CN111057682B

CN111057682B - 一株禽源h9n2亚型禽流感毒株分离鉴定及应用

Info

Publication number: CN111057682B
Application number: CN201911230771.9A
Authority: CN
Inventors: 贺亚奇; 尚川川; 武沛泽; 王顺山; 吴国彬; 王延博; 赵�卓; 胡义彬; 商云鹏; 李晓亮; 金扩世; 王力; 王秀敏; 江厚生
Original assignee: Beijing Centre Biology Co ltd; Beijing Huaxia Xingyang Biological Science & Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Centre Biology Co ltd; Beijing Huaxia Xingyang Biological Science & Technology Co ltd
Priority date: 2019-12-05
Filing date: 2019-12-05
Publication date: 2022-01-14
Anticipated expiration: 2039-12-05
Also published as: CN111057682A

Abstract

本发明涉及动物病毒学领域，本发明提供一株禽源H9N2亚型禽流感毒株分离鉴定及应用。该H9N2亚型禽流感毒株已于2019年07月02日保藏至中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.18172。本发明从分子水平阐述分离毒株的抗原变异情况；甲醛灭活后，与605佐剂制备灭活疫苗，免疫21日龄SPF鸡，通过血清学方法和免疫攻毒方法对免疫效果进行评价，证实该毒株保护效果较好，可用作禽流感H9N2亚型疫苗候选毒株。本发明为禽流感防控提供思路，为禽流感候选毒株筛选提供技术教导，具有重要的公共卫生意义。

Description

一株禽源H9N2亚型禽流感毒株分离鉴定及应用

技术领域

本发明涉及动物病毒学领域，本发明提供一株禽源H9N2亚型禽流感病毒毒株的生物特性研究及在疫苗开发上的应用。

技术背景

禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)隶属于正粘病毒科A型流感病毒属，核酸为单股负链RNA，总长度约为13.6kb，共含有8个节段，可编码11个蛋白。由于单股负链RNA中HA节段和NA节段最易发生变异这一特性，不同病毒侵入同一宿主时，极易发生不同病毒之间的基因重排，增加病毒变异几率，甚至可能产生新型的流感病毒，改变病毒的宿主侵袭范围及病毒的毒力。按照AIV对家禽致病程度，可分为高致病性(High Pathogenic AvianInfluenza virus，HPAIV)和低致病性(Low Pathogenic Avian Influenza virus，LPAIV)，感染家禽的HPAIV 和LPAIV分别以H5、H7和H9亚型为主。

目前全世界范围的禽群中广泛存在AIV，H9N2亚型发病率占禽流感总发病率90％以上，虽然仅有不到30％的致死率，却可导致呼吸道症状、蛋鸡的产蛋下降，并使鸡群易继发严重的呼吸道疾病，影响家禽生产性能。该病毒自1966年在北美的火鸡体内首次分离，1992 年传入我国。该病毒的流行不仅对各国养殖业造成严重损失，还对人类健康构成巨大威胁，积极开展禽流感流行病学调查，对H9N2的分子进化进行长期、持续性的跟踪与监控，并选用保护效果较好的疫苗候选株制备免疫保护效果较好的疫苗，已成为防治H9N2爆发和流行的关键，具有重要的公共卫生学意义。

发明内容

本发明提供一株H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选毒株，阐明HA与NA两个基因片段序列及其与国内经典的疫苗病毒株的***进化差异；提供该毒株的分离、鉴定和纯化方法；提供利用该毒株制备预防禽流感H9N2灭活苗方法及疫苗判定指标；明确该毒株作为疫苗候选毒株的可行性。

发明人使用分离、鉴定并纯化好的H9N2亚型禽流感病毒，对以下生物学特性进行确定：

1.遗传进化分析：参考Genbank公布H9N2亚型序列，设计HA、NA片段全长引物，并对流感毒株HA、NA片段进行扩增、测序并构建进化图谱。结果表明，HA、NA基因属于 H9，4.2(Y280/G9-Like)谱系。

2.生长特性：病毒在SPF鸡胚中可稳定高滴度生长，血凝价稳定在10Log2左右。

3.HA抗原相关性分析：使用605佐剂，分别制备8株AIV分离毒株灭活疫苗，免疫 21日龄SPF鸡用于制备单因子血清，检测HA抗原相关性均大于0.81，可作为H9N2亚型禽流感流感疫苗候选毒株。

4.疫苗免疫后保护效果评估：本发明使用AIV-BZ株制备灭活苗免疫21日龄SPF鸡用血清学方法与免疫攻毒方法评估保护效果，结果表明，本发明使用毒株制备灭活油苗具有很好保护效果。

5.本发明对禽流感毒株A/chicken/Shandong/BZ/2018(H9N2)(AIV-BZ株)进行生物保藏，保藏信息如下：

保藏时间：2019年07月02日

保藏单位名称：中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏编号：CGMCC No.18172

分类株命名：禽流感A型流感病毒H9N2亚型

本发明提供一种H9N2亚型禽流感病毒AIV-BZ株，保藏编号为CGMCC No.18172。

在一个方面中，其在鸡胚中可高滴度增殖，血凝价稳定在2¹⁰。

本发明提供一种禽流感灭活疫苗，其包含灭活后的所述H9N2亚型禽流感病毒AIV-BZ 株，灭活后病毒液血凝价HA不低于9Log2。

本发明提供一种所述禽流感灭活疫苗的制备方法，采用所述H9N2亚型禽流感病毒AIV-BZ株接种SPF鸡胚，培养96-120小时，经0.1-0.3％甲醛灭活后与605佐剂按照4:6比例混合制备而成。

本发明提供一种禽流感病毒HA蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明提供一种禽流感病毒HA基因，其编码所述禽流感病毒HA蛋白。

本发明提供一种扩增禽流感病毒HA基因的引物对，上游引物为AGCAAAAGCAGGAGTAAAAAT，下游引物为AGTAGAAACAAGGAGTTTTTTC。

本发明提供一种禽流感病毒NA蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明提供一种禽流感病毒NA蛋白，其编码所述禽流感病毒NA蛋白。

本发明提供一种扩增禽流感病毒HA基因的引物对，上游引物为AGCAAAAGCAGGGGAATT，下游引物为AGTAGAAAACAAGGGTGTTTTT。

本申请的有益效果：本发明分离得到一株H9N2亚型禽流感病毒株 A/chicken/Shandong/BZ/2018(H9N2)(ShanDong/BZ)。该病毒AIV-BZ株与其余7株H9N2分离株HA抗原相关性均大于0.81，表明该病毒株与其余流行毒株HA抗原相关性较好，可作为 H9N2亚型禽流感疫苗的候选毒株。使用该病毒AIV-BZ株对免疫后的实验组、商品苗与空白对照组进行攻毒实验，发现AIV-BZ株制备灭活苗免疫后14天即可产生免疫保护性抗体，有效保护临床毒株攻击，且保护效果优于当前商品苗(SS株)。由此可见，本发明为禽流感防控提供保护效果较好的疫苗候选株，具有重要的公共卫生意义。

附图说明

图1：H9N2 HA基因氨基酸进化树，分离株A/chicken/Shandong/BZ/2018属于H9.4.2(Y280/G9-Like)谱系

图2：H9N2 NA基因氨基酸进化树，分离株A/chicken/Shandong/BZ/2018属于H9.4.2(Y280/G9-Like)谱系

具体实施方式

实施例1病毒分离鉴定

取发病鸡咽喉腔及泄殖腔拭子于含有青、链霉素双抗(600IU/ml)的PBS缓冲液中处理2小时，充分捻转、挤压，保留液体部分8000rpm离心10min，取上清液0.22um过滤处理，接种9-11日龄SPF鸡胚0.2ml/枚，收集24h后死胚尿囊液，用RT-PCR及血凝试验鉴定其纯净性。对混合感染样品尿囊液1:1加入特异性阳性血清中和，结合鸡胚终点稀释法继续传代。直至尿囊液连续两代检测H9N2血凝价不低于5Log2，AIV其它亚型及NDV血凝价不高于3Log2；同时RT-PCR检测H9为阳性，其余检测均为阴性，鉴定引物如表1。

表1鉴别及测序引物

结果显示：连续传代3-5代后，RT-PCR检测，仅H9亚型为阳性，H5、H7、NDV及IBV 均为阴性；H9血凝价均不低于5Log2，AIV其它亚型及NDV血凝价不高于3Log2。纯化好H9 尿囊液连续传代10-12代，HA血凝价稳定维持在10Log2左右，-80℃冻存备用。

实施例2病毒HA、NA基因扩增及序列测定

1.引物合成

根据Genbank公布的序列，用Primer5软件设计HA、NA特异性全长引物，如表2。

表2鉴别及测序引物

2.目的基因扩增及序列测定

本发明使用纯化后可在SPF鸡胚稳定增殖的尿囊液毒作为核酸提取样品，按照RNApure超纯总RNA快速提取试剂盒使用说明操作。所提取RNA按照EasyScript One-StepEnzyme Mix推荐方法进行RT-PCR扩增。1％琼脂糖凝胶电泳证明扩增出目的条带后，将RT-PCR扩增产物送北京生工生物公司进行测序。得到HA基因氨基酸序列如Seq ID No.1所示；得到NA 基因氨基酸序列如Seq ID No.2所示。测序结果，与Genbank公布的H9N2相关序列进行比对，利用Mega 6分生软件构建进化树，该分离株HA、NA基因氨基酸进化树均属于 H9,4.2(Y280/G9-Like)谱系，如图1、图2所示。

实施例3病毒HA抗原性分析

1.单因子血清制备

将2018年分离的包括本发明中涉及的AIV-BZ株在内共计8株H9N2流行毒株，按照灭活毒液:605佐剂4:6比例混合制备灭活疫苗，免疫21日龄SPF鸡，隔离器中饲养14天采血分离血清，制备单因子血清。

2.交叉HI试验

分别制备上述8株病毒的4单位病毒液，与上述8种单因子血清进行交叉HI试验，检测HA抗原交叉反应性。重复三次取均值用于确定上述H9N2病毒HA抗原之间的相关性R。

抗原相关性的判定标准如下:

抗原间的相关性R＝√(R1xR2)，

R:2株病毒间的抗原性差异

R1:甲病毒对乙血清的HI滴度/甲病毒对甲血清的HI滴度

R2:乙病毒对甲血清的HI滴度/乙病毒对乙血清的HI滴度

如果R＝1，表明两个毒株间抗原性相同；如果0.67≤R≤1.5，表明两个毒株间抗原性无明显差异；如果0.5≤R≤0.67，表明两个毒株间抗原性有小的差异；如果R<0.5，表明两个毒株间抗原性的明显差异；R值越小，抗原性差异越大。结果如下表3，表4：

表3不同H9N2毒株交叉凝集试验结果

表4不同H9N2毒株HA抗原相关性结果

8株H9N2流行毒株HI交叉试验结果以及HA抗原相关性分析结果见表3、表4。由结果可知，分离株A/chicken/Shandong/BZ/2018(H9N2)(ShanDong/BZ)与其余7株H9N2分离株HA抗原相关性均大于0.81，表明该分离株与其余流行毒株HA抗原相关性较好，可作为H9N2亚型禽流感疫苗的候选毒株。

实施例4免疫保护效果评估

1.AIV-BZ株灭活疫苗制备与检验

本发明使用AIV-BZ株稳定传代SPF鸡胚毒，加入终浓度0.2％甲醛，37℃灭活24h，期间震动4-6次。灭活后病毒液且血凝价HA不低于9Log2；按现行《中国兽药典》检验，均无菌生长；取灭活鸡胚液连续盲传SPF鸡胚两代，检测其HA均为阴性，方可用于制备疫苗。

灭活毒液与605佐剂按照4:6比例均匀混合制备灭活疫苗，搅拌速度为800rpm，加入终浓度为0.005％硫柳汞钠作为防腐剂。制备好疫苗按照按现行《中国兽药典》进行性状、无菌检验，均合格。

2.血清学实验

取21日龄SPF鸡，选取10只作为实验组，颈部皮下注射AIV-BZ株制备疫苗，0.3ml/只；10只免疫商品疫苗(AIV-SS株)作为对照组，颈部皮下免疫0.3ml/只；另取5只作空白对照。于接种后14天采血并分离血清，检测抗体。免疫组14天H9抗体值均在8Log2以上，高于商品苗组(SS株)免疫结果。见表5。

表5疫苗免疫SPF鸡14天后抗体结果

3.攻毒保护试验

如上述血清学实验，免疫后21天，分别用AIV-BZ株对实验组、商品苗与空白对照组进行翅静脉攻毒，攻毒剂量为0.2ml(10⁶EID50)。攻毒后5天分别采集喉头和泄殖腔棉拭子，接种10日龄SPF鸡胚，每只接5枚；培养观察96小时后，收集尿囊液，检测阳性率；如为阴性，收集尿囊液再次接种SPF鸡胚，HA大于4Log2判为阳性。实验组10只全部为阴性，商品苗组8只为阴性，对照组5只全部为阳性，见表6。说明AIV-BZ株制备灭活苗免疫后14 天可产生免疫保护性抗体，有效保护临床毒株攻击，且保护效果优于当前商品苗(SS株)。

表6疫苗免疫SPF鸡21天后攻毒保护结果

序列表

<110> 北京华夏兴洋生物科技有限公司

北京生泰尔科技股份有限公司

<120> 一株禽源H9N2亚型禽流感毒株分离鉴定及应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 560

<212> PRT

<213> Avian Influenza virus

<400> 1

Met Glu Thr Val Ser Leu Ile Thr Ile Leu Leu Val Ala Thr Val Ser

1 5 10 15

Tyr Ala Asp Lys Ile Cys Ile Gly Tyr Gln Ser Thr Asn Ser Thr Glu

20 25 30

Thr Val Asp Thr Leu Thr Glu Asn Asn Val Pro Val Thr His Ala Lys

35 40 45

Glu Leu Leu His Thr Glu His Asn Gly Met Leu Cys Ala Thr Ser Leu

50 55 60

Gly Gln Pro Leu Ile Leu Asp Thr Cys Thr Ile Glu Gly Leu Ile Tyr

65 70 75 80

Gly Asn Pro Ser Cys Asp Leu Ser Leu Glu Gly Lys Glu Trp Ser Tyr

85 90 95

Ile Val Glu Arg Pro Ser Ala Val Asn Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Asn

100 105 110

Val Glu Asn Leu Glu Glu Leu Arg Ser Leu Phe Ser Ser Ala Arg Ser

115 120 125

Tyr Gln Arg Val Gln Ile Phe Pro Asp Thr Ile Trp Asn Val Ser Tyr

130 135 140

Asp Gly Thr Ser Thr Ala Cys Ser Gly Ser Phe Tyr Arg Ser Met Arg

145 150 155 160

Trp Leu Thr Arg Lys Asp Gly Ser Tyr Pro Thr Gln Asp Ala Gln Tyr

165 170 175

Thr Asn Asn Gln Gly Lys Asn Ile Leu Phe Met Trp Gly Ile Asn Gln

180 185 190

Pro Pro Thr Asp Asp Thr Gln Arg Ser Leu Tyr Thr Arg Thr Asp Thr

195 200 205

Thr Thr Ser Val Ala Thr Glu Glu Ile Asn Arg Ile Phe Lys Pro Leu

210 215 220

Ile Gly Pro Arg Pro Leu Val Asn Gly Leu Met Gly Arg Ile Asp Tyr

225 230 235 240

Tyr Trp Ser Val Leu Lys Pro Gly Gln Thr Leu Arg Ile Lys Ser Asp

245 250 255

Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Gly Tyr Ile Leu Ser Gly Glu Ser

260 265 270

His Gly Arg Ile Leu Lys Thr Asp Leu Lys Arg Gly Ser Cys Thr Val

275 280 285

Gln Cys Gln Thr Glu Lys Gly Gly Leu Asn Thr Thr Leu Pro Phe Gln

290 295 300

Asn Val Ser Lys Tyr Ala Phe Gly Asn Cys Ser Lys Tyr Ile Gly Ile

305 310 315 320

Lys Ser Leu Lys Leu Ala Val Gly Leu Arg Asn Val Pro Ser Arg Ser

325 330 335

Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp

340 345 350

Ser Gly Leu Val Ala Gly Trp Tyr Gly Phe Gln His Ser Asn Asp Gln

355 360 365

Gly Val Gly Met Ala Ala Asp Arg Asp Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp

370 375 380

Lys Ile Thr Ser Lys Val Asn Asn Ile Val Asp Lys Met Asn Lys Gln

385 390 395 400

Tyr Glu Ile Ile Asp His Glu Phe Ser Glu Val Glu Thr Arg Leu Asn

405 410 415

Met Ile Asn Asn Lys Ile Asp Asp Gln Ile Gln Asp Ile Trp Ala Tyr

420 425 430

Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gln Lys Thr Leu Asp Glu

435 440 445

His Asp Ala Asn Val Asn Asn Leu Tyr Asn Lys Val Lys Arg Ala Leu

450 455 460

Gly Ser Asn Ala Ala Glu Asp Gly Lys Gly Cys Phe Glu Leu Tyr His

465 470 475 480

Lys Cys Asp Asp Gln Cys Met Glu Thr Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asn

485 490 495

Arg Arg Lys Tyr Gln Glu Glu Ser Lys Leu Glu Arg Gln Lys Leu Glu

500 505 510

Gly Val Lys Leu Glu Ser Glu Gly Thr Tyr Lys Ile Leu Thr Ile Tyr

515 520 525

Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Ile Ala Met Gly Phe Ala Ala Phe

530 535 540

Leu Phe Trp Ala Met Ser Asn Gly Ser Cys Thr Cys Thr Ile Gly Ile

545 550 555 560

<210> 2

<211> 466

<212> PRT

<213> Avian Influenza virus

<400> 2

Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Thr Ala Ile Gly Ser Val Ser Leu Ile

1 5 10 15

Ile Ala Ile Ile Cys Leu Leu Met Gln Ile Ala Ile Leu Thr Thr Thr

20 25 30

Met Thr Leu His Phe Arg Gln Lys Glu Cys Ser Asn Pro Ser Asn Asn

35 40 45

Gln Val Met Pro Cys Glu Pro Ile Ile Ile Glu Arg Asn Thr Val His

50 55 60

Leu Asn Ser Thr Thr Ile Glu Arg Glu Ile Cys Pro Lys Val Ala Glu

65 70 75 80

Tyr Lys Asn Trp Ser Lys Pro Gln Cys Leu Ile Thr Gly Phe Ala Pro

85 90 95

Phe Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Leu Ser Ala Gly Gly Asp Ile Trp

100 105 110

Val Thr Arg Glu Pro Tyr Val Ser Cys Ser Pro Asp Lys Cys Tyr Gln

115 120 125

Phe Ala Leu Gly Gln Gly Thr Thr Leu Lys Asn Lys His Ser Asn Gly

130 135 140

Thr Thr His Asp Arg Thr Pro His Arg Thr Leu Leu Met Asn Glu Leu

145 150 155 160

Gly Val Pro Phe His Leu Gly Thr Lys Gln Val Cys Ile Ala Trp Ser

165 170 175

Ser Ser Ser Cys Tyr Asp Gly Lys Ala Trp Leu His Ile Cys Val Thr

180 185 190

Gly Asp Asp Lys Asn Ala Thr Ala Ser Ile Ile Tyr Asp Gly Met Leu

195 200 205

Val Asp Ser Ile Gly Ser Trp Ser Lys Asn Ile Leu Arg Thr Gln Glu

210 215 220

Ser Glu Cys Val Cys Ile Asn Gly Thr Cys Ala Val Val Met Thr Asp

225 230 235 240

Gly Ser Ala Ser Gly Val Ala Asp Thr Arg Val Leu Phe Ile Arg Glu

245 250 255

Gly Lys Ile Ile Asn Ile Arg Pro Leu Ser Gly Ser Ala Gln His Val

260 265 270

Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Arg Tyr Pro Glu Ile Arg Cys Val Cys

275 280 285

Arg Asp Asn Trp Lys Gly Ser Asn Arg Pro Ile Ile Tyr Ile Asn Met

290 295 300

Ala Asp Tyr Ser Ile Glu Ser Ser Tyr Val Cys Ser Gly Leu Val Gly

305 310 315 320

Asp Thr Pro Arg Asn Asp Asp Ser Ser Ser Ser Ser Asn Cys Arg Asp

325 330 335

Pro Asn Asn Glu Arg Gly Ala Pro Gly Val Lys Gly Trp Ala Phe Asp

340 345 350

Asp Gly Asn Asp Val Trp Met Gly Arg Thr Ile Lys Asn Gly Ser Arg

355 360 365

Ser Gly Tyr Glu Thr Phe Arg Val Ile Asn Gly Trp Thr Met Ala Asn

370 375 380

Ser Lys Ser Gln Ile Asn Arg Gln Val Ile Val Asp Ser Asp Asp Trp

385 390 395 400

Ser Gly Tyr Ser Gly Ile Phe Ser Val Glu Gly Lys Lys Cys Ile Asn

405 410 415

Arg Cys Phe Tyr Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Pro Gln Glu Pro Arg

420 425 430

Val Trp Trp Thr Ser Asn Ser Ile Ile Val Phe Cys Gly Thr Ser Gly

435 440 445

Thr Tyr Gly Thr Gly Ser Trp Pro Asp Gly Ala Asn Ile Asn Phe Met

450 455 460

Pro Ile

465

Claims

1.一种H9N2亚型禽流感病毒AIV-BZ株，保藏编号为CGMCC No.18172。

2.如权利要求1所述的H9N2亚型禽流感病毒AIV-BZ株，其在鸡胚中可高滴度增殖，血凝价稳定在2¹⁰。

3.一种禽流感灭活疫苗，其包含灭活后的如权利要求1所述的H9N2亚型禽流感病毒AIV-BZ株，灭活后病毒液血凝价HA不低于9Log2。

4.一种如权利要求3所述的禽流感灭活疫苗的制备方法，采用如权利要求1或2所述的H9N2亚型禽流感病毒AIV-BZ株接种SPF鸡胚，培养96-120小时，经0.1%-0.3%甲醛灭活后与605佐剂按照4:6比例混合制备而成。