CN112500458A

CN112500458A - 鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株亚单位疫苗、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN112500458A
Application number: CN202011473614.3A
Authority: CN
Inventors: 祁小乐; 王笑梅; 高玉龙; 高立; 李凯; 崔红玉; 刘长军; 潘青; 张艳萍; 刘爱晶
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2020-12-15
Filing date: 2020-12-15
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2040-12-15
Also published as: CN112500458B

Abstract

本发明公开了一种鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株亚单位疫苗、其制备方法及应用。针对IBDV新型变异株的流行，本发明对IBDV新型变异株代表毒株SHG19主要保护性蛋白VP2的基因表达盒进行了设计，引入了利于其正确构象形成的元件，构建了重组原核表达质粒，制备了重组大肠杆菌基因工程菌，经过表达条件和纯化条件的摸索，高效制备了IBDV新型变异株病毒样颗粒，将该病毒样颗粒与佐剂乳化制备成疫苗，试验结果显示，该疫苗不仅对同源的新型变异株产生了100％的免疫保护，而且对异源的vvIBDV的致死性攻击也产生了良好的免疫保护。本发明的提出为IBDV新型变异株以及超强毒株的防治提供了有效的技术手段。

Description

鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株亚单位疫苗、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株亚单位疫苗、其制备方法及应用，特别涉及一种由鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株VP2蛋白病毒样颗粒组成的亚单位疫苗、其制备方法及应用。本发明属于兽用医药技术领域。

背景技术

传染性法氏囊病(infectious bursal disease，IBD)是鸡的一种重要的免疫抑制病，其病原是传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)。IBDV对养禽业的危害分直接危害和间接危害。直接危害：摧毁中枢免疫器官法氏囊，且能直接致死。间接危害：IBDV感染耐过的鸡免疫力低下，造成禽流感、新城疫等其它重要疫病的疫苗免疫失败，且易造成继发感染，影响鸡群生产性能，造成严重经济损失。总之，IBD严重影响养禽业的健康发展，其防控形势十分严峻。

IBDV有两个血清型：血清I型和血清II型。血清I型对鸡致病，血清II型对鸡不致病。在过去的60多年里，血清I型IBDV主要发生过两次较大的变异，相继出现了经典毒、变异株和超强毒。上世纪90年代以来，以急性、高致死率为主要特征的IBDV超强毒(Veryvirulent IBDV,vvIBDV)席卷全球，给养禽业造成了巨大损失。经近30年的努力，基于饲养管理水平的提高和疫苗的广泛使用等因素，vvIBDV感染正逐渐被控制。然而，近年来IBD出现了新变化，非典型IBD在我国部分鸡场相继被发现，无明显外观症状，但中枢免疫器官法氏囊却严重萎缩，导致严重免疫抑制和生产性能下降，严重威胁养禽业健康发展。2017年以来，本实验室率先鉴定了该疫情的病原是IBDV新型变异株，在我国主要养禽地区均检测到了IBDV新型变异株的流行，该疫情正在不断蔓延扩大(范林进等，2019；Fan et al,2019,2020；Xu etal,2019)。最近，IBDV新型变异株在日本也开始流行了(Myint etal,2020)。

我们前期研究发现，IBDV新型变异株不仅造成中枢免疫器官损伤和免疫抑制进而显著影响生产性能，而且由于其抗原性与vvIBDV有显著差异进而导致有些针对vvIBDV的疫苗对其保护效果不理想。因此研制针对IBDV新型变异株的疫苗是十分必要而迫切的。

不包含完整病毒粒子和病毒核酸成分的亚单位疫苗，无毒力返强和基因重组的风险，安全性高，已经成为新型疫苗研制的新方向。为此，针对IBDV新型变异株的流行，本发明对IBDV新型变异株代表毒株SHG19主要保护性蛋白VP2的基因表达盒进行了设计，引入了利于其正确构象形成的原件，构建了重组原核表达质粒，制备了重组大肠杆菌基因工程菌，经过表达条件和纯化条件的摸索，高效制备了IBDV新型变异株病毒样颗粒，其免疫反应活性良好。因此，本发明的提出为IBDV新型变异株以及超强毒株的防治提供了有效的技术手段。

发明内容

针对IBDV新型变异株防控尚无疫苗可用的迫切问题，本发明的目的在于提供一种鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株亚单位疫苗、其制备方法及应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明对IBDV新型变异株代表毒株SHG19主要保护性蛋白VP2的基因表达盒进行了设计，引入了利于其正确构象形成的元件，构建了重组原核表达质粒，制备了重组大肠杆菌基因工程菌，经过表达条件和纯化条件的摸索，高效制备了IBDV新型变异株病毒样颗粒(SHG19-VLP)，将SHG19-VLP与佐剂乳化制备成疫苗，在SPF鸡上通过免疫应答检测及攻毒保护试验来评估疫苗的有效性。试验结果显示，IBDV新型变异株亚单位疫苗(SHG19-VLP)不仅对对同源的新型变异株产生了100％的免疫保护，而且对异源的vvIBDV的致死性攻击也产生了良好的免疫保护。

具体的，本发明的一种鸡传染性法氏囊病病毒(infectious bursal diseasevirus，IBDV)新型变异株亚单位疫苗，所述的疫苗中含有经优化后的鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株VP2蛋白组成的病毒样颗粒，所述的经优化后的鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株VP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

其中，优选的，所述的鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株VP2蛋白组成的病毒样颗粒是将编码所述的经优化后的鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株VP2蛋白的核苷酸序列***表达载体中，然后转化大肠杆菌，经过诱导表达、纯化后获得。

其中，优选的，编码所述的经优化后的鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株VP2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

其中，优选的，所述的表达载体为pCold I表达载体。

其中，优选的，所述的大肠杆菌为E.coli Transetta(DE3)表达工程菌。

进一步的，本发明还提出了一种制备所述的亚单位疫苗的方法，包括以下步骤：

(1)合成得到编码所述的经优化后的鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株VP2蛋白的核苷酸序列，并在所述的核苷酸序列的两端加上限制性内切酶酶切位点，得到目的片段；

(2)利用同源重组试剂盒将步骤(1)得到的目的片段与经相同酶切位点线性化后的pCold I表达载体进行同源重组反应，反应结束后取同源重组反应产物转化DH5α大肠杆菌，转化后12小时挑取单克隆，运用菌液PCR筛选阳性克隆，并将阳性克隆进行测序鉴定，将经鉴定正确的重组表达质粒命名为pCo-HHT28-SHG19VP2-466；

(3)将pCo-HHT28-SHG19VP2-466转化入E.coli Transetta(DE3)表达工程菌中，转化后12小时挑取单克隆菌落接种至氨苄抗性LB液体培养基中培养，收获菌液，进行RT-PCR鉴定，鉴定正确的阳性菌即为大肠杆菌基因工程菌Transetta(DE3)-SHG19VP2株菌种，于负80℃保存；

(4)重组蛋白的表达

将大肠杆菌基因工程菌Transetta(DE3)-SHG19VP2株菌种接种氨苄抗性的LB培养基，当OD₆₀₀达到0.6时，将摇瓶从摇床中取出，置冰上快速冷却，在摇瓶中加入IPTG，继续在摇床上培养；

诱导表达结束后，将菌液转入离心管，离心，弃去培养基，用PB缓冲液充分重悬菌体沉淀，随后将菌体运用高压细胞破碎仪进行高压破碎，将破碎后的菌液离心，弃沉淀，得到含有鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株VP2蛋白的溶液；

(5)重组蛋白的纯化

将得到的含有鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株VP2蛋白的溶液经过硫酸铵沉淀法获得初步纯化后的鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株VP2蛋白，然后再通过分子筛法进一步获得纯化后的鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株VP2蛋白，负染电镜结果显示，纯化后的鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株VP2蛋白形成了病毒样颗粒；

(7)疫苗的制备

将步骤(5)得到的病毒样颗粒以1:2的体积比与白油佐剂混合后充分乳化，得到传染性法氏囊病病毒新型变异株亚单位疫苗。

其中，优选的，在编码所述的经优化后的鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株VP2蛋白的核苷酸序列的两端分别加上KpnI和EcoRI酶切位点。

更进一步的，本发明还提出所述的亚单位疫苗在制备防治鸡传染性法氏囊病病毒药物中的用途。

其中，优选的，所述的鸡传染性法氏囊病病毒包括IBDV新型变异株以及IBDV超强毒株。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

(1)本发明对IBDV新型变异株代表毒株SHG19主要保护性蛋白VP2的基因表达盒进行了设计，引入了利于其正确构象形成的元件，构建了重组原核表达质粒，制备了重组大肠杆菌基因工程菌，经过表达条件和纯化条件的摸索，高效制备了IBDV新型变异株病毒样颗粒(SHG19-VLP)；

(2)该SHG19-VLP与目前流行的IBDV新型变异株的抗原匹配；

(3)基于SHG19-VLP的亚单位疫苗对IBDV新型变异株和超强毒株均能产生高效免疫保护。

附图说明

图1a为IBDV分离株VP2代表区段氨基酸序列进化树；

图1b为IBDV分离株VP1代表区段氨基酸序列进化树.

其中，红色，新型变异株；***，弱毒株；淡紫色，经典株；蓝色，超强毒；绿色，早期变异株；橙色，血清II型；黑色实心圆，本研究分离毒株.

图2a为SHG19的多聚蛋白氨基酸序列进化树；

图2b为SHG19的VP1氨基酸序列进化树；

图2c为SHG19的VP5、多聚蛋白和VP1的特征性氨基酸比对

其中，Var：变异株；VV：超强毒；AT：弱毒株.

图3为SHG19株IBDV对SPF鸡的致病性评价；

其中，(a)体重变化；(b)BBIX的动力学曲线；(c)脾脏体重比值；(d)法氏囊组织病理变化

图4为SHG19株IBDV的水平传播能力评价；

其中，(a)血清抗体滴度；(b)法氏囊中病毒RNA拷贝数；(c)BBIX；(d)脾脏体重比值；

图5为IBDV新型变异株对禽流感疫苗的免疫抑制；

图6为IBDV超强毒疫苗对IBDV新型变异株的免疫保护评价；

其中，(a)IBDV抗体滴度；(b)BBIX；(c)脾脏体重比值；(d)法氏囊；(e)法氏囊病理变化；

图7为IBDV新型变异株VLP的制备和鉴定；

其中，A.SHG19-VP2的Western-blot检测；B.SHG19-VP2的纯化(M、1、2、3分别为蛋白Marker(Prestained Protein Ladder)、纯化前样品、饱和硫酸铵沉淀法纯化后样品、分子筛纯化后样品)；C.SHG19-VLP的负染电镜观察；D.SHG19-VLP的琼脂扩散检测结果；

图8为SHG19-VLP疫苗对IBDV新型变异株的攻毒免疫试验结果；

其中，A.对IBDV新型变异株抗原(rGtVarVP2)的中和抗体；B.对IBDV超强毒株抗原(rGtHLJVP2)的中和抗体；C.B/B值；D.法氏囊及其显微病理切片；

图9为SHG19-VLP疫苗对IBDV超强毒株的攻毒免疫试验结果。

其中，A.对IBDV超强毒抗原(rGtHLJVP2)的中和抗体；B.存活率；C.法氏囊及其显微病理切片。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随具体实施例的描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株SHG19的分离鉴定

1.材料和方法

1.1临床样品采集及处理

2017年9月，安徽省滁州市某鸡场36日龄肉鸡出现疑似IBD的临床症状。患病鸡表现为精神不振，剖检发现其法氏囊严重萎缩。将送检的患病鸡法氏囊样品加入适量PBS，研磨后反复冻融三次，制备成的混悬液于4℃、5000g离心5min，取上清用于后续检测。

1.2 SPF鸡、病毒和主要试剂

无特定病原体(Specific-pathogen-free，SPF)鸡及SPF鸡胚由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所试验动物中心提供，SPF鸡饲养于负压隔离器中。DT40细胞由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽免疫抑制病团队(以下简称本实验室)保存。

IBDV超强毒(vvIBDV)中国代表毒株Gx(Wang et al.,2004)和HLJ0504(Qi etal.,2011)由本实验室分离鉴定。这三种病毒的单因子血清以及IBDVVP2蛋白单克隆抗体(7D4株)由本实验室制备。禽流感二价灭活疫苗(H5+H7)为哈尔滨维科生物技术有限公司产品。

RNAiso Plus购自TAKARA公司；M-MLV反转录试剂盒采购自Invitrogen公司；PrimeSTARTM HS DNAPolymerase、Ex TaqPolymerase、pMD18-T vector、RNAiso Plus、DL2000DNAMarker均为大连宝生物工程有限公司(Takara)产品；核酸凝胶回收试剂盒、小提质粒试剂盒为AxyPrep产品。胎牛血清为AusBian产品；EDTA-胰酶消化液、青链霉素双抗为哈尔滨国生生物科技股份有限公司产品；DMEM、Opti-MEM、1640为Thermo Scientific产品。

1.3RNA的提取及RT-PCR检测

取200μL上述病料混悬液，按照RNAiso Plus产品说明书提取样品总RNA，再根据M-MLV反转录试剂盒提供的操作步骤合成cDNA。以cDNA为模板，利用上游引物2U和下游引物2L(表1)进行IBDVVP2代表区段的检测。PCR程序为：95℃5min，95℃30s、56℃30s、72℃45s，35个循环；72℃5min。运用1％琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR结果，扩增预期长度为930bp。

VP2扩增阳性的样品，进一步以B464U/B1718L为引物(表1)，用PCR技术扩增VP1基因代表区段，反应程序为：95℃5min；95℃30s、56℃30s、72℃1min，35个循环；72℃10min。预期扩增长度为1255bp。

上述阳性PCR产物送吉林省库美生物科技有限公司测序，将VP2的有效序列确定为777bp(VP2基因的547-1323bp，对应氨基酸为183-441aa)；将VP1的有效序列确定为1152bp(VP1基因的511-1662bp，对应氨基酸为134-517aa)。将确定的SHG19株的VP2代表区段和VP1代表区段序列分别上传GenBank。

1.4病毒的分离

运用SPF鸡胚法进行病毒分离。取200μL病料混悬液，经绒毛***途径以接种9日龄SPF鸡胚，每代接种5个鸡胚，对照3个，观察5d。置37℃恒温箱中培养，每天观察鸡胚的临床症状及死亡情况，24h内的死胚弃去。接种后第5天，将期间死亡的鸡胚和耐过鸡胚剖检，采集法氏囊、***和尿囊液混合研磨制成混悬液，进行RT-PCR检测，并在新的9日龄SPF鸡胚上进行传代，盲传三代。收集第三代鸡胚的法氏囊、***和尿囊液混悬液，进行特异性和纯净性鉴定，即为分离得到的IBDV(鸡胚毒)，命名为SHG19株。

1.5病毒全基因组的扩增及测序

为了进一步鉴定SHG19的分子特征，本研究对该病毒基因组进行扩增。利用引物AU/A1542L和A1421U2/AL2(表1)分两段扩增IBDV基因组A节段(两段RT-PCR产物相互重叠)；利用引物BU/B1344L和B1344U/BL(表1)分两段扩增IBDV基因组B节段(两段RT-PCR产物相互重叠)。将RT-PCR产物纯化后分别克隆至pMD18-T载体中，将重组质粒送至吉林省库美生物科技有限公司进行测序。

表1引物

1.6病毒遗传演化分析

利用软件Clustal X program(version 2.0)(Larkin et al.,2007)和MEGA(version 3.1)(Kuma et al.,2004)对SHG19株病毒进行序列分析。所有的各型参考毒株见表2。我国新近分离的IBDV新型变异株(均为本实验室分离)见表3，其分离区域涵盖黑龙江、辽宁、河北、北京、山东、江苏、安徽、广西、山西、云南、浙江、福建、湖北等13个省(市)，其流行正在不断蔓延。

表2 IBDV参考毒株

表3我国近期分离的IBDV新型变异株

1.7 IBDV新型变异株SHG19的致病性研究

为了研究IBDV新型变异株SHG19对鸡的致病性，将50只16日龄的SPF鸡随机分为3组，第1组(10只)和第2组(15只)为感染组，第3组(25只)为空白对照组。第1组和第2组的SPF鸡在16日龄以滴鼻点眼的途径感染8×10⁶viral RNA copies(200μL)的IBDV SHG19株，第3组以相同途径给予相同体积(200μL)的无菌PBS。感染后的1-5天(day post-infection,dp.i.)，每天随机剖检第2组和第3组各3只鸡，称量体重，采集法氏囊和脾脏并称重，观察心脏、肝脏、肺脏、肾脏、胸腺、腿肌和胸肌的病理变化，并取适量法氏囊和脾脏样品浸泡于10％***中，制备切片进行组织病学观察。剖检的鸡，依据法氏囊重量和体重，计算囊重指数(bursa:body-weight index,BBIX)。囊重比＝(法氏囊重/体重)×1000；BBIX＝试验组鸡囊重比/空白对照组鸡平均囊重比；当BBIX<0.7时，判定为法氏囊萎缩(Lucio andHitchner,1979)。依据脾脏重量和体重计算脾体比，脾体比＝(脾脏重量/体重)×1000。第2组鸡用于SHG19感染的致病性观察，感染后每天观察其临床症状(不剖检)，统计临床症状指数、发病率和致死率，一直持续到感染后25天，并对存活的鸡称量体重，观察体重的变化。

为了评估IBDV新型变异株的水平传播能力，在第1组隔离器中将另外5只具有相同背景的未感染SPF鸡与已有的10只感染鸡同居，第3组中剖检剩余的10只鸡用作对照。每天观察鸡的临床症状，同居25天后，每组随机选择5只鸡，称量体重，计算BBIX和脾体比，观察法氏囊的病理变化，运用荧光定量RT-PCR检测法氏囊中的IBDV拷贝数。

1.8 IBDV新型变异株SHG19的免疫抑制研究

通过禽流感疫苗免疫试验评估SHG19株IBDV感染对鸡的免疫抑制情况。将30只16日龄SPF蛋鸡随机分为3组，每组10只。16日龄时，第1组以滴鼻点眼的途径感染SHG19，剂量为8×10⁶viral RNAcopies/只。在4dp.i.时，第1组和第2组通过腿肌注射途径免疫禽流感二价灭活疫苗(H5+H7)，按照产品说明书每只鸡免疫300μL。第3组为空白对照。在免疫后的0、7和14天，采血收集血清，通过血凝抑制试验(HI)检测血清中针对H5和H7的抗体效价。

1.9IBDV超强毒疫苗对IBDV新型变异株的免疫保护试验

为了评价IBDV超强毒(vvIBDV)疫苗对IBDV新型变异株的免疫保护效果，本研究选用三种针对vvIBDV的商品化疫苗开展免疫保护试验，即弱毒疫苗(VaccineA)、亚单位疫苗(Vaccine B)、多联疫苗(Vaccine C)。30只1日龄的SPF鸡被随机分为5组，每组6只。根据疫苗的使用说明，第1组在10日龄通过滴鼻点眼的途径免疫VaccineA；第2组和第3组在10日龄通过腿肌注射分别免疫Vaccine B和Vaccine C；第4组在10日龄接种PBS作为非免疫对照组；第5组作为空白对照。在17、24和27日龄时，对所有实验鸡进行翅下采血，收集血清，用禽传染性法氏囊病病毒抗体检测试剂盒检测血清IBDV抗体。28日龄时，对第1至第4组鸡通过滴鼻点眼的途径感染SHG19，剂量为8×10⁶viral RNA copies/只。5dp.i.和10dp.i.，每组随机剖检3只鸡，称量体重，观察心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺和法氏囊的病理变化，对法氏囊和脾脏称重，计算BBIX和脾体比。将剖检鸡的部分法氏囊浸泡在10％***溶液中，经HE染色后，观察病理变化。将法氏囊样品处理后提取RNA，反转录合成cDNA，运用IBDV荧光定量PCR方法检测法氏囊中的IBDV情况。

1.10 IBDV新型变异株与超强毒的血清交叉中和试验

为了了解IBDV新型变异株与超强毒(vvIBDV)之间是否存在抗原性差异，本研究用IBDV新型变异株代表毒株SHG19和vvIBDV代表毒株(Gx和HLJ0504)以及各自的单因子血清进行体外血清交叉中和试验。血清交叉中和试验在DT40细胞上进行。

IBDV的TCID50测定：三株IBDV(SHG19、Gx、HLJ0504)在DT40细胞上的TCID₅₀采用IBDV单抗介导的间接免疫荧光试验(IFA)进行检测。将10倍比稀释的IBDV接种DT40细胞，感作24h后，用IFA方法测定病毒效价。具体操作步骤如下：弃掉细胞培养液，加适量4％多聚甲醛于室温固定20min；弃掉多聚甲醛，用PBS将细胞洗3次，分别加入适量的IBDVVP2蛋白鼠源单抗(7D4，1:500稀释)，置于湿盒中37℃孵育1h；弃去单抗，用PBS将细胞洗3次，加入适量FITC标记的抗鼠荧光二抗(1:200稀释)，置于湿盒中37℃避光孵育1h；弃去荧光二抗，用PBS将细胞洗3次，最后在每孔中加入100μL的PBS，于倒置荧光显微镜下观察。有绿色荧光信号的即为IBDV感染阳性孔。

血清交叉中和试验：

首先测定SHG19单因子血清对三株IBDV(SHG19、Gx、HLJ0504)的中和效价。将SHG19单因子血清进行2倍倍比稀释；然后将200TCID50的SHG19、Gx、HLJ0504与稀释好的SHG19血清分别混匀并在37℃温箱中孵育1h；将100μL的病毒血清混合液加入培养在96孔培养板的DT40细胞中，在37℃细胞培养箱中继续培养24h，用IFA方法分别测定SHG19单因子血清对三株IBDV的中和效价。另外，用类似的方法，分别测定Gx单因子血清和HLJ0504单因子血清对三株IBDV(SHG19、Gx、HLJ0504)的的中和效价。

运用Archetti和Horsfall(1950)提出的方法(Archetti andHorsfall,1950)计算三种单因子血清对三株IBDV(SHG19、Gx、HLJ0504)的交叉抗原相关性(R值)。两株IBDV之间的R值计算方法：R2＝r1 x r2；rl＝病毒2的异源中和效价/病毒1的同源中和效价；r2＝病毒1的异源中和效价/病毒2的同源中和效价。同源R值定义为1，R值等于1或接近1表示两种测试病毒株之间的抗原性相似。R值与病毒之间抗原性的对应关系为：0-0.10，两种病毒存在血清型差异；0.11-0.70，两种病毒存在亚型差异；大于0.70，两种病毒抗原性之间没有差异或差异较小(Chen et al.,2018；Jackwood and Saif,1987)。

2.结果

2.1.SHG19的分离与基因克隆

成功从病料中分离得到IBDV毒株SHG19。SHG19的VP2代表区段和VP1代表区段GeneBank登录号分别为MH879092和MH879045；基因组A、B节段GeneBank登录号分别为MN393076和MN393077。测序结果显示，SHG19的A节段全长3260bp，包括5’非编码区84bp、VP5蛋白基因450bp、PP蛋白基因3039bp和3’非编码区91bp；SHG19的B节段全长2827bp，包括5’非编码区111bp、VP1蛋白基因2640bp和3’非编码区76bp。

2.2.SHG19的遗传演化分析

将SHG19毒株与27株不同类型的参考毒株以及81株本实验室分离鉴定的IBDV新型变异株进行了基因同源性和遗传演化分析。基于VP2基因代表区段的氨基酸序列进化树显示，血清I型IBDV明显分为四个分支，分别为经典株、超强毒、变异株和弱毒株。在变异株分支中，81株IBDV新型变异株与美国早期变异株处于完全不同的两个亚群；SHG19与81株IBDV新型变异株处于同一亚群(图1a)。SHG19与81株IBDV新型变异株与美国早期变异株进行氨基酸序列比对，发现与Variant E、E/Del、VariantA、9109、GLS等早期变异株的同源率分别为95.7％-97.3％、95.7％-97.3％、94.1％-95.7％、95.2％-96.8％、92.5％-94.6％，且在VP2高变区序列中，SHG19与81株IBDV新型变异株存在3个独特氨基酸位点217K、252I、299S。基于VP1基因代表区段氨基酸序列的进化树显示，IBDV明显分为两个分支，即超强毒株分支和非超强毒株分支；非超强毒株分支包括变异株、弱毒株和经典株，本研究鉴定的SHG19和其它IBDV新型变异株也属于非超强毒株分支，但形成了单独的亚群，且147D和508K和美国早期变异株也不相同(图1b)。上述数据说明，SHG19属于IBDV新型变异株，可以作为IBDV新型变异株的代表毒株。

为了进一步探索新型变异株的分子特征，我们克隆了SHG19株的全基因组。基于PP(图2a)和VP1(图2b)氨基酸序列的进化树显示，SHG19处于IBDV变异株分支。然而，在IBDV变异株中，SHG19也表现出独特的分子特征。与***IBDV变异株相比，SHG19在PP中具有10个不同的氨基酸位点，包括73I、77D、79S、187V、221K、252I、299S、451L、922Q和951L。对于VP5，SHG19与美国变异株仅具有96.4％-96.8％的同源性，并且具有八个不同的氨基酸位点，即7R、44P、78L、92R、104G、109R、116V和147E，美国变异株在VP5的N端有一个四肽(MLSL)缺失，SHG19无此缺失。另外，SHG19的VP1也存在一个独特的氨基酸位点(508K)(图2c)。这些特征性氨基酸的生物学意义有待进一步研究。

2.3 IBDV新型变异株的致病性

与对照组相比，在SHG19感染的25d内，第1组鸡没有死亡且未观察到明显临床症状，然而体重在25dp.i.时却显著减轻(P<0.01)(图3a)。通过剖检进一步评估SHG19导致的病理损伤，每天随机剖检第2组和第3组鸡各3只。第2组鸡在3-5dp.i.观察到法氏囊有炎性渗出、出血和黄染，其BBIX在3dp.i.低于0.7，到5dp.i.降到0.24(图3b)。另外，第2组SHG19感染鸡的脾体比明显高于对照组，尤其在4dp.i.差异显著(图3c)。病理学切片观察结果显示，第2组感染鸡的法氏囊出现了明显组织病理学损伤，从1dp.i.开始，淋巴细胞减少，滤泡中观察到巨噬细胞浸润，3dp.i.在滤泡周围发现纤维组织的增生，5dp.i.观察到滤泡严重萎缩；对照组未发现病变(图3d)。这些数据证明了，IBDV新型变异株对鸡具有严重的致病性。

在与SHG19感染组同居的鸡中，同居后25天通过ELISA检测到了IBDV特异性抗体(图4a)，这提示发生了IBDV新型变异株的水平传播。同居后25天的荧光定量RT-PCR结果显示，同居鸡法氏囊中IBDV的平均效价达到7.9×10⁷viral RNA copies/克组织(图4b)，这进一步证实了IBDV新型变异株的水平传播。同居后25天的剖检结果显示，同居鸡的法氏囊严重萎缩，平均BBIX为0.29(图4c)。此外，同居后25天，同居鸡的脾体比显着低于对照组(图4d)。这说明，IBDV新型变异株可以通过水平传播导致感染扩散。

2.4IBDV新型变异株对鸡的免疫抑制

为了评价IBDV变异株对鸡的免疫抑制影响，检测了SHG19感染SPF鸡后对禽流感疫苗免疫效果的影响。用SHG19感染16日龄蛋鸡，在4dp.i.时免疫二价灭活(H5+H7)禽流感疫苗。免疫后14d，收集血清检测血凝抑制(HI)抗体效价。与未感染组相比，SHG19感染组在接种禽流感疫苗后14d，H5(P<0.05)和H7(P<0.05)的HI效价明显受到抑制(图5)。

2.5IBDV超强毒疫苗对IBDV新型变异株的免疫保护评价结果

为了评估现有商品化疫苗对IBDV新型变异株的免疫保护效果，本研究检测了三个针对vvIBDV的疫苗(弱毒疫苗VaccineA、亚单位疫苗Vaccine B、多联疫苗Vaccine C)对IBDV新型变异株SHG19的攻毒保护情况。结果显示，三个vvIBDV疫苗免疫组在27日龄时均呈现IBDV血清抗体阳性(图6a)。在28日龄时，除作为空白对照的第5组外，对其它三个vvIBDV疫苗免疫组均进行IBDV新型变异株SHG19攻击。与空白对照组相比，三个免疫攻毒组在5dp.i.和10dp.i.时均呈现法氏囊严重损伤，表现为萎缩、黄染和质地坚硬；第4组(未免疫攻毒对照组)的法氏囊同免疫攻毒组相似也呈现严重萎缩和损伤(图6d)。BBIX测定结果也显示，三个免疫攻毒组的法氏囊是萎缩的，Vaccine A、Vaccine B、Vaccine C三个组在5dp.i时的BBIX值分别为0.453±0.188、0.266±0.078、0.380±0.043,在10dp.i.的BBIX值分别为0.606±0.114、0.235±0.079、0.293±0.063(图6b)。荧光定量RT-PCR结果也显示，病变的法氏囊中检测到了SHG19的存在。另外，脾体比结果显示，Vaccine C组在5dp.i.时脾脏肿胀(图6c)。组织病理学检测结果显示，在5dp.i.时，与对照组相比，三个免疫组的法氏囊淋巴细胞减少，巨噬细胞浸润，滤泡萎缩，***增生(图6e)。这说明，这三种vvIBDV疫苗免疫对IBDV新型变异株SHG19的攻毒保护效果不理想。

2.6 IBDV新型变异株与超强毒的血清交叉中和试验结果

通过体外血清交叉中和试验探索了IBDV新型变异株(SHG19)与超强毒(Gx和HLJ0504)之间的抗原相关性。研究结果显示，IBDV超强毒株Gx和HLJ0504之间的抗原相关性R值为1.05(表4)，这表明两者抗原性没有明显差异。然而，IBDV新型变异株SHG19与Gx、HLJ0504的R值分别为0.64和0.35(表4)，这说明SHG19与Gx、HLJ0504抗原性有明显差异。

疫苗的攻毒保护试验和血清交叉中和试验都显示，IBDV新型变异株与vvIBDV抗原性存在明显差异。本研究通过基因组比对，揭示了其可能的分子基础。与vvIBDV相比，SHG19在PP和VP1中都显示出明显的差异。在PP中，除了氨基酸残基253、284、299、330、451、541、981和1005外，图2c中列出的SHG19的其它17个特征氨基酸均与vvIBDV不同，这些差异可能与抗原变异有关。在VP1中，图2c中列出的15个特征性氨基酸中，SHG19有13个不同于vvIBDV，这可能与毒力差异有关。

表4 IBDV新型变异株与超强毒的血清交叉中和试验

血清/毒株	SHG19	Gx	HLJ0504
				SHG19	1.00
Gx	0.64	1.00
				HLJ0504	0.35	1.05	1.00

实施例2 IBDV新型变异株病毒样颗粒的制备

1.材料和方法

1.1病毒、质粒与菌种

IBDV新型变异株代表毒株SHG19(Fan etal.,2019)由实施例1分离和保存。pCold-I原核表达质粒为TaKaRa产品。大肠杆菌工程菌株DH5α和E.coli Transetta(DE3)为北京全式金生物技术有限公司产品。

1.2主要试剂

M-MLV反转录试剂盒为Invitrogen产品。RNAiso Plus、PrimerStar DNAPolymerase为TaKaRa产品。限制性内切酶KpnI和EcoRI、PrestainedProtein Ladder为TheromoFisher Scientific产品。凝胶回收试剂盒为Axygen产品。同源同组试剂盒为南京诺唯赞生物科技股份有限公司产品。Sepharose 6 Fast Flow层析柱为GE产品。硫酸铵为国药集团化学试剂有限公司产品。IBDV VP2蛋白单克隆抗体由本实验室制备和保存。IBDV标准阳性血清和IBDV标准抗原为哈尔滨国生生物科技有限公司产品。

1.3重组表达质粒的构建

选取IBDV新型变异株的代表毒株SHG19的VP2基因进行原核表达和VLP的制备。

1.3.1 SHG19株VP2表达盒的设计

为了利于SHG19株VP2基因的可溶性表达和正确组装，设计VP2基因表达盒。pVP2编码511个氨基酸，在病毒成熟组装的过程中，通过C端的自我剪切，pVP2变为成熟的VP2(编码440个氨基酸)。在pVP2的N端，有四个α螺旋，其中前两个螺旋有利于VP2正确构象的形成。所以本实施例表达的SHG19 VP2保留了C末端的两个α螺旋，全长为465个氨基酸(aa 2-466)(除了起始密码子)，命名为SHG19-VP2-466。在SHG19-VP2-466的N端，融合了HT28。HT28为一段特殊的含有6个His的标签，编码27个氨基酸(除了起始密码子)，可模拟IBDV VP3的C末端与VP2互作而利于VP2正确构象的形成。设计得到的VP2基因表达盒的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

1.3.2重组表达质粒的构建

1.3.2.1引物设计

根据SHG19株的基因序列(GenBank登录号：MN393076)和HT28标签序列设计引物(表5)，用于SHG19株的SHG19-VP2的扩增和HT28标签的融合。引物由吉林库美生物科技有限公司合成。

表5引物

注：字体加粗序列为同源臂序列；HT28序列用下划线突出显示；酶切位点KpnI(GGTACC)和EcoRI(GAATTC)用斜体表示。

1.3.2.2IBDV基因组提取与cDNA的合成

取SHG19毒株病毒液200μL，用RNAiso Plus(Takara)依据其产品说明书提取总RNA，再利用M-MLV反转录试剂盒(Invitrogen)按产品说明书将提取的RNA反转录为cDNA。

1.3.2.3目的片段的扩增

通过两步PCR获得目的片段。首先以1.3.2.2中的cDNA为模板，利用引物HT28-F2和SHG19-VP2-R进行第一步PCR。PCR反应体系见表6。反应程序为：95℃5min；95℃30s、56℃30s、72℃1min30s，35个循环；72℃10min。反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，使用凝胶回收试剂盒(AxyPrep)按说明书对目的片段进行回收。第二步PCR反应以第一步PCR产物为模板，利用引物HT28-F1和SHG19-VP2-R进行扩增。反应体系同表6；反应程序与第一步PCR反应程序相同。反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，使用凝胶回收试剂盒(AxyPrep)按说明书对目的片段进行回收。

表6 PCR反应体系

1.3.2.4表达质粒的构建与阳性克隆的鉴定

利用同源重组试剂盒将1.3.2.3中胶回收的目的片段与经KpnI和EcoRI线性化后的pCold I表达载体进行同源重组反应。反应体系见表7，反应条件为37℃30min。反应结束后取10μL同源重组反应产物转化DH5α大肠杆菌，转化后12小时挑取单克隆，运用菌液PCR筛选阳性克隆，并将阳性克隆进行测序鉴定。将经鉴定正确的重组表达质粒命名为pCo-HHT28-SHG19VP2-466。

表7同源重组反应体系

1.4重组工程菌的制备

将pCo-HHT28-SHG19VP2-466转化入E.coli Transetta(DE3)表达工程菌中，转化后12小时挑取单克隆菌落接种至氨苄抗性LB液体培养基中，于37℃、220rpm条件下培养12小时，收获菌液，对该菌用引物HT28-F1和SHG19-VP2-R按1.3.1方法进行RT-PCR鉴定。阳性菌即为大肠杆菌基因工程菌Transetta(DE3)-SHG19VP2株菌种，与50％甘油冻干保护剂等量混合，进行分装，1mL/管，于负80℃保存。

1.5重组蛋白的表达

将重组菌种按1％比例接种氨苄抗性的LB培养基，37℃、220rpm培养2h后用分光光度计测OD₆₀₀。当OD₆₀₀达到0.6时，将摇瓶从摇床中取出，置冰上快速冷却10min。在摇瓶中加入IPTG至终浓度为0.2mM，在22℃、180rpm条件下继续在摇床上培养20h。

诱导表达结束后，将菌液转入离心管，8000g、4℃离心10min，弃去培养基，用10倍菌重的PB缓冲液(pH 6.5)充分重悬菌体沉淀。随后将菌体运用高压细胞破碎仪(Homogenising Systems Ltd)进行高压破碎，破碎压力为120帕斯卡。将破碎后的菌液于8000g、20℃离心10min，弃沉淀，对上清样品进行Western-blot检测，所用抗体为抗IBDVVP2单克隆抗体。

1.6重组蛋白的纯化

1.6.1硫酸铵沉淀法粗纯目的蛋白

将蛋白溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，同时向蛋白溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液。继续搅拌5min后，将蛋白溶液转入离心管中，于1000g、25℃离心10分钟。离心结束后，弃去上清(上清要沥干以尽量除去硫酸铵)，用PB缓冲液(PH6.5)充分重悬沉淀。于1000g、25℃离心10分钟，以去除未能溶解的蛋白。离心结束后，用0.22μm滤器对上清进行过滤，滤液用于下一步纯化。

1.6.2分子筛法进一步纯化目的蛋白

平衡：使用PB溶液(PH6.5)平衡Sepharose 6 Fast Flow层析柱，流速2.5mL/min，平衡2个柱体积。上样：使用注射器将1.6.1中制备的蛋白样品注入10mL上样杯，切换***Buffer流路，将样品杯中的10mL蛋白样品以恒定流速(2.5mL/min)注入平衡好的Sepharose6 FastFlow层析柱。收集：当紫外检测器UV280信号高于20mAU时Frac950自动开始收集，每14mL收集一次，然后对收集到的样品进行SDS-PAGE检测。

1.7病毒样颗粒的鉴定

1.7.1电镜鉴定

将样品用醋酸双氧铀负染处理后用透射电镜(HITACHI H-7650)进行观察，以确定所表达的VP2样品是否形成IBDV病毒样颗粒(VLP)，命名为SHG19-VLP。

1.7.2琼脂扩散试验鉴定

运用琼脂扩散试验(简称琼扩)检测SHG19-VLP的特异性和琼扩效价。具体方法为：①常法制备琼脂扩散试验平板。②使用六角打孔器进行打孔，孔径为4mm，孔间距为3mm。挑出孔中琼脂后，将平皿底部微微加热，使孔底琼脂稍微融化而封底。③在中间孔加入20μL的IBDV阳性血清；将SHG19-VLP样品进行2倍比稀释，将22、23、24、25倍稀释的样品依次分别加入外周孔中；同时设立阴性对照(PBS)和抗原标准品阳性对照。④将平皿倒置，置湿盒中37℃孵育36h后，观察结果。

2.结果

2.1重组表达质粒的构建和重组工程菌株的制备

测序结果显示，重组表达质粒pCo-HHT28-SHG19VP2-466被成功构建，IBDV新型变异株SHG19的VP2-466基因的C端保留了两个α螺旋序列，N段融合了标签HT28，***的外源基因总长度1482bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码493个氨基酸，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示。重组大肠杆菌基因工程菌Transetta(DE3)-SHG19VP2株菌种RT-PCR检测阳性，共制备了100管(1ml/管)，于负80℃保存。

2.2重组蛋白SHG19-VP2的表达和纯化

将重组大肠杆菌基因工程菌Transetta(DE3)-SHG19VP2株进行诱导表达，Western-blot检测结果显示，重组SHG19-VP2蛋白被成功表达，大小为约55kDa(图7A)。SDS-PAGE检测结果显示，经饱和硫酸铵法-分子筛法串联纯化，重组SHG19-VP2蛋白获得了良好纯化效果(图7B)。

2.3病毒样颗粒SHG19-VLP的鉴定

负染电镜结果显示，重组蛋白高效形成了25nm左右的病毒样颗粒(SHG19-VLP)(图7C)。琼脂扩散试验结果显示，SHG19-VLP能与IBDV阳性血清特异反应，琼扩效价为4log2，免疫反应活性良好(图7D)。

实施例3 IBDV新型变异株亚单位疫苗(SHG19-VP2)免疫效果初步评估

1材料和方法

1.1主要试剂、耗材和仪器

胎牛血清为Ausbian产品；EDTA-胰酶消化液、青链霉素双抗为哈尔滨国生生物科技股份有限公司产品；DMEM、1640培养基为Sigma产品；细胞培养板为NEST产品；多功能酶标仪为PE产品。

1.2细胞和病毒

DF1细胞由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽免疫抑制病创新团队(以下简称本实验室)保存。IBDV新型变异株代表毒株SHG19由实施例1分离鉴定，IBDV超强毒代表毒株HLJ0504由本实验室分离鉴定。IBDV重组病毒rGtVarVP2(以弱毒株Gt为亲本骨架，表达新型变异株SHG19的主要保护性抗原蛋白VP2)，用于IBDV新型变异株中和抗体的检测；IBDV重组病毒rGtHLJVP2(以弱毒株Gt为亲本骨架，表达超强毒株HLJ0504的主要保护性抗原蛋白VP2)，用于IBDV超强毒中和抗体的检测；这两个毒株均由本实验室拯救和制备。

1.3试验动物

无特定病原体(Specific-pathogen-free，SPF)鸡购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所试验动物中心，饲养在该中心的负压隔离器内。

1.4亚单位疫苗的制备

用PBS将SHG19-VLP原液稀释至琼扩效价分别为3log2和1log2。再分别将两种抗原含量的SHG19-VLP分别以1:2的体积比与白油佐剂混合后充分乳化。

1.5对IBDV新型变异株的免疫保护效果评价

1.5.1免疫

将20只14日龄SPF鸡随机分为四组，每组5只鸡。第1组为空白对照组，第2组为不免疫攻毒对照组，第3、4组为免疫组。第1组和第2组肌肉注射200μL PBS；第3组和第4组分别肌肉注射200μL上述两种SHG19-VLP疫苗(抗原含量分别为3log2、1log2琼扩效价)。

1.5.2中和效价测定

免疫后第13天，采集所有鸡的血清进行中和效价的测定，分别检测针对IBDV新型变异株和IBDV超强毒抗原的中和抗体。

1.5.2.1针对IBDV新型变异株抗原的中和抗体检测

在DF1细胞上用rGtVarVP2毒株检测血清中针对IBDV新型变异株抗原的中和抗体效价。将血清样品置于56℃水浴锅中灭活30min后，用0.22μm的滤器进行过滤。随后用含有2％胎牛血清的DMEM对血清样品进行2倍比稀释(血清样品的检测从24稀释度开始)。取100μL稀释好的血清与100μL含有200TCID₅₀的rGtVarVP2进行充分混合，置于37℃培养箱中孵育1h。将饲养于96孔板中的DF1细胞的培养上请弃去，取100μL上述病毒血清混合液加入DF1细胞培养孔中，置于37℃培养箱中继续培养72小时。同时设置阴性对照和阳性对照。通过观测细胞病变测定血清样品中和效价。

1.5.2.2针对IBDV超强毒株的中和抗体检测

在DF1细胞上用rGtHLJVP2毒株检测血清中针对IBDV超强毒株抗原的中和抗体效价。

1.5.3攻毒保护试验

免疫后第14天，进行攻毒保护试验。用SHG19毒株对第2、3、4组的鸡以滴鼻点眼途径进行攻毒，攻毒剂量为10CID₅₀(50％chicken infection dose，鸡半数感染量)；第1组SPF鸡以相同方式接种200μL PBS。攻毒后逐天进行临床观察，统计发病情况。攻毒后第7天，对所有SPF鸡进行安乐死，并进行剖检。称量体重和法氏囊重量，计算囊体比(bursa/bodyweight ratio,B/B),囊体比＝(法氏囊重/体重)×1000。每组随机取3个法氏囊的部分组织浸泡于10％***溶液中，经HE染色后，进行病理观察。

1.6对IBDV超强毒的免疫保护效果评价

将15只14日龄SPF鸡随机分为3组，每组5只鸡。第1组为空白对照组，第2组为不免疫攻毒对照组，第3组为免疫组。第1组和第2组肌肉注射200μLPBS，第3组肌肉注射SHG19-VLP疫苗(半成品抗原含量为1log2琼扩效价)。免疫后第13天，采集所有鸡的血清按1.5.2方法进行中和效价测定。免疫后第14天，进行攻毒保护试验。攻毒用毒为IBDV超强毒株HLJ0504，攻毒途径为点眼滴鼻，攻毒剂量为10CLD₅₀(50％chicken lethal dose，鸡半数致死量)。第1组SPF鸡以相同方式接种200μLPBS。攻毒后逐天进行临床观察，统计死亡和发病情况。攻毒后第7天，对所有SPF鸡进行安乐死，并按照1.5.3方法进行剖检。

2.结果

2.1对IBDV新型变异株的免疫保护效果

SHG19-VLP疫苗免疫鸡后，鸡生长状态均正常。两个不同剂量(3log2和1log2琼扩效价)的SHG19-VLP疫苗均能刺激鸡产生中和抗体。在免疫后第13天，两个免疫剂量组针对IBDV新型变异株抗原的中和抗体效价分别为10.80±1.79log2和10.60±0.89log2(图8A)；针对IBDV超强毒抗原的中和抗体效价相对较低，分别为7.40±1.82log2和7.40±1.67log2(图8B)；未免疫组对两种IBDV的中和抗体效价值均低于4log2。随后的攻毒保护试验显示，在攻毒后第7天，攻毒对照组的法氏囊发黄、萎缩，B/B值显著低于空白对照组(图8C)；病理切片也显示法氏囊滤泡萎缩、间质增生，淋巴细胞显著减少(图8D)。两个免疫组攻毒后均未见任何临床症状，剖检可见法氏囊均正常，无任何病变(图8D)，B/B值和空白对照组差异不显著(图8C)。这表明，SHG19-VLP疫苗免疫后对IBDV新型变异株的攻击产生了100％(5/5)的免疫保护。

2.2对IBDV超强毒株的免疫保护效果

在2.1的实验数据中还显示，SHG19-VLP疫苗免疫鸡后，血清抗体对IBDV超强毒株HLJ0504也有一定的中和活性，本研究进一步测试了SHG19-VLP疫苗(1log2琼扩效价)对IBDV超强毒株HLJ0504的免疫保护效果。在该试验中，在免疫后第13天，免疫组既产生了针对IBDV新型变异株抗原的中和抗体(11.75±0.50log2)，也产生了针对IBDV超强毒HLJ0504抗原的中和抗体(8.75±0.96log2)(图9A)；未免疫组对两种IBDV的中和抗体效价值均低于4log2。基于IBDV超强毒株的攻毒保护试验结果显示，攻毒对照组鸡100％(5/5)发病；从攻毒后第3天开始精神沉郁、食欲不振，至攻毒后第7天，造成60％(3/5)死亡(图9B)；对攻毒后第7天耐过的2只鸡进行了剖检，可见法氏囊萎缩、发黄，滤泡萎缩、间质增生，淋巴细胞显著减少(图9C)。免疫组鸡攻毒后和空白对照组鸡一样，未见任何临床症状，法氏囊剖检均正常，无任何病变(图9C)。这表明，SHG19-VLP疫苗免疫后对IBDV超强毒的致死性攻击也产生了100％(5/5)的免疫保护。

序列表

<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)

<120> 鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株亚单位疫苗、其制备方法及应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1482

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

atgagctact atcaccatca ccaccatcac gattatgaca ttccaacaac cgagaatctg 60

tactttcagg gagctatggg aagcacaaac ctgcaagatc aaacccaaca gattgttccg 120

ttcatacgga gccttctgat gccaacaacc ggaccggcgt ccatcccgga cgacaccctg 180

gagaagcaca ctctcaggtc agagacctcg acctacaatt tgactgtggg ggacacaggg 240

tcagggctaa ttgtcttttt ccctggcttc cctggctcaa ttgtgggtgc tcactacata 300

ctgcagagcg atgggagcta caagttcgac cagatgctcc tgacggccca gaacctaccc 360

gccagctaca actattgcag gttagtgagt cggagtctca cagtaaggtc aagcacactc 420

cctggtggcg tttatgcact aaacggcacc ataaacgccg tgaccttcca agggagcctg 480

agtgaactga cagatgttag ctacaacggg ttgatgtctg caacagccaa catcaacgat 540

aaaattggga acgtcctagt aggggaaggg gtaaccgttc tcagcttacc cacatcatat 600

gatctcgggt atgtgaggct tggtgacccc atacctgccg tagggctcga cccaaaaatg 660

gtagcaacat gtgacagcag tgacaggccc agagtctaca ccataactgc agccgataat 720

taccaattct catcacagta caagacaggt ggggtaacaa tcacactgtt ctcagccaac 780

attgatgcca tcactagtct cagcgttggg ggggagctcg tgttcaaaac cagcatccaa 840

aaccttgtac tgggcgccac catctacctt ataggctttg atgggactgc ggtaatcacc 900

agagctgtag ctgcaaacaa tgggctgacg gccggcatcg acaacctcat gccattcaac 960

cttgttattc cgaccagcga gataacccag ccaatcacat ccatcaaatt ggagatagtg 1020

acctccaaaa gtgatggcca ggcaggggaa cagatgtcgt ggtcggcaag tgggagtcta 1080

gctgtgacga tccatggtgg caactatcca ggagccctcc gtcccgtcac gctagtggcc 1140

tacgaacgag tggcaacagg atctgtcgtt acggtcgccg gggtgagcaa cttcgagctg 1200

atcccaaatc ctgaactagc aaagaacctg gtcacagaat acggccgatt cgacccagga 1260

gccatgaact acacgaaact gatactgagt gagagggacc gtcttggtat caagaccgtc 1320

tggccgacaa gggagtacac cgactttcgc gagtacttca tggaggtggc cgacctcaac 1380

tctcccttga agattgcagg agcatttggc ttcaaagaca taattcgggc cctaaggagg 1440

atagctgtac cggtggtatc cacattgttc ccacctgcct ag 1482

<210> 2

<211> 493

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 2

Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr

1 5 10 15

Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Gly Ser Thr Asn Leu Gln

20 25 30

Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro Phe Ile Arg Ser Leu Leu Met Pro

35 40 45

Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro Asp Asp Thr Leu Glu Lys His Thr

50 55 60

Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Asn Leu Thr Val Gly Asp Thr Gly

65 70 75 80

Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Pro Gly Phe Pro Gly Ser Ile Val Gly

85 90 95

Ala His Tyr Ile Leu Gln Ser Asp Gly Ser Tyr Lys Phe Asp Gln Met

100 105 110

Leu Leu Thr Ala Gln Asn Leu Pro Ala Ser Tyr Asn Tyr Cys Arg Leu

115 120 125

Val Ser Arg Ser Leu Thr Val Arg Ser Ser Thr Leu Pro Gly Gly Val

130 135 140

Tyr Ala Leu Asn Gly Thr Ile Asn Ala Val Thr Phe Gln Gly Ser Leu

145 150 155 160

Ser Glu Leu Thr Asp Val Ser Tyr Asn Gly Leu Met Ser Ala Thr Ala

165 170 175

Asn Ile Asn Asp Lys Ile Gly Asn Val Leu Val Gly Glu Gly Val Thr

180 185 190

Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Asp Leu Gly Tyr Val Arg Leu Gly

195 200 205

Asp Pro Ile Pro Ala Val Gly Leu Asp Pro Lys Met Val Ala Thr Cys

210 215 220

Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile Thr Ala Ala Asp Asn

225 230 235 240

Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr Lys Thr Gly Gly Val Thr Ile Thr Leu

245 250 255

Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu Ser Val Gly Gly Glu

260 265 270

Leu Val Phe Lys Thr Ser Ile Gln Asn Leu Val Leu Gly Ala Thr Ile

275 280 285

Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly Thr Ala Val Ile Thr Arg Ala Val Ala

290 295 300

Ala Asn Asn Gly Leu Thr Ala Gly Ile Asp Asn Leu Met Pro Phe Asn

305 310 315 320

Leu Val Ile Pro Thr Ser Glu Ile Thr Gln Pro Ile Thr Ser Ile Lys

325 330 335

Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Asp Gly Gln Ala Gly Glu Gln Met

340 345 350

Ser Trp Ser Ala Ser Gly Ser Leu Ala Val Thr Ile His Gly Gly Asn

355 360 365

Tyr Pro Gly Ala Leu Arg Pro Val Thr Leu Val Ala Tyr Glu Arg Val

370 375 380

Ala Thr Gly Ser Val Val Thr Val Ala Gly Val Ser Asn Phe Glu Leu

385 390 395 400

Ile Pro Asn Pro Glu Leu Ala Lys Asn Leu Val Thr Glu Tyr Gly Arg

405 410 415

Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn Tyr Thr Lys Leu Ile Leu Ser Glu Arg

420 425 430

Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro Thr Arg Glu Tyr Thr Asp

435 440 445

Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu Val Ala Asp Leu Asn Ser Pro Leu Lys

450 455 460

Ile Ala Gly Ala Phe Gly Phe Lys Asp Ile Ile Arg Ala Leu Arg Arg

465 470 475 480

Ile Ala Val Pro Val Val Ser Thr Leu Phe Pro Pro Ala

485 490

Claims

1.一种鸡传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)新型变异株亚单位疫苗，其特征在于，所述的疫苗中含有经优化后的鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株VP2蛋白组成的病毒样颗粒，所述的经优化后的鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株VP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株VP2蛋白组成的病毒样颗粒是将编码所述的经优化后的鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株VP2蛋白的核苷酸序列***表达载体中，然后转化大肠杆菌，经过诱导表达、纯化后获得。

3.如权利要求1所述的亚单位疫苗，其特征在于，编码所述的经优化后的鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株VP2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.如权利要求1所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的表达载体为pCold I表达载体。

5.如权利要求1所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的大肠杆菌为E.coli Transetta(DE3)表达工程菌。

6.一种制备权利要求1-5任一项所述的亚单位疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)合成得到编码权利要求1中所述的经优化后的鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株VP2蛋白的核苷酸序列，并在所述的核苷酸序列的两端加上限制性内切酶酶切位点，得到目的片段；

(4)重组蛋白的表达

(5)重组蛋白的纯化

(6)疫苗的制备

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在编码权利要求1中所述的经优化后的鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株VP2蛋白的核苷酸序列的两端分别加上KpnI和EcoRI酶切位点。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，编码权利要求1中所述的经优化后的鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株VP2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

9.权利要求1-5任一项所述的亚单位疫苗在制备防治鸡传染性法氏囊病病毒药物中的用途。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的鸡传染性法氏囊病病毒包括IBDV新型变异株以及IBDV超强毒株。