CN107868131A

CN107868131A - 一种猪细小病毒病亚单位疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN107868131A
Application number: CN201710955079.7A
Authority: CN
Inventors: 夏振强; 金宏丽; 石晶; 殷玉和; 刘冰; 刘伟; 崔玉梅; 付玉
Original assignee: CHANGCHUN SR BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: CHANGCHUN SR BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2017-10-13
Filing date: 2017-10-13
Publication date: 2018-04-03

Abstract

本发明提供了一种猪细小病毒病亚单位疫苗及其制备方法，本发明首先提供一种猪细小病毒病毒样颗粒，其是将优化后的VP2基因与白介素15基因融合表达，利用杆状病毒/昆虫细胞表达***来生产猪细小病毒病毒样颗粒。将所述猪细小病毒病毒样颗粒与防腐剂和佐剂混合，即制备得到猪细小病毒病疫苗。本发明的猪细小病毒病疫苗具有产量高、生产成本低、免疫原性高、安全性好、便于大规模生产等优点，对猪细小病毒病具有良好的免疫及预防效果。

Description

一种猪细小病毒病亚单位疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生物领域、基因工程领域及兽医生物制药领域，具体地说，涉及猪细小病毒病毒样颗粒、其制备方法及应用。

背景技术

猪细小病毒病是由猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)感染引起的猪繁殖障碍性疾病，其特征为感染母猪，特别是初产母猪，使母猪产出死胎、畸形胎、木乃伊胎、流产及病弱仔猪，而母猪本身并无明显的临床症状。本病于1967年首先在英国被报道并分离出病毒，其后在欧洲、美洲、亚洲和大西洋很多国家均有该病的报道，现在已经遍布全世界，我国在上海、四川、北京和江苏等地也相继分离到猪细小病毒。

PPV在我国猪场广泛流行，造成养猪业巨大的经济损失。猪细小病毒病的防治主要以免疫预防为主。PPV疫苗主要为弱毒疫苗和灭活疫苗。PPV弱毒疫苗主要有N株(自然弱毒株)、NADL-2株(细胞培养适应株)、HT-SK-C株(HT株经紫外线照射后再传代育成株)和HT株(低温细胞传代育成株)等毒株。但是由于PPV强毒株的大量存在，PPV弱毒苗应限于非怀孕母猪使用、以及人们对病毒重组及弱毒返强的担心一直制约着PPV弱毒疫苗的应用。目前，研发成商品的PPV弱毒疫苗屈指可数，国内外主要使用灭活疫苗用于该病的免疫预防，美国也仅批准PPV灭活疫苗的生产与使用，我国上市的PPV疫苗也均为灭活疫苗。但灭活疫苗存在免疫效果不稳定、整个疫苗制备过程需要处理大量的感染性病毒而存在一定的生物安全风险，不是最理想的疫苗。PPV的弱毒苗和灭活苗在猪细小病毒病的预防控制中有着明显的优缺点，因此，用基因工程的方法生产PPV基因工程疫苗能很好的弥补PPV灭活苗和弱毒苗的缺点。

白细胞介素15(Interleukin-15,IL-15)是一种细胞因子，可激活T细胞(特别是CD8+CTLs)，还在NK细胞的活化和其功能调节中起关键作用。石娜等(参见“猪IL-15与PRRS病毒GP5基因核酸疫苗免疫效力”，东北农业大学学报，2010年，第41卷，第1期，第97-102页)将可表达猪IL15的质粒与猪繁殖呼吸综合征病毒(Porcine respiratory andreproductive syndrome virus，PRRSV)GP5基因的核酸疫苗共同进行免疫试验，结果表明，猪IL15可作为分子佐剂增强核酸疫苗的免疫效果。张天援等(参见“表达鸡IL2和IL15重组新城疫病毒的免疫增强作用研究”，中国预防兽医学报,2014年，第36卷，第12期，第971-974页)将鸡IL15克隆于新城疫病毒中，重组病毒对雏鸡的免疫效果和保护水平均较好。其中，IL15不能组装进重组病毒中，为收获的病毒液中游离成分。本发明拟将猪IL15与PPV VP2融合表达，构建重组VLPs，在模拟野生型病毒空间构象的同时，促进抗原特异性免疫应答效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪细小病毒病毒样颗粒、其制备方法及应用。

本发明的另一目的是提供一种猪细小病毒病疫苗、其制备方法及应用。

为了实现本发明目的，本发明利用杆状病毒/昆虫细胞表达***来生产猪细小病毒病毒样颗粒。

本发明首先提供一种融合蛋白，由IL-15融合表达于猪细小病毒VP2蛋白N端组成，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供编码上述融合蛋白的基因，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，该基因中编码猪细小病毒VP2蛋白的基因序列根据昆虫细胞偏爱进行密码子优化。

本发明还提供一种猪细小病毒病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：(1)根据昆虫细胞偏爱密码子对猪细小病毒VP2基因进行优化，将猪IL15基因与优化的猪细小病毒VP2基因***到昆虫细胞表达载体中，转化DH10Bac感受态，提取重组杆状病毒基因组；(2)将重组杆状病毒基因组转染昆虫细胞，拯救获得重组杆状病毒，按MOI＝0.1-1接种昆虫细胞，4-5天后收获混合物，即得猪细小病毒病毒样颗粒。

所述优化的猪细小病毒VP2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。所述猪IL15基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

其中所述的昆虫细胞表达载体选自pFastBac1、pFastBac HT、pFastBac Dual、pFastBac1-Gus、pFastBac HT-GAT、pFastBac Dual-Gus/GAT，更优选为pFastBac Dual。

其中所述的昆虫细胞选自Sf9、Sf21、High Five、Tn-368、BTI-TN-5B1-4，更优选为Sf9。

本发明还提供所述猪细小病毒病毒样颗粒在制备猪细小病毒病疫苗中的应用。

本发明还提供一种猪细小病毒病疫苗，其是将上述制备的猪细小病毒病毒样颗粒辅以防腐剂和佐剂制备而成。其中，所述防腐剂为硫柳汞等，优选终浓度为0.005％；所述佐剂为ISA201VG。本发明的猪细小病毒病疫苗为肌肉注射疫苗或皮下注射疫苗。

本发明进一步提供上述制备的猪细小病毒病疫苗在预防猪细小病毒病中的应用。

本发明将猪IL15融合表达于密码子优化的PPV VP2蛋白中，构建重组VLPs，属于国内外首次报道，获得的猪细小病毒病毒样颗粒不仅可以增强免疫效果，也可弥补在后期纯化中，存在两种目的抗原不方便纯化的不足。本发明以杆状病毒作为表达载体，以Sf9细胞作为生物反应器，制备的猪细小病毒病疫苗具有滴度高、免疫原性高、安全性好、便于大规模生产等优点，肌肉免疫可诱导机体产生高水平的特异性抗体，对猪细小病毒病具有良好的免疫及预防效果。

附图说明

图1为本发明实施例1中重组杆状病毒感染Sf9细胞后的情况；其中，A为正常细胞孔，B为病毒感染孔。

图2为本发明实施例1中重组杆状病毒感染Sf9细胞后间接免疫荧光检测结果；其中，A为病毒感染孔，B为正常细胞孔。

图3为本发明实施例1中重组杆状病毒感染Sf9细胞后收获抗原的SDS-PAGE鉴定结果；其中，泳道1为实施例1的重组杆状病毒感染细胞收获的抗原，泳道2为蛋白Marker，泳道3为空杆状病毒感染细胞收获的抗原。

图4为本发明实施例1中重组杆状病毒感染Sf9细胞后收获抗原的电镜观察结果。

图5为本发明实施例1中重组杆状病毒感染Sf9细胞后收获抗原的血凝检测结果；其中，A为哺乳动物细胞培养收获的猪细小病毒，B为重组杆状病毒培养收获的病毒样颗粒。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1猪细小病毒病毒样颗粒的制备及鉴定

对保存的猪细小病毒提取基因组进行测序，获得VP2序列，根据Sf9细胞偏爱性进行优化，并送公司进行基因合成。优化后的猪细小病毒VP2序列如SEQ ID NO.3所示。

对优化后的序列，使用引物(SEQ ID NO.4-5所示)进行扩增VP2基因，通过PstI-HindIII连入pFastBac Dual载体的pH MCS中，再在VP2N端通过RsrII-PstI引入IL-15基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。通过PCR将IL-VP2基因扩增(引物如SEQ ID NO.7-8所示)，利用SmaI-XhoI连入p10MCS处，最终获得携带有双拷贝外源片段的转移载体。将转移载体转化DH10Bac感受态进行重组，获得携带有双拷贝外源片段的重组杆状病毒基因组Bacmid。将Bacmid转染Sf9细胞后，拯救获得重组杆状病毒。将重组杆状病毒感染Sf9细胞，可产生明显的细胞病变，如体积增大、细胞脱落、细胞内颗粒增多(图1)。对24孔板中已长单层的Sf9细胞接种重组杆状病毒，48h后使用针对猪细小病毒的单克隆抗体(购自VMRD公司，cat no.3C9D11H11)进行间接免疫荧光检测，可见有特异性的绿色荧光(图2)，表明可成功表达目的蛋白。

将重组杆状病毒按MOI＝0.1接毒量接种悬浮培养的Sf9细胞，接毒后4天收获抗原，对抗原进行SDS-PAGE检测，结果可见有目的蛋白条带(图3)。对抗原负染后，进行电镜观察，结果可见有直径18-26nm的病毒样颗粒，形态与天然病毒相似(图4)，表明表达的目的蛋白可成功组装成病毒样颗粒。以豚鼠红细胞测定收获抗原的血凝效价为1:2¹²，效价远高于利用哺乳动物细胞生产病毒的效价(1:2⁸)(图5)。

实施例2豚鼠免疫试验

将实施例1制得的猪细小病毒病毒样颗粒以20mM PBS(pH 7.2)进行稀释，使其血凝效价分别为1:2⁸和1:2¹⁰，按终浓度0.005％比例加入硫柳汞，按等体积比例加入ISA201VG佐剂，乳化制成高剂量疫苗和低剂量疫苗，于4℃保存。

将200-300g豚鼠分为4组，分别为阴性对照组、高剂量疫苗组、低剂量疫苗组和灭活疫苗(购自武汉科前动物生物制品有限公司)对照组，3只/组，免疫剂量为0.5ml/只，首免后第4周加强免疫一次。首免后第0、2、3、4、6周分别采血，测定其血清血凝抑制抗体效价(操作方法参照“兽用生物制品—猪细小病毒灭活疫苗质量标准”)。

结果显示，免疫动物抗体滴度呈剂量依赖性，高剂量疫苗免疫组抗体效价高于低剂量疫苗免疫组。与灭活疫苗对照组相比，免疫后2周病毒样颗粒疫苗免疫组即可刺激机体产生抗猪细小病毒抗体，且高剂量疫苗免疫组抗体效价均大于1:64。免疫后4周，病毒样颗粒低剂量疫苗免疫组和高剂量疫苗免疫组所有动物抗体效价均大于1:64现行猪细小病毒疫苗质量标准要求：免疫后第4周血凝抑制抗体效价需大于1:64)。

表1豚鼠免疫后不同时间猪细小病毒抗体效价

实施例3猪免疫试验

将生产的猪细小病毒病毒样颗粒以20mM PBS(pH 7.2)进行稀释，使其血凝效价为1:2¹⁰，按终浓度0.005％比例加入硫柳汞，按等体积比例加入ISA201VG佐剂，乳化制成疫苗，于4℃保存。

将4-6周龄健康易感仔猪10头随机分为2组，分别为免疫组和对照组，5头/组。免疫组仔猪于颈部肌肉注射上述猪细小病毒病毒样颗粒疫苗2ml。免疫后第0、3、4周，对实验猪进行采血，分离血清，以血凝抑制试验测定血清抗猪细小病毒血凝抑制抗体效价。

结果显示(表2)，免疫后第3周VLPs疫苗免疫组即可刺激机体产生抗猪细小病毒抗体，免疫后第4周，血凝抑制抗体效价均大于等于1:128(现行猪细小病毒疫苗质量标准要求：免疫后第4周血凝抑制抗体效价需大于1:64)。

表2猪免疫后不同时间猪细小病毒血凝抑制抗体效价

本发明通过大量实验发现并确认，将猪细小表达VP2基因密码子优化后与猪白介素15基因融合表达，其能够高水平地表达外源蛋白，正确包装成病毒样颗粒，以豚鼠红细胞测定病毒样颗粒的血凝效价可达1:2¹²，较现有技术提高至少4个滴度。本发明提供的猪细小病毒病毒样颗粒以及相关的表达***可安全、高效、大规模的生产猪细小病毒病毒样颗粒，且所得病毒样颗粒滴度高、免疫原性好，肌肉免疫可诱导动物机体产生高水平的特异性抗体，对易感动物提供很好的保护作用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 长春西诺生物科技有限公司

<120> 一种猪细小病毒病亚单位疫苗及其制备方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 742

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Arg Ile Leu Lys Pro Cys Leu Arg Ser Thr Cys Ile Gln Cys Tyr

1 5 10 15

Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Asp Gly Ile His

20 25 30

Val Phe Ile Leu Gly Cys Ile Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala

35 40 45

Thr Trp Gln His Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

50 55 60

Arg Ser Ile His Met Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Ala His

65 70 75 80

Pro Asn Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Arg

85 90 95

Val Ile Leu Gln Glu Ser Arg Asn Ser Asp Ile Ser Asp Thr Val Glu

100 105 110

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Ser Ser Leu Ser Ser Ile Glu Tyr Lys

115 120 125

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

130 135 140

Asn Glu Phe Leu Lys Ser Phe Ile His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

145 150 155 160

Pro Ser Leu Gln Ser Glu Asn Val Glu Gln His Asn Pro Ile Asn Ala

165 170 175

Gly Thr Glu Leu Ser Ala Thr Gly Asn Glu Ser Gly Gly Gly Gly Gly

180 185 190

Gly Gly Gly Gly Arg Gly Ala Gly Gly Val Gly Val Ser Thr Gly Thr

195 200 205

Phe Asn Asn Gln Thr Glu Phe Gln Tyr Leu Gly Glu Gly Leu Val Arg

210 215 220

Ile Thr Ala His Ala Ser Arg Leu Ile His Leu Asn Met Pro Glu His

225 230 235 240

Glu Thr Tyr Lys Arg Ile His Val Leu Asn Ser Glu Ser Gly Val Ala

245 250 255

Gly Gln Met Val Gln Asp Asp Ala His Thr Gln Met Val Thr Pro Trp

260 265 270

Ser Leu Ile Asp Ala Asn Ala Trp Gly Val Trp Phe Asn Pro Ala Asp

275 280 285

Trp Gln Leu Ile Ser Asn Asn Met Thr Glu Ile Asn Leu Val Ser Phe

290 295 300

Glu Gln Glu Ile Phe Asn Val Val Leu Lys Thr Ile Thr Glu Ser Ala

305 310 315 320

Thr Ser Pro Pro Thr Lys Ile Tyr Asn Asn Asp Leu Thr Ala Ser Leu

325 330 335

Met Val Ala Leu Asp Thr Asn Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Pro Ala Ala

340 345 350

Pro Arg Ser Glu Thr Leu Gly Phe Tyr Pro Trp Leu Pro Thr Lys Pro

355 360 365

Thr Gln Tyr Arg Tyr Tyr Leu Ser Cys Ile Arg Asn Leu Asn Pro Pro

370 375 380

Thr Tyr Thr Gly Gln Ser Gln Gln Ile Thr Asp Ser Ile Gln Thr Gly

385 390 395 400

Leu His Ser Asp Ile Met Phe Tyr Thr Ile Glu Asn Ala Val Pro Ile

405 410 415

His Leu Leu Arg Thr Gly Asp Glu Phe Ser Thr Gly Ile Tyr His Phe

420 425 430

Asp Thr Lys Pro Leu Lys Leu Thr His Ser Trp Gln Thr Asn Arg Ser

435 440 445

Leu Gly Leu Pro Pro Lys Leu Leu Thr Glu Pro Thr Thr Glu Gly Asp

450 455 460

Gln His Pro Gly Thr Leu Pro Ala Ala Asn Thr Arg Lys Gly Tyr His

465 470 475 480

Gln Thr Ser Asn Asn Ser Tyr Thr Glu Ala Thr Ala Ile Arg Pro Ala

485 490 495

Gln Val Gly Tyr Asn Thr Pro Tyr Met Asn Phe Glu Tyr Ser Asn Gly

500 505 510

Gly Pro Phe Leu Thr Pro Ile Val Pro Thr Ala Asp Thr Gln Tyr Asn

515 520 525

Asp Asp Glu Pro Asn Gly Ala Ile Arg Phe Thr Met Asp Tyr Gln His

530 535 540

Gly Gln Leu Thr Thr Ser Ser Gln Glu Leu Glu Arg Tyr Thr Phe Asn

545 550 555 560

Pro Gln Ser Lys Cys Gly Arg Ala Pro Lys Gln Gln Phe Asn Gln Gln

565 570 575

Ala Pro Leu Asn Leu Glu Asn Thr Asn Asn Gly Thr Leu Leu Pro Ser

580 585 590

Asp Pro Ile Gly Gly Lys Ser Asn Met His Phe Met Asn Thr Leu Asn

595 600 605

Thr Tyr Gly Pro Leu Thr Ala Leu Asn Asn Thr Ala Pro Val Phe Pro

610 615 620

Asn Gly Gln Ile Trp Asp Lys Glu Leu Asp Thr Asp Leu Lys Pro Arg

625 630 635 640

Leu His Val Thr Ala Pro Phe Val Cys Lys Asn Asn Pro Pro Gly Gln

645 650 655

Leu Phe Val Lys Ile Ala Pro Asn Leu Thr Asp Asp Phe Asn Ala Asp

660 665 670

Ser Pro Gln Gln Pro Arg Ile Ile Thr Tyr Ser Asn Phe Trp Trp Lys

675 680 685

Gly Thr Leu Thr Phe Thr Ala Lys Met Arg Ser Ser Asn Met Trp Asn

690 695 700

Pro Ile Gln Gln His Thr Thr Thr Ala Glu Asn Ile Gly Asn Tyr Ile

705 710 715 720

Pro Thr Asn Ile Gly Gly Ile Arg Met Phe Pro Glu Tyr Ser Gln Leu

725 730 735

Ile Pro Arg Lys Leu Tyr

740

<210> 2

<211> 2229

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgagaattt tgaaaccatg tttgagaagt acttgcatcc agtgctactt gtgtttactt 60

ctgaacagtc attttttaac tgaggatggc attcatgtct tcattttggg ctgtatcagt 120

gcaggtcttc ctaaaacaga agcaacctgg cagcacgtaa taagtgattt gaaaaaaatt 180

gaagatctta ttcgatctat acatatggat gccacattgt atactgaaag tgatgctcat 240

cccaattgca aagtaacagc gatgaagtgc tttctcctgg agttacgcgt cattttgcaa 300

gagtccagaa attcagacat tagtgataca gtagaaaacc ttatcatcct tgcaaacagc 360

agtttatcgt ccattgagta taaaactgaa tctggatgca aagaatgtga ggagctggag 420

gaaaaaaata ttaacgaatt tttgaagagt tttatacata tcgtgcaaat gttcatcaac 480

ccttctctgc agtccgaaaa cgtggagcag cataacccta tcaacgccgg aactgagttg 540

tccgctaccg gtaacgaatc cggtggaggt ggaggcggcg gaggtggtcg tggtgctgga 600

ggagttggtg tgagtactgg tactttcaac aaccaaacag aatttcaata cttgggagaa 660

ggattggtca ggatcactgc tcatgcttcc aggctcatcc acttgaacat gccagagcac 720

gaaacctaca agaggatcca cgtcctcaac tccgaaagcg gagttgctgg tcaaatggtc 780

caggatgatg ctcacaccca aatggtgacc ccttggtcat tgatcgacgc taacgcttgg 840

ggtgtgtggt tcaacccagc tgattggcaa ttgatctcca acaacatgac cgagatcaac 900

ctggttagct tcgagcagga gatcttcaat gtggtgctca agaccatcac agaatccgcc 960

acctctccac caaccaagat ctacaacaac gacctcaccg ccagcctgat ggtggctctc 1020

gataccaaca ataccctccc atacacccca gctgctccta gaagtgagac cttgggtttc 1080

tacccatggt tgcctaccaa gccaactcaa taccgttact acctcagctg catccgtaac 1140

ctcaacccac caacatacac cggtcagagc cagcaaatca cagacagcat ccagacaggt 1200

ctgcacagcg atatcatgtt ctacaccatc gagaacgccg tcccaatcca cctgttgaga 1260

accggagatg agttctccac aggaatctac cacttcgaca ccaaaccact gaagctcacc 1320

cactcatggc agaccaaccg tagcctggga ctgcctccaa aactgctgac tgagcctact 1380

acagaaggtg accaacatcc aggtacactg ccagctgcca atacacgtaa gggataccac 1440

cagacttcta acaacagcta caccgaagcc acagccattc gtcctgccca agttggctat 1500

aatacccctt acatgaactt cgagtactct aacggcggcc ctttcctgac tcctatcgtt 1560

cctacagccg atacacagta caacgacgac gagcctaatg gtgctatccg tttcacaatg 1620

gactaccagc acggacagct gactacatct tcacaagagc tcgaaaggta cacattcaac 1680

ccccagtcta agtgcggccg cgctcctaag cagcagttca accagcaggc ccctctgaat 1740

ctggaaaaca caaacaacgg cacactcctc ccttcagacc ccattggcgg caaatctaat 1800

atgcacttca tgaacactct caacacatac ggccccctga cagccctgaa caacactgcc 1860

cctgttttcc ccaacggcca gatttgggac aaagaactcg acactgacct gaagccccgc 1920

ctgcacgtga ctgctccctt tgtctgtaag aataatcccc ccggccaact gtttgtcaag 1980

attgccccca acctgactga cgactttaac gccgactctc cccaacaacc ccgcatcatc 2040

acttattcaa acttctggtg gaagggcact ctgactttca ctgccaagat gcgctcatca 2100

aacatgtgga accccattca acagcacact acaacagccg aaaacatcgg caactacatc 2160

cccactaata tcggcggcat ccgcatgttc cccgaataca gtcagctcat tccccgcaag 2220

ctctactaa 2229

<210> 3

<211> 1740

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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gtgagtactg gtactttcaa caaccaaaca gaatttcaat acttgggaga aggattggtc 180

aggatcactg ctcatgcttc caggctcatc cacttgaaca tgccagagca cgaaacctac 240

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gctcacaccc aaatggtgac cccttggtca ttgatcgacg ctaacgcttg gggtgtgtgg 360

ttcaacccag ctgattggca attgatctcc aacaacatga ccgagatcaa cctggttagc 420

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ccaacataca ccggtcagag ccagcaaatc acagacagca tccagacagg tctgcacagc 720

gatatcatgt tctacaccat cgagaacgcc gtcccaatcc acctgttgag aaccggagat 780

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cagaccaacc gtagcctggg actgcctcca aaactgctga ctgagcctac tacagaaggt 900

gaccaacatc caggtacact gccagctgcc aatacacgta agggatacca ccagacttct 960

aacaacagct acaccgaagc cacagccatt cgtcctgccc aagttggcta taatacccct 1020

tacatgaact tcgagtactc taacggcggc cctttcctga ctcctatcgt tcctacagcc 1080

gatacacagt acaacgacga cgagcctaat ggtgctatcc gtttcacaat ggactaccag 1140

cacggacagc tgactacatc ttcacaagag ctcgaaaggt acacattcaa cccccagtct 1200

aagtgcggcc gcgctcctaa gcagcagttc aaccagcagg cccctctgaa tctggaaaac 1260

acaaacaacg gcacactcct cccttcagac cccattggcg gcaaatctaa tatgcacttc 1320

atgaacactc tcaacacata cggccccctg acagccctga acaacactgc ccctgttttc 1380

cccaacggcc agatttggga caaagaactc gacactgacc tgaagccccg cctgcacgtg 1440

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<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taactgcagt ccgaaaacgt ggagcagc 28

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<211> 30

<212> DNA

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<400> 5

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<210> 6

<211> 499

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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catcaaccct tctctgcag 499

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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taacccggga tgagaatttt gaaaccatg 29

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

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Claims

1.一种融合蛋白，其特征在于，由IL-15融合表达于猪细小病毒VP2蛋白N端组成，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.编码权利要求1所述融合蛋白的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.猪细小病毒病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)根据昆虫细胞偏爱密码子对猪细小病毒VP2基因进行优化，将IL-15基因与优化的猪细小病毒VP2基因***到昆虫细胞表达载体中，转化DH10Bac感受态，提取重组杆状病毒基因组；

(2)将重组杆状病毒基因组转染昆虫细胞，拯救获得重组杆状病毒，按MOI＝0.1-1接种昆虫细胞，4-5天后收获混合物，即得猪细小病毒病毒样颗粒。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的昆虫细胞表达载体选自pFastBac1、pFastBac HT、pFastBac Dual、pFastBac1-Gus、pFastBac HT-GAT、pFastBacDual-Gus/GAT。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的昆虫细胞选自Sf9、Sf21、HighFive、Tn-368、BTI-TN-5B1-4。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述优化的猪细小病毒VP2基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示。

7.由权利要求3-6任一所述的方法制备得到的猪细小病毒病毒样颗粒。

8.权利要求7所述的猪细小病毒病毒样颗粒在猪细小病毒病疫苗的制备中的用途。

9.一种猪细小病毒病疫苗，其特征在于，将权利要求7所述的猪细小病毒病毒样颗粒辅以防腐剂和佐剂制备而成。

10.根据权利要求9所述的猪细小病毒病疫苗，其特征在于，所述防腐剂为硫柳汞，终浓度为0.005％；所述佐剂为ISA201VG；所述疫苗为肌肉注射疫苗或皮下注射疫苗。