)所述血浆样品为含OXC、MHD、MHD-G的血浆。

步骤(2)中色谱柱长度为100mm，内径为2.1mm，填料粒径为2.6μm。

步骤(3)中检测离子具体如下：OXC选择性反应检测离子[M+H]⁺m/z253.2→m/z180.2CE:28eV；MHD选择性反应检测离子[M+H]⁺m/z 255.2→m/z194.2CE:21eV；MHD-G选择性反应检测离子[M+H]⁺m/z 431.1→m/z194.2CE:28eV；内标硝基安定选择性反应检测离子[M+H]⁺m/z 282.3→m/z 236.2CE:22eV。

本发明的有益效果：

(1)预处理方法简便：采用一步蛋白沉淀法，适用于常规检测。

(2)专属性强，采用Phenomenex kinetex XB-C18色谱柱进行分离，乙腈:水(水中含有质量浓度为0.1％的甲酸)的混合液作为流动相，等度洗脱，OXC的保留时间约为1.24min，MHD的保留时间约为1.07min，MHD-G保留时间约为1.00min，内标硝基安定(Nitrazepam)的保留时间约为1.55min，四者具有良好的分离度，可在3min内完成测定。此外，内源性物质不干扰两者的测定。

(3)灵敏度高：血浆中OXC、MHD、MHD-G最低定量限为10、50、125ng/mL。

(4)检测快速：3min完成样品的一次测定，时间短，因此适合大批量的生物样品的检测。

(5)样品用量小：仅需150μL血浆样品，即可测定出准确浓度。

(6)本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为OXC、MHD、MHD-G的血药浓度测定提供依据。本方法的OXC、MHD、MHD-G血浆标准曲线线性范围为10～750ng/mL、50～10000ng/mL、125～5000ng/mL，低QC日内、日间精密度和准确度均小于20％；中、高QC日内、日间精密度和准确度均小于15％。

附图说明

图1为空白人血浆质谱图。

图2为空白人血浆中加入OXC、MHD、MHD-G和内标硝基安定(Nitrazepam)的质谱图。

图3为人血浆OXC的标准曲线图。

图4为人血浆MHD的标准曲线图。

图5为人血浆MHD-G的标准曲线图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明，然而本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例：人血浆OXC、MHD和MHD-G浓度的测定

实验材料和仪器

奥卡西平，纯度>99.8％，批号：100657-201102，购于中国食品药品检定研究院；10,11-二氢-10-羟基卡马西平，纯度>98％，批号：D449135，购于百灵威公司；10,11-二氢-10-羟基卡马西平葡萄糖醛酸结合物，纯度>95.5％，批号：MD114541501，购于英国carbosynth公司；硝基安定，批号：9201，购于国家麻醉品实验室；甲醇，批号：HX080973，乙腈，批号：HX086245，均购于CNW公司；甲酸，批号：T20090811，购于国药集团化学试剂有限公司；水为超纯水(Milli-Q纯水机)自制。

液相色谱***：ACCELA autosampler，ACCELA 1250pump，美国Thermo Fisher公司；MS/MS***：TSQ QuantumAccess型三重四级杆串联质谱仪，配备电喷雾离子化ESI离子源，美国Thermo Fisher公司；数据采集：LC QUAN^TM2.6软件，美国Thermo Fisher公司；XW-80A微型旋涡混合仪，上海医大仪器厂；Z233MK-2高速离心机，德国HERMLE公司；BT25S型分析天平，德国Sartorius公司。HGC-12A氮吹仪，天津衡奥公司。

液质条件

1、液相色谱条件：

色谱柱：Phenomenex kinetex XB-C18(2.6μm，2.1×100mm)；流动相：乙腈:水(水中含有质量浓度为0.1％的甲酸)＝50:50(V/V)；流速：200～300μL/min；柱温：30～35℃；进样量：10μL。

2、质谱条件：

离子源：电喷雾离子化ESI离子源，方式扫描：选择反应检测扫描(SRM)，喷雾电压：3500～4000V，鞘气：20～50psi，辅助气：10～20arb，毛细管温度：350℃，离子源温度：300℃。检测离子：OXC选择性反应检测离子[M+H]⁺m/z 253.2→m/z180.2CE:28eV；MHD选择性反应检测离子[M+H]⁺m/z 255.2→m/z194.2CE:21eV；MHD-G选择性反应检测离子[M+H]⁺m/z431.1→m/z194.2CE:28eV；内标硝基安定选择性反应检测离子[M+H]⁺m/z 282.3→m/z236.2CE:22eV；

实验过程

1、OXC、MHD、MHD-G和内标硝基安定标准溶液配制

精密称取OXC标准品少量，置于容量瓶中，甲醇配置成1mg/mL OXC储备液。精密量取适量OXC储备液用甲醇依次稀释，配成浓度分别为100、200、500、1000、2500、5000、7500ng/mL的OXC标准溶液。

精密称取MHD标准品少量，置于容量瓶中，甲醇配置成1mg/mL MHD储备液。精密量取适量MHD储备液用甲醇依次稀释，配成浓度分别为500、1250、5000、20000、50000、80000、100000ng/mL的MHD标准溶液。

精密称取MHD-G标准品少量，置于容量瓶中，甲醇配置成1mg/mL MHD-G储备液。精密量取适量MHD-G储备液用甲醇依次稀释，配成浓度分别为1250、2500、5000、10000、20000、40000、50000ng/mL的MHD-G标准溶液。

精密称取内标硝基安定标准品少量，置于容量瓶中，甲醇配置成1mg/mL硝基安定储备液。精密量取适量储备液用甲醇稀释，配置成浓度为1000ng/mL硝基安定标准溶液。

2、专属性

取150μL空白人血浆，加入300μL乙腈沉淀蛋白，涡旋混匀5～10min，13000rpm离心10～15min，取上清液10μL进行LC-MS/MS分析。空白人血浆样品质谱图如图1所示。

取1.5mL EP管数支，加入OXC、MHD、MHD-G标准溶液各15μL，氮气吹干后，加入150μL空白人血浆，15μL 1000ng/mL内标硝基安定溶液以及285μL乙腈沉淀蛋白，涡旋混匀5～10min，13000rpm离心10～15min，取上清液10μL进行LC-MS/MS分析。

空白人血浆中加入OXC、MHD、MHD-G和内标硝基安定(Nitrazepam)的质谱图如图2所示。

注：通道a:OXC选择性反应检测离子[M+H]⁺m/z 253.2→m/z180.2CE:28eV；通道b:MHD选择性反应检测离子[M+H]⁺m/z 255.2→m/z194.2CE:21eV；通道c:内标硝基安定选择性反应检测离子[M+H]⁺m/z 282.3→m/z 236.2CE:22eV；通道d:MHD-G选择性反应检测离子[M+H]⁺m/z 431.1→m/z194.2CE:28eV。

结果显示，在本实验所采用的LC-MS/MS条件下，血浆内无杂峰对检测物质造成干扰，OXC的保留时间约为1.24min，MHD的保留时间约为1.07min，MHD-G保留时间约为1.00min，内标硝基安定的保留时间约为1.55min，3min内完成测定。OXC、MHD、MHD-G和内标硝基安定互不干扰，峰形良好，基线平稳。

3、标准曲线

取1.5mL EP管数支，分别加入OXC、MHD、MHD-G标准系列溶液，氮气吹干后，加入150μL空白人血浆，配置成浓度为(OXC:10、20、50、100、250、500、750ng/mL；MHD:50、125、500、2000、500、8000、10000ng/mL；MHD-G：125、250、500、1000、2000、4000、5000ng/mL)的标准含药血浆。再加入15μL1000ng/mL内标硝基安定溶液，285μL乙腈沉淀蛋白，涡旋混匀5～10min，13000rpm离心10～15min，取上清液10μL进行LC-MS/MS分析。分别计算OXC、MHD、MHD-G的峰面积As和内标峰面积Ai的比值f(f＝As/Ai)，以待测物浓度c为横坐标，以f值为纵坐标，用加权(权重系数：1/x²)最小二乘法进行线性回归运算得回归方程。

OXC：f＝0.0055663+0.00615469*c，r²＝0.9985；

MHD：f＝0.0245203+0.000508853*c，r²＝0.9953；

MHD-G：f＝-0.00106133+8.3264e-005*c,r²＝0.9967。

OXC在10～750ng/mL范围内线性关系良好，最低定量限为10ng/mL。

MHD在50～10000ng/mL范围内线性关系良好，最低定量限为50ng/mL。

MHD-G在125～5000ng/mL范围内线性关系良好，最低定量限为125ng/mL。

具体标准曲线图如图3-5所示。

4、最低定量限(LLOQ)

取1.5mL EP管数支，分别加入OXC、MHD、MHD-G标准溶液，氮气吹干后，加入150μL空白人血浆，配置成浓度为(OXC:10ng/mL；MHD:50ng/mL；MHD-G：125ng/mL)的标准含药血浆。再加入15μL 1000ng/mL内标硝基安定溶液以及285μL乙腈沉淀蛋白，涡旋混匀5～10min，13000rpm离心10～15min，取上清液10μL进行LC-MS/MS分析。同时设5个平行样。计算OXC、MHD、MHD-G的峰面积As和内标峰面积Ai的比值f，代入当天的血浆标准曲线中求得含OXC、MHD、MHD-G的实测浓度。由实测浓度计算最低定量限(LLOQ)的精密度(RSD％)和准确度(RE％)。

由表1结果可知，OXC、MHD、MHD-G的RSD％和RE％均在15％以内，OXC、MHD、MHD-G的定量下限(LLOQ)分别为10、50、125ng/mL(S/N>10)。

表1LC-MS/MS法测定人血浆中OXC、MHD、MHD-G的定量下限(LLOQ)

	OXC(10ng/mL)	RE％	MHD(50ng/mL)	RE％	MHD-G(125ng/mL)	RE％
							1	10.60	106.04	42.18	84.36	130.23	104.18
2	10.06	100.61	47.39	94.78	122.59	98.07
							3	9.31	93.09	48.12	96.23	100.02	80.02
4	9.84	98.42	45.54	91.07	110.87	88.70
							5	10.45	104.46	48.54	97.07	131.07	104.85
平均值	10.05		46.35		118.96
							RSD％	5.11		5.61		11.21

5、精密度和准确度

按照人血浆标准曲线方法配制含OXC(20、100、500ng/mL)、MHD(125、2000、8000ng/mL)、MHD-G(250、1000、4000ng/mL)血浆样品为低、中、高质控(QC)样品。再加入15μL1000ng/mL内标硝基安定溶液以及285μL乙腈沉淀蛋白，涡旋混匀5～10min，13000rpm离心10～15min，取上清液10μL进行LC-MS/MS分析。连续3天，每天每个浓度5个平行样，计算OXC、MHD、MHD-G的峰面积As和内标峰面积Ai的比值f，代入当天的血浆标准曲线中求得含OXC、MHD、MHD-G的实测浓度，由实测浓度计算日内、日间精密度，即为相对标准偏差(RSD％)，实测浓度与理论浓度的比值即为准确度(RE％)。

由表2-4可知，OXC、MHD、MHD-G的低QC日内、日间精密度和准确度均小于20％；中、高QC日内、日间精密度和准确度均小于15％。

表2LC-MS/MS法测定人血浆中OXC的日内、日间精密度和准确度

表3LC-MS/MS法测定人血浆中MHD的日内、日间精密度和准确度

表4LC-MS/MS法测定人血浆中MHD-G的日内、日间精密度和准确度

6、回收率

取1.5mL空白离心管数支，分别加入不同浓度的OXC、MHD和MHD-G标准溶液各15μL，N₂吹干后，再加入150μL人空白血浆配制成低、中、高三个浓度的标准含药血浆(OXC血浆浓度分别为20、100、500ng/mL，MHD血浆浓度分别为125、2000、8000ng/mL，MHD-G血浆浓度分别为250、1000、4000ng/mL)。再加入15μL 1000ng/mL内标硝基安定溶液以及285μL乙腈沉淀蛋白，涡旋混匀5～10min，13000rpm离心10～15min，取上清液10μL进行LC-MS/MS分析。得到相应药物峰面积和内标峰面积，分别为As(H)、Ai(H)；每一浓度进行5样本分析。

取1.5mL空白离心管数支，加入150μL人空白血浆后加再入300μL乙腈沉淀蛋白，涡旋混匀5～10min，13000rpm离心10～15min后，备用。另取1.5mL空白离心管数支，分别加入不同浓度的OXC、MHD和MHD-G质控(QC)溶液和1000ng/mL内标硝基安定溶液各15μL，N₂下吹干，每管加入上述450μL乙腈离心处理后空白血浆上清液，涡旋溶解，配制成低、中、高三个浓度的对照品溶液，进样分析，得到相应药物峰面积和内标峰面积，分别为As(D)、Ai(D)，每一浓度进行5样本分析。提取回收率按下式计算＝[As(H)/As(D)平均]×100％。

表5-7结果表明，OXC回收率为85.48％～96.24％，MHD回收率为90.73％～97.95％，MHD回收率为72.30％～80.63％。

表5LC-MS/MS法测定血浆中OXC的回收率(n＝5)

表6LC-MS/MS法测定血浆中MHD的回收率(n＝5)

表7LC-MS/MS法测定血浆中MHD-G的回收率(n＝5)

7、检测结果

检测10名患儿服用奥卡西平(OXC)后，血浆OXC、MHD、MHD-G的谷浓度，见表8。

表8

样本	OXC(ng/mL)	MHD(ng/mL)	MHD-G(ng/mL)
				Sample-1	54.20	3629.71	694.95
Sample-2	124.30	5731.20	1607.33
				Sample-3	96.70	6055.96	1459.04
Sample-4	55.26	4047.15	1286.54
				Sample-5	51.38	4339.84	507.61
Sample-6	77.90	4360.72	578.98
				Sample-7	48.84	2826.03	856.97
Sample-8	120.55	5892.58	619.28
				Sample-9	75.14	5244.91	614.33
Sample-10	77.00	6466.42	1667.10

由表1-8可知，本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为OXC、MHD、MHD-G的血药浓度测定提供依据。本方法的OXC、MHD、MHD-G血浆标准曲线线性范围为10～750ng/mL、50～10000ng/mL、125～5000ng/mL，低QC日内、日间精密度和精确度均小于20％；中、高QC日内、日间精密度和准确度均小于15％。

Claims

1.一种同时测定人血浆中OXC以及代谢产物MHD和MHD-G的检测方法，其特征是步骤为：

（1）血浆样品预处理：取血浆样品，加入内标硝基安定，再加入乙腈沉淀蛋白，离心取上清液，得到血浆样品；

（2）色谱：将步骤（1）预处理后的血浆样品进行液相色谱分离：色谱条件中色谱柱：Phenomenex kinetex XB-C18柱；流动相：乙腈:水体积比为50:50，水中含有质量浓度为0.1%的甲酸；流速：250~300μL/min；柱温：30~40℃；进样量：10μL；

（3）质谱：离子源：电喷雾离子化ESI离子源，扫描方式：选择反应检测扫描SRM，喷雾电压：3500~4000V，鞘气：20~50psi，辅助气：10~20arb，毛细管温度：350℃，离子源温度：300℃；

（4）计算：采用内标法，以OXC、MHD和MHD-G和内标硝基安定的峰面积比值代入标准曲线方程，计算OXC、MHD和MHD-G的血药浓度；

步骤（1）具体为：取血浆样品150μL，加入1000ng/mL内标硝基安定溶液15μL，再加入乙腈285μL，涡旋混匀5~10min，13000rpm离心10~15min，离心后取上清液；步骤（1）所述血浆样品为含OXC、MHD和MHD-G的血浆；

步骤（2）中色谱柱长度为100mm，内径为2.1mm，填料粒径为2.6μm；

步骤（3）中检测离子具体如下：OXC选择性反应检测离子[M+H]⁺ m/z 253.2→ m/z180.2CE: 28eV；MHD选择性反应检测离子[M+H]⁺ m/z 255.2→ m/z194.2 CE: 21eV；MHD-G选择性反应检测离子[M+H]⁺ m/z 431.1→ m/z194.2 CE: 28eV；内标硝基安定选择性反应检测离子[M+H]⁺ m/z 282.3 → m/z 236.2 CE: 22eV。