CN113984943B - 一种同时检测血浆或血清中钆对比剂与游离钆离子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种同时检测血浆或血清中钆对比剂与游离钆离子的方法，本发明属于钆对比剂临床检测技术领域。为解决现有临床检测中钆对比剂与游离钆离子不能有效分离、检测准确度及灵敏度低的问题，本发明提供了一种同时检测血浆或血清中钆对比剂与游离钆离子的方法，包括确定检测条件、配制同时含有钆对比剂和钆元素的混合标准样本组、绘制标准曲线、临床样本前处理以及样本检测与数据处理。本发明中高效分子排阻色谱柱粒径更小，分离效率更大，能够有效分离血浆或血清中钆对比剂与游离钆离子，检测灵敏度更高，检测结果更准确。本发明前处理时采用乙腈或双氧水处理血浆或血清样本，提取效果好，不影响钆对比剂结构，保证了检测结果的准确性。
Description
技术领域
本发明属于钆对比剂临床检测技术领域，特别涉及一种高效分子排阻色谱联用电感耦合等离子体质谱(HPSEC-ICP-MS)同时检测血浆或血清中钆对比剂与游离钆离子的方法。
背景技术
磁共振成像是一种重要的影像学检查方法，具有较高的分辨率，但是其分辨率在某些情况下还不能满足临床需要，而增强磁共振可提供更多的诊断信息，对于全身各个***疾病的早期诊断、鉴别诊断有重要价值。增强磁共振检查中需要使用磁共振对比剂以达到增强对比度的目的。磁共振对比剂一般以静脉注射进入人体内，通过改变其周围组织中质子的弛豫时间，提高病灶与正常组织的对比度，从而增加病变的检出率，提高诊断的正确率。
钆对比剂(Gadolinium-based contrast agent，GBCAs)是临床上常用的一种磁共振对比剂，这种对比剂主要是钆的螯合物，钆离子(Gd3+)是一种顺磁性很强的金属离子，可表现出较大的磁动量，但是游离Gd3+有较大的毒性，易在体内沉积。GBCAs将游离Gd3+形成聚氨基羧酸螯合物，从而规避游离Gd3+的毒性，同时保持其优异的顺磁性，因此一直被认为是安全性较高的一种对比剂。然而随着增强磁共振的普及和推广，GBCA的使用逐年增多，其安全性受到越来越多的关注。GBCAs主要以原形经过肾小球滤过，对于肾功能正常者，98％的GBCAs能在注射后24h内被清除，完全清除需要约24～48h。然而有研究表明，GBCAs进入体内后可释放出游离的Gd3+，游离Gd3+可迅速分布到皮肤、骨骼、肝脏和脑等组织器官中，并发生少量沉积。另一方面，游离Gd3+与Ca2+尺寸类似，可竞争Ca2+电压依赖型通道和酶，抑制Ca2+内流及一系列相关酶的活性。游离Gd3+在体内长时间滞留还可能抑制网状内皮***功能。更值得注意的是，严重肾损伤患者应用GBCAs还可能引起肾源性***性纤维化，该病以对称性分布的皮肤增厚、***及色素沉着为特征，还可累及全身其他组织器官如关节、骨骼肌、心肌、肾脏、神经等。患者往往隐匿起病，症状进行性加重，目前尚无有效的治疗方法，死亡率极高。发病机制可能与GBCAs***受阻，Gd3+在体内蓄积有关，并且有研究表明肾源性***性纤维化与GBCAs注射剂量存在相关性。测定体内GBCAs含量有助于探究疾病的发生机制，减少不良反应的发生。
为了评估GBCAs的体内动力学过程以及释放游离Gd3+的动力学特点，研究钆沉积量与钆毒性的相关性，减少患者不良反应的发生，有必要对体内GBCAs和游离Gd3+含量进行测定。国外已有报道应用高效液相色谱法、液相色谱联用质谱法、电感耦合等离子体质谱法、电感耦合等离子体发射光谱法等检测手段测定血浆、尿液、胆汁等生物样本中的GBCAs，其中有报道利用分子排阻色谱法(SEC)结合电感耦合等离子体质谱检测头发中GBCAs和游离Gd3+，但是分离度较差，未能将两者完全分离；其前处理方法使用四甲基氢氧化铵并进行消解，然而四甲基氢氧化铵会诱导部分GBCAs解离为游离Gd3+，导致无法准确测定样本中的GBCAs和游离Gd3+。此外，该方法未能在尿液中检测到游离Gd3+，这可能与方法的灵敏度不够有关。
综上，现有技术关于生物样本中GBCAs和游离Gd3+的同时检测主要难点在于：1、GBCAs和游离Gd3+分离度较差，不能有效分离；2、前处理过程破坏GBCAs，影响检测的准确度；3、生物样本中游离Gd3+含量较低，需要提高方法的灵敏度来满足检测目的。
发明内容
为解决现有临床生物样本检测中GBCAs和游离Gd3+不能有效分离、检测准确度受样品前处理影响以及检测方法灵敏度低的问题，本发明提供了一种同时检测血浆或血清中钆对比剂与游离钆离子的方法。
本发明的技术方案：
一种同时检测血浆或血清中钆对比剂与游离钆离子的方法，步骤如下：
步骤一、确定HPSEC-ICP-MS检测条件；
步骤二、配制不同浓度的同时含有钆对比剂和钆元素的混合标准样本组：
(一)空白血液前处理：将收集所得空白血液离心处理，收集上清液得到空白血浆或空白血清，取空白血浆或空白血清加入乙腈，混匀后离心处理，取离心上清液为空白血浆样本或空白血清样本；
(二)配制混合标准样本：取相应浓度的钆对比剂标准溶液和钆元素标准溶液加入所得空白血浆样本或空白血清样本中，得到不同浓度的同时含有钆对比剂和钆元素的混合标准样本组；
步骤三、绘制钆对比剂标准曲线和钆元素的标准曲线：
将步骤二配制所得不同浓度的同时含有钆对比剂和钆元素的混合标准样本组按照步骤一确定的HPSEC-ICP-MS检测条件依次进样检测；分别以钆对比剂或钆元素的浓度为横坐标，以对应的峰面积为纵坐标进行线性回归，分别得到钆对比剂标准曲线方程和钆元素的标准曲线方程；
步骤四、临床生物样本前处理：
将收集所得待测血液样本离心处理，收集上清液得到待测血浆或待测血清，取待测血浆或待测血清加入乙腈，混匀后离心，取离心上清液为待测样品；
步骤五、样本检测与数据处理：
步骤四得到的待测样品按照步骤一确定的HPSEC-ICP-MS检测条件进样检测，由保留时间定性，峰面积定量，利用步骤三所得标准曲线方程，外标法定量，计算得出待测样品中钆对比剂浓度和钆元素的浓度。
进一步的，步骤一所述HPSEC-ICP-MS检测条件为：
高效分子排阻色谱条件：分子排阻色谱柱：TSK gel G2000SWXL，7.8mm×300mm，5μm；流动相：pH为7.4的20mM Tris-HCl溶液，流速为1.0mL/min；进样量10μL；
ICP-MS分析条件：射频功率：1500W，雾化气流速：0.8L/min，冷却气流速：15.0L/min，辅助气流速：1.0L/min，停留时间100ms，检测模式：碰撞气模式。
进一步的，步骤二所述空白血液离心条件为3000rpm下离心10min；所述空白血浆或空白血清与乙腈按体积比为1:4，所述混匀后离心的条件为4℃下13000rpm离心15min；所述相应浓度的钆对比剂标准溶液、钆元素标准溶液和空白血浆样本或空白血清样本的体积比为10:10:80。
进一步的，步骤二所述同时含有钆对比剂和钆元素的混合标准样本组中钆对比剂和钆元素的浓度依次为：钆对比剂0.005μM+钆元素1ng/mL、钆对比剂0.025μM+钆元素5ng/mL、钆对比剂0.05μM+钆元素10ng/mL、钆对比剂0.1μM+钆元素25ng/mL、钆对比剂0.15μM+钆元素50ng/mL、钆对比剂0.25μM+钆元素75ng/mL和钆对比剂0.5μM+钆元素100ng/mL。
进一步的，步骤三所述钆对比剂的标准曲线方程为Y＝5184.12X+6954.52，r2＝0.9981，线性范围为0.005～0.5μM；钆元素的标准曲线方程为Y＝8746.77X+1114.80，r2＝0.9986，线性范围为1～100ng/mL。
进一步的，步骤四所述待测血浆或待测血清与乙腈的体积比为1:4；混匀后离心条件为4℃下离心速度为13000rpm离心15min。
进一步的，将步骤二(一)中空白血液前处理使用的乙腈和步骤四临床生物样本前处理使用的乙腈全部替换为质量浓度为30％的双氧水。
进一步的，使用质量浓度为30％的双氧水对空白血液进行前处理时空白血浆或空白血清与质量浓度为30％的双氧水的体积比为2:1，混匀后离心条件为4℃下离心速度为13000rpm离心15min。
进一步的，仅将空白血液前处理使用的乙腈替换为质量浓度为30％的双氧水，配制与乙腈前处理时同样浓度的同时含有钆对比剂和钆元素的混合标准样本组，按照相同方法绘制标准曲线，分别得到钆对比剂的标准曲线方程为Y＝4.23e4X+7510.94，r2＝0.994，线性范围为0.005～0.5μM；钆元素的标准曲线方程为Y＝5.51e4X+940.47，r2＝0.991，线性范围为1～100ng/mL。
进一步的，使用质量浓度为30％的双氧水对待测血液进行前处理时待测血浆或待测血清与质量浓度为30％的双氧水的体积比为2:1，混匀后离心条件为4℃下离心速度为13000rpm离心15min。
本发明的有益效果：
本发明采用高效分子排阻色谱联用电感耦合等离子体质谱同时检测血浆或血清中钆对比剂与游离钆离子，具有高特异性、高灵敏度、高准确度以及样本量体积少、样本前处理简单等优势。高效分子排阻色谱柱粒径更小，分离效率更大，能够有效分离血浆或血清中GBCAs和游离Gd3+，使检测灵敏度更高，检测结果更准确，并且通用性强，易于推广。
本发明对血浆或血清样本进行前处理时采用乙腈或双氧水，乙腈沉淀蛋白时不影响GBCAs的结构，双氧水可将蛋白结合的钆有效分离，提取效果好，不影响GBCAs结构，保证了检测结果的准确性。而且双氧水前处理时稀释倍数比乙腈前处理稀释倍数小，用双氧水前处理的检测灵敏度更高。本发明前处理方法简单，样本量小，操作性强，便于临床推广。
将本发明用于检测经磁共振检查的患者体内钆沉积以及钆的清除率和钆释放程度，能够为评估钆对比剂在患者体内的动力学特征提供准确的依据，有助于研究体内钆沉积量与钆毒性的相关性，为钆对比剂的使用提供预警，减少患者不良反应的发生。
附图说明
图1为实施例1钆对比剂钆布醇和钆元素血浆混合标准样品的总色谱图；
图2为钆对比剂钆布醇血浆标准样品的色谱图；
图3为钆元素血浆标准样品的色谱图；
图4为实施例2钆对比剂钆布醇和钆元素血浆混合标准样品的总色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置，若未特别指明，本发明实施例中所用的原料等均可市售获得；若未具体指明，本发明实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本实施例提供了一种HPSEC-ICP-MS同时检测血浆中钆对比剂与游离钆离子的方法，步骤如下：
步骤一、确定HPSEC-ICP-MS检测条件；
本实施例中高效分子排阻色谱条件：分子排阻色谱柱：TSK gel G2000SWXL，7.8mm×300mm，5μm；流动相：pH为7.4的20mM Tris-HCl溶液，流速为1.0mL/min；进样量10μL；
ICP-MS分析条件：射频功率：1500W，雾化气流速：0.8L/min，冷却气流速：15.0L/min，辅助气流速：1.0L/min，停留时间100ms，检测模式：碰撞气模式。
本实施例采用高效分子排阻色谱联用电感耦合等离子体质谱，其中高效分子排阻色谱柱的孔径为0.5～200kDa，色谱柱粒径更小，分离效率更大，能够有效分离血浆或血清中GBCAs和游离Gd3+，具有高特异性、高灵敏度、高准确度以及样本量体积少、样本前处理简单等优势，通用性强，易于推广。
步骤二、配制不同浓度的同时含有钆对比剂和钆元素的混合标准样本组：
(一)空白血液前处理：
本实施例中空白血液来自7位不同阴性志愿者的混合血液样本，以抗凝管收集志愿者血液并混合、3000rpm下离心10min收集上清得到空白血浆，取空白血浆100μL加入400μL乙腈，涡旋混匀15s，在4℃下离心速度为13000rpm离心15min，去除蛋白质沉淀，取离心上清液为空白血浆样本；
(二)配制混合标准样本：
使用纯水分别配制钆对比剂和钆元素的储备液，本实施例使用的钆对比剂为钆布酚。使用纯水将钆对比剂和钆元素的储备液分别逐级稀释，得到浓度为1000μM的钆对比剂标准母液和20mg/L的钆元素标准母液；用2％硝酸水溶液分别稀释钆对比剂标准母液和钆元素标准母液得到钆对比剂标准溶液和钆元素的标准溶液。
本实施例中钆对比剂标准溶液中钆对比剂的浓度依次为0.05、0.25、0.5、1、1.5、2.5和5μM；钆元素标准溶液中钆元素的浓度依次为10、50、100、250、500、750和1000ng/mL。
取相应浓度的钆对比剂标准溶液和钆元素标准溶液各10μL，加入空白血浆样本80μL，得到同时含有钆对比剂和钆元素的混合标准样本。
本实施例共配制了7种不同浓度的同时含有钆对比剂和钆元素的混合标准样本组(STD1-STD7)，其中钆对比剂和钆元素的浓度见表1。
表1
如表1所示同时含有钆对比剂和钆元素的混合标准样本组中钆对比剂和钆元素的浓度依次为：钆对比剂0.005μM+钆元素1ng/mL、钆对比剂0.025μM+钆元素5ng/mL、钆对比剂0.05μM+钆元素10ng/mL、钆对比剂0.1μM+钆元素25ng/mL、钆对比剂0.15μM+钆元素50ng/mL、钆对比剂0.25μM+钆元素75ng/mL和钆对比剂0.5μM+钆元素100ng/mL。
步骤三、绘制钆对比剂标准曲线和钆元素的标准曲线：
按照步骤一确定的HPSEC-ICP-MS检测条件将同时含有钆对比剂和钆元素的混合标准样本组STD1-STD7依次进样检测；分别以钆对比剂或钆元素的浓度为横坐标，以对应的峰面积为纵坐标进行线性回归，分别得到钆对比剂标准曲线方程和钆元素的标准曲线方程：钆对比剂的标准曲线方程为Y＝5184.12X+6954.52，r2＝0.9981，线性范围为0.005～0.5μM；钆元素的标准曲线方程为Y＝8746.77X+1114.80，r2＝0.9986，线性范围为1～100ng/mL。
步骤四、收集与处理临床生物样本：
收集待测血液，3000rpm下离心10min，以抗凝管收集待测血液并离心收集上清得到待测血浆，每份分装100μL，置于-80℃冰箱中保存备用；
取100μL待测血浆加入400μL乙腈，涡旋混匀15s，在4℃下离心速度为13000rpm离心15min，去除蛋白质沉淀，移液器取上清液即为待测样品。
本实施例采用乙腈沉淀蛋白，不会影响钆对比剂的结构，方法简单，样本量小，操作性强，便于临床推广。
步骤五、样本检测与数据处理：
步骤四得到的待测样品按照步骤一确定的HPSEC-ICP-MS检测条件进样检测，由保留时间定性，峰面积定量，利用步骤三所得标准曲线方程，外标法定量，计算得出待测样品中钆对比剂浓度和钆元素的浓度。
本实施例用普通血清管收集空白血液时，同样的离心处理条件得到的空白血清采用步骤二、步骤三相同方法进样处理，绘制得到的标准曲线与使用空白血浆得到的标准曲线基本是相同的，因此，在对临床生物样本进行处理时，使用待测血浆样本或待测血清样本进样检测得到的数据均可以带入标准曲线方程，得到待测样品中钆对比剂浓度和钆元素的浓度，并且待测血浆样本和待测血清样本的检测结果是基本相同的。
实施例2
本实施例提供了一种HPSEC-ICP-MS同时检测血浆中钆对比剂与游离钆离子的方法，步骤如下：
步骤一、确定HPSEC-ICP-MS检测条件；
本实施例中高效分子排阻色谱条件：分子排阻色谱柱：TSK gel G2000SWXL，7.8mm×300mm，5μm；流动相：pH为7.4的20mM Tris-HCl溶液，流速为1.0mL/min；进样量10μL；
ICP-MS分析条件：射频功率：1500W，雾化气流速：0.8L/min，冷却气流速：15.0L/min，辅助气流速：1.0L/min，停留时间100ms，检测模式：碰撞气模式。
步骤二、配制不同浓度的同时含有钆对比剂和钆元素的混合标准样本组：
(一)空白血液前处理：
本实施例中空白血液来自7位不同阴性志愿者的混合血液样本，以抗凝管收集志愿者血液并混合、3000rpm下离心10min收集上清得到空白血浆，取空白血浆100μL加入50μL质量浓度为30％的双氧水，涡旋混匀15s，在4℃下离心速度为13000rpm离心15min，取离心上清液为空白血浆样本；
(二)配制混合标准样本：
使用纯水分别配制钆对比剂和钆元素的储备液，本实施例使用的钆对比剂为钆布酚。使用纯水将钆对比剂和钆元素的储备液分别逐级稀释，得到浓度为1000μM的钆对比剂标准母液和20mg/L的钆元素标准母液；用2％硝酸水溶液分别稀释钆对比剂标准母液和钆元素标准母液得到钆对比剂标准溶液和钆元素的标准溶液。
本实施例中钆对比剂标准溶液中钆对比剂的浓度依次为0.05、0.25、0.5、1、1.5、2.5和5μM；钆元素标准溶液中钆元素的浓度依次为10、50、100、250、500、750和1000ng/mL。
取相应浓度的钆对比剂标准溶液和钆元素标准溶液各10μL，加入空白血浆样本80μL，得到同时含有钆对比剂和钆元素的混合标准样本。
本实施例共配制了7种与实施例1表1所示钆对比剂和钆元素浓度相同的同时含有钆对比剂和钆元素的混合标准样本组(STD1-STD7)。
步骤三、绘制钆对比剂标准曲线和钆元素的标准曲线：
按照步骤一确定的HPSEC-ICP-MS检测条件将同时含有钆对比剂和钆元素的混合标准样本组STD1-STD7依次进样检测；分别以钆对比剂或钆元素的浓度为横坐标，以对应的峰面积为纵坐标进行线性回归，分别得到钆对比剂的标准曲线方程为Y＝4.23e4X+7510.94，r2＝0.994，线性范围为0.005～0.5μM；钆元素的标准曲线方程为Y＝5.51e4X+940.47，r2＝0.991，线性范围为1～100ng/mL。
步骤四、收集与处理临床生物样本：
收集待测血液，3000rpm下离心10min，以抗凝管收集待测血液并离心收集上清得到待测血浆，每份分装100μL，置于-80℃冰箱中保存备用；
取100μL待测血浆加入50μL质量浓度为30％的双氧水，涡旋混匀15s，在4℃下离心速度为13000rpm离心15min，移液器取上清液即为待测样品。
本实施例采用双氧水进行前处理，双氧水可将与蛋白结合的钆有效分离，提取效果好，不会影响钆对比剂的结构，而且使用双氧水稀释倍数小，检测结果准确，方法简单，样本量小，操作性强，便于临床推广。
步骤五、样本检测与数据处理：
步骤四得到的待测样品按照步骤一确定的HPSEC-ICP-MS检测条件进样检测，由保留时间定性，峰面积定量，利用步骤三所得标准曲线方程，外标法定量，计算得出待测样品中钆对比剂浓度和钆元素的浓度。
本实施例用普通血清管收集空白血液时，同样的离心处理条件得到的空白血清采用步骤二、步骤三相同方法进样处理，绘制得到的标准曲线与使用空白血浆得到的标准曲线基本是相同的，因此，在对临床生物样本进行处理时，使用待测血浆样本或待测血清样本进样检测得到的数据均可以带入标准曲线方程，得到待测样品中钆对比剂浓度和钆元素的浓度，并且待测血浆样本和待测血清样本的检测结果是基本相同的。
图1为实施例1中钆布醇0.1μM+钆元素25ng/mL浓度的同时含有钆对比剂和钆元素的血浆混合标准样本的总色谱图；图2为仅含有钆布醇0.1μM的乙腈处理血浆标准样品的色谱图；图3为仅含有钆元素25ng/mL的乙腈处理血浆标准样品的色谱图；由图1-图3的对比可以看出钆对比剂的保留时间是6.13min，钆元素的保留时间是9.28min，本发明提供的检测方法目标分析物专属性强，分离度好，干扰小。
图4为实施例2中钆布醇0.1μM+钆元素25ng/mL浓度的同时含有钆对比剂和钆元素的血浆混合标准样本的总色谱图；由此可见，使用双氧水对血液样本进行前处理同样能够获得目标分析物专属性强、分离度好、干扰小的检测结果。
实施例3
本实施例对实施例1提供的同时检测血浆中钆对比剂与游离钆离子的方法的准确度与精密度进行了如下验证：
分别取钆对比剂浓度为0.25μM的钆对比剂标准溶液2.5μL、钆元素浓度为50ng/mL的钆元素标准溶液2.5μL，加入空白血浆95μL；分别取钆对比剂浓度为1μM的钆对比剂标准溶液2.5μL、钆元素浓度为250ng/mL的钆元素标准溶液2.5μL，加入空白血浆95μL；分别取钆对比剂浓度为2.5μM的钆对比剂标准溶液2.5μL、钆元素浓度为750ng/mL的钆元素标准溶液2.5μL，加入空白血浆95μL；得到低、中、高三个浓度的同时含有钆对比剂和钆元素的混合标准品。
按实施例1提供的方法进行测定，重复分析测定3批次，所得回收率、日内日间精密度如表2所示。
表2
由表2数据可以看出，实施例1提供的方法在不同加标水平下钆对比剂和钆元素的加标回收率均在±15％内；日内精密度和日间精密度均在±15％内，这说明实施例1提供的检测方法精密度和重复性较好，可用于精确的定量分析。
实施例4
本实施例对实施例1提供的同时检测血浆中钆对比剂与游离钆离子的方法的稳定性进行了如下验证：
分别取钆对比剂浓度为0.25μM的钆对比剂标准溶液2.5μL、钆元素浓度为50ng/mL的钆元素标准溶液2.5μL，加入空白血浆95μL；分别取钆对比剂浓度为1μM的钆对比剂标准溶液2.5μL、钆元素浓度为250ng/mL的钆元素标准溶液2.5μL，加入空白血浆95μL；分别取钆对比剂浓度为2.5μM的钆对比剂标准溶液2.5μL、钆元素浓度为750ng/mL的钆元素标准溶液2.5μL，加入空白血浆95μL；得到低、中、高三个浓度的同时含有钆对比剂和钆元素的混合标准品。分别配制三组，组1在室温放置6h，组2放入-80℃冰箱并反复冻融三次，组3放入-80℃冰箱存放30天。
按实施例1检测方法进行测定，将组1、组2和组3重复分析测定3批次，得到室温稳定性、冻融稳定性、-80℃稳定性(30天)如表3所示。
表3
由表3数据可知，组1、组2和组3中钆对比剂和钆元素在不同加标水平下的回收率均在±15％内，实施例1提供的检测方法的稳定性符合标准。
实施例5
本实施例对实施例2提供的同时检测血浆中钆对比剂与游离钆离子的方法的准确度与精密度进行了如下验证：
分别取钆对比剂浓度为0.25μM的钆对比剂标准溶液2.5μL、钆元素浓度为50ng/mL的钆元素标准溶液2.5μL，加入空白血浆95μL；分别取钆对比剂浓度为1μM的钆对比剂标准溶液2.5μL、钆元素浓度为250ng/mL的钆元素标准溶液2.5μL，加入空白血浆95μL；分别取钆对比剂浓度为2.5μM的钆对比剂标准溶液2.5μL、钆元素浓度为750ng/mL的钆元素标准溶液2.5μL，加入空白血浆95μL；得到低、中、高三个浓度的同时含有钆对比剂和钆元素的混合标准品。
按实施例2提供的方法进行测定，重复分析测定3批次，所得回收率、日内日间精密度如表4所示。
表4
由表4数据可以看出，实施例2提供的方法在不同加标水平下钆对比剂和钆元素的加标回收率均在±15％内；日内精密度和日间精密度均在±15％内，这说明实施例2提供的检测方法精密度和重复性较好，可用于精确的定量分析。
实施例6
本实施例对实施例2提供的同时检测血浆中钆对比剂与游离钆离子的方法的稳定性进行了如下验证：
分别取钆对比剂浓度为0.25μM的钆对比剂标准溶液2.5μL、钆元素浓度为50ng/mL的钆元素标准溶液2.5μL，加入空白血浆95μL；分别取钆对比剂浓度为1μM的钆对比剂标准溶液2.5μL、钆元素浓度为250ng/mL的钆元素标准溶液2.5μL，加入空白血浆95μL；分别取钆对比剂浓度为2.5μM的钆对比剂标准溶液2.5μL、钆元素浓度为750ng/mL的钆元素标准溶液2.5μL，加入空白血浆95μL；得到低、中、高三个浓度的同时含有钆对比剂和钆元素的混合标准品。分别配制三组，组1在室温放置6h，组2放入-80℃冰箱并反复冻融三次，组3放入-80℃冰箱存放30天。
按实施例2检测方法进行测定，将组1、组2和组3重复分析测定3批次，得到室温稳定性、冻融稳定性、-80℃稳定性(30天)如表5所示。
表5
由表5数据可知，组1、组2和组3中钆对比剂和钆元素在不同加标水平下的回收率均在±15％内，实施例2提供的检测方法的稳定性符合标准。
Claims (8)
1.一种同时检测血浆或血清中钆对比剂与游离钆离子的方法，其特征在于，步骤如下：
步骤一、确定HPSEC-ICP-MS检测条件；
所述HPSEC-ICP-MS检测条件为：
高效分子排阻色谱条件：分子排阻色谱柱：TSK gel G2000SWXL，7.8 mm×300 mm，5 μm；流动相：pH为7.4的20 mM Tris-HCl溶液，流速为1.0 mL/min；进样量10 μL；
ICP-MS分析条件：射频功率：1500W，雾化气流速：0.8L/min，冷却气流速：15.0 L/min，辅助气流速：1.0L/min，停留时间100ms，检测模式：碰撞气模式；
步骤二、配制不同浓度的同时含有钆对比剂和钆元素的混合标准样本组：
（一）空白血液前处理：将收集所得空白血液离心处理，所述空白血液离心条件为3000rpm下离心10 min；收集上清液得到空白血浆或空白血清，取空白血浆或空白血清加入乙腈，所述空白血浆或空白血清与乙腈按体积比为1:4混匀后离心处理，所述混匀后离心的条件为4℃下13000 rpm离心15 min；取离心上清液为空白血浆样本或空白血清样本；
（二）配制混合标准样本：取相应浓度的钆对比剂标准溶液和钆元素标准溶液加入所得空白血浆样本或空白血清样本中，所述相应浓度的钆对比剂标准溶液、钆元素标准溶液和空白血浆样本或空白血清样本的体积比为10:10:80，得到不同浓度的同时含有钆对比剂和钆元素的混合标准样本组；
步骤三、绘制钆对比剂标准曲线和钆元素的标准曲线：
将步骤二配制所得不同浓度的同时含有钆对比剂和钆元素的混合标准样本组按照步骤一确定的HPSEC-ICP-MS检测条件依次进样检测；分别以钆对比剂或钆元素的浓度为横坐标，以对应的峰面积为纵坐标进行线性回归，分别得到钆对比剂标准曲线方程和钆元素的标准曲线方程；
步骤四、临床生物样本前处理：
将收集所得待测血液样本离心处理，收集上清液得到待测血浆或待测血清，取待测血浆或待测血清加入乙腈，混匀后离心，取离心上清液为待测样品；
步骤五、样本检测与数据处理：
步骤四得到的待测样品按照步骤一确定的HPSEC-ICP-MS检测条件进样检测，由保留时间定性，峰面积定量，利用步骤三所得标准曲线方程，外标法定量，计算得出待测样品中钆对比剂浓度和钆元素的浓度。
2.根据权利要求1所述一种同时检测血浆或血清中钆对比剂与游离钆离子的方法，其特征在于，步骤二所述同时含有钆对比剂和钆元素的混合标准样本组中钆对比剂和钆元素的浓度依次为：钆对比剂0.005 μM+钆元素1 ng/mL、钆对比剂0.025 μM+钆元素5 ng/mL、钆对比剂0.05 μM+钆元素10 ng/mL、钆对比剂0.1 μM+钆元素25 ng/mL、钆对比剂0.15 μM+钆元素50 ng/mL、钆对比剂0.25 μM+钆元素75 ng/mL和钆对比剂0.5 μM+钆元素100 ng/mL。
3.根据权利要求2所述一种同时检测血浆或血清中钆对比剂与游离钆离子的方法，其特征在于，步骤三所述钆对比剂的标准曲线方程为Y=5184.12X+6954.52，r2=0.9981，线性范围为0.005~0.5 μM；钆元素的标准曲线方程为Y=8746.77X+1114.80，r2=0.9986，线性范围为1~100 ng/mL。
4.根据权利要求3所述一种同时检测血浆或血清中钆对比剂与游离钆离子的方法，其特征在于，步骤四所述待测血浆或待测血清与乙腈的体积比为1:4；混匀后离心条件为4℃下离心速度为13000 rpm离心15 min。
5.根据权利要求4所述一种同时检测血浆或血清中钆对比剂与游离钆离子的方法，其特征在于，将步骤二（一）中空白血液前处理使用的乙腈和步骤四临床生物样本前处理使用的乙腈全部替换为质量浓度为30%的双氧水。
6.根据权利要求5所述一种同时检测血浆或血清中钆对比剂与游离钆离子的方法，其特征在于，使用质量浓度为30%的双氧水对空白血液进行前处理时空白血浆或空白血清与质量浓度为30%的双氧水的体积比为2:1，混匀后离心条件为4℃下离心速度为13000 rpm离心15 min。
7.根据权利要求6所述一种同时检测血浆或血清中钆对比剂与游离钆离子的方法，其特征在于，仅将空白血液前处理使用的乙腈替换为质量浓度为30%的双氧水，配制与乙腈前处理时同样浓度的同时含有钆对比剂和钆元素的混合标准样本组，按照相同方法绘制标准曲线，分别得到钆对比剂的标准曲线方程为Y=4.23e4X+7510.94，r2=0.994，线性范围为0.005~0.5 μM；钆元素的标准曲线方程为Y=5.51e4X+940.47，r2=0.991，线性范围为1~100ng/mL。
8.根据权利要求7所述一种同时检测血浆或血清中钆对比剂与游离钆离子的方法，其特征在于，使用质量浓度为30%的双氧水对待测血液进行前处理时待测血浆或待测血清与质量浓度为30%的双氧水的体积比为2:1，混匀后离心条件为4℃下离心速度为13000 rpm离心15 min。
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2021
- 2021-10-29 CN CN202111271893.XA patent/CN113984943B/zh active Active
Patent Citations (4)
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