CN101566634A

CN101566634A - 肌钙蛋白ⅰ血清快速检测试剂盒(胶体金法)

Info

Publication number: CN101566634A
Application number: CNA2008100364182A
Authority: CN
Inventors: 宣生良
Original assignee: SHANGHAI YIDIZHUN BIOLOGICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI YIDIZHUN BIOLOGICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2008-04-22
Filing date: 2008-04-22
Publication date: 2009-10-28

Abstract

本发明属于生物科技领域，本发明公开了一种肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒(胶体金法)制作及工艺，采用了金标法测定人血清样品中cTnI的量，心肌钙蛋白I(cTnI)的分子量为22.5KD，其连同肌钙蛋白T和肌钙蛋白C构成结构复合物，在心脏中的细胞间钙信号肌动蛋白－肌球蛋白相互作用的转化过程中起着重要作用，本试剂盒采用双抗夹心免疫法，当标本加入样品槽后，通过结合垫和金抗体结合，复合物沿膜流动和抗体在检测区域反应。如果标本中存在有可检出浓度或更浓的标志物，就会在检测区出现一条色带。如果没有就会保持无色。标本继续移动至控制区域，出现粉红－玫瑰红的色带，说明试验正常结果有效。本发明的有益效果是肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒，性能极其稳定，用户使用极其方便、能准确快速检测。

Description

肌钙蛋白Ⅰ血清快速检测试剂盒(胶体金法)

技术领域

本发明提供了一种心肌梗死快速检测的肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒及检测方法。

背景技术

心肌缺血性损伤，特别是急性心肌梗塞(AMI)是威胁人类生命的主要疾病之一，临床化学家和临床科学家一直努力寻找和探索特异性好、灵敏度高的血清指标。心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)具有高度的心肌特异性，当心肌细胞受损时，血液中的cTnI出现时间早，持续时间长，与心肌损伤程度及预后密切相关，因此，它可作为心肌损伤的一种特异性指标。

发明内容

本发明通过如下技术解决方案实现的：一种肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒，其特征在于：一种肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒，其特征在于：心肌钙蛋白I(cTnI)的分子量为22.5KD，其连同肌钙蛋白T和肌钙蛋白C构成结构复合物。在心脏中的细胞间钙信号肌动蛋白-肌球蛋白相互作用的转化过程中起着重要作用。人的cTnI与骨骼肌中的形式在结构上有所不同，它的氨基端上多了一个氨基酸残基。使得cTnI成为一个特异性的标志物。在心肌梗死(AMI)发生后，cTnI便迅速释放入血液循环中

1.cTnI标记用单克隆抗体的预处理

1.1 透析(纯化水，24小时)

1.2 离心去上清(4～10℃，10000转/分钟、5分钟)

1.3 BCA法则浓度(物料平衡)

1.4 PH的调节(0.1mol/LK₂CO₃量的确定)

1.5 最佳标记量的确定

1.6 分装(5000人份量/支)、-20度冻存

2. 试剂的配制

2.1 1％的柠檬酸三钠的配制

2.2 1％的氯金酸的配制

2.3 0.01％的氯金酸的配制

2.4 0.1ml/L K2CO3的配制

2.5 10％的氯化钠的配制

2.6 1％的叠氮钠的配制

2.7 10％的BSA的配制

2.8 1mol/l PBS的配制

2.9 0.05mol/l PBS的配制

2.10 胶体金复溶液的的配制

3. 胶体金的制备

3.1 量取0.01％的HAuCL4溶液

3.2 加热至沸腾

迅速加入1％柠檬酸三钠溶液，搅拌均匀

(比例：100ml 0.01％的HAuCL4溶液加1.6ml 1％柠檬酸三钠溶液)

3.3 继续加热10分钟

冷却至室温，用超纯水恢复至原体积

3.4 0.22μm微孔滤膜过滤除菌

3.5 送检、装瓶、贴标签

4. cTnI免疫金的制备和干燥

4.1 cTnI标记抗体的稀释

按照每生产5000人份4mm宽的cTnI试纸条需1支cTnI标记抗体计算，领取相应量的抗体，用0.05mol/l PBS稀释到0.5mg/ml。

4.2 生产前小试：

a取1ml胶体金

b调PH(0.1mol/L K₂CO₃的量，混匀5min)

c根据生产指令加入CTnIAb1，混匀10min

d加入100ul 10％BSA，混匀10min

e离心1000转/min，30min(要求环境温度4-10℃)

f30％复溶，浸泡聚酯膜0.8ml/条(0.6cm×30cm)

g温度20-30℃，相对湿度30-35％干燥5小时

h送质检部检验

4.3 cTnI抗体标记

1)标记小试质检质检合格，取胶体金，电磁搅拌

(以生产1000人份5mm宽的肌钙蛋白I胶体金试纸条约需50ml胶体金来计算。)

2)调PH(0.1mol/L K₂CO₃的量)，混匀5min

3)根据最适标记量加入CTnIAb1，混匀10min

4)加入100ul 10％BSA，混匀10min

5)离心1000转/min，30min，4-10℃

6)30％复溶，浸泡聚酯膜25.3ml/张(20cm×30cm)

7)温度20-30℃，相对湿度30-35％干燥5小时

8)抽一条0.6cm宽送质检部做膜金匹配检测

9)cTnI免疫金送中间品室暂存

5.cTnI包被板的制备

5.1包被抗体的稀释

羊抗鼠Ig0.05mol/LPBS稀释到1.2mg/ml工作浓度

cTnI捕获抗体用0.05mol/LPBS稀释到1.1mg/ml工作浓度

5.2包被前小试

1)各取20ul试包被1条20cm长的膜，线浓度1.0ul/cm

2)2℃-8℃过夜

3)贴膜

4)温度20-30℃、相对湿度30-35％干燥5小时

最后送质检部检验质检合格。

5.3包被生产

1)cTnI包被小试质检合格单

2)羊抗鼠IgG、cTnI捕获抗体工作浓度包被质控线和检测线，线浓度1.0ul/cm

3)2℃-8℃过夜

4)贴膜

5)温度20-30℃、相对湿度30-35％干燥5小时

6)抽1板送质检部作膜金匹配

7)密封后送中间品库暂存

本发明的有益效果是肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒，性能极其稳定，用户使用极其方便、能准确快速检测。

附图说明

制作肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒的工艺流程图

注：1.“☆”所代表的过程必须在净化车间内操作

2.“◆”所代表的过程必须在温度20-30度、湿度30-35度操作，另外cTnI包被极的制备以及cTnI免疫金的制备的干燥过程也必须在温度20-30度、湿度30-35度进行。

3

代表关键控制点

具体实施方式

肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒的配制操作如下：

心肌钙蛋白I(cTnI)的分子量为22.5KD，其连同肌钙蛋白T和肌钙蛋白C构成结构复合物。在心脏中的细胞间钙信号肌动蛋白-肌球蛋白相互作用的转化过程中起着重要作用。人的cTnI与骨骼肌中的形式在结构上有所不同，它的氨基端上多了一个氨基酸残基。使得cTnI成为一个特异性的标志物。在心肌梗死(AMI)发生后，cTnI便迅速释放入血液循环中。释放的模式和CK-MB相同(在AMI发生4-6个小时以后)。然而，CK-MB的水平在36-48小时后恢复正常，cTnI可以持续升高6-10天。在正常健康人体内，cTnI水平是非常低的，在骨骼肌受损的病人体内也检测不到cTnI。因此cTnI是诊断心肌梗死的一个特异性指标。

本试剂盒采用双抗夹心免疫法，当标本加入样品槽后，通过结合垫和金抗体结合，复合物沿膜流动和抗体在检测区域反应。如果标本中存在有可检出浓度或更浓的标志物，就会在检测区出现一条色带。如果没有就会保持无色。标本继续移动至控制区域，出现粉红-玫瑰红的色带，说明试验正常结果有效。

【产品名称】肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒(胶体金法)

【规格】25人份/盒

【适用范围】

本试剂盒是免疫层析基础上的一步法体外诊断试剂盒。用来对发生心肌梗死时人血清中的心肌钙蛋白I进行定性检测。

【检测原理】胶体金法

应用双抗体夹心法原理，以胶体金作为指示标记，交联抗肌钙蛋白I抗体，另一抗体为捕获抗体，与血液中的肌钙蛋白I结合并显色。测试时，样本向检测区及质控区移动，如果样品中含有肌钙蛋白I，它就会和试剂中的金标抗体组成抗原抗体复合物，再和检测区中的相对应的捕获抗体形成***的色带。如果样品中肌钙蛋白I水平低于最低检测限，检测区中就不会有色带出现。在任何情况下，质控区色带都应出现。质控区色带的出现表明反应***有效。

【主要组成成分】

测试卡片和一份干燥剂、一个滴管一起装于铝箔袋中，每个试剂盒有25个相同的铝箔袋。

【自备材料】

1、血清收集设备

2、计时装置

【样本要求】

1、必须在标准实验室环境下采集血清标本。

2、标本采集后最好马上就做检测。如不能在24小时内检测，血清标本应冷冻起来，在试验以前使标本回复到室温。

3、可以加0.1％的叠氮钠作为防腐剂，不会影响试验结果。

【质控方法】

1.控制线是内对照试剂和步骤控制。只要正确操作试剂有效控制线总会出现。

2.建议每次都使用对照品以确保试剂盒的有效性。本试剂盒内没有提供对照品，可外购。

【操作步骤】

1.使用前，将所有的试剂成分和病人样本置于室温。

2.把测试卡片从铝箔袋中取出。

3.用微量移液器吸取150μl样本。

4.移液器垂直，加标本2-3滴(100-150μl)至样品槽中。

5.15分钟读取显示结果。

【对试验结果的解释】

阳性：

15分钟后出现两条色带，说明结果阳性试验有效。只要在检测区域出现有色带即可以读取结果。

注：很低浓度的cTnI会在长于15分钟的时候出现两条带。

阴性：

如果在检测区域没有条带而控制区域有条带，说明结果阴性而试验有效。

无效试验：

如果在控制区域没有任何条带，说明试验无效，标本应用一个新的卡片重新测试。

【产品性能指标】

本试剂盒在cTnI≥1.5ng/ml时出现阳性结果。

【注意事项】

1.处理样品时，请戴一次性手套。

2.测试时，测试卡应水平放置，不要倾斜。

3.加样15分钟后显示的结果无诊断意义。

4.测试结束，请彻底清洗双手剩余标本和废弃物应用1∶25稀释的84消毒液浸泡30分钟以上才能丢弃。

5.一个吸管只能吸取一个样品，以免交叉污染。

6.若用微量滴管头滴加样本，应迅速一次性加入到样品槽中，避免断续加入。

7.本试剂结果仅供定性的辅助诊断，对实验结果解释需与临床症状相结合。

【贮存】2-8℃保存。

【有效期】12个月。

【医疗器械注册证书编号】

【产品标准编号】Q/YZ 021-2006

Claims

1.心肌钙蛋白I(cTnI)的分子量为22.5KD，其连同肌钙蛋白T和肌钙蛋白C构成结构复合物，在心脏中的细胞间钙信号肌动蛋白-肌球蛋白相互作用的转化过程中起着重要作用，本试剂盒采用双抗夹心免疫法，当标本加入样品槽后，通过结合垫和金抗体结合，复合物沿膜流动和抗体在检测区域反应。如果标本中存在有可检出浓度或更浓的标志物，就会在检测区出现一条色带。如果没有就会保持无色。标本继续移动至控制区域，出现粉红-玫瑰红的色带，说明试验正常结果有效。

2.根据权利要求1所述的肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒(胶体金法)，其特征在于：心肌钙蛋白I(cTnI)的分子量为22.5KD，其连同肌钙蛋白T和肌钙蛋白C构成结构复合物。

3.根据权利要求1所述的肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒(胶体金法)的配制，其特征在于：1％的柠檬酸三钠，1％的氯金酸，0.01％的氯金酸，0.1ml/LK2CO3，10％的氯化钠，1％的叠氮钠，10％的BSA，1mol/l PBS，0.05mol/lPBS，胶体金复溶液。

4.根据权利要求1所述的肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒(胶体金法)，包括如下工艺步骤：

第一步cTnI标记用单克隆抗体的预处理

1.1透析(纯化水，24小时)

1.2离心去上清(4~10℃，10000转/分钟、5分钟)

1.3BCA法则浓度(物料平衡)

1.4PH的调节(0.1mol/LK2CO3量的确定)

1.5最佳标记量的确定

1.6分装(5000人份量/支)、-20度冻存

第二步胶体金的制备

2.1量取0.01％的HAuCL4溶液(加热至沸腾)

2.2迅速加入1％柠檬酸三钠溶液，搅拌均匀

(比例：100ml 0.01％的HAuCL4溶液加1.6ml 1％柠檬酸三钠溶液)(继续加热10分钟)

2.3冷却至室温，用超纯水恢复至原体积

2.40.22μm微孔滤膜过滤除菌

2.5送检、装瓶、贴标签

第三步cTnI免疫金的制备和干燥

3.1cTnI标记抗体的稀释

3.2生产前小试：

取1ml胶体金

1)调PH(0.1mol/L K2CO3的量，混匀5min)

2)根据生产指令加入CTnIAb1，混匀10min

3)加入100ul 10％BSA，混匀10min

4)离心1000转/min，30min(要求环境温度4-10℃)

5)30％复溶，浸泡聚酯膜0.8ml/条(0.6cm×30cm)

6)温度20-30℃，相对湿度30-35％干燥5小时

7)送质检部检验

3.3cTnI抗体标记

1)标记小试质检质检合格

2)取胶体金，电磁搅拌

3)调PH(0.1mol/L K2CO3的量)，混匀5min

4)根据最适标记量加入CTnIAb1，混匀10min

5)加入100ul 10％BSA，混匀10min

6)离心1000转/min，30min，4-10℃

7)30％复溶，浸泡聚酯膜25.3ml/张(20cm×30cm)

8)温度20-30℃，相对湿度30-35％干燥5小时

9)抽一条0.6cm宽送质检部做膜金匹配检测

10)cTnI免疫金送中间品室暂存

第四步cTnI包被板的制备

4.1包被抗体的稀释