CN117607461A - 一种s100a8蛋白的检测方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种S100A8蛋白的检测方法及其应用。该检测方法包括如下步骤：特异性抗体的制备：以S100A8重组蛋白为免疫抗原，通过其进行动物免疫制备多克隆抗体和单克隆抗体；取样：取待测林麝血清样本；标准曲线的建立；检测：将标准品替换成待测林麝血清样本，重复上述标准曲线的建立中的操作步骤检测，并根据标准曲线计算得到上述待测血清样本中的S100A8蛋白的浓度。本发明提供的检测方法可用于检测S100A8蛋白，实现对林麝血清样品中S100A8蛋白的定量检测，最低检测灵敏度为15.625ng/mL，可用于林麝群体的炎症水平的监测以及治疗评估。

Description

一种S100A8蛋白的检测方法及其应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种S100A8蛋白的检测方法及其应用。
背景技术
S100A8属于S100家族的钙结合蛋白，S100A8由93个氨基酸残基组成。在先天免疫细胞中表达，特别是在中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞中。已被证实在炎症的发展中起决定性作用。
在炎症病变中早期渗透出的炎性细胞中，S100A8也有所表达，大量实验数据表明，炎症发展的过程中，髓样细胞产生的S100A8由于接触抗原从而发生正反馈效应，进而引起了更多的白细胞聚集效应。这些聚集于急性和慢性感染部位的髓样细胞参与炎症反应，而受损部位高浓度的聚集S100A8妨碍于组织的修复，使炎症进一步发生恶化。本研究人员前期应用实时荧光定量PCR对林麝肺炎组织中的S100A8进行检测，发现S100A8在林麝的肺炎组织中表达显著上调。所以，S100A8蛋白可能是潜在的林麝炎症的早期诊断生物标记物。
病原菌感染引起林麝的各种炎性疾病，严重影响人工养殖的发展，尤其是发生炎性疾病呈亚临床症状时。由于没有任何明显的临床表现，很难被发现，因而不能及时救治，导致病情加重，甚至死亡。而国内关于人工养殖林麝呼吸道的疾病研究虽已逐步开展，但主要是针对病原菌的研究；本研究人员前期也针对病原菌进行了快速检测研究工作，这些工作的开展是基于已经发现临床症状，甚至死亡以后才检测出来的病原菌。对于没有临床症状的动物而言，效果不佳。
炎症标记物的检测更趋向于炎症发生的早期反应，是一种早期诊断的指标。在动物中，关于炎性标记物仅在伴侣动物中有检测炎症标志物和治疗炎性疾病的方法。而林麝几乎没有报道。由于S100A8蛋白可能作为一种林麝炎症的早期诊断生物标记物，对于患有炎性疾病的林麝中S100A8蛋白进行检测是非常重要的。
目前，对于林麝中S100A8蛋白的检测方法使用的是常规对于S100A8蛋白的检测方法，即采用实时荧光定量PCR对林麝炎性组织中S100A8蛋白进行检测。利用这种检测方法虽然可以用于患有炎性疾病的林麝中S100A8蛋白的检测，但是现有的检测方法的灵敏度较低，不适用于林麝群体的S100A8蛋白的检测。
因此，迫切需要开发一种高灵敏度的S100A8蛋白的检测方法，适用于林麝群体的S100A8蛋白的检测方法，可用于林麝群体的炎症水平的监测以及治疗评估。
发明内容
为解决现有技术中检测方法的灵敏度较低，不适用于林麝群体的S100A8蛋白的检测的问题，为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种S100A8蛋白的检测方法，包括如下步骤：
特异性抗体的制备：以S100A8重组蛋白为免疫抗原，通过其进行动物免疫制备多克隆抗体和单克隆抗体；
取样：取待测林麝血清样本；
标准曲线的建立：以单克隆抗体作为包被抗体，以多克隆抗体作为检测抗体，林麝S100A8重组蛋白作为标准品，建立标准曲线；
检测：将标准品替换成待测林麝血清样本，重复上述标准曲线的建立中的操作步骤检测，并根据标准曲线计算得到上述待测血清样本中的S100A8蛋白的浓度。。
优选地，所述单克隆抗体为鼠抗麝S100A8单克隆抗体；多克隆抗体为兔抗麝S100A8多克隆抗体。
优选地，所述鼠抗麝S100A8单克隆抗体包括1D12F5、2B31A6、6F94A5和4F83D2中的任意一种；所述兔抗麝S100A8多克隆抗体包括兔G2395和兔G2396抗体中的任意一种。
优选地，以鼠抗1D12F5单克隆抗体作为包被抗体，兔抗G2395多克隆抗体作为检测抗体，以林麝S100A8重组蛋白作为标准品，采用酶标仪测450nm处吸光值，以吸光值为横坐标，样本浓度为纵坐标建立标准曲线；
所述标准曲线为：y＝(4.68366212+68.9807145x)/(1-0.5975346x+0.10992796x2)；其中，y为标准品浓度，x为吸光值。。
优选地，所述S100A8重组蛋白的制备包括如下步骤：获取麝源S100A8基因序列，设计上游引物和下游引物，以大肠杆菌PET-B2M为载体，构建麝源S100A8-PET-B2M原核表达载体，将其转化至大肠杆菌菌株Rosetta后，加入诱导剂在LB培养基中培养，将菌液离心，收集沉淀，纯化后即得S100A8重组蛋白。
优选地，所述S100A8基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述包被缓冲液为pH 7.0～7.3的0.01mol/L PBS溶液；所述封闭液的制备方法为；称取脱脂牛奶，溶于PBS溶液中，取195～205μL/孔为封闭液；所述终止液的制备方法为：取浓硫酸加入至纯水中配制成浓度为2～4％即得。
本发明还提供了适用于所述的S100A8蛋白的检测方法的检测试纸。
优选地，所述检测试纸为包括包被有所述的鼠抗麝S100A8单克隆抗体1D12F5的胶体金试纸条。
优选地，所述胶体金试纸条包括硝酸纤维素膜、吸水纸、金标垫、样品垫；
所述硝酸纤维素膜上设有检测带和质控带；以所述鼠抗1D12F5单克隆抗体作为检测带，羊抗兔IgG抗体作为质控带；
所述金标垫经兔抗G2395多克隆抗体标记胶体金制成的胶体金抗体制备而成；
所述胶体金试纸条的组装步骤如下：将吸水纸压于硝酸纤维膜一端上表面，金标垫压于硝酸纤维膜另一端上表面，样品垫边缘附着在金标垫上表面，密封。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种S100A8蛋白的检测方法及其应用。本发明所建立的双抗体夹心ELISA检测方法可用于检测林麝S100A8蛋白，实现对林麝血清样品中S100A8蛋白的定量检测，最低检测灵敏度为15.625ng/mL。该检测方法是一种适用于林麝群体的S100A8蛋白的检测方法，可用于林麝群体的炎症水平的监测以及治疗评估。
本发明利用分子生物学和免疫学技术制备林麝S100A8重组蛋白，并通过制备相应的高特异性抗体，建立了具有灵敏、特异、准确、方便操作的林麝S100A8的ELISA检测方法。本发明所建立的S100A8蛋白的检测方法是一种双抗体夹心ELISA检测方法，可为制定合理的预防措施提供理论依据和防控林麝疾病提供帮助和指导，为濒危动物的保护和利用提供技术支撑。动物血清样品中能够检测到S100A8蛋白，其含量在15.625-1000ng/mL之间，正常样本中该蛋白浓度较低。表明本发明所提供的S100A8蛋白的检测方法能够实现对林麝血清样品中S100A8蛋白的定量检测。
附图说明
图1为本发明中纯化后表达蛋白的SDS-PAGE结果；
图2为本发明中纯化后的兔多抗电泳鉴定，其中，1为兔G2395纯化抗体5倍稀释；2为兔G2396纯化抗体4倍稀释；
图3为本发明中WB检测结果，其中，1为重组蛋白50ng，免前抗体2μg/mL孵育；2为重组蛋白50ng，抗体G23952μg/mL孵育；3为重组蛋白50ng，抗体G23962μg/mL孵育；
图4为本发明中免疫小鼠的尾血抗体效价结果，其中，A为免疫小鼠的尾血抗体效价结果(数据表格)；A为免疫小鼠的尾血抗体效价结果(折线图)；
图5为本发明中株单抗纯度的SDS-PAGE分析结果；
图6为本发明中夹心ELISA法测定S100A8的标准曲线及灵敏度；
图7为本发明制备试纸条血清样品检测结果判定，其中，A为阳性结果，B为阴性结果，C为无效结果，D为无效结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面实施例所用到的试剂及材料如下所示：
Protein marker购自Fermentas；亲和层析柱料购自汇研生物；酶标二抗购自Jackson公司；TMB购自索莱宝；Hyclone DMEM购自Thermo；HAT和HT购自SIGMA公司；胎牛血清购自四季青；快速蛋白纯化***(AKTAPurifierUPC 100)购自GE Healthcare公司。
实施例1
一种林麝S100A8蛋白的检测方法的建立：
1、林麝免疫抗原的制备
通过对前期林麝转录组测序获得的S100A8的基因序列，S100A8基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
ATGCTGACGGATCTGGAGAGTGCCATTAACTCCCTGATCGATGTCTACCACAAGTACTCCCTGCTGAGAGGGAATTACCATGCCGTCTATAGGGATGACTTGAAGAAATTGTTAGAGACAGAGTGTCCTAAGTATATGAAGAAAAAGGATGCGGACACTTGGTTCAAAGAGTTGGACATCAATCAGGACGGTGGAATTAACTTCGAGGAGTTCCTTGTGCTGGTGATAAAGGTGGGCCTGGCAGCCCATGAAGACATTCACAAAGAATAG。
根据上述获得的基因序列设计一对引物(包括上游引物和下游引物)及酶切位点，其中：上游引物为：5′-TCCACTGGGTTCTCGGACTATGCTGACCG ATCTGGAAAGCGCAATTAATAGCCTG-3′(如SEQ ID NO.2所示)，下游引物为：5′-GTGGTGCTCGAGTGCGGCCTTATTATTCTTTATGAATATCTTCATGTGCTGCCAG-3′(如SEQ ID NO.3所示)；NotI和CpoI为酶切位点。
以大肠杆菌PET-B2M为载体，上述引物和酶切位点，将目的基因(林麝的S100A8基因)连接到PET-B2M载体上，构建麝源S100A8-PET-B2M原核表达载体，将麝源S100A8-PET-B2M原核表达载体转化至大肠杆菌Rosetta菌株，挑取单菌落至LB培养基，放大体系为100mL菌液接种于2000mL LB液体培养基中，37℃扩大培养至OD600约0.6，降低培养温度到30℃，以0.5mM的诱导剂浓度继续培养4h，在LB培养基中培养，离心收集上清和沉淀进行SDS-PAGE检测，采用SDS-PAGE电泳进行检测，检测结果见图1(破菌检测图)。由图1可知，在27kDa处出现一条清晰条带，表明S100A8蛋白主要表达在沉淀部分，结果与预期位置相符。其中，诱导剂为IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，Isopropylβ-D-Thiogalactoside)，购自北京索莱宝。
LB培养基(包括LB液体培养基)的配方为如下：10g胰蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠，于适量蒸馏水中搅拌溶解，蒸馏水定容至1000mL。用5mol/LNaOH(约0.2mL)调pH至7.2，121℃灭菌30min。
将上述离心得到的沉淀部分通过Ni柱亲和层析方法纯化蛋白，准备Ni-NTA柱，以1mL/min的流速上样蛋白溶液，以6M pH8.0的盐酸胍缓冲液洗柱至流出液不含蛋白(G250检测液不变色)，分别以含20mM、60mM、200mM和500mM咪唑的洗脱液洗脱，分段收集洗脱液至G250检测液不变色，以3倍柱体积去离子水洗涤柱料，以20％乙醇封柱，4℃对收集的洗脱液超滤浓缩后进行SDS-PAGE电泳检测，将跑胶结果进行灰度分析，测定S100A8重组蛋白的纯度。其中，Ni柱采购InvitrogenTM的Ni-NTA Agarose，产品货号R90101。
根据SDS-PAGE的检测结果，测定得到的S100A8重组蛋白的纯度达到85％以上，可用于后续实验。
S100A8重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示：
mLTDLESAINSLIDVYHKYSLLRGNYHAVYRDDLKKLLETECPKYMKKKDADTWFKELDINQDGGINFEEFLVLVIKVGLAAHEDIHKE。
2、抗体的制备
(1)兔抗多克隆抗体制备
以上述纯化的S100A8重组蛋白为免疫原，与弗氏完全佐剂1:1混合，乳化完成后分别于2只白兔颈背部皮下多点注射，蛋白免疫量为每只白兔0.5mg蛋白。之后，于初次免疫后第14天、28天和42天用弗氏不完全佐剂乳化等量蛋白进行免疫。采用间接ELISA检测抗体效价，结果见图2。其中，弗氏完全佐剂：sigma，F5881-10mL。
间接ELISA检测抗体效价的步骤如下：
a.)抗原包被：用包被液稀释抗原(S100A8重组蛋白)到2μg/mL，100μL/孔加入96孔酶标反应板中，4℃过夜(≥12h)包被。其中，包被液的组成成分为：Na2CO31.6g，NaHCO32.93g，ddH2O定容至1L，pH 9.6。b)洗涤：次日弃掉孔内的液体，洗涤液洗3次。其中，洗涤液的组成成分为：取200mL25*PBS溶液，2.5mL吐温20，加纯水稀释至5L。c)封闭：加200μL/孔封闭液，37℃温育2h。其中，封闭液的配制方法为：称取5g脱脂牛奶，溶于100mL1×PBS溶液中作为封闭液。d)洗涤：用洗涤液洗3次。e)加待测样品(一抗)：加入抗血清，取血4℃4000rmp离心10min取上清，用稀释液将血清按1:2000，1:4000，1:8000，1:16000，1:32000，1:64000，1:128000.进行倍比稀释(空白血清同比稀释做阴性对照)，每孔100μL，37℃孵育1h。其中，抗血清指的是经兔多克隆抗体：兔G2395和兔G2396抗体免疫后的血清。f)洗涤：用洗涤液洗3次。g)加酶标抗抗体：加入HRP(辣根过氧化物酶)标记IgG二抗，100μl/孔，37℃孵育40min。(羊抗小鼠-HRP 1：5000-1：10000，羊抗兔-HRP 1：5000-1：10000)。h)洗涤：用洗涤液洗5次后拍干。l显色：加新鲜配制的底物溶液100μL/孔，37℃遮光放置15min。其中，底物溶液为：TMB，购自英创，货号为：S-004。m终止反应、比色：加50μL/孔终止液。颜色变黄；用酶标仪测定450nm处各孔的吸光值。其中，终止液的配制方法为：用移液管取28mL浓硫酸缓慢加入到900mL纯水中，然后定容至1L，浓度3％。
由图2可知，在50kDa和25kDa处条带明亮，分别为IgG的重链和轻链。兔G2395和兔G2396抗体纯化浓度为10mg/mL、8mg/mL，纯度为90％。
间接ELISA检测抗S100A8的多克隆抗体的血清效价均高达1:50k，且经Westernblot鉴定发现两种抗体(兔G2395和兔G2396抗体)均具有抗原特异性。
Westernblot鉴定的步骤如下：
1)聚丙烯酰胺凝胶的制备：a.)配制浓度为12％的分离胶溶液(5mL)：依次加入去离子水2.6mL、30％丙烯酰胺1.0mL、PH8.8的1.5M Tris-HCl 1.3mL、10％过硫酸铵50μL、10％SDS 50μL、TEMED 4μL。在加入TEMED后，分离胶马上开始聚合，立即快速混匀。b)迅速在两玻璃板的间隙中加入分离胶溶液，留出灌注浓缩胶所需空间.。c)分离胶聚合完全后(25℃约30min)，排去凝胶上的液体，再用滤纸的边缘吸净残留液体。d)配置5％浓缩胶(2mL):依次加入去离子水1.4mL、30％丙烯酰胺0.33mL、PH6.8的1.5M Tris-HCl 0.25mL、10％过硫酸铵20μL、10％SDS20μL、TEMED 2μL。e)快速在已聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中***干净的梳子，小心避免混入气泡。f)浓缩胶聚合完全后(25℃约30min)，小心移出梳子，向电泳槽内加入蛋白质电泳缓冲液。
2)电泳：a)用移液枪慢慢将样品混合物加至样品槽中，预染Marker一般加10μL。b)打开电源，采用80V电泳30min，换电压至120V电泳直至溴酚蓝上样缓冲液在凝胶中迁移至凝胶底部。
3)湿转转膜：a)取胶并浸入转膜buffer中。b)将PVDF膜(6％-12％的胶膜是0.45um，15％的胶是0.2μm)浸泡于甲醇1min后用滤纸吸干后再转入转膜buffer中，将滤纸也浸入转膜buffer中。其中，PVDF膜和滤纸均剪成与胶相同大小，5.5cm*8.5cm。c)制作转膜三明治：(负极黑面)转印滤纸3张+凝胶+PVDF膜+转印滤纸3张(正极白面)，每铺一层都要赶尽气泡。d)将转膜三明治放入转膜槽中，黑面对黑面，白面对红面，恒流200mA 60min(12％的胶是200mA 60min，15％的胶是100mA45min,6％的胶是360mA 120min)。
4)封闭：a)将膜取出，TBS洗1次，每次水平摇床上震荡5min。b)将膜取出，浸没于封闭液中25℃，1h或4℃过夜。其中，封闭液为500mL的1*TBS+5g酪蛋白配制。
5)结合抗体：a)将膜取出，TBST洗1次，每次水平摇床上震荡5min。b)将膜取出，浸泡于用稀释液稀释的一抗稀释液中，25℃，2h或4℃过夜。一般抗血清稀释1：2000抗体稀释至1-10μg/mL。稀释液为500mL的1*TBS+2.5g的酪蛋白+250μL吐温。c)将膜取出，TBST洗5次，每次水平摇床上震荡5min。d)将膜取出，浸泡于用稀释液稀释的二抗中，25℃，1h。羊抗兔-HRP 1:5000。
6)ECL曝光：a)将A、B发光液各500μl/膜稀释混合，将膜至于保鲜膜上AB混合液均匀滴至膜上，盖上保鲜膜，避光反应1min。b)将膜放在滤纸上吸干液体，无液体流出即可，膜不可干透，转移至洁净保鲜膜中包好，保持正面平整，固定于暗盒中。c)将暗盒至于暗室中，取出胶片迅速至于暗盒内膜上，关闭暗盒，根据所见荧光强度曝光。一般曝光时间为1min，若条带较弱可选择压片过夜。d)打开暗盒，取出胶片立即完全侵入显影液中1min。e)取出胶片，去离子水漂洗后侵入至定影液中1min。f)取出胶片，去离子水漂洗后晾干，标定Marker，分析实验结果。
(2)鼠抗单克隆抗体制备
将S100A8重组蛋白和弗氏完全佐剂按1:1的比例混合，用无菌磁性转子乳化。免疫量约为100μg/只，分别背部皮下注射免疫6只6周龄的雌性BALB/c小鼠，每只小鼠免疫体积为500μL。于初次免疫后14天、28天和42天，将S100A8重组蛋白和弗氏不完全佐剂按1:1的比例混合乳化，免疫剂量仍约为100μg/只，进行免疫。
利用间接ELISA检测上述S100A8重组蛋白4次常规免疫后，6只免疫小鼠尾血的抗体效价，间接ELISA检测方法同上兔抗多克隆抗体的检测。其中，未经S100A8重组蛋白免疫的小鼠尾血为阴性对照，即对应图4中的“空白血”。依据P/N≥2.1的最高值定为小鼠免疫的血清效价，结果见图4。由图4可知，与阴性小鼠相比，6只小鼠的免疫效果均较好，最高效价为1:128000。
随后取血清效价最高的两只小鼠，进行脾脏免疫后细胞融合，间接ELISA检测细胞融合之后的细胞培养上清，选择效价及亲和力较高的细胞株进行亚克隆，间接ELISA检测一亚克隆的细胞培养上清，选择效价及亲和力较高的细胞株进行第二次亚克隆，并收集上清进行WB检测，采用间接ELISA检测二亚克隆的细胞培养上清，对全阳的细胞株进行扩大培养，将定株的细胞株进行传代扩大，收集上清，利用小鼠抗体亚型检测试剂盒对杂交瘤细胞制备的腹水抗体进行亚型鉴定。其中，小鼠抗体亚型检测试剂盒为福因德，FRD90100P8Rd，8*15mL。
其中，细胞融合的操作步骤为：
1)将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按5:1的比例，加至50mL尖底离心管中，1000rmin-1水平离心10min。一般每只免疫小鼠能得到1-2×108个脾细胞，因此通常可以不计算脾细胞的数量，取1×107个骨髓瘤细胞SP2/0与所有脾细胞进行融合。2)弃上清，用无菌滤纸吸去残余培养基，轻轻敲击离心管管底，使细胞沉淀松动。3)将离心管置于37℃水浴中，在1min内缓慢加入1mL 50％PEG1450，边加边轻柔的搅拌，加完后继续轻轻搅拌30s，静置1min。其中，PEG1450提前预热至37℃。4)缓慢加入10mL 37℃预热的RPMI-1640基础培养基。5)1000r/min离心5min，弃上清，37℃放置6min。6)用含有饲养层细胞的HAT培养基重悬细胞沉淀，均匀滴加至5块96孔细胞培养板中，约200μL/孔，置于细胞培养箱中培养。7)12d后观察细胞的生长情况，待细胞集落长至视野1/3-1/2时，可对杂交瘤细胞孔进行半换液，换液3次后，可对细胞上清液进行抗体检测。
亚型鉴定的具体步骤如下：
1)抗原的包被：包被液稀释抗原至浓度2μg/mL，100μL/孔加入酶标板中，4℃过夜包被。2)封闭：次日，将酶标板内的液体弃掉，用洗板机洗板2次，拍干孔内残留液体后，加入封闭液进行封闭，50μL/孔。3)一抗的孵育：加完封闭液，每个检测样品加6个孔，并设置空白、阴性和阳性对照，50μL/孔，置于37℃温箱内进行孵育，孵育时间为40min。4)二抗的孵育：一抗孵育后将96孔酶标板内液体弃掉，置于洗板机上洗板6次，将孔内残留液体拍干。在每个检测样品的6个孔内分别加入1：3000封闭液稀释的6种酶标二抗，100μL/孔，于37℃温箱孵育30min。5)三抗的孵育：二抗孵育后将酶标板内液体弃掉，置于洗板机上洗板6次，将孔内残留液体拍干。山羊抗小鼠IgG二抗以封闭液1：4000稀释后，100μL/孔加入酶标板中，于37℃温箱孵育15min。6)显色与读数：显色终止并读数分析。
经两轮亚克隆培养和筛选，共筛选出阳性细胞株30株左右，细胞培养上清经亲和力检测共选5株细胞安排亚克隆，5株细胞经亚克隆后共定株4株，分别为1D12F5、2B31A6、6F94A5和4F83D2，经亚型鉴定均为单一亚型，分别为IgG2b和IgG1，选取2株不同表位的细胞制备腹水。
最后收集杂交瘤细细胞，注射小鼠制备腹水。使用ProteinG柱腹水纯化，SDS鉴定，间接ELISA法测定单抗效应浓度和灵敏度，蛋白免疫印迹WB(见图3)，验证抗体特异性。其中，杂交瘤细细胞的株号为：1D12F5和2B31A6
其中，腹水纯化实验步骤：
①层析柱预处理：10倍柱床体积的去离子水冲洗4遍，流速1mL/min 10倍柱体积的0.02M PB+0.3MNaCl冲洗4遍，流速1mL/min。②样品上样：8mL抗血清/腹水，用0.02M PB稀释后，0.22um滤器过滤后上柱，调整流速为6s/滴。③洗杂：0.02M PB冲洗至检测(G250不变蓝)无蛋白流出为止，流速2s/滴。④抗体洗脱：0.1MPH＝3.0甘氨酸以4s/滴过柱洗脱，收集洗脱物并用G250检测洗脱产物至不变蓝为止。⑤PH值调节：饱和碳酸钠调节洗脱产物pH至中性。⑥超滤浓缩：10kDa超滤管，超滤浓缩至1-3mL左右。⑦透析：5L,0.01MPH＝7.4PBS溶液透析过夜，第二天换液1次后再透析5h左右后跑SDS胶并测定抗体浓度后装入标记好EP管，可暂存于4℃备用或直接保存于-20℃。⑧层析柱洗涤与贮存：去离子水冲洗层析柱，5倍柱床体积20％乙醇冲洗层析柱后，4℃封存。
SDS鉴定实验步骤：
①凝胶板的准备：将洗洁精用温水稀释后，用它浸透海绵擦洗二块玻璃板，然后用自来水洗净，再用酒精将板擦干。将二块玻璃板叠放整齐，用夹子两边夹好，下沿两边角可用凡士林封住缝隙，将这二块玻璃板固定在底座上。②配制浓度为12％的分离胶溶液(5mL)：依次加入去离子水2.6mL、30％丙烯酰胺1.0mL、PH8.8的1.5M Tris-HCl 1.3mL、10％过硫酸铵50μL、10％SDS 50μL、TEMED 4μL。其中，加入TEMED后，分离胶马上开始聚合，立即快速混匀。迅速在两玻璃板的间隙中加入分离胶溶液，留出灌注浓缩胶所需空间.3分离胶聚合完全后，排去凝胶上的液体，再用滤纸的边缘吸净残留液体。配置5％浓缩胶2mL；依次加入去离子水1.4mL、30％丙烯酰胺0.33mL、PH6.8的1.5MTris-HCl 0.25mL、10％过硫酸铵20μL、10％SDS20μL、TEMED 2μL5快速在已聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中***干净的梳子。浓缩胶聚合完全后，小心移出梳子，向电泳槽内加入蛋白质电泳缓冲液。③电泳：将制备好的胶板***垂直电泳槽，电泳液浸没电丝，向加样孔中点样，其中1孔为预染Protein Marker，电泳时浓缩胶电压为80V，待指示带刚迁移至分离胶则调整电压至120V，待溴酚蓝指示带迁移至距离胶板底部约1cm时，停止电泳。④染色：电泳结束后，关闭电源，取出玻璃板，在长短两块玻璃板下角空隙内，用刀轻轻撬动，即将胶面和一块玻璃板分开，然后轻轻将胶片托起，放入打培养皿中染色，使用0.25％考马斯亮蓝染色3小时左右。⑤脱色：将染色液倒去。染色的凝胶用水漂洗数遍，沥干水后置于染色皿中，再加入100mL脱色液，加盖，脱色至染色的凝胶经脱色后能清晰显示出蛋白条带止。
间接ELISA法：实验步骤见上。
蛋白免疫印迹Westernblot:实验步骤见上。鼠抗单克隆抗体委托武汉金开瑞生物工程有限公司制备。
间接ELISA法测得纯化后1D12F5和2B31A6两株单抗的浓度分别为1.2mg/mL和3.5mg/mL，抗体效价均为3.906ng/mL。经过SDS-PAGE分析结果如图5显示，条带相对分子质量分别位于25kD和50kD附近，与抗体轻重链大小基本一致，可用于后续实验。
(3)生物素标记抗体的制备
1)用1*CB将待标记抗体(鼠抗(1D12F5和2B31A6)，兔抗(G2395和G2396))稀释至1mg/mL，取350μl于1.5mLEP管中备用，将生物素按照10mg/mL的浓度溶于二甲亚砜(DMSO)。其中，生物素为B2643-10mg，sigma。2)按照抗体质量：生物素质量＝10:1的比例，将生物素加入抗体备用管中，然后37℃摇床反应2h，得到摇床反应好的抗体生物素。3)同时用无菌1×PBS溶液清洗标记5mL层析柱子，清洗2.5h，保持柱料不能干，当最后一滴流下来后，将摇床反应好的抗体生物素加入层析柱过柱，然后加1mL1×PBS溶液将抗体洗脱下来，并用EP管接住流下的标记物(指的是标记后的兔抗和鼠抗)，第一滴不接，在接到约500μl体积后用G250检测是否变蓝，若依然很蓝则继续接洗脱液，至多接到1mL左右，若不是很蓝则不用再接洗脱物。4)标记物接完后，用1×PBS溶液洗柱，保持柱料不干，洗柱1h。5)洗柱后，用20％的乙醇洗柱一次后，用20％的乙醇封柱放于4℃保存。6)加入一定体积甘油0％-50％，-20℃保存。
3、检测重组S100A8蛋白的双抗体夹心ELISA方法的建立
3.1抗体配对试验
将纯化的单克隆抗体(小鼠单抗以定株细胞株命名，包括(鼠抗(1D12F5和2B31A6)和多克隆抗体(兔G2395和兔G2396抗体)分别用包被缓冲液(pH7.2的0.01mol/LPBS溶液)稀释，加入96孔酶标板，100μL/孔，4℃包被过夜(≥12h)；PBST(PBST(1L)：称取PBS粉末10g，溶于1L ddH2O，玻璃棒搅拌至完全溶解后，按0.05％(v/v)加入Tween-20)洗板3次，加入封闭液，250μ/孔，37℃封闭2h；PBST洗板3次，加入S100A8重组蛋白及待检样品(指的是检测的样本有：乾县、10041、37915、27235、46772、16362、16387、54933、37143、08717、45036(均为样本名称))，以0.01mol/LPBS溶液(S100A8重组蛋白和样本的稀释液)作为阴性对照，100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗板3次，生物素标记抗体稀释液(1×PBS溶液)稀释的检测抗体(指的是双抗夹心法中的检抗，鼠抗(1D12F5和2B31A6)，兔抗(G2395和G2396)，以上四个抗体有分别作为包抗和检抗，互相配对，形成16个配对组合)100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗板3次，加入辣根过氧化物酶标记亲和素avidin-HRP稀释液稀释的辣根过氧化物酶标记的亲和素，100μL/孔，37℃孵育1h；洗板5次，加入TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)，90μL/孔，37℃避光显色20min；加入2mol/L硫酸终止显色，50μL/孔，酶标仪测定450nm处OD值(吸光值)。根据P/N值最大，确定鉴别检测的抗体组合，结果见表1。其中，辣根过氧化物酶标记亲和素avidin-HRP：三鹰，SA00001-0。
表1抗体配对结果
抗体配对试验结果显示(表1)，兔G2395多克隆抗体做包被抗体和检测抗体，1D12F5单克隆抗体做包被抗体和兔G2395多克隆抗体做检测抗体时，阴阳样本区分较好，最终选择1D12F5单克隆抗体和兔G2395作为最佳配对抗体(其中，1D12F5单克隆抗体做包被抗体，兔G2395多克隆抗体做检测抗体)，建立检测重组S100A8蛋白的双抗体夹心ELISA方法。
3.2、包被抗体和检测抗体最适工作浓度的确定
采用方阵滴定法确定包被抗体和检测抗体的最适工作浓度。方阵滴定法实验步骤为：
a)用包被缓冲液稀释单克隆抗体，浓度分别为4.0μg/mL、2.0μg/mL和1.0μg/mL,包被酶标板，每一浓度包被三个纵行，每孔100μl，每孔均作复孔。4℃过夜，PBST洗涤3次。b)5％脱脂奶粉封闭酶标板，37℃孵育1h，洗涤3次。c)在横行包被孔中依次加入空白对照，阴性对照血清，弱阳性抗原液及强阳性抗原液，各100μL,37℃孵育1h，洗涤3次。d)在每一包被浓度的一个纵行中分别加入按1:500、1：1000、1：2000和1:4000稀释的多抗，37℃孵育1h，洗涤3次。e)在每一包被浓度的一个纵行中分别加入hrp标记IGG抗体，稀释度先按说明书上的，37℃孵育1h，洗涤3次。f)加tmb底物，37℃避光显色13min，用2mol/mL硫酸终止反应，酶标仪450nm读取吸光度(OD)值。g)测得的强阳性抗原液OD值在1.0左右，阴性对照od值小于0.1的组合为较理想的组合。
本实验检测数据见下表2，最终确定1D12F5单克隆抗体的包被浓度为4.0μg/mL，兔G2395多克隆抗体的检测浓度为5.0μg/mL。具体的：兔G2395多克隆抗体的浓度为10.0mg/μL，将其在1:2000稀释比情况下浓度为5.0μg/ml。HRP标记小鼠(兔)二抗的最佳稀释浓度为1:4000。
表2方阵滴定法测样
经测定，兔G2395多克隆抗体在37℃感作2h，1D12F5单克隆抗体在4℃条件下包被12h，P/N值均较大，可以作为这两个抗体的最佳反应条件。
3.3、检测重组S100A8蛋白的双抗体夹心ELISA方法的标准曲线及性范围标准曲线建立
将特异抗体(鼠抗1D12F5和兔抗G2395)按照上述确定的浓度(即1D12F5单克隆抗体的包被浓度为4.0μg/mL，兔G2395多克隆抗体的检测浓度为0.4μg/mL)于包被液中4℃下过夜(≥12h)包被在96微孔板内，每孔100μL。包被形成固相抗体，甩去并彻底扣干板内液体后，用封闭液200μL/孔，在37℃恒温培养箱内温育2h，然后取出酶标板，甩去液体，用洗液洗板3次，彻底扣干板内液体。洗板完成后，用酶标板稳定剂37℃浸板2h。加入标准品(即林麝S100A8重组蛋白)或含待测血清样本，100μL/孔，37℃温育2h后，甩掉酶标板孔内液体，拍干；然后加入生物素标记的抗体100μL/孔，温育1h后洗板3次；再加入辣根过氧化物酶标记的亲和素100μL/孔，温育1h后洗板5次。此时，在固相上形成固相抗体-待测抗原-生物素标记的抗体-辣根过氧化物酶标记的亲和素复合物。其中，酶标板稳定剂购自德国candor。其中，辣根过氧化物酶标记的亲和素：HRP-Avidin。待测血清样本指的是临床上出现发烧林麝的血清样品。本发明选取了7份出现发烧动物的血清样本和4份正常动物血清样本作为待测血清样本，这些待测血清样本如表3中“样本”一列所示，表格中记载的是为样本名称，其中，“乾县”、“10041”、“37915”、“27235”、“46772”、“16362”和“16387”为7份出现发烧动物的血清样本；“54933”、“37143”、“08717”和“45036”为4份正常动物血清样本。
洗板后立即加入TMB，每孔加入90μL，盖上覆膜，放入37℃恒温箱温育。在显色过程中，注意观察颜色变化，以便及时终止。一般显色20分钟。显色完成后，每孔依次加入50μL终止液，酶标仪测450nm处OD值，以吸光值为横坐标，样本(标准品)浓度为纵坐标建立检测重组S100A8蛋白的双抗体夹心ELISA方法的标准曲线。
将S100A8重组蛋白作为检测原，对建立的检测重组S100A8蛋白的双抗体夹心ELISA方法进行敏感性分析，抗原浓度在40ng/mL至10μg/mL之间时，利用cvxpt32软件绘制ELISA标准曲线，结果如表3和图7所示，得到一个有理函数方程y＝(4.68366212+68.9807145x)/(1-0.5975346x+0.10992796x^2)，R2为0.99。如图6所示。根据OD值判定最低灵敏度，最低检测抗原灵敏度为15.625ng/mL。
表3标准曲线滴定并测样
注：“样本”一列中分别为样本名称，“乾县”、“10041”、“37915”、“27235”、“46772”、“16362”和“16387”
为7份出现发烧动物的血清样本；“54933”、“37143”、“08717”和“45036”为4份正常动物血清样本。
本发明建立了一种林麝S100A8蛋白的检测方法，即上述检测重组S100A8蛋白的双抗体夹心ELISA方法。该方法可以用于可检测林麝S100A8蛋白，实现对林麝S100A8蛋白的定量检测。为了说明本发明所建立的该林麝S100A8蛋白的检测方法的特异性，本发明选取了7份出现发烧动物的血清样本和4份正常动物血清样本进行检测，用于评价该检测方法的特异性，具体步骤如下：
采用本发明建立的该林麝S100A8蛋白的检测方法对上述11份血清样本(临床上出现发烧林麝的血清样品)分别进行检测，检测结果如表4所示。表4中“样本”一列所示，表格中记载的是为样本名称，其中，“乾县”、“10041”、“37915”、“27235”、“46772”、“16362”和“16387”为7份出现发烧动物的血清样本；“54933”、“37143”、“08717”和“45036”为4份正常动物血清样本。
由表4的结果可知，出现发烧症状的7份血清样本的检测结果为阳性，其余4份正常动物血清样本检测结果为阴性，均与已知背景相符，表明本发明建立的林麝S100A8蛋白的检测方法可应用于林麝血清样品的定量检测。
表4样本定量计算结果
注：“样本”一列中分别为样本名称，“乾县”、“10041”、“37915”、“27235”、“46772”、“16362”和“16387”
为7份出现发烧动物的血清样本；“54933”、“37143”、“08717”和“45036”为4份正常动物血清样本。
本发明建立的一种林麝S100A8蛋白的检测方法能够特异性识别重组S100A8蛋白，具有较强的特异性，可以用于重组S100A8蛋白的检测。
在此基础上，本发明还提供了一种用于快速检测林麝S100A8蛋白的胶体金胶体金试纸条。该胶体金试纸条的制备方法如下：
以上述制备的鼠抗1D12F5单克隆抗体作为测试线包被抗体(检测带)，以兔抗G2395多克隆抗体标记胶体金制成胶体金抗体检测试纸条的金胶垫(流动带)，以羊抗兔IgG抗体作为检测试纸条的质控抗体(质控带)，同时含有试纸条样品吸收垫(样品垫)、玻璃纤维素膜(胶体金垫)、吸水纸。
胶体金试纸条的组装步骤如下：将吸水纸压于喷有检测线、质控线的硝酸纤维膜一端上表面，金标垫压于硝酸纤维膜另一端上表面，样品垫边缘附着在金标垫上表面，密封。
为了说明本发明所制备的胶体金试纸条的使用方法以及验证其效果，本发明选取了临床上出现发烧林麝的血清样品，分别为：乾县、10041、37915、27235、46772、16362、16387、54933、37143、08717、45036(均为样本名称)。
样本进行检测，具体步骤如下：
(1)从-80冰箱取出上述血清样品，解冻之后，待检测。(2)取出上述制备的试纸条，开封后平放于桌面，使用滴管吸取待检样本上清液，加入3滴于样本孔中。(3)加样后5～15min，观察显色区，判定结果。(4)结果判定：如图7所示，其中图中A为阳性结果，B为阴性结果，C为无效结果，D为无效结果。
具体判定分析过程如下：
阳性：C线显色，T线肉眼可见，无论颜色深浅均可判定为阳性，颜色深浅跟目标蛋白浓度呈正比。阴性：C线显示，T线不显色，判定为阴性。无效：C线不显色，无论T线是否显色，该检测卡均判为无效。
上述实验结果表明，本发明所制备的的胶体金试纸条的检测效果特异性强、敏感度高，10min即可判定结果，在临床样品检测中，与PCR检测方法的符合率达到了94.9％，并且可以保存较长的时间仍具有很好的检测效果，有助于养殖场中林麝炎症性疾病的早期快速诊断和筛查。
随着我国养麝业的大规模发展以及对呼吸道疾病认识和了解的深入，研究发现，呼吸道疾病在养麝场中普遍存在，其造成的损失也在逐渐增加。
本发明构建的一种林麝S100A8蛋白的检测方法是单克隆-多克隆抗体检测体系，包被抗体使用抗S100A8的鼠源单克隆抗体，检测抗体使用抗S100A8的兔源多克隆抗体。若多抗作为包被抗体，存在与单抗竞争结合抗原同一表位的问题，但多抗可以结合同一抗原的不同表位，其亲和力更高，一分子抗原可以结合多分子的多抗，作为检测抗体可以起到信号放大的作用(Zhai et al.2019)。由于单抗结合的是单一表位，特异性更好，合适在双抗体夹心ELISA中作为包被抗体使用。
在优化林麝S100A8蛋白的检测方法(检测重组S100A8蛋白的双抗体夹心ELISA方法)的过程时，以原核表达的重组S100A8蛋白作为待检测样品，对ELISA操作过程中的各项指标(缓冲液的选择、抗体的稀释浓度、孵育温度和时间等)进行条件优化(J et al.2018)，以提高检测体系的特异性和灵敏度。采用棋盘法确定包被抗体包被浓度和检测抗体工作浓度时，发现当选择的抗体浓度超过一定剂量后，随着包被抗体包被浓度的升高，读取的OD450值反而有所降低，过量的抗体有一定的封闭作用。进一步对其他环节进行条件优化，各抗体的使用浓度是优化时的重要指标，其次为封闭液的选择，再次为孵育时间的最终确认。
本发明所建立的一种林麝S100A8蛋白的检测方法可检测S100A8蛋白，实现对样品中S100A8蛋白的定量检测，最低检测灵敏度为15.625ng/mL。该检测方法是一种适用于林麝群体的S100A8蛋白的检测方法，可用于林麝群体的炎症水平的监测以及治疗评估，为制定合理的预防措施提供理论依据和防控林麝疾病提供帮助和指导，为濒危动物的保护和利用提供技术支撑。动物血清样品中能够检测到S100A8F蛋白，其含量在15.625-1000ng/mL之间，正常样本中该蛋白浓度较低。表明本发明建立的林麝S100A8蛋白的检测方法能够实现对样品中S100A8蛋白的定量检测。
需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种S100A8蛋白的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
特异性抗体的制备：以S100A8重组蛋白为免疫抗原，通过其进行动物免疫制备多克隆抗体和单克隆抗体；
取样：取待测林麝血清样本；
标准曲线的建立：以单克隆抗体作为包被抗体，以多克隆抗体作为检测抗体，林麝S100A8重组蛋白作为标准品，建立标准曲线；
检测：将标准品替换成待测林麝血清样本，重复上述标准曲线的建立中的操作步骤检测，并根据标准曲线计算得到上述待测血清样本中的S100A8蛋白的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种S100A8蛋白的检测方法，其特征在于，所述单克隆抗体为鼠抗麝S100A8单克隆抗体；多克隆抗体为兔抗麝S100A8多克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的一种S100A8蛋白的检测方法，其特征在于，所述鼠抗麝S100A8单克隆抗体包括1D12F5、2B31A6、6F94A5和4F83D2中的任意一种；所述兔抗麝S100A8多克隆抗体包括兔G2395和兔G2396抗体中的任意一种。
4.根据权利要求3所述的一种S100A8蛋白的检测方法，其特征在于，以鼠抗1D12F5单克隆抗体作为包被抗体，兔抗G2395多克隆抗体作为检测抗体，以林麝S100A8重组蛋白作为标准品，采用酶标仪测450nm处吸光值，以吸光值为横坐标，样本浓度为纵坐标建立标准曲线；
所述标准曲线为：y＝(4.68366212+68.9807145x)/(1-0.5975346x+0.10992796x2)；其中，y为标准品浓度，x为吸光值。
5.根据权利要求1所述的一种S100A8蛋白的检测方法，其特征在于，所述S100A8重组蛋白的制备包括如下步骤：获取麝源S100A8基因序列，设计上游引物和下游引物，以大肠杆菌PET-B2M为载体，构建麝源S100A8-PET-B2M原核表达载体，将其转化至大肠杆菌菌株Rosetta后，加入诱导剂在LB培养基中培养，将菌液离心，收集沉淀，纯化后即得S100A8重组蛋白。
6.根据权利要求5所述的一种S100A8蛋白的检测方法，其特征在于，所述S100A8基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
7.根据权利要求1所述的一种S100A8蛋白的检测方法，其特征在于，所述包被缓冲液为pH 7.0～7.3的0.01mol/LPBS溶液；所述封闭液的制备方法为；称取脱脂牛奶，溶于PBS溶液中，取195～205μL/孔为封闭液；所述终止液的制备方法为：取浓硫酸加入至纯水中配制成浓度为2～4％即得。
8.适用于权利要求1～7所述的S100A8蛋白的检测方法的检测试纸。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述检测试纸为包括包被有所述的鼠抗麝S100A8单克隆抗体1D12F5的胶体金试纸条。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述胶体金试纸条包括硝酸纤维素膜、吸水纸、金标垫、样品垫；
所述硝酸纤维素膜上设有检测带和质控带；以所述鼠抗1D12F5单克隆抗体作为检测带，羊抗兔IgG抗体作为质控带；
所述金标垫经兔抗G2395多克隆抗体标记胶体金制成的胶体金抗体制备而成；
所述胶体金试纸条的组装步骤如下：将吸水纸压于硝酸纤维膜一端上表面，金标垫压于硝酸纤维膜另一端上表面，样品垫边缘附着在金标垫上表面，密封。
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Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101788563A (zh) * 2010-02-03 2010-07-28 华中农业大学 梅花鹿γ-干扰素双抗体夹心ELISA检测方法及试剂盒与应用
WO2012175602A2 (en) * 2011-06-21 2012-12-27 Calpro As Elisa for calprotectin
WO2013132338A2 (en) * 2012-03-06 2013-09-12 Calpro As Competitive immunoassay for calprotectin
CN105785041A (zh) * 2016-04-05 2016-07-20 付国亮 用于定量检测钙卫蛋白的试纸条及其制备方法和钙卫蛋白浓度的测定方法
CN108333368A (zh) * 2018-02-07 2018-07-27 深圳市伯劳特生物制品有限公司 一种检测人粪便中钙卫蛋白的试剂盒及制备方法
CN109507435A (zh) * 2018-11-23 2019-03-22 重庆医科大学 Grp78蛋白双抗夹心elisa法检测试剂盒及其检测方法
CN109682979A (zh) * 2019-01-30 2019-04-26 珠海市银科医学工程股份有限公司 一种钙卫蛋白联合乳铁蛋白抗原检测试纸条及其制备方法
CN110221079A (zh) * 2019-06-20 2019-09-10 北京林业大学 粪便钙卫蛋白和乳铁蛋白检测在林麝肠道炎症性疾病诊断中的应用
CN110221050A (zh) * 2019-06-20 2019-09-10 北京林业大学 圈养林麝肠道健康状况的非损伤诊断及评价方法
CN110244062A (zh) * 2019-07-18 2019-09-17 珠海市医友生物科技有限公司 一种粪便钙卫蛋白或乳铁蛋白联合检测试剂及其制备方法
CN110609143A (zh) * 2019-10-31 2019-12-24 苏州普瑞森基因科技有限公司 一种钙卫蛋白异二聚体检测试剂盒及其应用
US20210177988A1 (en) * 2018-08-06 2021-06-17 Lemonex Inc. Immunoreactant carrier
CN114729019A (zh) * 2020-02-24 2022-07-08 伯尔曼实验室股份有限公司 重组钙卫蛋白
CN114891103A (zh) * 2022-06-11 2022-08-12 巴迪泰(青岛)生物科技有限公司 一种钙卫蛋白单克隆抗体及试剂盒
US20230160911A1 (en) * 2018-04-24 2023-05-25 Universiteit Gent Intestinal and fecal biomarkers for intestinal health of poultry
US20230258660A1 (en) * 2020-04-27 2023-08-17 Abacuslabs Ltd. A method for distinguishing healthy individuals from individuals having infectious or inflammatory conditions

Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101788563A (zh) * 2010-02-03 2010-07-28 华中农业大学 梅花鹿γ-干扰素双抗体夹心ELISA检测方法及试剂盒与应用
WO2012175602A2 (en) * 2011-06-21 2012-12-27 Calpro As Elisa for calprotectin
WO2013132338A2 (en) * 2012-03-06 2013-09-12 Calpro As Competitive immunoassay for calprotectin
CN105785041A (zh) * 2016-04-05 2016-07-20 付国亮 用于定量检测钙卫蛋白的试纸条及其制备方法和钙卫蛋白浓度的测定方法
CN108333368A (zh) * 2018-02-07 2018-07-27 深圳市伯劳特生物制品有限公司 一种检测人粪便中钙卫蛋白的试剂盒及制备方法
US20230160911A1 (en) * 2018-04-24 2023-05-25 Universiteit Gent Intestinal and fecal biomarkers for intestinal health of poultry
US20210177988A1 (en) * 2018-08-06 2021-06-17 Lemonex Inc. Immunoreactant carrier
CN109507435A (zh) * 2018-11-23 2019-03-22 重庆医科大学 Grp78蛋白双抗夹心elisa法检测试剂盒及其检测方法
CN109682979A (zh) * 2019-01-30 2019-04-26 珠海市银科医学工程股份有限公司 一种钙卫蛋白联合乳铁蛋白抗原检测试纸条及其制备方法
CN110221050A (zh) * 2019-06-20 2019-09-10 北京林业大学 圈养林麝肠道健康状况的非损伤诊断及评价方法
CN110221079A (zh) * 2019-06-20 2019-09-10 北京林业大学 粪便钙卫蛋白和乳铁蛋白检测在林麝肠道炎症性疾病诊断中的应用
CN110244062A (zh) * 2019-07-18 2019-09-17 珠海市医友生物科技有限公司 一种粪便钙卫蛋白或乳铁蛋白联合检测试剂及其制备方法
CN110609143A (zh) * 2019-10-31 2019-12-24 苏州普瑞森基因科技有限公司 一种钙卫蛋白异二聚体检测试剂盒及其应用
CN114729019A (zh) * 2020-02-24 2022-07-08 伯尔曼实验室股份有限公司 重组钙卫蛋白
US20230258660A1 (en) * 2020-04-27 2023-08-17 Abacuslabs Ltd. A method for distinguishing healthy individuals from individuals having infectious or inflammatory conditions
CN114891103A (zh) * 2022-06-11 2022-08-12 巴迪泰(青岛)生物科技有限公司 一种钙卫蛋白单克隆抗体及试剂盒

Non-Patent Citations (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIU, HANG等: "Distribution and associations for antimicrobial resistance and antibiotic resistance genes of Escherichia coli from musk deer (Moschus berezovskii) in Sichuan, China", PLOS ONE, vol. 18, no. 11, 27 November 2023 (2023-11-27), pages 0289028 *
MACKINTOSH, C. G.等: "SOLiD SAGE sequencing shows differential gene expression in jejunal lymph node samples of resistant and susceptible red deer (Cervus elaphus) challenged with Mycobacterium avium subsp paratuberculosis", VETERINARY IMMUNOLOGY AND IMMUNOPATHOLOGY, vol. 169, 1 January 2016 (2016-01-01), pages 102 - 110 *
NCBI_NUCLOTIDE: "PREDICTED: Moschus berezovskii S100 calcium binding protein A8 (S100A8), mRNA", Retrieved from the Internet <URL:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/XM_055402586> *
NCBI_PROTEIN: "protein S100-A8 [Moschus berezovskii]", Retrieved from the Internet <URL:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/XP_055258561> *
刘丛盛: "人工养殖林麝主要疾病防治技术——助推我国林麝产业高质量发展", 动物医学进展, vol. 43, no. 10, 20 October 2022 (2022-10-20), pages 121 - 125 *
刘丽: "《胶体金免疫层析技术》", 30 September 2017, 河南科学技术出版社, pages: 63 - 64 *
刘亮等: "《基因工程原理与实验指导》", 30 September 2010, 中国轻工业出版社, pages: 52 - 53 *
周俊彤: "圈养林麝消化道健康状态的多参数判定体系", 中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑, no. 6, 15 June 2022 (2022-06-15), pages 3 *
孙亮等: "麝香通心滴丸联合西药治疗缺血性心肌病并发慢性心力衰竭气虚血瘀证临床研究", 新中医, vol. 55, no. 6, 27 April 2023 (2023-04-27), pages 22 - 26 *
孙国瑛等: "《实用组织化学与细胞化学技术》", 31 August 2022, 湖南科学技术出版社, pages: 108 *
李夏西等: "克罗恩病患者血清中网膜素-1的水平变化及其临床意义", 胃肠病学和肝病学杂志, vol. 32, no. 9, 20 September 2023 (2023-09-20), pages 997 - 1000 *
杨新玲等: "《 普通高等教育十四五规划教材 分析化学》", 28 February 2022, 中国农业大学出版社, pages: 247 *
沈晓玲等: "《病原生物学与免疫学实验指导》", 30 June 2022, 江苏凤凰科学技术出版社, pages: 90 - 93 *
罗荣城等: "《生物标志物与精准医学》", 31 March 2020, 上海交通大学出版社, pages: 467 *
邹丹丹等: "林麝IL-1β基因的克隆、表达及其功能分析", 第二届中国西部动物学学术研讨会论文集, 30 September 2014 (2014-09-30), pages 1 *
邹雄等: "《临床检验仪器》", 31 August 2015, 中国医药科技出版社, pages: 212 - 213 *
马毅等: "《疫情下奶牛健康生产技术指南》", 31 January 2021, 机械工业出版社, pages: 88 - 90 *

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