CN109705223B

CN109705223B - 一种羊口疮病毒重组亚单位疫苗及其生产方法

Info

Publication number: CN109705223B
Application number: CN201811628927.4A
Authority: CN
Inventors: 冯平; 陈瑞; 张磊
Original assignee: Yulin University
Current assignee: Yulin University
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2023-05-12
Anticipated expiration: 2038-12-29
Also published as: CN109705223A

Abstract

本发明涉及一种羊口疮病毒融合蛋白rB2LcF1L，所述羊口疮病毒B2L和F1L融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No:2，所述羊口疮病毒融合蛋白rB2LcF1L，与野生型羊口疮病毒F1L蛋白相比，缺失了1‑70位的氨基酸序列，其能够有利于融合蛋白的表达，提高表达量，同时，在融合蛋白的C端加上6组氨酸标签，方便在后续生产中进行纯化，上述氨基酸序列中，相比传统的分离毒株的B2L氨基酸序列，将第9位氨基酸的V/L突变为G，即“IPVG或者IPLG突变为IPGG”，第35位的LDCF突变为LYCF，上述突变显著提高了融合蛋白的表达量和免疫原性。

Description

一种羊口疮病毒重组亚单位疫苗及其生产方法

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种羊口疮病毒重组亚单位疫苗及其生产方法。

背景技术

羊口疮又称羊传染性脓疱，是一种严重威胁养羊业的接触性、嗜上皮性传染病，主要危害3～6月龄羔羊和部分成年羊。该病的临床症状表现为嘴唇、口黏膜部分皮肤红疹、脓疱、溃疡和结痂，羔羊表现为齿唇部破溃，不能进食，发病率高达100%，若继发或混合感染其他病原微生物死亡率较高，可达15%。羊口疮世界范围内发生，且广泛流行。近年来，随着我国养羊产业的发展和饲养方式的改变，该病的发生风险增大，波及的面积以及危害的严重程度也越来越高，给养羊业带来了巨大的经济损失。与此同时，作为一种人畜共患病，该病毒也危害人类的健康。该病在我国部分地区呈暴发和流行，其中甘肃、宁夏、四川、江苏、云南、青海、陕西、山东、内蒙古、新疆、贵州、黑龙江等省区均有此病发生和流行的报道。羊口疮从临床症状上容易诊断，目前尚无针对性药物用于治疗，通常使用抗生素防止继发或混合感染治疗无特异性药物，疫苗接种被认为是预防和控制该病可靠且有效的手段。当前国外主要用弱毒疫苗来预防羊口疮，由于各种原因目前在我国市场上无口疮弱毒疫苗供应，可能弱毒疫苗本身存在毒力返强、病毒扩散等缺陷。因此，研制使用简单、方便、免疫效果确实的羊口疮基因工程亚单位疫苗已成为防控羊口疮疫病的必然趋势。

羊口疮病毒（Orf virus，ORFV）属于痘病毒科（Poxviridae）脊索动物痘病毒亚科（Chordopoxrinae）的副痘病毒属（Parapoxvirus），其基因组约有135个基因，能够编码多种不同的蛋白。其中，Orf 011（B2L）基因编码的42 kU囊膜蛋白，是一种重要的免疫原性蛋白。此外，由于该基因能够检测出最低拷贝数的病毒粒子而被广泛应用于副痘病毒属病毒的实验室检测。经羊口疮病毒刺激后机体会产生细胞免疫反应和体液免疫反应，其中以细胞免疫应答为主，但体液免疫产生的抗体在抵御病毒方面也发挥一定的作用。研究表明， B2L蛋白是病毒表面囊膜的组成成分之一，能够刺激机体产生强烈的体液免疫应答，同时还可引起淋巴细胞的增殖分化。鉴于B2L蛋白的这种特性，其已经在不同的***中获得表达，如原核***、真核表达载体pCDNA3.1、pVAX1等。

发明人本人也进行了相关的研究，“ORFV-Yulin株的分离鉴定及其B2L基因在昆虫杆状病毒***中的表达”（西北农林科技大学学报（自然科学版），2017 45(9)）成功分离出1株羊口疮病毒，命名为ORFV-Yulin株，扩增的B2L全长基因长度为1137 bp，与Hub13和GY-AHF10株亲缘关系最近，核苷酸序列和氨基酸序列的相似性分别为99％和99.2％，通过昆虫杆状病毒表达***成功表达了B2L基因，获得了重组蛋白。但经过血清学实验表明，其对免疫小鼠的保护力仅达到60%，不能满足疫苗生产的要求。另外，刘嫒等人（“羊口疮病毒F1L和B2L基因真核表达质粒构建及其在MDBK细胞中的表达”，《中国***共患病学报》，201531(12)）以pVAX1为真核表达载体，构建真核表达质粒pVAX1-F1L和pVAX1-B2L，转染至MDBK细胞，RT-PCR和IFA同时验证目的基因在MDBK细胞浆中能瞬时表达，该项技术中采用单独构建表达载体的方式，一方面操作比较复杂，另一方面，其仅能在真核细胞中实现瞬时表达，正如该文献中指出“由于pVAXl载体在pCDNA3.1载体基础上去掉多余的序列，故在细胞中只能瞬时表达不能筛选稳定表达的细胞系”，其不能获得稳定表达的细胞系，因此，仅考虑其用于双基因核酸疫苗，而不能用于工业化生产的亚单位疫苗，且其免疫效果尚待实验验证。发明专利申请 CN201710138033.6由真核表达质粒pVAX1-FIL，pVAX1-B2L和pVAX1-IL-2组成的免疫原性组合物，所述羊口疮疫苗含有可以表达两个高度保守的羊口疮病毒基因的真核表达质粒和可以表达细胞因子IL-2基因的真核表达质粒作为疫苗抗原，通过构建真核表达质粒作为DNA疫苗来预防羊口疮，该疫苗能够有效刺激机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫应答，对新型羊口疮疫苗的研究具有重要的临床意义。但是和刘媛等人的文献报道一样，该发明专利申请的方法仅能在真核细胞中实现瞬时表达，并不能获得稳定表达的亚单位疫苗，且涉及多个质粒的转化，其在传代过程中也容易发生质粒的丢失，其不能获得具有遗传稳定的表达细胞系。

基于以上技术研究表明，目前的羊口疮病毒在常规细胞系上难以培养增殖，不适合制作灭活疫苗或者弱毒疫苗，而现有亚单位疫苗或核酸疫苗的研究也存在一定的缺陷，例如，遗传稳定性差，不能获得遗传稳定的表达细胞系，免疫原性差或者保护率低等。因此，亟需开发一种能够稳定表达、生产的羊口疮病毒亚单位疫苗。

发明内容

为解决以上技术问题，本发明目的在于制备出羊口疮病毒重组亚单位疫苗，用于预防由羊口疮病毒引起的疾病。本发明专利制备的羊口疮病毒重组亚单位疫苗，是以从陕西榆林发病的陕北白绒山羊病料中分离出羊口疮病毒ORFV-Yulin株系的B2L和F1L为模板，采用经过密码子优化、并采用杆状病毒表达***对B2L和F1L进行了串联表达。同时，该疫苗还具有制备工艺简单、免疫剂量低、免疫效力好等优点，是我国现行羊口疮病毒的理想候选疫苗。

为解决以上技术问题，本发明采用如下技术手段：

一种羊口疮病毒融合蛋白rB2LcF1L，其特征在于，所述羊口疮病毒B2L和F1L融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No:2。

编码羊口疮病毒融合蛋白rB2LcF1L的基因，所述编码羊口疮病毒融合蛋白rB2LcF1L的基因的核酸序列为SEQ ID No:1。

上述氨基酸序列中，相比传统的分离毒株的B2L氨基酸序列，将第9位氨基酸的V/L突变为G，即“IPVG或者IPLG突变为IPGG”，第35位的LDCF突变为LYCF，上述突变显著提高了融合蛋白的表达量和免疫原性。

所述羊口疮病毒融合蛋白rB2LcF1L，与野生型羊口疮病毒F1L蛋白相比，缺失了1-70位的氨基酸序列，其能够有利于融合蛋白的表达，提高表达量。同时，在融合蛋白的C端加上6组氨酸标签，方便在后续生产中进行纯化。

一种重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Bac-ORFV-01毒株，所述毒株已于2018年03月22日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.15494；所述毒株能够稳定、高效地表达羊口疮病毒B2L和F1L融合蛋白。

上述羊口疮病毒B2L和F1L融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No:2。

所述重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Bac-ORFV-01毒株的制备方法包括如下步骤：

步骤一，用化学合成的方法，合成序列为SEQ ID No:1的基因序列，共包含1908个核苷酸；

步骤二，融合表达载体的构建：以人工合成的SEQ ID No:1的基因序列为模板，采用引物对1F/1R（序列3/序列4）进行PCR扩增；其中上游引物1F序列为：5’-CGCGCTAGCATGTGGCCGTT CTCCTCC -3’（SEQ ID No:3），其5’端引入限制性内切酶 NheIⅠ位点及保护性碱基；下游引物1R序列为：5’-CCGAAGCTTTTAGTGGTGAT GGTG -3’（SEQ ID No:4），其5’端引入限制性内切酶 Hind III位点及保护性碱基；扩增得到的目的DNA条带，经回收后，采用 NheⅠ/ Hind III双酶切消化，与经过相同酶切消化的昆虫杆状病毒表达***质粒pBac5载体连接，得到***羊口疮病毒全长基因的阳性克隆pBac5-GB2LcF1L；将连接好的质粒转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒备用；

步骤三：重组表达羊口疮病毒融合蛋白rB2LcF1L基因工程毒株的构建：取6孔细胞培养板，以1×10⁶ml^-1的细胞密度接种生长状态良好sf9细胞，置于27 ℃培养2 h，待细胞的融合度达到80%左右时进行转染，用100 µL无血清培养基把3 µg pBac5-GB2LcF1L与3 µg线性化的 Bacmid混匀，作溶液I；用100 µL无血清培养基稀释5 µL的阳离子（梭华转染试剂）后，缓慢滴加到溶液I中，混匀，静置20min；将混合液加入到上述sf9的细胞板中，27 ℃孵育5～7 d，荧光显微镜下观察报告基因cGFP的表达情况，待病变细胞达到90%以上后收获细胞上清液于1 mL离心管中，标注为P1代重组杆状病毒，-80 ℃长期保存；该毒株已于2018年03月22日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.15494。

本发明还请求保护所述重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Bac-ORFV-01毒株在制备羊口疮病毒重组亚单位疫苗中的应用。

一种羊口疮病毒重组亚单位疫苗，其特征在于，所述疫苗含有采用昆虫杆状病毒表达的重组羊口疮病毒B2L和 F1L融合蛋白rB2LcF1L；制苗用毒株为重组表达羊口疮病毒B2L和 F1L融合蛋白的杆状病毒，被命名为重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Bac-ORFV-01毒株，该毒株已于2018年03月22日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.15494。

本发明所述羊口疮病毒重组亚单位疫苗，其特征在于用所述表达羊口疮病毒重组融合蛋白的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Bac-ORFV-01）毒株作为疫苗生产毒株，经培养、表达目的蛋白分离纯化后，加双相油佐剂混合制成。

一种制备羊口疮病毒重组亚单位疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）毒株：制苗用毒株为重组表达羊口疮病毒B2L和F1L融合蛋白的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Bac-ORFV-01毒株，该毒株已于2018年03月22日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.15494；

（2）一级种子繁殖及鉴定：将sf9细胞按照2.5×10⁶mL^-1细胞总数铺T25方瓶，待细胞贴壁2 h后，用1 mL注射器将100 μL P1代病毒接到T25方瓶中，培养5～7 d，经纯粹检验合格后，冻于负80度，作为制苗用一级种子；

（3）二级种子繁殖及鉴定：取一级种子，接种到初级发酵罐中，培养3 d，经纯粹检验合格后，即为二级种子；

（4）制苗用抗原制备：取合格的二级种子，在生产用发酵罐内培养24～48h；

（5）样品收集：离心收集分别收集细胞和上清；

（6）纯化：采用镍柱的方法，利用His抗体进行亲和层析，通过灰度扫描，最终获得的rB2LcF1L经SDS-PAGE检测并对条带进行灰度扫描，蛋白纯度应不低于75%；

（7）蛋白含量检测：用BCA法检测蛋白含量，应不低于0.2mg/mL；

（8）无菌检验：按现行《中国兽药典》（中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部，中国农业出版社，2011，以下称《中国兽药典》）附录进行，应无菌生长；

（9）疫苗配制：将双相油佐剂（如201佐剂）导入油相罐内，以至少121℃高压灭菌30分钟，冷却至室温备用，根据蛋白含量测定结果，用PBS（pH值7.2 0.01mol/L）将检验合格的纯化蛋白适当稀释后混匀，将水相加入乳化罐内，以80～100 r/min搅拌，同时按1:1（V/V）的比例，缓慢加入油相，加完后搅拌20～30min。乳化后取样进行检验，合格后分装。

基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果;

首先，本发明采用融合表达的技术，突破了现有技术的单独表达B2L、F1L制备疫苗，所制备的蛋白免疫原性低，不足以达到制备疫苗的效价需求；也克服了采用多载体表达达B2L、F1L，不能得到具有遗传稳定性的细胞/毒株、不能产业化生产的缺陷。本发明通过设计、合成融合表达rB2LcF1L的基因、构建了重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Bac-ORFV-01毒株，所述毒株具有很好的遗传稳定性，且能在sf9细胞上大量稳定地增殖，生产融合蛋白rB2LcF1L；采用串联融合表达，大大降低了疫苗生产过程中成本和疫苗的效果。

其次，本发明基于国内分离强毒毒株羊口疮病毒ORFV-Yulin株系的B2L和F1L为模板，经过密码子优化，更易于在苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒中实现高表达。采用点突变的技术，对B2L的部分氨基酸位点进行了突变，所述突变显著提高了融合蛋白的表达量和免疫原性，对F1L的部分氨基酸进行了截短缺失，与野生型羊口疮病毒F1L蛋白相比，缺失了1-70位的氨基酸序列，该缺失有利于融合蛋白的表达，提高表达量。在融合蛋白的C端加上6个组氨酸标签，方便在后续生产中进行纯化。

复次，本发明采用点突变的技术，在蛋白质序列设计过程中，对某些位点进行了有针对性的突变，主要对第9位和第35位的氨基酸进行了突变，相比传统的分离毒株的B2L氨基酸序列，将第9位氨基酸的V/L突变为G，即“IPVG或者IPLG突变为IPGG”，第35位的LDCF突变为LYCF，上述突变显著提高了融合蛋白的表达量和免疫原性。其所取得的技术效果是不可预期的。

综上所述，本发明采用融合表达的技术，通过密码子优化和氨基酸片段的优化，构建重组杆状病毒表达***，能够实现在sf9中高表达量的表达，能够用于羊口疮病毒重组亚单位疫苗的生产，且其所生产的亚单位疫苗具有良好的免疫原性，能够产生高滴度的抗体，具有较高的保护效力。本发明重组表达的蛋白rB2LcF1L在小鼠体内完全无毒，且在小鼠模型中呈现良好的免疫原性和免疫保护性。采用本发明提出的羊口疮病毒重组亚单位疫苗，大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险。此外，凭借疫苗半成品蛋白浓度高的优势，在与其它抗原共同制备联苗时，无需增大联苗的使用剂量，即可制备联苗，极大方便了联苗的开发。

附图说明

图1：表达rB2LcF1L融合蛋白的昆虫病毒中GFP的表达。

图2：rB2LcF1L在sf9细胞中的表达鉴定图中：M: Protein marker；Lane 1:细胞上清；Lane 2:细胞沉淀

图3：rB2LcF1L在sf9细胞中的western blot鉴定图中：M: Protein marker；Lane1:细胞上清；Lane 2:细胞沉淀

图4：小鼠血清中抗ORFV抗体检测结果

具体实施例

以下实施例为更好说明本发明的技术方案，但不对本发明技术方案构成限制。

实施例一羊口疮病毒B2L和F1L融合蛋白载体的构建、表达及鉴定

1. 基因合成

根据羊口疮病毒ORFV-Yulin株系的B2L和F1L天然蛋白基因的序列，经密码子优化后，合成表达B2L全长基因和F1L截短基因（删掉1-70位氨基酸）的串联融合基因，从而获得了对于羊口疮病毒B2L和F1L融合蛋白。同时，突变蛋白的C端加上6组氨酸标签。用化学合成的方法，合成了该段基因序列，共包含1908个核苷酸。其中，第1-1134位为羊口疮病毒B2L全长序列，第1147-1908位为F1L截短基因（删掉1-70位氨基酸）。具体的核酸序列如SEQ IDNo.1所示，氨基酸序列见SEQ ID No.2所示。

2. 融合表达载体的构建

以人工合成的羊口疮病毒B2L全长基因和F1L截短基因（删掉1-70位氨基酸）的串联融合基因为模板，采用引物对1F/1R（序列3/序列4）进行PCR扩增。其中上游引物1F序列为：5’-CGCGCTAGCATGTGGCCGTT CTCCTCC -3’ 27nt（序列3），其5’端引入限制性内切酶 NheIⅠ位点及保护性碱基；下游引物1R序列为：5’-CCGAAGCTTT TAGTGGTGAT GGTG -3’ 24nt（序列4），其5’端引入限制性内切酶 Hind III位点及保护性碱基。

PCR体系为：10×EX Taq Buffer 5µlµl，dNTPs 4µl，上、下游引物各2µl，EX Taq酶0.5µl,全长基因DNA模板2µl，补充ddH₂O至50µl体系。PCR反应条件为：94℃预变性10min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸2min10s，共33个循环；最后72℃环延伸10min。

扩增得到的目的DNA条带，经回收后，采用 NheⅠ/ Hind III双酶切消化，与经过相同酶切消化的昆虫杆状病毒表达***质粒pBac5载体连接，得到***羊口疮病毒全长基因的阳性克隆pBac5-GB2LcF1L。将连接好的质粒转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒备用。

3. 重组表达羊口疮病毒B2L全长基因和F1L截短基因融合基因工程毒株的构建

取6孔细胞培养板，以1×10⁶ml^-1的细胞密度接种生长状态良好sf9细胞，置于27℃培养2 h，待细胞的融合度达到80%左右时进行转染。用100 µL无血清培养基把3 µgpBac5-GB2LcF1L与3 µg线性化的 Bacmid混匀，作溶液I；用100 µL无血清培养基稀释5 µL的阳离子（梭华转染试剂）后，缓慢滴加到溶液I中，混匀，静置20min。将混合液加入到上述sf9的细胞板中，27 ℃孵育5～7 d，荧光显微镜下观察报告基因cGFP的表达情况，待病变细胞达到90%以上后收获细胞上清液于1 mL离心管中，标注为P1代重组杆状病毒，-80 ℃长期保存。该毒株已于2018年03月22日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.15494。

4. 目的蛋白的表达与鉴定

将sf9细胞按照2.5×10⁶ml^-1细胞总数铺T25方瓶，待细胞贴壁2 h后，用1 mL注射器将100 μL P1代病毒盲接到T25方瓶中，培养5～7 d，观察荧光，收取细胞上清液和细胞作为后续试验样品，并且取部分细胞进行超声破碎（超声1s，间隔5s，总共超声1min）后收集上清液和沉淀备用。对上述细胞上清液和超声后的上清液及沉淀样品进行12% SDS-PAGE，检测重组蛋白的表达情况及其可溶性。切取凝胶蛋白上的目的条带，送华大基因公司进行质谱鉴定。与此同时，将上述样品经SDS-PAGE电泳后转印至硝酸纤维素膜（NC膜）上，分别以His标签抗体为一抗、HRP标记的山羊抗鼠IgG为二抗进行孵育，用ECL显色液进行显色，最后在化学发光仪中曝光。同时分别以loading Buffer、sf9细胞上清和杆状病毒表达的40 kU蛋白作空白、阴性和阳性对照。

5. 目的蛋白的纯化

将树脂填充入纯化柱后，用1×Extraction Buffer （PH 7.0）平衡树脂。将上清加入到平衡过的树脂中，冰上结合30-60min，结合时不时晃动平衡柱使树脂与蛋白更充分的结合，用10倍柱体积的1×Wash Buffer（10mL）洗涤后，加入一定体积的1×Elution Buffer（PH7.0）冰上结合30 min。

收集流出液即为纯化好的rB2LcF1L蛋白。

实施例二羊口疮病毒重组亚单位疫苗的制备

（1）毒株培养：取苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Bac-ORFV-01）株二级种子，按培养基总量的1%接种悬浮培养罐内，培养48h。

（3）纯化：采用镍柱的方法，利用His抗体进行亲和层析，通过灰度扫描，最终获得的rB2LcF1L经SDS-PAGE检测并对条带进行灰度扫描，蛋白纯度应不低于75%。

（4）蛋白含量检测：用BCA法检测蛋白含量。结果蛋白含量为0.65mg/mL。经SDS-PAGE检测并对条带进行灰度扫描，蛋白纯度为85%。

（5）无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行。结果均无菌生长。

（6）疫苗配制：将双相油佐剂（如201佐剂）导入油相罐内，以至少121℃高压灭菌30分钟，冷却至室温备用。根据蛋白含量测定结果，用PBS（pH值7.2 0.01mol/L）将检验合格的纯化蛋白稀释至终浓度为500μg/ml后混匀。将水相加入乳化罐内，以80～100 r/min搅拌，同时按1:1（V/V）的比例，缓慢加入油相，加完后搅拌20～30min。乳化后取样进行检验，合格后分装。

羊口疮病毒重组亚单位疫苗的检验

（1）性状

外观乳白色乳剂。

剂型呈水包油包水型（W/O/W）。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于清洁冷水表面，应呈云雾状扩散。

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15min，应不破乳，并且管底析出的水相应不多于0.5ml。

黏度按《中国兽药典》附录进行测定，应符合规定。

（2）装量检查按《中国兽药典》附录进行检查，应符合规定。

（3）无菌检验按《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

（4）安全检验用6～8周龄Balb/c小鼠10只，各肌肉或皮下注射疫苗1.0ml，观察10日。应全部健活。

（5）效力检验将20只Balb/c小鼠随机分为2组，每组10只。皮下分别免疫rB2LcF1L和PBS对照，抗原接种剂量为100 ug/只，共免疫2次，免疫间隔为2周。第2次免疫接种后的第7天，用羊口疮病毒细胞培养物（1*10⁷TCID50/ mL），对其进行攻毒保护性试验，攻毒剂量：皮下接种600µL/只。攻毒后进行隔离饲养，每日观察并记录攻毒后动物的精神、食欲等主要的临床指标，记录并统计各免疫组小鼠的发病数和死亡数。对照鼠死亡率不低于50%，免疫组保护率不低于80%，即判为合格。

实施例三羊口疮病毒B2L和F1L融合蛋白rB2LcF1L对小鼠的毒力试验

通过测定实施例一制备的羊口疮病毒B2L和F1L融合蛋白rB2LcF1L对小鼠的毒力，以验证该突变体在体内的实际减毒效果。将羊口疮病毒B2L和F1L融合蛋白rB2LcF1L，以300μg/只的剂量，经皮下注射6～8周龄Balb/c小鼠小鼠，共10只。结果发现小鼠100%存活，且经颈椎脱臼法处死后，经解剖未见脏器异常。该结果表明，融合蛋白rB2LcF1L在小鼠体内是无毒的。

实施例四羊口疮病毒B2L和F1L融合蛋白rB2LcF1L免疫小鼠后，血清中OrfV特异性抗体检测

为验证本发明实施例一的融合蛋白rB2LcF1L的免疫原性，采用小鼠进行了实验。选取80只昆明系6周龄小鼠100只，随机分为5组，每组20只，分别为对照组（PBS），采用皮下注射的方式注射PBS+1头份的201佐剂；B2L+F1L组，采用皮下注射的方式，注射B2L重组蛋白和F1L重组蛋白，具体重组B2L蛋白的制作方法参见“ORFV-Yulin株的分离鉴定及其B2L基因在昆虫杆状病毒***中的表达”，重组F1L蛋白的制作也参照以上文献中同样的方法，采用的序列也是Yulin株的F1L序列（全长，未截断），抗原接种剂量为B2L、F1L蛋白各60 μg/只+1头份的201佐剂；对照组1，采用以下对照组1制备得到的重组B2L+F1L融合蛋白，抗原接种量为100μg/只；弱毒商品苗组，采用新疆天康畜牧生物生产的羊口疮弱毒细胞冻干活疫苗，接种量为1头份/只；rB2LcF1L组，采用以上实施例二制备得到的羊口疮病毒重组亚单位疫苗1头份，采用皮下注射的方式进行免疫，抗原接种量为100μg/只。共免疫2次，免疫间隔期为2周，分别在免疫前（0天）、首次免疫后7天、14天、21天、28天、42天、70天对小鼠进行眼球采血，收集血清，于-20℃保存备用，采用羊口疮病毒抗体(OrfV-Ab)ELISA检测试剂盒（市售）测定小鼠血清中OrfV特异性抗体。酶标仪测定OD450值。具体结果参见图4。

基于图4的检测结果可知，采用本发明实施例一的融合蛋白rB2LcF1L在首次免疫7天后，小鼠体内即产生特异性抗体，在二免两周后，即第28天，小鼠体内的特异性抗体水平达到最高水平，第42天和第70天仍保持一个较高的抗体水平；相比市售的弱毒疫苗组，其产生的特异性抗体水平接近，但是本发明实施例二的亚单位疫苗，其达到特异性抗体最高水平的时间要早，市售弱毒疫苗组在42天左右达到最高水平，而本发明的疫苗在第28天即能达到最高抗体水平，这对于动物保护而言具有很大的意义，特别是区域疫情爆发时，为了预防和控制羊口疮的扩散，迅速达到较高的免疫水平能够更有效的控制疫情的扩散，且相比市售疫苗组，本发明的抗体水平维持时间较长，从图4可知，本发明亚单位疫苗在首免后第42天和第70天仍保持一个较高的抗体水平，表明本发明的亚单位疫苗能够保持较长的免疫保护期限。相比B2L+F1L组，本发明采用融合表达的方式制备得到融合蛋白rB2LcF1L相比单独的重组B2L蛋白和重组F1L蛋白的组合，其能够刺激机体产生更高和更持续的特异性抗体；相比对照组1，本发明的融合蛋白rB2LcF1L具有更好的免疫原性。

其中对照组1相比本发明实施例一和二而言，其区别在于，对照组1采用的序列为传统序列，即将第9位处氨基酸为V，并非本发明的突变为G，即仍为“IPVG”，而非IPGG，第35位仍为LDCF，并非本发明的突变为LYCF（参见SE1 ID No：5）。具体蛋白的表达和制备方法以及疫苗的生产方法参见实施例1和2.

实施例五羊口疮病毒B2L和F1L融合蛋白rB2LcF1L的免疫保护试验

将60只Balb/c小鼠随机分为3组，每组20只。组1和2分别在皮下分别免疫rB2LcF1L（抗原接种剂量为100 μg/只）、PBS对照，组3采用新疆天康畜牧生物生产的羊口疮弱毒细胞冻干活疫苗，接种量为1头份/只，共免疫2次，免疫间隔为2周。第2次免疫接种后的第7天，用羊口疮病毒Yulin株细胞培养物（1*10⁷TCID50/ mL），对其进行攻毒保护性试验，攻毒剂量：皮下接种600µL/只。攻毒后进行隔离饲养，每日观察并记录攻毒后动物的精神、食欲等主要的临床指标，记录并统计各免疫组小鼠的发病数和死亡数。

经测定二次免疫后攻毒，对照鼠死亡率为75%，rB2LcF1L免疫组保护率为90%，弱毒细胞冻干活疫苗组的保护率为90%，证明该亚单位疫苗具有良好的免疫原性，与市售的弱毒苗的保护效力接近。

鉴于我国市场上目前羊口疮疫苗供应，因此，本申该生产的疫苗是我国现羊口疮痍疫苗的理想候选疫苗。

序列表

<110> 榆林学院

<120> 一种羊口疮病毒重组亚单位疫苗及其生产方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1914

<212> DNA

<213> 羊口疮病毒B2L全长基因和F1L截短基因的串联基因(人工合成)

<400> 1

atgtggccgt tctcctccat ccccgggggc gccgactgcc gcgtcgtgga gacgctgccc 60

gcagaggtgg cgtccctggc gcagggcaac atgagcaccc tctactgctt caccgccatc 120

gccgagtccg cgaagaagtt tttgtacatc tgcagcttct gctgcaacct gagctccacc 180

aaggagggcg tcgacgtcaa ggacaagctc tgcacgctcg ccaaggaggg cgtcgacgtc 240

acgctgctcg tggacgtgca gagcaaggac aaggacgcgg acgagctgcg cgaggcgggc 300

gtcaactact acaaagtcaa ggtgtccacg cgggaaggcg tcggcaacct tctcggcagc 360

ttctggctct cggacaccgg gcactggtac gtgggcagcg cctcgctcac gggcgggtcc 420

gtgtccacca tcaagaacct cgggctctac tccaccaaca agcacctggc ctgggacctc 480

atgaaccgct acaacacctt ctactccatg atagtggagc cgaaggtgcc gttcacgcgg 540

ctctgctgcg ccgtcgtcac gcccacggcc acgaacttcc acctcaacca ctccgggggc 600

ggcgtattct tctcggactc gccggagcgc ttcctgggtt tctaccgcac gctcgacgag 660

gacctcgtgc tgcaccgcat cgagaacgcc aagaacagca tcgacctctc gctgctctcg 720

atggtgccgg tgatcaagca cgccggcgcc gtggagtact ggccgcggat catagacgcg 780

ctgctgcgcg cggccatcga ccgcggcgtg cgcgtgcgcg tgatcatcac cgagtggaag 840

aacgcggacc cgctgtcggt ctcggccgcg cgcagcctcg acgactttgg cgtcggcagc 900

gtggacatgt ccgtgcgcaa gttcgtggta cccggccggg acgacgctgc gaacaacacc 960

aagctgctca tcgtggacga caccttcgcg cacctcacgg tcgccaacct cgacggcacg 1020

cactaccgct accacgcctt cgtgagcgtg aacgccgaga agggcgacat cgtcaaggac 1080

ctgtcagcgg tcttcgagcg ggactggcgc tcggagttct gcaaaccaat aaatggcggt 1140

gggtcgcctc ccgcgccgca ccccaagggc gaccacgtgc tcaaggcggt ggaatggaaa 1200

gacgtggact ccaaagacta cccgcacttc ttcacggaca tgtgcaagtc cacgtgtccg 1260

aaggagatgc agcgccgcgc ggcacaccac ctcaaccttt gggagagcat atcggccggc 1320

actgtctcca ccaagtactc cgacaatgac ttcatcctgg tggtcgacaa cgacatgacc 1380

ttccgcaagc ccgagatggt aaagccgctc atcgaggcga tgaagacgaa cggctggtac 1440

atggcgcagc tcaaggagac ctacatgacc ggcgcgctgg ccaccaacgt ccccggcacc 1500

ggcgaccccg agctcatggt ctaccccggc ggatacgacg tctcgctaga cgcctacatc 1560

atcaacgtcg gcggcatgaa gaagctctac gacgcgatca tcaaggatgg agggctgcgc 1620

agcggcctgc tcaccgaggt gttcacgcta gagaagcggc tctctctggc gcgcgtggtg 1680

ctctccggcg ccgagcaggt ggtctaccct gagtactaca tacaggtgaa gacgcggctc 1740

ggcggcgcgc cctccctgtg gtcgctgctc gccacgtggc tggcgcgcgg cggtgggtcg 1800

ctggcatacc tgctggtgtt cgtgctgctg ctgccgaact cgcggctgct gtggttcatc 1860

gccgggctgc tggtcacggc catcgtgcat catcaccatc accactaaaa gctt 1914

<210> 2

<211> 635

<212> PRT

<213> 羊口疮病毒B2L全长基因和F1L截短基因的串联蛋白(人工合成)

<400> 2

Met Trp Pro Phe Ser Ser Ile Pro Gly Gly Ala Asp Cys Arg Val Val

1 5 10 15

Glu Thr Leu Pro Ala Glu Val Ala Ser Leu Ala Gln Gly Asn Met Ser

20 25 30

Thr Leu Tyr Cys Phe Thr Ala Ile Ala Glu Ser Ala Lys Lys Phe Leu

35 40 45

Tyr Ile Cys Ser Phe Cys Cys Asn Leu Ser Ser Thr Lys Glu Gly Val

50 55 60

Asp Val Lys Asp Lys Leu Cys Thr Leu Ala Lys Glu Gly Val Asp Val

65 70 75 80

Thr Leu Leu Val Asp Val Gln Ser Lys Asp Lys Asp Ala Asp Glu Leu

85 90 95

Arg Glu Ala Gly Val Asn Tyr Tyr Lys Val Lys Val Ser Thr Arg Glu

100 105 110

Gly Val Gly Asn Leu Leu Gly Ser Phe Trp Leu Ser Asp Thr Gly His

115 120 125

Trp Tyr Val Gly Ser Ala Ser Leu Thr Gly Gly Ser Val Ser Thr Ile

130 135 140

Lys Asn Leu Gly Leu Tyr Ser Thr Asn Lys His Leu Ala Trp Asp Leu

145 150 155 160

Met Asn Arg Tyr Asn Thr Phe Tyr Ser Met Ile Val Glu Pro Lys Val

165 170 175

Pro Phe Thr Arg Leu Cys Cys Ala Val Val Thr Pro Thr Ala Thr Asn

180 185 190

Phe His Leu Asn His Ser Gly Gly Gly Val Phe Phe Ser Asp Ser Pro

195 200 205

Glu Arg Phe Leu Gly Phe Tyr Arg Thr Leu Asp Glu Asp Leu Val Leu

210 215 220

His Arg Ile Glu Asn Ala Lys Asn Ser Ile Asp Leu Ser Leu Leu Ser

225 230 235 240

Met Val Pro Val Ile Lys His Ala Gly Ala Val Glu Tyr Trp Pro Arg

245 250 255

Ile Ile Asp Ala Leu Leu Arg Ala Ala Ile Asp Arg Gly Val Arg Val

260 265 270

Arg Val Ile Ile Thr Glu Trp Lys Asn Ala Asp Pro Leu Ser Val Ser

275 280 285

Ala Ala Arg Ser Leu Asp Asp Phe Gly Val Gly Ser Val Asp Met Ser

290 295 300

Val Arg Lys Phe Val Val Pro Gly Arg Asp Asp Ala Ala Asn Asn Thr

305 310 315 320

Lys Leu Leu Ile Val Asp Asp Thr Phe Ala His Leu Thr Val Ala Asn

325 330 335

Leu Asp Gly Thr His Tyr Arg Tyr His Ala Phe Val Ser Val Asn Ala

340 345 350

Glu Lys Gly Asp Ile Val Lys Asp Leu Ser Ala Val Phe Glu Arg Asp

355 360 365

Trp Arg Ser Glu Phe Cys Lys Pro Ile Asn Gly Gly Gly Ser Pro Pro

370 375 380

Ala Pro His Pro Lys Gly Asp His Val Leu Lys Ala Val Glu Trp Lys

385 390 395 400

Asp Val Asp Ser Lys Asp Tyr Pro His Phe Phe Thr Asp Met Cys Lys

405 410 415

Ser Thr Cys Pro Lys Glu Met Gln Arg Arg Ala Ala His His Leu Asn

420 425 430

Leu Trp Glu Ser Ile Ser Ala Gly Thr Val Ser Thr Lys Tyr Ser Asp

435 440 445

Asn Asp Phe Ile Leu Val Val Asp Asn Asp Met Thr Phe Arg Lys Pro

450 455 460

Glu Met Val Lys Pro Leu Ile Glu Ala Met Lys Thr Asn Gly Trp Tyr

465 470 475 480

Met Ala Gln Leu Lys Glu Thr Tyr Met Thr Gly Ala Leu Ala Thr Asn

485 490 495

Val Pro Gly Thr Gly Asp Pro Glu Leu Met Val Tyr Pro Gly Gly Tyr

500 505 510

Asp Val Ser Leu Asp Ala Tyr Ile Ile Asn Val Gly Gly Met Lys Lys

515 520 525

Leu Tyr Asp Ala Ile Ile Lys Asp Gly Gly Leu Arg Ser Gly Leu Leu

530 535 540

Thr Glu Val Phe Thr Leu Glu Lys Arg Leu Ser Leu Ala Arg Val Val

545 550 555 560

Leu Ser Gly Ala Glu Gln Val Val Tyr Pro Glu Tyr Tyr Ile Gln Val

565 570 575

Lys Thr Arg Leu Gly Gly Ala Pro Ser Leu Trp Ser Leu Leu Ala Thr

580 585 590

Trp Leu Ala Arg Gly Gly Gly Ser Leu Ala Tyr Leu Leu Val Phe Val

595 600 605

Leu Leu Leu Pro Asn Ser Arg Leu Leu Trp Phe Ile Ala Gly Leu Leu

610 615 620

Val Thr Ala Ile Val His His His His His His

625 630 635

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 上游引物(人工合成)

<400> 3

cgcgctagca tgtggccgtt ctcctcc 27

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 下游引物(人工合成)

<400> 4

ccgaagcttt tagtggtgat ggtg 24

<210> 5

<211> 635

<212> PRT

<213> 对照组1(人工合成)

<400> 5

Met Trp Pro Phe Ser Ser Ile Pro Val Gly Ala Asp Cys Arg Val Val

1 5 10 15

Glu Thr Leu Pro Ala Glu Val Ala Ser Leu Ala Gln Gly Asn Met Ser

20 25 30

Thr Leu Asp Cys Phe Thr Ala Ile Ala Glu Ser Ala Lys Lys Phe Leu

35 40 45

Tyr Ile Cys Ser Phe Cys Cys Asn Leu Ser Ser Thr Lys Glu Gly Val

50 55 60

Asp Val Lys Asp Lys Leu Cys Thr Leu Ala Lys Glu Gly Val Asp Val

65 70 75 80

Thr Leu Leu Val Asp Val Gln Ser Lys Asp Lys Asp Ala Asp Glu Leu

85 90 95

Arg Glu Ala Gly Val Asn Tyr Tyr Lys Val Lys Val Ser Thr Arg Glu

100 105 110

Gly Val Gly Asn Leu Leu Gly Ser Phe Trp Leu Ser Asp Thr Gly His

115 120 125

Trp Tyr Val Gly Ser Ala Ser Leu Thr Gly Gly Ser Val Ser Thr Ile

130 135 140

Lys Asn Leu Gly Leu Tyr Ser Thr Asn Lys His Leu Ala Trp Asp Leu

145 150 155 160

Met Asn Arg Tyr Asn Thr Phe Tyr Ser Met Ile Val Glu Pro Lys Val

165 170 175

Pro Phe Thr Arg Leu Cys Cys Ala Val Val Thr Pro Thr Ala Thr Asn

180 185 190

Phe His Leu Asn His Ser Gly Gly Gly Val Phe Phe Ser Asp Ser Pro

195 200 205

Glu Arg Phe Leu Gly Phe Tyr Arg Thr Leu Asp Glu Asp Leu Val Leu

210 215 220

His Arg Ile Glu Asn Ala Lys Asn Ser Ile Asp Leu Ser Leu Leu Ser

225 230 235 240

Met Val Pro Val Ile Lys His Ala Gly Ala Val Glu Tyr Trp Pro Arg

245 250 255

Ile Ile Asp Ala Leu Leu Arg Ala Ala Ile Asp Arg Gly Val Arg Val

260 265 270

Arg Val Ile Ile Thr Glu Trp Lys Asn Ala Asp Pro Leu Ser Val Ser

275 280 285

Ala Ala Arg Ser Leu Asp Asp Phe Gly Val Gly Ser Val Asp Met Ser

290 295 300

Val Arg Lys Phe Val Val Pro Gly Arg Asp Asp Ala Ala Asn Asn Thr

305 310 315 320

Lys Leu Leu Ile Val Asp Asp Thr Phe Ala His Leu Thr Val Ala Asn

325 330 335

Leu Asp Gly Thr His Tyr Arg Tyr His Ala Phe Val Ser Val Asn Ala

340 345 350

Glu Lys Gly Asp Ile Val Lys Asp Leu Ser Ala Val Phe Glu Arg Asp

355 360 365

Trp Arg Ser Glu Phe Cys Lys Pro Ile Asn Gly Gly Gly Ser Pro Pro

370 375 380

Ala Pro His Pro Lys Gly Asp His Val Leu Lys Ala Val Glu Trp Lys

385 390 395 400

Asp Val Asp Ser Lys Asp Tyr Pro His Phe Phe Thr Asp Met Cys Lys

405 410 415

Ser Thr Cys Pro Lys Glu Met Gln Arg Arg Ala Ala His His Leu Asn

420 425 430

Leu Trp Glu Ser Ile Ser Ala Gly Thr Val Ser Thr Lys Tyr Ser Asp

435 440 445

Asn Asp Phe Ile Leu Val Val Asp Asn Asp Met Thr Phe Arg Lys Pro

450 455 460

Glu Met Val Lys Pro Leu Ile Glu Ala Met Lys Thr Asn Gly Trp Tyr

465 470 475 480

Met Ala Gln Leu Lys Glu Thr Tyr Met Thr Gly Ala Leu Ala Thr Asn

485 490 495

Val Pro Gly Thr Gly Asp Pro Glu Leu Met Val Tyr Pro Gly Gly Tyr

500 505 510

Asp Val Ser Leu Asp Ala Tyr Ile Ile Asn Val Gly Gly Met Lys Lys

515 520 525

Leu Tyr Asp Ala Ile Ile Lys Asp Gly Gly Leu Arg Ser Gly Leu Leu

530 535 540

Thr Glu Val Phe Thr Leu Glu Lys Arg Leu Ser Leu Ala Arg Val Val

545 550 555 560

Leu Ser Gly Ala Glu Gln Val Val Tyr Pro Glu Tyr Tyr Ile Gln Val

565 570 575

Lys Thr Arg Leu Gly Gly Ala Pro Ser Leu Trp Ser Leu Leu Ala Thr

580 585 590

Trp Leu Ala Arg Gly Gly Gly Ser Leu Ala Tyr Leu Leu Val Phe Val

595 600 605

Leu Leu Leu Pro Asn Ser Arg Leu Leu Trp Phe Ile Ala Gly Leu Leu

610 615 620

Val Thr Ala Ile Val His His His His His His

625 630 635

Claims

1.一种羊口疮病毒融合蛋白rB2LcF1L，其特征在于，所述羊口疮病毒融合蛋白rB2LcF1L的氨基酸序列为SEQ ID No：2。

2.编码权利要求1所述的羊口疮病毒融合蛋白rB2LcF1L的基因，所述编码羊口疮病毒融合蛋白rB2LcF1L的基因的核酸序列为SEQ ID No:1。

3.一种重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Bac-ORFV-01毒株，所述毒株已于2018年03月22日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.15494；所述毒株能够稳定、高效地表达羊口疮病毒B2L和F1L融合蛋白，所述羊口疮病毒B2L和F1L融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No:2。

4.权利要求3所述的重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Bac-ORFV-01毒株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤二，融合表达载体的构建：以人工合成的SEQ ID No:1的基因序列为模板，采用引物对1F和1R进行PCR扩增；其中上游引物1F序列为：5’-CGCGCTAGCA TGTGGCCGTT CTCCTCC -3’（SEQ ID No:3），其5’端引入限制性内切酶NheIⅠ位点及保护性碱基；下游引物1R序列为：5’-CCGAAGCTTTTAGTGGTGAT GGTG -3’（SEQ ID No:4），其5’端引入限制性内切酶Hind III位点及保护性碱基；扩增得到的目的DNA条带，经回收后，采用NheⅠ/Hind III双酶切消化，与经过相同酶切消化的昆虫杆状病毒表达***质粒pBac5载体连接，得到***羊口疮病毒全长基因的阳性克隆pBac5-GB2LcF1L；将连接好的质粒转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒备用；

步骤三：重组表达羊口疮病毒融合蛋白rB2LcF1L基因工程毒株的构建：取6孔细胞培养板，以1×10⁶ ml^-1的细胞密度接种生长状态良好sf9细胞，置于27 ℃培养2 h，待细胞的融合度达到80%时进行转染，用100 µL无血清培养基把3 µg pBac5-GB2LcF1L与3 µg线性化的Bacmid混匀，作溶液I；用100 µL无血清培养基稀释5 µL的梭华转染试剂后，缓慢滴加到溶液I中，混匀，静置20 min；将混合液加入到上述sf9的细胞板中，27 ℃孵育5～7 d，荧光显微镜下观察报告基因cGFP的表达情况，待病变细胞达到90%以上后收获细胞上清液于1 mL离心管中，标注为P1代重组杆状病毒，-80 ℃长期保存；该毒株已于2018年03月22日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.15494。

5.根据权利要求3所述重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Bac-ORFV-01毒株在制备羊口疮病毒重组亚单位疫苗中的应用。

6.一种羊口疮病毒重组亚单位疫苗，其特征在于，所述疫苗含有采用昆虫杆状病毒表达的重组羊口疮病毒B2L和 F1L融合蛋白rB2LcF1L；制苗用毒株为重组表达羊口疮病毒B2L和 F1L融合蛋白的杆状病毒，被命名为重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Bac-ORFV-01毒株，该毒株已于2018年03月22日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.15494。

7.根据权利要求6所述的羊口疮病毒重组亚单位疫苗，其特征在于用所述的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Bac-ORFV-01毒株作为疫苗生产毒株，经培养、表达目的蛋白分离纯化后，加双相油佐剂混合制成。

8.一种制备羊口疮病毒重组亚单位疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（2）一级种子繁殖及鉴定：将sf9细胞按照2.5×10⁶ mL^-1细胞总数铺T25方瓶，待细胞贴壁2 h后，用1 mL注射器将100 μL P1代病毒接到T25方瓶中，培养5～7 d，经纯粹检验合格后，冻于负80度，作为制苗用一级种子；

（5）样品收集：离心收集，分别收集细胞和上清；

（8）无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行，应无菌生长；

（9）疫苗配制：将双相油佐剂导入油相罐内，以至少121℃高压灭菌30分钟，冷却至室温备用，根据蛋白含量测定结果，用PBS将检验合格的纯化蛋白适当稀释后混匀，将水相加入乳化罐内，以80～100 r/min搅拌，同时按1:1（V/V）的比例，缓慢加入油相，加完后搅拌20～30min；乳化后取样进行检验，合格后分装。