CN1188235A - 抗人iv型胶原蛋白酶联免疫定量测定试剂盒及制作方法 - Google Patents
抗人iv型胶原蛋白酶联免疫定量测定试剂盒及制作方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1188235A CN1188235A CN97122057A CN97122057A CN1188235A CN 1188235 A CN1188235 A CN 1188235A CN 97122057 A CN97122057 A CN 97122057A CN 97122057 A CN97122057 A CN 97122057A CN 1188235 A CN1188235 A CN 1188235A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- monoclonal antibody
- human
- elisa plate
- add
- collagen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明涉及抗人Ⅳ型胶原蛋白酶联免疫定量测定试剂盒及制作方法,它由酶标板和检测试剂组成,用人胎盘提取Ⅳ胶原采用细胞工程——杂交瘤技术制备单克隆抗体用酶联免疫吸附原理将单抗包被酶标板上,采用双抗体夹心法,定量测定人血清中Ⅳ型胶原蛋白的含量,可用于肝纤维化的诊断、治疗和病后的判断,具有较好灵敏度,特异性好,可重复性,准确快速,达到临床检测的要求。
Description
本发明涉及抗人IV型胶原蛋白酶联免疫定量测定试剂盒,用于各种原因导致肝纤维化、糖尿病和矽肺等疾病的诊断及其病程的监控。
本发明还涉及该试剂盒的制作方法和测定方法。
肝纤维化是由多种原因引起的肝脏慢性损伤,肝脏细胞外质间成分异常沉积,导致肝功能受损的综合症,随着肝纤维化研究的深入,不断地揭示了胶原结构,功能与病理学的内在关系,尤其是在对IV型胶原蛋白(英文缩写IV-CL)的研究更加深入,在诊断上更有价值,因此检测血液中的IV型胶原蛋白的含量对肝纤维化的诊断、治疗效果和愈后的判断具有重要意义,目前在治疗和诊断以及病程监控,多数采用肝刺穿的办法,不仅病人痛苦,而且在治疗过程中不能定期进行,因此,损伤了病人的体质,同时也非常麻烦,有一种进口的试剂盒,它即把抗人IV型胶原氨基端7S单抗包被在小珠子上,再采用双抗体夹心二步法操作,该试剂盒价格昂贵,操作麻烦。
本发明的目的正是为了克服上述已有技术的缺点与不足采用抗人IV型胶原单抗包被酶标板上的一种双抗体夹心一步法测定人血清中IV型胶原蛋白含量的抗人IV型胶原蛋白酶联免疫定量测定试剂盒,从而可迅速、准确的判断和监控病程。
本发明还提供了该试剂盒的制作方法和定量测定方法。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的:
抗人IV型胶原蛋白酶联免疫测定试剂盒,其特征在于它由抗人IV型胶原蛋白单克隆抗体包被的酶标板和测定试剂组成,测定试剂为:
标准抗原冻干品:
酶标抗体结合物,
稀释液磷酸盐缓冲液,
洗液吐温磷酸盐缓冲液,
显色液A四甲基联苯胺,B双氧水,
终止液2M硫酸溶液。
本发明试剂盒的制作方法,包括标准抗原的制备,单克隆抗体的制备,单克隆抗体包被的酶标板的制作,酶标抗体结合物的制备和试剂的配制。
标准抗原是从人胎盘提取制备的,它将胎盘洗净后制浆,用中性盐提取数次,经胃蛋白酶消化、氯化钠沉淀,并过离子交换柱层析CM-24纤维柱,采用氯化钠线性梯度洗脱IV型胶原即得标准抗原。
此品用于测定时标准曲的制作,可将标准抗原冻干品用磷酸盐缓冲液稀释不同浓度为1000、500、250、125、62、31、16、0ng/ml,八个点作为曲线的横坐标,以A450OD平均值为纵坐标,用对数坐标纸绘制曲线。
本发明试剂盒的单克隆抗体包被的酶标板的制作是将单克隆抗体用磷酸盐缓冲液稀释加入酶标板孔中,每孔可加100μl,吸附过夜,用吐温磷酸盐缓冲液洗板,再用牛、马血清封闭液在37℃温度封闭1小时,甩干,吹干,即将单克隆抗体包被在酶标板上。
单克隆抗体制备是用人胎盘提取IV型胶原蛋白的抗原进行免疫BaCB/小鼠后取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合培养,经筛选克隆,选择特异性抗人IV型胶原单克隆细胞株注入小鼠腹腔制备腹水,得到单克隆腹水,再用正辛酸沉淀纯化得到单克隆抗体。
酶标抗体结合物的制备它是将辣根过氧化酶溶于醋酸缓冲液中,加入NaIO4溶液,乙二醇和纯化抗人IV型胶原,过夜,加NaHB4溶液,用硫酸铵沉淀、离心、脱盐即得到酶标抗体结合物,加等体积甘油保存,使用时选择适宜的稀释度。
洗液为吐温磷酸盐缓冲液,用于洗板,可在2-8℃保存6个月。
显色液用于显色,在2-8℃保存6个月。
终止液用2M硫酸溶液,在2-8℃保存6个月。
IV型胶原蛋白单克隆抗体可以是氨基端7S,羧基NC1,三螺旋中心区,IV型胶原全抗体的其中任意一种。
试剂盒的测定方法,其特征在于它依次按下述步骤进行:
a)在酶标板上孔内加稀释液,
b)再加入人血清样品,在37℃水浴上静置10-20分钟,
c)再加入酶标抗体结合物,在37℃水浴上静置60分钟;
d)用洗液洗板并甩干、吹干;
e)依次加显色液A、B,在37℃水浴上静置5-10分钟;
f)加终止液,结束反应;
g)测OD450值,计算结果。
本发明的实验动物BACB/C小鼠体重12-14g,由北京实验动物中心提供,酶标板为进口和国产两种,酶标仪为BIO-RAD。
临床应用结果:
1、试剂盒临床应用结果:
检测临床标本436例,其中健康对照162例,肝炎36例,糖尿病患者92例,肝癌患者77例,肝硬化69例,结果见表(1):
表1 试剂盒临床应用结果:组别 例数 均值 标准差 超过上限正常例数*及其百分率
X SD X±SD健康对照 162 44.96 59.4 10 6.2%糖尿病组 92 225.9 49 53%肝炎组 36 237.9 20 55.5%肝硬化组 69 527.88 54 78.3%肝癌组 77 325..6 55 71.4%
结果显示各患者均显著高于健康对照组(P<0.01),在各患者组中肝硬化组显著高于其它组(P<0.01)。
2、18例经病理确诊酒精性肝病患者血清IV型胶原测定结果见表2
表2 酒精性肝病患者血清IV型胶原测定结果组别 例数 均值 超过正常上限例数及其百分率轻度酒精性肝病 3 69.4 0 0%酒精性肝炎 2 1050.7 2 100%(合并IIBV感染)酒精性肝纤维化II 5 148.6 1 20%酒精性肝纤维化III 4 143.6 2 50%酒精性肝纤维化IV 4 176.4 4 100%
从表2中可以看出,在13例肝纤维化患者中II级纤维化有20%患者高于正常,III级纤维化患者中有50%高于正常,IV级纤维化患者中100%高于正常;在2例合并HBV感染的酒精性肝炎患者血清IV-CL浓度也均高于正常,结果显示血清IV-CL水平与肝纤维化程度呈正相关,且与肝细胞坏死及炎细胞浸润程度密切相关。
3、126例肝病患者IV型胶原检测结果见表:
(1),126例肝病患者病因检查结果见表(3)
表3 肝病病因检查结果
例数 乙肝 丙肝 乙+丙 戊肝病毒性肝炎 110 88 16 5 1酒精性肝炎 12病毒性+酒精肝病 4 2 1 1
检查结果表明病毒性肝炎110例,酒精性肝炎12例,4例为混合性肝炎。
(2).IV型胶原对2级以上肝纤维化的诊断价值:对上述126便肝病患者肝穿刺组织标本进行电镜病理检查。对2级以上肝纤维化患者血清标本采用多种血清IV-CL进行测定,测定数据处理后其界值、敏感性、特异性和准确性结果列表(4):
表4 血清IV型胶原对2级以上肝纤维化的诊断价值指标 界值 敏感性% 特异性% 准确性%PCIII 600ng/ml 81.6 81.8 81.7HA-Ch 80ng/ml 81.3 77.8 80.2HA 20ng/ml 76.9 78.6 77.5TIMP 240ng/ml 69.2 81.9 73.4PIIIP 0.9u/ml 71.4 75.0 72.6IV-Ch 150ng/ml 71.4 72.7 71.8LN 2.4u/ml 70.1 73.9 71.3IV-C 120ng/ml 65.2 65.8 65.3PH 20ng/ml 70.0 55.6 65.3
表4中结果指出试剂盒对2级以上肝纤维化的诊断敏感性为71.4%,特异性为72.7%,准确性为71.8%。
5.IV型胶原对3级以上肝纤维化的诊断价值结果见表5:
表5 血清IV型胶原对3级以上肝纤维化的诊断价值PCIII 700ng/ml 60.0 65.2 63.1HA-Ch 220ng/ml 78.3 80.0 79.3HA 40ng/ml 77.8 80.6 79.5TIMP 280ng/ml 68.1 70.0 72.2PIIIP 1.0u/ml 73.9 68.7 70.8IV-Ch 180ng/ml 74.2 61.7 66.7LN 2.6u/ml 60.0 64.0 62.4IV-C 200ng/ml 71.1 87.3 80.8PH 35ng/ml 75.0 60.0 66.0
表5中结果指出试剂盒对3级以上肝纤维化的诊断敏感性为74.2%,特异性为61.7%,准确性为66.7%。
本发明技术与已有技术相比具有如下优点及效果:
a)本试剂盒可用于临床检测肝、肺纤维化肾脏病和糖尿病,尤其对肝纤维化的诊断治疗效果和病后的判断具有重要的现实意义;
b)具有较高的灵敏度,特异性好,可重复性,达到临床检测要求;
c)使用操作方法,快速准确,价格便宜,易推广普及;
下面结合实施例进一步说明本发明技术:
试剂盒的抗人IV型胶原蛋白单抗包被板用可折条形96孔酶标板,将单克隆抗体干包被各孔底面上,每盒一块,标原冻干品2瓶,样品稀释液每瓶20ml/瓶,酶抗体结合物1瓶,结合物稀释液12ml一瓶,洗液一瓶,显色液A、B两瓶,每瓶6ml,终止液1瓶,每瓶6ml,测定时,在酶标板上作标准曲线的8孔内加入用稀释液稀释的标准抗原冻干品,依次浓度为1000、500、250、125、63、31、16、0ng/ml,每孔加50μl,置水浴上,放置10分钟,每孔再加用结合物稀释液稀释50倍的酶标抗体结合物100μl,在水浴上放置1小时,将洗液瓶中的洗液加蒸馏稀释20倍,洗板,再在各孔加显色液A、B各50μl在水浴上放置10分钟,加终止液50μl,终止反应,测各孔用酶标仪测OD450值,绘制曲线,在同一板上测定人血液中的IV型胶原,取人血,制血清,先在孔内加血清样品稀释液50μl,再加血清50μl,在水浴上37℃放置10分钟,加入上述稀释酶标抗体结合物100μl,继续在水浴上37℃放置60分钟,用洗液洗板并甩干,吹干,依次加入显然液A、B,在水浴上37℃放置10分钟加终止液,终止反应用酶标仪测A450OD值,计算结果。
试剂盒标准曲线的工作范围16-1000ng/l,灵敏度为16ng/l。
Claims (4)
1、抗人IV型胶原蛋白酶联免疫测定试剂盒,其特征在于它由抗人IV型胶原蛋白单克隆抗体包被的酶标板和测定试剂组成,测定试剂为:
标准抗原冻干品:
酶标抗体结合物,
稀释液磷酸盐缓冲液,
洗液吐温磷酸盐缓冲液,
显色液A四甲基联苯胺,B双氧水,
终止液2M硫酸溶液。
2、如权利要求1所述的试剂盒制作方法,包括标准抗原的制备,单克隆抗体包被的酶标板的制作,酶标抗体结合物的制备和试剂的配制,其特征在于:
a)单克隆抗体的制备,是将人胎盘提取的IV型胶原蛋白抗原进行免疫BACB/C小鼠,再取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合,培养,筛选克隆,选择特异性抗人IV型胶原单克隆细胞株注入小鼠腹腔制备腹水,得到单克隆抗体腹水用正辛酸纯化得到单克隆抗体;
b)单克隆抗体包被的酶标板的制作,将单克隆抗体用碳酸盐缓冲液释释后滴入酶标板各孔内,过夜吸附,用洗液洗板,再用牛、马血清封闭液在37℃温度封闭,甩干,吹干,即制成单克隆抗体包被的酶标板。
3、根据权利要求2所述的制作方法,其特征在于IV型胶原蛋白单克隆抗体可以是氨基端7S,羧基NC1,三螺旋中心区,IV型胶原全抗体的其中任意一种。
4、如权利要求1所述的试剂盒的测定方法,其特征在于它依次按下述步骤进行:
a)在酶标板上孔内加稀释液,
b)再加入人血清样品,在37℃水浴上静置10-20分钟,
c)再加入酶标抗体结合物,在37℃水浴上静置60分钟;
d)用洗液洗板并甩干、吹干;
e)依次加显色液A、B,在37℃水浴上静置5-10分钟;
f)加终止液,结束反应;
g)测OD450值,计算结果。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN97122057A CN1188235A (zh) | 1997-12-19 | 1997-12-19 | 抗人iv型胶原蛋白酶联免疫定量测定试剂盒及制作方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN97122057A CN1188235A (zh) | 1997-12-19 | 1997-12-19 | 抗人iv型胶原蛋白酶联免疫定量测定试剂盒及制作方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1188235A true CN1188235A (zh) | 1998-07-22 |
Family
ID=5176650
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN97122057A Pending CN1188235A (zh) | 1997-12-19 | 1997-12-19 | 抗人iv型胶原蛋白酶联免疫定量测定试剂盒及制作方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN1188235A (zh) |
Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101915843A (zh) * | 2010-07-29 | 2010-12-15 | 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 | 一种检测甲苯胺红的间接竞争法酶联免疫试剂盒 |
CN102010470A (zh) * | 2010-10-22 | 2011-04-13 | 上海贝西生物科技有限公司 | 一种抗ⅳ型胶原单克隆抗体及其用途 |
CN102507943A (zh) * | 2011-11-03 | 2012-06-20 | 潘世扬 | 一种用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心elisa试剂盒及其制备方法 |
CN102650637A (zh) * | 2011-02-25 | 2012-08-29 | 广州固康生物科技有限公司 | 尿β-胶原降解产物检测试剂盒及其制备方法 |
CN102650638A (zh) * | 2011-02-25 | 2012-08-29 | 广州固康生物科技有限公司 | 尿中ii型胶原降解产物检测试剂盒及其制备方法 |
CN102809541A (zh) * | 2012-05-14 | 2012-12-05 | 浙江省海洋开发研究院 | 一种胶原蛋白酶酶活的测定方法 |
CN104655853A (zh) * | 2014-12-18 | 2015-05-27 | 山东省医疗器械产品质量检验中心 | 一种酶解牛源性生物骨材料中残留α-Gal抗原的表征方法 |
CN110531088A (zh) * | 2019-09-26 | 2019-12-03 | 阿里生物技术泰州有限公司 | 一种iv型胶原蛋白检测试剂盒的检测方法 |
CN114031686A (zh) * | 2021-12-23 | 2022-02-11 | 杭州百凌生物科技有限公司 | 一种四型胶原蛋白ɑ5的抗体、检测试剂盒及其应用 |
-
1997
- 1997-12-19 CN CN97122057A patent/CN1188235A/zh active Pending
Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101915843A (zh) * | 2010-07-29 | 2010-12-15 | 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 | 一种检测甲苯胺红的间接竞争法酶联免疫试剂盒 |
CN102010470A (zh) * | 2010-10-22 | 2011-04-13 | 上海贝西生物科技有限公司 | 一种抗ⅳ型胶原单克隆抗体及其用途 |
CN102010470B (zh) * | 2010-10-22 | 2012-09-05 | 上海贝西生物科技有限公司 | 一种抗ⅳ型胶原单克隆抗体及其用途 |
CN102650637A (zh) * | 2011-02-25 | 2012-08-29 | 广州固康生物科技有限公司 | 尿β-胶原降解产物检测试剂盒及其制备方法 |
CN102650638A (zh) * | 2011-02-25 | 2012-08-29 | 广州固康生物科技有限公司 | 尿中ii型胶原降解产物检测试剂盒及其制备方法 |
CN102650638B (zh) * | 2011-02-25 | 2015-11-04 | 广州固康生物科技有限公司 | 尿中ii型胶原降解产物检测试剂盒及其制备方法 |
CN102507943A (zh) * | 2011-11-03 | 2012-06-20 | 潘世扬 | 一种用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心elisa试剂盒及其制备方法 |
CN102809541A (zh) * | 2012-05-14 | 2012-12-05 | 浙江省海洋开发研究院 | 一种胶原蛋白酶酶活的测定方法 |
CN102809541B (zh) * | 2012-05-14 | 2014-12-31 | 浙江省海洋开发研究院 | 一种胶原蛋白酶酶活的测定方法 |
CN104655853A (zh) * | 2014-12-18 | 2015-05-27 | 山东省医疗器械产品质量检验中心 | 一种酶解牛源性生物骨材料中残留α-Gal抗原的表征方法 |
CN110531088A (zh) * | 2019-09-26 | 2019-12-03 | 阿里生物技术泰州有限公司 | 一种iv型胶原蛋白检测试剂盒的检测方法 |
CN114031686A (zh) * | 2021-12-23 | 2022-02-11 | 杭州百凌生物科技有限公司 | 一种四型胶原蛋白ɑ5的抗体、检测试剂盒及其应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11959912B2 (en) | Fluorescence immunochromatographic detection card and a preparation method therefor and use thereof | |
CN108254563B (zh) | 检测cTnI的时间分辨荧光免疫层析试纸条、试剂盒及其制备方法 | |
WO2021185124A1 (zh) | 维生素d结合蛋白作为标志物在精神疾病抑郁症诊断中的应用 | |
KR880001533B1 (ko) | 항원 항체반응의 측정방법 및 그 시약 | |
CN101833009A (zh) | 一种双抗体复合的视黄醇结合蛋白检测试剂盒 | |
CN107656069A (zh) | 全血中全量程c‑反应蛋白定量检测试剂及方法 | |
CN1188235A (zh) | 抗人iv型胶原蛋白酶联免疫定量测定试剂盒及制作方法 | |
CN202916286U (zh) | 一种定量检测降钙素原pct的胶乳增强免疫比浊试剂盒 | |
CN205333641U (zh) | 一种pct时间分辨荧光纳米免疫层析定量检测试纸条 | |
US11067579B2 (en) | Target marker GP73 for detecting steatohepatitis and detection application method | |
CN104459140B (zh) | 一种定量检测类风湿因子、抗链球菌溶血素o、抗环瓜氨酸肽抗体、c反应蛋白的检测试剂盒 | |
CN110554197A (zh) | 一种荧光免疫层析联合检测试剂盒及其制备方法 | |
CN102095868A (zh) | 甲胎蛋白化学发光定量检测试剂盒 | |
CN110441531A (zh) | 一种检测血液中降钙素原的试剂盒及制备方法 | |
CN207301081U (zh) | 一种胰蛋白酶原时间分辨荧光纳米免疫层析定量检测试纸条 | |
EP0354954B1 (en) | Reagent and method for detecting rheumatoid factor | |
Chiodi et al. | Measles IgM antibodies in cerebrospinal fluid and serum in subacute sclerosing panencephalitis | |
JP3998245B2 (ja) | 酸化アポリポタンパク質ai及びそれを含有する酸化リポタンパク質の測定法及びキット | |
CN111596069B (zh) | Hsp10在pop早期预警、诊断、预后评估中的应用和产品 | |
CN107490692A (zh) | 一种定量检测超敏c反应蛋白和脂蛋白磷脂酶a2的荧光免疫层析方法 | |
CN102721819B (zh) | 一种脂联素的竞争抑制性酶联免疫检测试剂盒及方法 | |
CN109374904A (zh) | 一种蛋白质类脓毒症标志物及其在严重脓毒症早期预警的应用及其筛选方法 | |
AU2021101912A4 (en) | Use of vitamin d-binding protein (vdbp) as biomarker in diagnosis of depression | |
Jensen et al. | Influence of freeze-drying on the clotting properties of fibrinogen in plasma | |
CN111378627B (zh) | 高尔基体蛋白73的单克隆抗体、试剂盒及应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |