CN109564151A - 使用高通量荧光流式细胞仪进行细胞分选 - Google Patents

使用高通量荧光流式细胞仪进行细胞分选 Download PDF

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Abstract

在一个方面，公开了一种在流式细胞术***中分选细胞的方法，所述方法包括用具有彼此偏移一个射频的至少两个光学频率的辐射照射细胞以从所述细胞引出荧光辐射，检测所述荧光辐射以生成时间荧光数据，并且在并未基于所述荧光数据生成所述细胞的图像(即，逐像素图像)的情况下处理所述时间荧光数据以得出关于所述细胞的分选决定。换句话说，虽然荧光数据可以含有将允许生成逐像素荧光强度图的图像数据，但是所述方法在不生成这种图的情况下得出分选决定。在一些情况下，可以用小于约100微秒的延迟时间作出分选决定。在一些实施方案中，上述分选细胞的方法可以具有亚细胞分辨率，例如，分选决定可以是基于细胞组分的特征。在采用超过两个频移光学频率的一些实施方案中，采用单个射频偏移来分离光学频率，而在其他此类实施方案中采用多个不同的射频偏移。

Description

使用高通量荧光流式细胞仪进行细胞分选
相关申请
本申请要求于2016年3月17日提交的标题为“Cell Sorting Using A HighThroughput Fluorescence Flow Cytometer”的临时申请号62/309,806的优先权，并且将该临时申请通过引用以其全文并入本文。
政府权利
本发明由美国国家科学基金会(National Science Foundation)(批准号NSF1447381)资助。政府对本发明享有某些权利。
背景技术
本发明总体上涉及用于例如经由样品的荧光分析确定流过流式细胞仪的颗粒的特征的设备和方法，并且更具体地涉及用于在流式细胞仪中基于例如它们的特征分选颗粒(例如分选细胞)的设备和方法。
从异质群体中分离亚群体或甚至单个细胞在现代生物学和生物医学中具有多种应用。用于分离细胞亚群的一些常规技术包括荧光激活细胞分选(FACS)、磁激活细胞分选(MACS)、激光捕获显微切割和DEP阵列分选。虽然在细胞分选应用中常规使用，但这些技术存在许多缺点。例如，广泛用于细胞生物学的所有领域的FACS缺乏亚细胞分辨率，并因此仅基于细胞参数的平均值作出分选决定。此外，基于成像细胞的常规分选方法由于它们在作出分选决定中的高延迟时间通常不能用于高通量细胞分离应用。
因此，对用于例如在流式细胞术***中分选细胞的改进方法和***存在需求。
发明内容
在一个方面，公开了一种确定颗粒特征的方法，该方法包括在颗粒流过流式细胞术***时用射频调制的光束照射该颗粒以便从该颗粒引出至少一个辐射响应，检测从该颗粒发出的辐射响应以生成与该辐射响应相关的时间波形数据，并且处理该波形数据以获得该颗粒的至少一个特征的估计。在一些实施方案中，在并未基于波形数据生成颗粒的图像的情况下执行该处理步骤。在一些实施方案中，辐射响应可以是荧光辐射或散射辐射中的任何一种。在一些实施方案中，该处理步骤足够快使得与获得颗粒的至少一个特征的估计相关的延迟时间等于或小于约100微秒，例如等于或小于约20微秒。
在一些实施方案中，射频调制的光束包括彼此分离至少一个射频的至少两个光学频率。在此类实施方案中，该处理步骤可以包括分析与在所述辐射响应中检测到的至少一个射频相关的至少一个拍频，以确定颗粒的至少一个特征的估计。
上述方法可以用于确定颗粒的各种不同特征的估计。通过举例的方式，颗粒的特征可以是以下中的至少一个：颗粒的维度尺寸、颗粒沿两个不同维度的尺寸比率、由与颗粒相关的两种或更多种标记发射的荧光辐射的共定位、辐射响应的点状度、从颗粒发出的荧光辐射的空间分布的量度、颗粒的位置或取向的量度、颗粒的偏心率的量度、颗粒与参考颗粒相似性的量度、颗粒的一个或多个空间傅里叶(Fourier)分量的组合、颗粒位于照射辐射焦点的程度的量度。
在相关方面，颗粒的至少一个特征的估计可以用于得出关于该颗粒的分选决定。
在相关方面，公开了一种确定颗粒的一个或多个特征的方法，该方法包括在颗粒流过流式细胞术***时用具有彼此偏移一个射频的至少两个光学频率的辐射照射该颗粒以从该颗粒引出荧光辐射，检测来自该颗粒的荧光辐射以生成时间荧光数据，并且处理该时间荧光数据以获得该颗粒的至少一个特征的估计。在一些实施方案中，在并未基于时间荧光数据生成荧光图像的情况下执行该处理步骤。在一些实施方案中，该处理步骤可以包括分析一个或多个调制时间荧光数据的拍频以获得该颗粒的至少一个特征的所述估计。在一些实施方案中，该处理步骤足够快使得与获得该颗粒的至少一个特征的所述估计相关的延迟时间小于约100微秒，例如小于约20微秒。
在一些实施方案中，所确定的特征可能与颗粒的内部组分相关。在一些实施方案中，所确定的特征可以是以下中的任何一个：颗粒的维度尺寸、颗粒沿两个不同维度的尺寸比率、由与颗粒相关的两种或更多种标记发射的荧光辐射的共定位、荧光辐射的点状度、荧光辐射的空间分布的量度、颗粒的位置或取向的量度、颗粒的偏心率的量度、颗粒与参考颗粒相似性的量度、颗粒的一个或多个空间傅里叶分量的组合、颗粒位于照射辐射焦点的程度的量度。
在一些实施方案中，照射颗粒的步骤包括将颗粒暴露于光学辐射束，该光学辐射束包括至少两个小束，每个小束具有所述至少两个光学频率之一，这样使得所述小束照射颗粒内的至少两个空间位置。在一些实施方案中，两个照射的空间位置部分重叠。
在一些实施方案中，可以用至少两种荧光标记对颗粒染色，其中每种标记被配置成响应于通过具有一个光学频率的辐射的照射而发射荧光辐射。在此类实施方案中，该方法可以进一步包括收集和数字化从这些标记发出的荧光信号，以生成每个对应于一个标记的时间荧光波形。可以处理这些荧光波形以获得荧光信号的共定位的量度。通过举例的方式，荧光波形的处理可以包括将高通或带通滤波器应用于至少一个波形以生成至少一个滤波波形、随后进行波形的逐点乘法以生成至少一个乘法波形，对乘法波形进行积分以获得积分值，并将积分值与预定阈值进行比较以获得共定位的量度。在一些实施方案中，共定位量度的确定可以包括将高通或带通滤波器应用于至少一个波形以生成至少一个滤波波形、随后进行波形的逐点乘法以生成合成乘法波形，对乘法波形进行积分以获得积分值，从积分值中减去背景值，并按强度换算合成值以生成最终值，并将最终值与预定阈值进行比较以获得共定位量度。
在上述方法的一些实施方案中，处理的步骤包括获得沿着与流式细胞术***中的颗粒流动的方向基本上垂直的方向的颗粒侧向尺寸的估计。
在上述方法的一些实施方案中，采用荧光波形通过将波形平方、将带通滤波器应用于平方的波形、对滤波波形进行积分、并将积分值与预定阈值进行比较来获得颗粒侧向尺寸的估计。
在一些实施方案中，可以基于响应于照射步骤从颗粒发出的荧光辐射的脉冲的时距来获得在与流式细胞仪中的颗粒流动方向平行的方向上的颗粒尺寸的估计。
在一些实施方案中，可以使用在与颗粒流动方向垂直的方向和平行的方向上的颗粒尺寸的估计来获得颗粒纵横比的估计。
上述方法可以应用于各种不同的颗粒。通过举例的方式，颗粒可以是以下中的任何一种：细胞、小生物体(例如，线虫秀丽隐杆线虫(c.elegan))、珠粒、微粒、纳米颗粒、病毒颗粒、细菌、外来体或药物制品。在一些实施方案中，颗粒可以是哺乳动物细胞，例如患病细胞。
在相关方面，颗粒的至少一个特征的估计可以用于得出关于该颗粒的分选决定，如下面更详细讨论的。
在相关方面，公开了一种确定颗粒的特征的方法，该方法包括用射频调制的光束照射颗粒以便从该颗粒中引出荧光辐射和散射辐射中的任何一种，检测从该颗粒发出的荧光辐射或散射辐射以生成时间荧光或散射波形数据，并且处理任何荧光和散射数据以获得颗粒的至少一个特征的估计。在一些实施方案中，可以在并未基于时间荧光或散射波形数据生成颗粒的图像的情况下形成该处理步骤。在一些此类实施方案中，该处理步骤足够快使得与获得该颗粒的至少一个特征的估计相关的延迟时间小于约100微秒，例如小于约20微秒。
在上述方法的一些实施方案中，颗粒的特征可以包括以下中的至少一个：颗粒的维度尺寸、颗粒沿两个不同维度的尺寸比率、由与颗粒相关的两种或更多种标记发射的荧光辐射的共定位、荧光辐射的点状度、荧光辐射的空间分布的量度、颗粒的位置或取向的量度、颗粒的偏心率的量度、颗粒与参考颗粒相似性的量度、颗粒的一个或多个空间傅里叶分量的组合、颗粒位于照射辐射焦点的程度的量度。
在一些实施方案中，可以检测从颗粒发出的荧光辐射和散射辐射两者以生成荧光和散射波形数据。可以使用荧光数据来获得在与颗粒流动方向基本上垂直的方向上的颗粒的侧向尺寸的估计，并且可以使用散射波形数据来获得在与所述流式细胞仪***中的颗粒流动方向平行的方向上的颗粒尺寸的估计。
在一些实施方案中，当颗粒流过流式细胞仪时，可以使用颗粒的至少一个特征的估计来得出关于该颗粒的分选决定。
在相关方面，公开了一种用于执行计算机辅助流式细胞术的方法，该方法包括将含有多个颗粒的样品引入流式细胞仪，从一个或多个流式细胞仪测量中获得所述多个颗粒的至少一个颗粒特征的估计，其中所述获得步骤包括当颗粒流过流式细胞仪时用具有彼此偏移一个射频(例如，在约50MHz至约250MHz的范围内的射频)的至少两个光学频率的辐射照射颗粒以从该颗粒中引出辐射响应，检测来自该颗粒的辐射响应以生成与该响应相关的时间波形数据。该方法可以进一步包括处理时间波形数据以通过分析一个或多个调制所述时间波形数据的拍频来获得所述至少一个颗粒特征(如上面讨论的那些)的值，并且经由计算机处理器鉴别门控，该门控指示所述颗粒特征的值在预定范围内的所述颗粒中的一个或多个。通过举例的方式，辐射响应可以是以下中的任何一种：荧光辐射、散射辐射或透射辐射。
在一个方面，公开了一种在流式细胞术***中分选细胞的方法，该方法包括用具有彼此偏移一个射频的至少两个光学频率的辐射照射细胞以从该细胞引出荧光辐射，检测该荧光辐射以生成时间荧光数据，并且处理该时间荧光数据以得出关于该细胞的分选决定。在一些实施方案中，可以在并未基于荧光数据生成细胞的图像(即，逐像素图像)的情况下作出分选决定。换句话说，虽然荧光数据可以含有将允许生成逐像素荧光强度图的图像数据，但是该方法在不生成这种图的情况下得出分选决定。在一些情况下，可以用小于约100微秒的延迟时间作出分选决定。在一些实施方案中，上述分选细胞的方法可以具有亚细胞分辨率，例如，分选决定可以是基于细胞组分的特征。在采用超过两个频移光学频率的一些实施方案中，采用单个射频偏移来分离光学频率，而在其他此类实施方案中采用多个不同的偏移。
处理步骤可以包括分析一个或多个调制荧光数据的拍频，以便得出分选决定。拍频可以对应于射频偏移光学频率的频率之间的差异。例如，当光束包括在发光细胞处干扰并且具有由射频分离的两个光学频率的两个小束时，拍频对应于光学频率之间的差。拍频典型地在约1MHz至约250MHz的频率范围内。
在一些实施方案中，处理步骤可以包括对荧光数据进行操作以获得细胞特征的估计并基于该估计作出分选决定。可以采用细胞的各种不同的特征。例如，细胞的特征可以涉及细胞组分的特征和/或细胞或其组分响应激发辐射的方式。通过举例的方式，细胞特征可以与细胞的内部细胞器相关，如其细胞核的尺寸。可以使用的细胞特征的一些例子包括但不限于细胞尺寸、细胞沿不同维度的尺寸比率、由与细胞相关的两种或更多种标记发射的荧光辐射的共定位、细胞的细胞质与其细胞核尺寸比率、从细胞发射的荧光辐射的点状度、荧光辐射的空间分布的量度、细胞的位置和/或取向的量度、细胞的偏心率的量度、细胞与参考细胞相似性的量度、细胞的一个或多个空间傅里叶分量的组合、细胞位于照射辐射焦点的程度的量度。应当理解的是，本传授内容不限于所列举的特征，而是可以与细胞的任何合适的特征结合使用。
在一些实施方案中，处理步骤足够快使得与得出分选决定相关的延迟时间小于约100微秒，例如，在约10微秒至约100微秒的范围内、或在约20微秒至约80微秒的范围内、或在约30微秒至约50微秒的范围内。
在一些实施方案中，光束被配置成使得照射细胞内的多个空间位置中的每一个的光学频率对应于射频偏移光学频率中不同的一个。通过举例的方式，在一些实施方案中，光束可以包括多个在角度或空间上分离的小束，每个小束相对于另一个具有射频偏移。
在一些实施方案中，可以用至少两种荧光标记将细胞染色，并且将光学辐射配置成从那些标记引出荧光辐射。可以将荧光辐射收集并数字化以生成时间荧光波形(即，作为时间的函数的指示荧光强度的波形)，每个波形对应于一个标记。处理步骤包括对波形进行操作以获得对应于荧光标记的荧光信号的共定位的量度，并基于共定位估计作出分选决定。特别地，该方法可以包括将高通或带通滤波器应用于至少一个波形以生成至少一个滤波波形、随后进行波形的逐点乘法以生成合成乘法波形，对乘法波形进行积分以获得积分值，并将积分值与预定阈值进行比较以获得共定位的量度。在一些实施方案中，共定位量度的确定可以包括将高通或带通滤波器应用于至少一个波形以生成至少一个滤波波形、随后进行波形的逐点乘法以生成合成乘法波形，对乘法波形进行积分以获得积分值，从积分值中减去背景值，并按强度换算合成值以生成最终值，并将最终值与预定阈值进行比较以获得共定位量度。可以采用共定位的量度来得出关于细胞的分选决定。
在一些实施方案中，处理步骤包括对荧光数据进行操作以获得细胞尺寸的估计并基于所估计的细胞尺寸作出分选决定。通过举例的方式，可以分析荧光数据以获得在流式细胞术***中细胞流动方向(即，沿着与细胞流动方向基本上平行的方向)的细胞尺寸或细胞的侧向尺寸(例如，在与细胞流动方向正交的方向上)的估计。在一些此类实施方案中，可以基于由细胞发射的荧光辐射的脉冲的时距来估计细胞流动方向上的细胞尺寸。此外，可以通过将检测到的荧光数据平方、将带通滤波器应用于平方的荧光数据、对滤波数据进行积分、并将滤波数据与预定阈值进行比较来获得细胞侧向尺寸的估计。在一些情况下，处理步骤包括对荧光数据进行操作以获得沿两个不同维度的细胞尺寸的比率，并利用该比率作出分选决定。
在一些实施方案中，细胞用两种荧光标记进行标记，其中一种荧光标记联接到细胞的膜且另一种联接到细胞的细胞核。施加到细胞的光学辐射被配置成从两种标记引出荧光。在两个不同的通道中检测由两种标记发射的荧光信号并对其进行分析以获得细胞质的尺寸相对于细胞核的尺寸的比率的估计。基于该比率作出关于该细胞的分选决定。
在一些实施方案中，该方法包括获得荧光数据的傅里叶变换，并确定在该变换中与用于调制光学辐射的射频不同的频率，该光学辐射用来从细胞引出荧光辐射。可以获得在那些不同频率处的傅里叶变换值的总和，并将其与预定阈值进行比较以作出分选决定。通过举例的方式，不同频率可以是用于调制光学辐射的那些频率之间的一个或多个频率。
在相关方面，公开了一种用于在流式细胞术***中分选细胞的方法，该方法包括用具有彼此偏移一个或多个射频的两个或更多个光学频率的辐射照射细胞以从该细胞引出荧光辐射，检测该荧光辐射以生成时间荧光数据，并且处理该时间荧光数据以用等于或小于约100微秒的延迟时间得出关于该细胞的分选决定。通过举例的方式，可以用在约10微秒至约100微秒的范围内、或在约20微秒至约80微秒的范围内、或在约30微秒至约50微秒的范围内的延迟时间作出分选决定。
在上述方法中，处理步骤可以包括对荧光数据进行操作以获得细胞的至少一个特征的估计并基于该估计作出分选决定。此外，处理步骤可以包括分析在与光学辐射的光学频率的干扰相关的一个或多个拍频处的荧光数据的调制，以便得出分选决定。
在另一个方面，公开了一种在流式细胞术***中分选细胞的方法，该方法包括将多个细胞(每个细胞与至少一个荧光团相关联)以大于约1000个细胞每秒的速率一次一个地引入光学询问区域，以用射频调制的光学辐射照射每个细胞，以便从一个或多个荧光团引出荧光辐射。对于每个细胞，检测从细胞发射的荧光辐射以生成时频波形，并且处理该波形以得出关于细胞的分选决定。该方法可以进一步包括基于该分选决定将细胞引导到多个容器中的一个中。
在另一个方面，公开了一种分选颗粒(例如，生物颗粒如细胞)的方法，该方法包括用射频调制的光束照射颗粒以便从该颗粒引出荧光辐射和散射辐射中的任何一种，检测从该颗粒发出的荧光辐射或散射(或透射)辐射以生成荧光或散射(或透射)波形数据，并且在并未基于该数据计算该颗粒的图像(即，逐像素荧光或散射(或透射)强度图)的情况下处理任何荧光和散射(或透射)数据以作出关于该颗粒的分选决定。光束可以是例如激光束。此外，在一些实施方案中，光束可以具有在约300THz至约1000THz范围内的光学频率。通过举例的方式，在一些实施方案中，光束的射频调制可以通过以在约50MHz至约250MHz范围内(例如，在约100MHz至约200MHz的范围内)的射频调制该光束来实现。此外，在一些实施方案中，射频调制的光束可以包括多个在角度或空间上分离的小束，每个小束相对于另一个具有射频偏移。在上述方法中，处理步骤可以包括分析在任何荧光辐射或散射辐射中检测到的一个或多个拍频以得出分选决定。拍频可以对应于照射颗粒(例如，细胞)的光学辐射的光学频率。
在相关方面，公开了一种用于确定颗粒特征的***，该***包括照射***，其用于利用射频调制的光学辐射照射颗粒；检测***，其用于检测响应于所述照射从颗粒发出的荧光辐射和散射辐射中的任何一种以生成荧光或散射数据；以及与所述检测***通信的分析模块，其用于接收所述荧光和散射数据并处理所述数据以计算颗粒的至少一个特征的估计。在一些实施方案中，在并未基于所述荧光或散射数据形成颗粒的图像的情况下，分析模块可以计算颗粒的至少一个特征的估计。通过举例的方式，颗粒的至少一个特征可以包括以下中的任何一个：颗粒的维度尺寸、颗粒沿两个不同维度的尺寸比率、由与颗粒相关的两种或更多种标记发射的荧光辐射的共定位、从颗粒发射的辐射辐射的点状度、荧光辐射的空间分布的量度、颗粒的位置或取向的量度、颗粒的偏心率的量度、颗粒与参考颗粒相似性的量度、颗粒的一个或多个空间傅里叶分量的组合、颗粒位于照射辐射焦点的程度的量度。
上述***可以用于获得各种不同颗粒的至少一个特征的估计。通过举例的方式，颗粒可以是以下中的任何一种：细胞、微囊泡、细胞碎片、脂质体、珠粒和小生物体。在一些实施方案中，颗粒是细胞，并且所确定的特征是细胞的细胞质和细胞核的尺寸比率。
在上述***的一些实施方案中，照射***可以包括包含多个在角度或空间上分离的小束的光束，这些小束具有彼此分离至少一个射频的光学频率。在一些此类实施方案中，照射***可以包括用于生成激光束的光源、接收所述激光束的单个声光偏转器(AOD)、以及射频(RF)梳状发生器，该射频梳状发生器用于将多个RF驱动信号施加到所述AOD以将所述接收的激光束衍射成所述多个在角度上分离的小束。
在另一个方面，公开了一种用于分选颗粒(例如，生物颗粒)的***，该***包括照射***，其用于利用射频调制辐射来照射颗粒；检测***，其用于检测响应于该照射从该颗粒发出的荧光和散射(或透射)辐射中的任何一种以生成荧光或散射数据(或透射数据)；与该检测***通信的分析模块，其用于接收荧光和/或散射(或透射)数据并且在并未基于荧光和/或散射(或透射)数据来形成颗粒图像的情况下处理该数据以得出关于该颗粒的分选决定；以及致动器，其能够将颗粒从其流动路径转移(如果需要)以基于所述分选决定分离容器。在一些实施方案中，射频调制的辐射可以处于由多个在角度或空间上分离的小束构成的光束的形式，每个小束相对于另一个具有射频偏移。
通过结合相关附图参考以下详细描述，可以获得对本发明各个方面的进一步理解，这些附图在下面简要描述。
附图说明
图1示意性地描绘了根据本发明的实施方案的***，
图2A是在与光束传播方向垂直的平面中的高斯光束的示意性示例性轮廓，
图2B是通过使图2A中所示的高斯光束穿过顶帽型光束整形器并聚焦光束整形器的输出光束获得的示意性顶帽型光束轮廓，
图3示意性地描绘了示例性顶帽型光束整形器的部件，
图4示意性地描绘了多个RF梳状光束的横截面光束轮廓，
图5示意性地描绘了图4中描绘的RF梳状光束和具有顶帽型光束轮廓的LO光束的叠加，
图6示意性地描绘了图5中所示的组合光束照射处于分析中的样品，
图7示意性地描绘了假设荧光团的示例性能级，
图8示意性地描绘了对应于图7的假设荧光团的吸收曲线，
图9A示意性地描绘了根据本传授内容的实施方案的检测***，其包括用于传输荧光辐射的光纤，
图9B示意性地描绘了根据本传授内容的实施方案的另一个检测***，其中荧光辐射通过自由空间传播以到达多个光检测器，
图9C示意性地描绘了用于在本传授内容的一些实施方案中使用的明视场和暗视场图像生成臂，
图9D示意性地描绘了用于在本传授内容的一些实施方案中使用的检测***，其包括用于生成明视场图像的检测臂以及集成了用于检测从样品散射的激发辐射和由样品发射的荧光辐射的能力的检测臂，
图10示意性地描绘了由根据本发明的***的实施方案中的光检测器生成的荧光信号可以通过放大器放大并且放大的信号可以通过分析模块分析以构建分析中的样品的荧光图像，
图11A和图11B描绘了根据本发明的实施方案的方法中用于分析通过利用由多个RF梳状光束和顶帽型轮廓的LO光束构成的组合光束照射样品而获得的荧光信号的各个步骤，
图12示意性地描绘了根据本发明的实施方案的分析模块的示例性硬件实现方式的所选部件，
图13A和图13B描绘了根据本发明的实施方案的另一种方法中用于分析通过利用由多个RF梳状光束和顶帽型轮廓的LO光束构成的组合光束照射样品而获得的荧光信号的各个步骤，
图14A和图14B描绘了根据本发明的实施方案的又另一种方法中用于分析通过利用由多个RF梳状光束和顶帽型轮廓的LO光束构成的组合光束照射样品而获得的荧光信号的各个步骤，
图15A示意性地描绘了在单个激发频率下通过顶帽型轮廓的光束照射样品，
图15B是根据本传授内容的实施方案的允许荧光寿命测量和荧光寿命成像的***的示意图，
图16A是描绘用于确定流过流式细胞术***的颗粒的至少一个特征的估计的各个步骤的流程图，
图16B示意性地描绘了根据实施方案的用于确定流过流式细胞术***的颗粒的至少一个特征的估计的***，
图16AA是描绘根据实施方案的用于基于一个或多个颗粒特征的值来门控流式细胞术***中的颗粒的方法中的各个步骤的流程图，
图16C是描绘用于基于在两个或更多个不同频率通道中从颗粒(例如，细胞)发射的荧光辐射的共定位来作出分选决定的实施方案中的各个步骤的流程图，
图17示意性地描绘了对应于在图16的流程图中所示的方法中使用的两个通道及其乘积的假设荧光时间-频率波形，
图18A显示了标记为A、B、C和D的四种细胞的荧光图像，包括通过用绿色染料和红色染料标记细胞获得的绿色和红色荧光图像以及明视场、暗视场图像，
图18B显示了针对图18A中所示的细胞所测量的绿色荧光时域信号，
图18C显示了针对图18A中所示的细胞所测量的红色荧光时域信号，
图18D显示了对于每种细胞，通过将图18B和图18C中所示的归一化红色和绿色荧光波形相乘并使合成波形通过低通滤波器而获得的共定位时域波形，
图19显示了针对细胞A、B、C和D中的每一种细胞的积分滤波信号的值(该图中的虚线表示分选阈值)，
图20是描绘根据本发明的实施方案在基于细胞尺寸进行细胞分选中的各个步骤的流程图，
图21A示意性地描绘了由包含多个射频调制小束的假设光束照射的假设细胞，
图21B示意性地描绘了从图21A中所示的照射细胞获得的假设荧光波形以及通过对荧光波形求平方获得的波形，
图22是描绘用于基于细胞的纵横比分选细胞的方法中的各个步骤的流程图，
图23A是描绘用于估计细胞的细胞核和细胞的细胞质的尺寸比率的方法中的各个步骤的流程图，
图23B是描绘用于基于细胞的细胞核和细胞的细胞质的尺寸的估计比率分选细胞的方法中的各个步骤的流程图，
图24A是描绘用于估计从细胞发射的荧光辐射的细胞粒度的方法中的各个步骤的流程图，
图24B是描绘用于基于从细胞发射的荧光辐射的估计细胞粒度分选细胞的方法中的各个步骤的流程图，
图25示意性地显示了用于调制在图24的流程图中描述的方法中用于从细胞引出荧光辐射的光束的调制频率，
图26示意性地描绘了结合本传授内容的用于分选细胞的分选***，
图27示意性地描绘了在图26的***中采用的分析/控制模块的示例性实现方式，
图28是描绘根据实施方案在用于确定特征或颗粒并使用该特征作出分选决定的示例性方法中的各个步骤的流程，以及
图29是多个细胞的竖直和水平二阶中心矩的散点图。
具体实施方式
本传授内容总体上涉及用于在流式细胞仪中确定颗粒(如细胞)的一个或多个特征并且在一些实施方案中使用那些特征来分选颗粒的方法和***。在下面讨论的实施方案中，这些方法采用计算机处理器用于它们的实现方式。除非另有说明，否则下面用于描述本传授内容的各种术语具有它们在本领域中的普通含义。例如，在本文使用的术语“荧光团”与它在本领域中的常规含义一致，是指可以响应于由激发辐射照射而发射辐射的荧光化学化合物。
使用的术语“细胞计数”和“流式细胞术”也与它们在本领域中的常规含义一致。特别地，术语“细胞计数”可以是指用于鉴定和/或分选或以其他方式分析细胞的技术。术语“流式细胞术”可以是指细胞计数技术，其中存在于流体流中的细胞可以例如通过用荧光标记标记它们并经由辐射激发检测荧光标记来进行鉴定、和/或分选、或以其他方式分析。如本文使用的术语“约”和“基本上”表示相对于包括数值的特性的10％或5％的最大变化。
用于确定颗粒(如细胞)的特征和分选颗粒的本发明的教导可以按各种不同的方式实施。可以通过使用各种***获得用于作出分选决定的荧光和/或散射数据。在一些实施方案中，通过具有多个射频偏移小束的光束照射颗粒，并且根据本传授内容收集和分析来自颗粒的荧光以作出分选决定。下面描述可以在其中并入本传授内容的用于从颗粒引出荧光数据的这种***的一些例子，随后详细描述根据本传授内容的用于分选颗粒的方法和***。
通过举例的方式，图1示意性地描绘了可以在其中并入用于分选颗粒的本传授内容的用于进行细胞计数的***10。***10可以按三种操作模式进行操作。如下面更详细讨论的，在一种操作模式中，可以用多个激发频率同时照射研究中的样品，每个激发频率可以例如通过移动激光束的中心频率来获得。更具体地，通过将参考激光束(本文也称为本机振荡器光束)与多个射频偏移的激光束混合而生成的激光束可以同时照射多个样品位置，使得每个样品位置都被参考光束和一个射频偏移光束照射以在该位置激发感兴趣的荧光团(如果存在)。在一些实施方案中，参考光束本身可以经由激光束的射频偏移生成。因此，样品的每个空间位置可以“标记”有不同的拍频，该拍频对应于参考光束的频率与射频偏移光束之一的频率之间的差。换句话说，由荧光团发射的荧光辐射将在空间上编码拍频。可以检测荧光发射并且可以分析其频率分量以构建样品的荧光图像。
在另一种操作模式中，可以通过多个激发频率的激光束在一定时间间隔内连续照射样品。在一些此类实施方案中，可以通过将时变驱动信号施加到接收激光束的声光偏转器(AOD)来获得激发频率。在许多实施方案中，激光束具有数百太赫兹(THz)范围内(例如，在约300THz至约1000THz的范围内)的频率。施加到AOD的驱动信号典型地在射频范围内，例如，在约10MHz至约250MHz的范围内。激光束通过AOD生成多个衍射光束，每个衍射光束对应于不同的衍射级。虽然第零衍射光束相对于输入激光束的频率没有表现出频移，但是较高阶衍射光束相对于输入激光束的频率表现出与驱动信号的频率或其倍数对应的频移。在一些实施方案中，具有由驱动信号偏移的与输入激光束的频率对应的频率的一阶衍射光束被用作激发感兴趣的荧光团(如果分析中的样品中存在)的激发光束。随着驱动信号随时间变化，一阶衍射光束的频率和角度偏移也变化，从而允许在不同位置处以不同激发频率照射样品。可以收集并分析来自每个照射位置的荧光发射(如果有的话)以构建样品的荧光图像。
在又另一种操作模式中，***10可以***作以通过单个激发频率同时照射样品的多个位置，该单个激发频率可以例如通过使激光束的中心频率偏移一个射频来生成。例如，可以通过激光束以单个激发频率照射样品的水平范围。检测到的荧光辐射可以用于分析样品(例如细胞/颗粒)的荧光含量。
因此，除了下面讨论的其他优点之外，***10的一个优点是它提供了在不同模式下获得荧光发射数据而不需要在不同操作模式之间切换时使用不同的仪器或对***进行任何机械修改的显著灵活性。
在某些实施方案中，***包括一个或多个光源。在一些情况下，光源是窄带光源，包括但不限于窄波长LED、激光器或联接到一个或多个光学带通滤波器的宽带光源、衍射光栅、单色器或其任何组合，它们组合在一起产生一窄带照射光。在某些情况下，光源是单波长激光器，如单波长二极管激光器(例如，488nm激光器)。在一些实施方案中，主题***包括单个光源(例如，激光器)。在其他实施方案中，主题***包括两个或更多个不同的光源，如3个或更多个不同的光源、如4个或更多个不同的光源、并且包括5个或更多个不同的光源。例如，***可以包括输出第一波长的第一光源(例如，激光器)和输出第二波长的第二光源。在其他实施方案中，***包括输出第一波长的第一光源、输出第二波长的第二光源和输出第三波长的第三光源。
每个光源可以具有从300nm至1000nm、如350nm至950nm、如400nm至900nm并且包括从450nm至850nm范围内的波长。在某些实施方案中，光源具有对应于一种或多种荧光团的吸收最大值的波长(如下所述)。例如，光源可以输出具有以下波长的光，该波长在280-310nm、305-325nm、320-350nm、340-375nm、370-425nm、400-450nm、440-500nm、475-550nm、525-625nm、625-675nm和650-750nm中的一个或多个的范围内。在某些实施方案中，每个光源输出具有以下波长的光，该波长选自：348nm、355nm、405nm、407nm、445nm、488nm、640nm和652nm。
***10包括生成激光束14的激光学辐射源12。通过举例的方式，激光束可以具有在约1000THz至约300THz的范围内的频率，对应在约300nm至约1000nm范围内的真空波长。激光束的光束直径(例如，当采用高斯激光束时的束腰)可以是，例如，在约0.1mm至约10mm的范围内。在不失任何一般性的情况下，在该实施方案中，激光器12发射488nm波长和约1mm光束直径的辐射。
可以基于***所针对的一个或多个特定应用来选择激光束的频率。具体地，如下面更详细讨论的，激光频率可以适合用于激发感兴趣的荧光团的电子跃迁，例如经由辐射吸收，从而导致该荧光团以较低的频率发射荧光辐射。可以使用各种激光源。此类激光源的一些例子包括但不限于由美国加利福尼亚州圣克拉拉(Santa Clara,CA U.S.A.)的相干公司(Coherent,Inc.)销售的Sapphire 488-SF、Genesis MX-488-1000-STM(相干公司)、OBIS405-LX(相干公司)、由美国加利福尼亚州萨克拉门托(Sacramento,CA U.SA.)的沃特兰激光技术公司(Vortran Laser Technology,Inc.)销售的Stadus 405-250、和美国加利福尼亚州尔湾(Irvine,CA U.S.A.)的纽波特公司(Newport Corporation)的LQC-660-110。在不失任何一般性的情况下，在本实施方案中，假设激光束在与其传播方向垂直的平面中具有高斯强度分布。
镜子16接收激光辐射束14并经由反射将激光束引导到声光偏转器(AOD)18。在该实施方案中，AOD 18被安装在可调节的后支架底座(A)上，该后支架底座允许AOD围绕与束14的传播方向垂直的轴旋转。在控制器21的控制下操作的直接数字合成器(DDS)20可以将一个或多个驱动信号施加到AOD 18。通过举例的方式，在一些实施方案中，这些驱动信号可以跨越约50MHz至约250MHz的频率范围。例如，施加到AOD的驱动信号可以在从约55MHz至约255MHz、如从约60MHz至约200MHz、如从约65MHz至约175MHz、如从约70MHz至约150MHz并且包括从约75MHz至约125MHz的范围内。在一些实施方案中，驱动信号可以彼此分离在约0.1MHz至约4MHz范围内的频率。例如，驱动信号可以彼此分离从约0.2MHz至约3.9MHz、如从约0.3MHz至约3.8MHz、如从约0.4MHz至约3.7MHz、如从约0.5MHz至约3.6MHz并且包括从约1MHz至约3.5MHz的频率。在该实施方案中，电子功率放大器21'放大由DDS 20生成的射频信号以施加到AOD 18。
在用多个激发频率同时照射样品的操作模式中，RF梳状发生器20同时将多个RF驱动信号施加到AOD 18。通过举例的方式，同时施加的RF驱动信号的数量可以在约20至约200的范围内。激光束和驱动信号的相互作用导致生成多个在角度上分离的激光束，每个激光束相对于由激光器12生成的激光束的频率具有对应于驱动信号之一的频移。不受任何特定理论的限制，在AOD中，压电换能器可以在晶体(例如，石英晶体)中生成射频声子，并且由此类射频声子对激光束的光学光子的散射可以导致频移激光束的生成。这些频移光束22中的一个在本文被称为“本机振荡器”(LO)光束，并且频移光束24的其余部分在本文被称为“RF梳状光束”。频移光束的角间距可以是例如在约1毫弧度至约100毫弧度的范围内。例如，频移光束的角间距可以在从2毫弧度至约95毫弧度、如从3毫弧度至约90毫弧度、如从4毫弧度至约85毫弧度、如从5毫弧度至约80毫弧度并且包括从10毫弧度至约75毫弧度的范围内。
LO和RF梳状光束通过透镜26，该透镜在该实施方案中是焦距为约50mm的正透镜。在通过透镜26之后，LO激光束被镜子28截取，该镜子使LO光束在不同方向上(在该实施方案中，在与LO光束的原始传播方向基本上正交的方向上)重定向。镜子28相对于RF梳状光束定位，使得这些光束错过镜子28并传播到透镜30(其在该实施方案中具有200mm的焦距)。以这种方式，沿着不同的传播方向引导LO光束和RF梳状光束。以上面公开的方式使用传感器镜子28允许利用单个AOD来生成LO光束和RF梳状光束，并且以下面讨论的方式将它们组合以生成用于照射样品的激发光束。使用单个AOD而不是多个AOD(例如，两个AOD，一个用于生成LO光束，另一个用于生成RF梳状光束)，简化了***的设计并且进一步允许以多个不同的操作模式有效使用***的，如下面更详细讨论的。
在一些实施方案中，在与RF梳状光束重新组合之前修改LO光束的光束轮廓。例如，可以在空间维度、光束形状、强度、光束的空间分布或其任何组合方面调整(增大或减小)LO光束的光束轮廓。在某些实施方案中，修改LO光束的光束轮廓的空间维度。例如，可以调节光束轮廓以在一个或多个维度上如沿着与流动流的纵轴正交的轴延长光束轮廓。在根据这些实施方案的一个例子中，光束轮廓的空间维度(例如，在一个或多个维度中)可以增大1％或更多、如2％或更多、如3％或更多、如5％或更多、如10％或更多、如25％或更多、如50％或更多、如75％或更多、如90％或更多、如1.5倍或更多、如2倍或更多、如3倍或更多并且包括5倍或更多。在根据这些实施方案的另一个例子中，光束轮廓的空间维度(例如，在一个或多个维度中)可以减小1％或更多、如2％或更多、如3％或更多、如5％或更多、如10％或更多、如25％或更多、如50％或更多、如75％或更多、如90％或更多、如1.5倍或更多、如2倍或更多、如3倍或更多并且包括5倍或更多。
在其他实施方案中，修改LO光束的光束形状。例如，可以修改光束形状以在一个或多个维度上延长光束轮廓。在某些情况下，LO光束的光束形状在与LO光束传播方向垂直的平面中延长。在某些实施方案中，LO光束轮廓的形状从圆形光束轮廓变为椭圆形光束轮廓，该椭圆形光束轮廓在与流动流的纵轴垂直的轴上延长。在其他实施方案中，LO光束轮廓的形状从圆形光束轮廓变为矩形光束轮廓，该矩形光束轮廓在与流动流的纵轴垂直的轴上具有长维度。在仍其他实施方案中，修改LO光束的强度。例如，LO光束的强度可以增大如1％或更多、如2％或更多、如3％或更多、如5％或更多、如10％或更多、如25％或更多、如50％或更多、如75％或更多、如90％或更多、如1.5倍或更多、如2倍或更多、如3倍或更多并且包括5倍或更多。在某些实施方案中，修改LO光束的强度以匹配RF梳状光束的强度。例如，LO光束可以具有如下强度，该强度与RF梳状光束的强度相差10％或更少、如9％或更少、如8％或更少、如7％或更少、如6％或更少、如5％或更少、如4％或更少、如3％或更少、如2％或更少、如1％或更少、如在0.01％或更少并且包括LO光束的强度与RF梳状光束相差0.001％或更少的情况。在某些情况下，LO光束和RF梳状光束的强度是相同的。
在又其他实施方案中，还可以修改光束轮廓的空间分布。例如，可以修改LO光束使得LO光束的强度在一个或多个维度上不再是高斯分布。例如，可以修改LO光束以沿着与流动流的纵轴平行的第一轴具有高斯分布，并且沿着与流动流的纵轴正交的第二轴具有非高斯分布。
可以采用任何光束整形协议来修改LO光束的光束轮廓，包括但不限于折射和衍射光束整形协议。在一些实施方案中，LO光束被顶帽型光束整形器修改。
在该实施方案中，LO光束传播到另一个正透镜32(其在该实施方案中具有约200mm的焦距)。透镜26和透镜32的组合放大并使LO光束准直，以便适当地填充顶帽型光束整形器34的后孔。更具体地，LO光束22通过透镜32并被镜子33和35反射到顶帽型光束整形器34上。
顶帽型光束整形器34对高斯LO光束的相前进行整形，以能够形成顶帽型强度分布。更具体地，离开顶帽型光束整形器的LO激光束22'被分束器44反射，并被透镜46(其在该实施方案中具有100mm的焦距)聚焦到中间图像平面48上。中间图像平面48上的激光束沿着与光束传播方向垂直的平面中的水平方向具有顶帽型强度分布。类似于AOD 18，在该实施方案中，分束器44被安装在可调节的后支架底座(B)上。在该实施方案中，顶帽型光束整形器生成顶帽型光束轮廓，其中辐射的偏振沿着光束的顶帽型方向(在该实施方案中沿着水平方向)是基本上均匀的。
通过说明的方式，图2A示意性地描绘了在LO激光束进入顶帽型光束整形器时该LO激光束的高斯强度分布。如图2B中示意性所示，在中间图像平面48上，LO激光束表现出在水平方向上(在该图解中与页面垂直的方向上)拉伸的光束轮廓，并且沿着延伸穿过轮廓的每条水平线(例如，水平线A)是基本上不变的，但根据高斯分布竖直地变化。
可以采用各种顶帽型光束整形器。通过举例的方式，具有非球面表面的折射光学元件或衍射光学元件可以用于产生具有适当空间相前的光束，这些光束在通过透镜聚焦后将在透镜的焦平面处产生顶帽型轮廓图案。对于此类顶帽型光束整形器存在多种形状因子，并且该方法的各种实现方式可用于在本传授内容的各种实施方案中在样品处产生适当的LO光束形状。例如，标题为“Refractive optical system that converts a laser beamto a collimated flat-top beam”的美国专利号6,295,168和标题为“Rectangular flat-top beam shaper”的美国专利号7,400,457(这两个专利均通过引用以其全文并入本文)公开了可以在根据本传授内容的一些实施方案的***中用作平顶光束整形器的光束整形***。通过说明的方式，图3是美国专利号7,400,457(具有不同的附图标记)中的图1的再现，示意性地描绘了用于提供正方形或矩形光束的光束整形***300，该光束整形***包括两个正交设置的圆柱形透镜302和304。第一圆柱形透镜302用于沿X轴将入射光束A整形，并且第二圆柱形透镜304用于沿Y轴将入射光束A整形。两个交叉的圆柱形透镜适于提供沿X轴具有平顶轮廓的合成矩形激光束B。圆柱形透镜302的输入表面302a是凸圆柱形表面，其具有可变曲率半径，该曲率半径在表面的中心处较小并且朝向透镜的两个X-末端平滑地增加。第二圆柱形透镜304类似于第一圆柱形透镜，但相对于透镜302正交设置，以便沿Y轴将光束整形。透镜302和304的输入表面302a/304a和输出表面302b/304b的轮廓可以随着入射光束A的X和Y分布以及合成矩形光束B的所希望强度分布的变化独立地选择(参见例如该专利的第5和6列)。
可以使用的可商购的顶帽型光束整形器的例子包括例如由加拿大拉钦(Lachine,Canada)的奥赛拉公司(Osela,Inc.)销售的DTH-1D-0.46deg-4mm。
如下面更详细讨论的，使用光束整形器沿水平方向拉伸LO光束提供了许多优点。例如，它可以确保LO光束和RF梳状光束的组合以基本上相似的照射强度照射多个样品位置，以便在整个样品上匹配LO和RF梳状光束的强度，因而造成荧光信号的强度幅度调制具有高调制深度。在不存在这种强度匹配的情况下，成像***可能具有小视图并且可能不利用驱动AOD的所有频率(像素)。由于荧光信号的调制深度在***重建样品的荧光图像的能力中起重要作用，因此激发拍频在所有像素处的均匀高调制深度对于***的操作特别有利。此外，可以通过控制直接数字合成器的输出(例如，通过采用控制器21)来调节施加到AOD以生成RF梳状光束的电子信号的幅度，以便均衡RF梳状光束使得它们的强度在RF梳状光束和LO光束重叠的所有空间位置上都等于LO光束的强度。该特性提供的优点在于其确保了荧光辐射的强度幅度调制的高调制深度。
再次参考图1，RF梳状光束24经由透镜26和30的组合在中间图像平面38上成像。更具体地，RF梳状光束24通过透镜26并且错过镜子28以到达透镜30，透镜30经由镜子40和42将RF梳状光束引导到中间图像平面38上。
图4示意性地描绘了示例性数量的RF梳状光束在中间图像平面38中的分布(在不失一般性的情况下，出于说明的目的，RF梳状光束的数量被选择为6(标记为RF1、...、RF6)，但是也可以使用其他数量。如图4所示，在中间图像平面38中，RF梳状光束24沿水平方向在空间上彼此分离。在其他实施方案中，两个或更多个RF梳状光束24可以部分重叠。因此，透镜26和30的组合将在角度上分离的RF梳状光束转换成跨越水平范围的一组在空间上分离的光束。
再次参考图1，如上所讨论，分束器44接收离开顶帽型光束整形器34的激光束22'并将该光束反射到透镜46，该透镜进而将该光束聚焦在LO光束展现顶帽型光束轮廓的中间图像平面48上。分束器还从中间图像平面38接收RF梳状光束24，并允许RF梳状光束通过其中。透镜46将RF梳状光束24聚焦到中间图像平面48上，以与具有顶帽型光束轮廓的LO光束组合，以生成组合光束49。
通过说明的方式，图5示意性地描绘了组合光束49在与其传播轴垂直的平面中的一个示例性轮廓。组合光束的强度分布被生成为顶帽型LO光束的强度分布(由正方形示意性地示出)和RF梳状光束24的强度分布(每个由圆圈示意性地示出)的叠加。如下面更详细讨论的，LO光束和RF梳状光束的这种叠加沿水平范围提供多个拍频，每个拍频与沿该水平范围的一个空间位置对应。在照射样品的水平范围时，从样品的位置发射的荧光辐射经由幅度调制编码与照射该位置的辐射相关的拍频。
再次参考图1，正透镜50(在该实施方案中为200mm透镜)和物镜52(在该实施方案中安装在可调节的后支架底座C上)形成望远镜，该望远镜用于将中间平面48处的图像传递到流过流动池54的样品上。在该实施方案中，镜子56将组合光束49反射到透镜50，并且二向色镜58将在组合光束在其通过透镜50后朝向物镜52反射。
如图6中示意性所示，组合光束49同时照射流过流动池54的样品62的多个空间位置60。因此，每个位置60由RF梳形光束之一与顶帽型形状的LO激光束的一部分的重叠照射。在这些空间位置，辐射将激发样品中感兴趣的荧光团(如果存在)。更具体地，在该实施方案中，LO光束和RF梳状光束同时激发荧光团，例如，经由导致在多个样品位置60处其电子跃迁到激发电子态。
在一些实施方案中，样品可以包括流动流体，其中夹带有多个细胞。在一些情况下，细胞可以用一种或多种荧光标记(荧光团)标记。荧光标记的一些例子包括但不限于荧光蛋白(例如，GFP、YFP、RFP)；标记有荧光团(例如，荧光素异硫氰酸酯(FITC)、藻红蛋白(PE)、别藻蓝蛋白(APC))的抗体；核酸染色剂(例如，4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、SYTO16、碘化丙啶(PI))；细胞膜染色剂(例如，FMI-43)；和细胞功能染料(例如，Fluo-4、Indo-1)。在其他情况下，细胞中存在的内源荧光团可以用于从细胞引出荧光辐射。如下面更详细讨论的，此类外源或内源荧光团响应于照射辐射而经历电子激发并发射荧光辐射(通常以比激发频率低的频率)，该荧光辐射被收集和分析。
通过说明的方式而不限于任何特定理论，图7显示了与基态电子态A以及荧光团的两个电子激发电子态B和C对应的假设能级。荧光团可以经由辐射能的吸收从其基态电子态(A)激发到激发电子态(B)。然后荧光团可以弛豫到下部激发态B，例如，经由由荧光团的振动模式介导的无辐射跃迁。荧光团可以经由光学跃迁进一步从较低电子态C弛豫到基态，从而以比激发频率小的频率发射荧光辐射。应当理解，提供该假设例子仅用于说明目的，而不是指示可以发射荧光辐射的唯一机制。
在许多情况下，荧光团可以在一定频率范围内吸收电磁辐射，以从基态激发到激发电子态。通过说明的方式，图8显示了结合图7讨论的假设荧光团的吸收曲线。在根据本传授内容的实施方案的一个实现方式中，可以选择LO频率以与如下频率一致，该频率与感兴趣荧光团的峰值吸收对应。射频偏移光束可以具有通过它们各自的拍频与峰值吸收分离的频率。典型地，与荧光团的吸收带宽相比，这些频率分离较小，以便避免激发频率的任何降低。通过举例的方式并且仅通过说明的方式，虚线A和B示意性地描绘了LO光束和一个RF梳状光束的频率(为了便于描述，这些图未按比例绘制)。通过LO激光束和一个所描绘的RF梳状光束同时照射样品的空间位置导致荧光辐射表现出按与LO频率和RF梳状光束频率之间的差对应的拍频的幅度调制。
再次通过说明的方式而不限于任何特定理论，经由其通过LO光束和一个RF梳状光束的同时照射施加到荧光团的电场可以在数学上定义如下：
其中，
Ecom表示组合光束的电场，
ERF表示与一个RF梳状光束相关的电场的幅度，
ELO表示与LO光束相关的电场的幅度，
ω0表示由激光器12生成的激光束的频率，
ωRF表示与RF梳状光束相关的频移，并且
ωLO表示与LO光束相关的频移。
响应于LO和RF梳状光束的电场的叠加而发射的荧光辐射的强度将表现出按与(ωRF–ωLO)对应的拍频的调制。因此，从由LO光束和一个RF梳状光束的叠加照射的样品的每个空间位置发出的荧光辐射表现出按对应于与LO光束相关的射频偏移和与照射该空间位置的RF梳状光束相关的射频偏移之间的差的拍频的调制。
由于荧光发射过程需要有限的时间量(对于普通有机荧光团典型地为1-10纳秒)，如果激发拍频过高，发射的荧光将不会表现出高调制深度。因此，在许多实施方案中，选择激发拍频为大大小于1/τf，其中τf是荧光团的特征荧光寿命。在一些情况下，激发拍频可以比1/τf小1％或更多、如2％或更多、如3％或更多、如5％或更多、如10％或更多、如25％或更多、如50％或更多、如75％或更多、如90％或更多、如1.5倍或更多、如2倍或更多、如3倍或更多并且包括5倍或更多。例如，激发拍频可以比1/τf小0.01MHz或更多、如0.05MHz或更多、如0.1MHz或更多、如0.5MHz或更多、如1MHz或更多、如5MHz或更多、如10MHz或更多、如25MHz或更多、如50MHz或更多、如100MHz或更多、如250MHz或更多、如500MHz或更多并且包括750MHz或更多。在一些实施方案中，光检测器被配置成从辐照的样品中检测光(例如，发光如荧光)。在一些实施方案中，光检测器可以包括一个或多个检测器，如2个或更多个检测器、如3个或更多个检测器、如4个或更多个检测器、如5个或更多个检测器、如6个或更多个检测器、如7个或更多个检测器并且包括8个或更多个检测器。可以采用任何光检测协议，包括但不限于有源像素传感器(APS)、象限光电二极管、图像传感器、电荷耦合器件(CCD)、强化电荷耦合器件(ICCD)、发光二极管、光子计数器、测辐射热计、热电探测器、光敏电阻器、光伏电池、光电二极管、光电倍增管、光电晶体管、量子点光电导体或光电二极管及其组合，以及其他光检测器。在一些实施方案中，感兴趣的光检测器被配置成检测范围从350nm至1200nm、如从450nm至1150nm、如从500nm至1100nm、如从550nm至1050nm、如从500nm至1000nm并且包括从400nm至800nm的光。在某些实施方案中，光检测器被配置成检测发光的最大发射处的光，如在395nm、421nm、445nm、448nm、452nm、478nm、480nm、485nm、491nm、496nm、500nm、510nm、515nm、519nm、520nm、563nm、570nm、578nm、602nm、612nm、650nm、661nm、667nm、668nm、678nm、695nm、702nm、711nm、719nm、737nm、785nm、786nm、或805nm处的光。
在一些实施方案中，由样品发射的荧光辐射可以按各种不同方式收集，例如，沿着与激发光束的传播方向垂直的光路。在其他实施方案中，在外延方向上检测荧光辐射。
再次参考图1，在该实施方案中，由照射样品中存在的一种或多种荧光团发射的荧光辐射穿过物镜52并透过二向色镜58以到达光检测器64。更具体地，在该实施方案中，透镜65将透过二向色镜58的荧光辐射聚焦到缝隙孔径66上。透过狭缝的荧光辐射通过荧光发射滤波器68以到达光检测器64。设置在光检测器的前面的狭缝孔径66(或下面讨论的其他实施方案中的光学滤波器)基本上允许从样品的特定平面发射的荧光辐射通过，同时拒绝平面外的荧光发射。此外，荧光发射滤波器68(例如通带滤波器)允许荧光辐射通过到达光检测器64，同时基本上阻挡其他频率的辐射通过。
光检测器64具有足够的RF带宽，以检测和发送来自整个拍频范围的信号。合适的光检测器的一些例子包括但不限于光电倍增管、雪崩光电二极管、PIN光电二极管和混合光检测器等等。通过举例的方式，在一些实施方案中，可以使用由滨松公司(HamamatsuCorporation)销售的光电倍增管(例如，R3896、R10699、H11462)。响应于接收的荧光辐射的检测，光检测器生成信号，例如，在该实施方案中的模拟信号。
通过另一举例的方式并参考图9A，响应于LO光束和空间分离的RF梳状光束同时照射由样品发射的荧光辐射穿过物镜52和二向色镜58，该物镜和该二向色镜经由透镜100耦合到从近侧端部102a延伸到远侧端部102b的多模光纤102上。更具体地，光纤102的近侧端部102a被定位在透镜100的焦平面附近，以便接收荧光辐射。与光纤的远侧端部102b联接的输出耦合透镜104使离开光纤的辐射准直。
在许多情况下，照射样品的激发辐射激发多个荧光团(例如，有机荧光团)，这些荧光团可以具有足够宽的辐射吸收光谱，使得激发频率落在样品中多个荧光团的吸收光谱内。然后，每个荧光团将以不同的频率发射荧光辐射。在不失一般性的情况下且出于说明的目的，在该实施方案中，检测***包括四个光电倍增管106、108、110和112，每个光电倍增管接收与在照射的样品中由激发辐射激发的由四个荧光团之一发射的荧光辐射对应的准直辐射的一部分。更具体地，二向色镜114将由荧光团之一以第一频率发射的荧光辐射反射到光电倍增管106，同时允许其他频率的荧光辐射通过。另一个二向色镜116将由不同荧光团以不同的第二频率发射的荧光辐射反射到光电倍增管108，同时允许包含由又另一个荧光团以第三频率发射的荧光辐射的其余辐射到达第三二向色镜118，该第三二向色镜将该荧光辐射反射到光电倍增管110。二向色镜118允许包括由第四荧光团以第四辐射频率发射的荧光辐射的其余辐射通过以到达光电倍增管112。
将多个带通滤波器120、122、124和126(每个以四个荧光频率之一为中心)分别放置在光电倍增管106、108、110和112的前面。以下面讨论的方式分析由每个光电倍增管检测到的信号，以生成在相应荧光频率下的荧光图像。在一些实施方案中，不是使用多个光检测器，而是可以使用单个光检测器，例如单个光电倍增管来探测荧光辐射，例如与来自单个荧光团的发射对应的荧光频率。
在一些实施方案中，当样品流过流动池时，照射样品的不同水平行，并且通过一个或多个光检测器(例如光电倍增器106、108、110和112)检测与每个水平行相关的荧光辐射。
图9B示意性地描绘了与上面结合图9A所讨论的检测***类似的检测***，除了该检测***不是使用光纤，而是通过二向色镜58的包含来自多个荧光团的荧光发射的荧光辐射在自由空间中传播以到达光电倍增管106、108和112以外。更具体地，透镜100将荧光辐射聚焦到设置在透镜100和104之间的孔126上，其中该孔可以拒绝离焦辐射。透镜104使通过该孔的辐射准直，其中该准直辐射以上面结合图9A所讨论的方式分布在光电倍增管之间。
在一些实施方案中，***10可以被配置成使用激发辐射提供(在不存在样品的情况下流动池的)样品的暗视场图像和明视场图像。通过举例的方式，图9C示意性地描绘了***10的一个实施方案，其包括用于分别检测样品的暗视场图像和明视场图像的两个检测臂200和202。
更具体地，将检测臂200定位成垂直于激发辐射的传播，以便接收由流过流动池的样品散射的激发辐射的一部分。检测臂200包括两个透镜204和206，这两个透镜共同将由样品散射的激发辐射的至少一部分引导到立体角中，该立体角通过透镜204对向到光电倍增管208上。更具体地，透镜204使接收的散射辐射准直，并且透镜206将准直的散射辐射聚焦到光电倍增管208上。在该实施方案中，适当的带通滤波器210被设置在光电倍增管208的前面，以允许具有所希望频率的辐射通过到达光电倍增管208，同时阻挡不需要的频率的辐射。光电倍增管208的输出可以按本领域中已知的方式(例如通过分析模块(如下面讨论的分析模块))处理以生成暗视场图像。
检测臂202进而包括两个透镜212和214，其中透镜212在向前方向上(基本上沿着进入流动池54的激发辐射的传播方向)使离开流动池的激发辐射准直，并且透镜214聚焦该准直辐射到光检测器216上。设置在光检测器前面的适当滤波器218(例如带通滤波器)允许将激发频率透射到光检测器216，同时基本上阻挡其他辐射频率。可以按本领域已知的方式处理光检测器216的输出以生成流动池的明视场图像。
因此，检测臂200检测由流过池的流体散射的激发辐射，并且检测臂202检测透射通过流动池的激发辐射。当没有流体流过流动池时，由光电倍增管208检测到的信号是低的并且由光检测器216检测到的信号是高的，通过流动池的激发辐射几乎没有散射，因此很大百分比(并且在一些情况下所有)的激发辐射都透射通过流动池。相反，流体样品通过流动池的流动可以导致由光电倍增管208生成的信号增加，这是由于一部分激发辐射通过样品散射，并且随着透射通过流动池的激发辐射的水平降低，由光检测器216生成的信号减少。
通过进一步举例的方式并且参考图9D，在根据本传授内容的***的一个实施方案中，相对于流动池54在基本上与激发辐射的传播方向正交的方向上定位的检测臂220a包括用于检测由样品中的多个荧光团发射的荧光辐射以及由样品散射的激发辐射两者的光检测器。更具体地，检测臂220包括透镜222和224，这两个透镜将荧光辐射以及散射的激发辐射引导到孔226上，该孔拒绝未聚焦的辐射。透镜228使通过孔的辐射准直。二向色镜230将激发频率处的辐射的部分反射到光电倍增管232上，用于检测暗视场图像，同时允许荧光辐射通过。设置在光电倍增管232前面的适当滤波器232a，例如带通滤波器，允许激发频率处的辐射通过到达光电倍增管232，同时阻挡不需要的辐射频率。另一个二向色镜234将由荧光团以第一频率发射的荧光辐射反射到光电倍增管236上，同时允许由其他荧光团以其他频率发射的荧光辐射通过。另一个二向色镜238将由另一荧光团以第二频率发射的荧光辐射反射到光电倍增管240上，同时允许由又另一荧光团以第三频率发射的荧光辐射通过，在这里该荧光辐射被光电倍增管242检测。类似于前面的实施方案，多个滤波器236a、240a和242a分别被设置在光电倍增管236、240和242的前面，以允许所希望频率的辐射透射，同时基本上阻挡不需要的辐射频率。
继续参考图9D，根据本传授内容的***的这种实现方式进一步包括另一个检测臂220b，用于例如以结合图9C所讨论的方式生成明视场图像。更具体地，检测臂202包括两个透镜212和214，这两个透镜将光聚焦到光检测器216上，以生成激发辐射的明视场图像。滤波器218(例如带通滤波器)被放置在光检测器216的前面，以允许激发辐射通过以到达检测器，同时拒绝不需要的辐射频率。
再次参考图1以及图10，在该实施方案中，跨阻抗放大器70可以与光检测器64(或结合图9A至图9D所讨论的每个光检测器)的输出耦合，以放大由光检测器生成的信号。数据分析单元72(在本文也称为分析模块或分析器)接收放大的信号并分析该信号以生成样品的荧光图像。数据分析单元72可以在硬件、固件和/或软件中实现。通过举例，用于分析检测到的荧光数据的方法可以存储在分析模块的只读存储器(ROM)单元中，以在处理器的控制下访问以分析接收的荧光信号。
如下面更详细讨论的，分析方法确定时变光检测器输出的频率分量，并基于那些频率分量构建样品的荧光图像。可以采用各种方法用于确定光检测器输出的频率成分。此类合适方法的一些例子包括但不限于傅里叶变换、锁定检测、滤波、I/Q解调制、零差检测和外差检测。
通过举例的方式，图11A和图11B显示了可以由分析模块72执行以生成样品的荧光图像的示例性分析步骤。在步骤(1)中，将模拟放大信号数字化以生成数字化荧光数据。在步骤(2)中，选择数字化数据的适当部分(长度)用于分析。例如，可以选择与样品的照射行(在本文也称为帧)对应的荧光数据用于分析。可选地，可以选择一部分数据帧用于分析。
在步骤(3)中，执行所选数据的傅里叶变换。通过举例的方式，在一些实施方案中，执行数据的快速傅里叶变换(FFT)以确定数据的频率分量。在一些此类实施方案中，FFT的区间可以对应于为数据采集所选择的频率。例如，对于256MHz取样率，256个样品可以产生彼此分离1MHz的频率区间，例如从DC到128MHz。FFT分析提供与发射的荧光发射表现出幅度调制的拍频对应的频率。
继续参考图11A和图11B，在该实施方案中，在步骤(4)中，通过获得该频率分量的实分量和虚分量的平方和的平方根来计算FFT数据中存在的每个频率分量的幅度的量度。由于每个频率分量与用于从样品的特定位置引出荧光辐射的拍频之一对应，因此频率分量的幅度的量度可以提供与沿着样品的水平行的那个频率分量相关的位置的像素值。以这种方式，可以确定样品的水平行的图像的像素值。当样品在竖直方向上流过流动池时，可以重复针对样品的每个水平行获得的荧光数据的上述步骤。像素值可以用于构建荧光图像(步骤5)。
如上所述，分析模块72可以使用本领域中已知的技术并根据本传授内容在硬件、固件和/或软件中实现。通过举例的方式，图12示意性地描绘了分析器72的示例性实现方式，其包括模数转换器74用于接收来自放大器70的放大的荧光信号并将该信号数字化以生成数字化的荧光数据。分析模块进一步包括中央处理单元(CPU)76，用于控制分析模块的操作，包括执行计算和逻辑操作。分析模块还包括ROM(只读存储器)78、RAM(随机存取存储器)80和永久存储器82。通信总线84便于分析模块的各种部件之间的通信，包括CPU 76与其他部件之间的通信。存储器模块可以用于存储用于分析荧光数据的指令和分析结果。通过举例的方式，在一些实施方案中，用于数据分析的指令，例如，用于执行结合图11A和图11B所讨论的上述步骤的指令可以存储在ROM 78中。CPU可以采用存储在ROM 78中的指令来操作存储在RAM 80中的数字化荧光数据，以生成样品的荧光图像(例如，一维或二维图像)。CPU可以将荧光图像存储在永久存储器82中，例如，在数据库中。如图12中示意性所示，分析模块可以任选地包括图形处理单元(GPU)76'，用于根据接收的数据(例如，荧光数据)执行像素强度和其他量的计算。
在一些实施方案中，可以使用锁定检测技术来实现由光检测器生成的输出信号的频率解调制。通过举例的方式，参考图13A和图13B，在一个这样的实施方案中，将放大的荧光信号数字化(步骤1)并生成数字化荧光信号的若干个拷贝(步骤2)，其中数字化拷贝的数量(N)对应于与RF梳状光束相关的频率的数量。信号的每个数字化拷贝与正弦波和余弦波相乘以生成多个中间信号(步骤2)，该正弦波和余弦波具有与等于RF梳状光束之一和LO光束的频率之间的差的拍频对应的频率。每个中间信号通过低通滤波器(步骤3)，其具有等于RF梳状频率之间频率间隔的一半的带宽。
对于与RF梳状频率之一对应的每个拍频(换句话说，对于与照射样品的空间位置对应的每个频率)，与该频率对应的两个滤波中间信号的平方和的平方根是作为与由具有该频率的LO光束和RF梳状光束照射的样品位置对应的图像像素的幅度的量度获得(步骤4)。在一些实施方案中，可以按上面讨论的方式处理与相同拍频对应于即，与相同样品位置对应)的多个荧光数据信号，并且可以对像素值进行平均以便获得平均像素值。
当样品在竖直方向上流过流动池时，可以重复针对样品的每个水平行获得的荧光数据的上述步骤。像素值可以用于构建荧光图像(步骤5)。
上述锁定检测方法可以在软件、固件和/或硬件中实现。通过举例的方式，在一个实施方案中，上述锁定检测方法可以使用现场可编程门阵列(FPGA)来实现，尤其是如果使用多于6个频率。在一些实施方案中，可以采用多频锁定放大器，如由瑞士苏黎世(Zurich，Switzerland)的苏黎世仪器公司(Zurich Instruments)销售的HF2L-MF多频放大器。
通过进一步举例的方式，在一些实施方案中，可以通过采用基于带通滤波器的图像解调制技术来实现检测到的荧光信号的频率解调制。通过参考图14A和图14B，在这种频率解调制方法的一个实施方案中，将由光检测器64和放大器70提供的荧光信号数字化(步骤1)并且生成若干拷贝的数字化信号(步骤2)，其中数字化拷贝的数量(N)对应于与RF梳状光束相关的频率数量。通过使该信号通过以与RF梳状光束之一相关的拍频(即，与样品的特定位置相关的拍频)为中心的带通滤波器来过滤数字化荧光信号的每个拷贝(步骤3)。更具体地，每个带通滤波器以N个拍频中的一个为中心，并且具有等于相邻拍频之间的频率间隔的一半的带宽。
采用每个拍频处的包络检测器来为每条水平线估计与该频率对应的每个像素的幅度(步骤4)。在一些情况下，对应于一个像素的多个像素值被平均以获得平均像素值，该多个像素值通过处理对应于与该像素相关的样品位置的多个荧光信号获得。当样品在竖直方向上流过流动池时，可以重复针对样品的每个水平行获得的荧光数据的上述步骤。像素值可以用于构建样品的一维或二维荧光图像(步骤5)。
分析模块还可以被配置成接收和处理明视场和暗视场图像数据。例如，参考图9C和图10，分析模块72可以被进一步配置成从光检测器208和218接收暗视场和明视场图像数据，以生成暗视场和明视场图像。例如，参考图12，用于例如以本领域中已知的方式生成暗视场和明视场图像的指令可以存储在永久存储器82中。处理器76可以使用这些指令来处理接收的暗视场和明视场图像数据以生成图像。分析模块还可以被配置成通过将例如荧光图像与明视场和暗视场图像中的一个或两个重叠来生成合成图像。
荧光图像以及由根据本传授内容的***(如上述***10)生成的明视场和暗视场图像可以用于各种不同的方式。例如，可以对荧光图像进行积分以产生与由传统流式细胞仪产生的数据相当的值。还可以分析荧光图像以确定产生该图像的荧光探针的位置(例如，其可以确定探针是细胞核、细胞质、定位于细胞器、还是在细胞膜的外部)。此外，在一些应用中，通过检测不同荧光带(所有荧光带均取自相同细胞)获得的多个荧光图像可以用于确定细胞内多个荧光探针的共定位程度。另外，使用多色荧光、明视场和暗视场图像，有可能对细胞形态学、细胞信号传导、内化、细胞-细胞相互作用、细胞死亡、细胞周期和光斑计数(例如，FISH)等等进行分析。
如上所述，***10可以按至少三种不同的模式操作。在上面讨论的一种模式中，LO光束和多个RF梳状光束同时照射样品的一部分(例如，沿着水平范围设置的位置)，并且检测和分析从照射位置发射的荧光辐射以便构建样品的荧光图像。在另一种操作模式中，不是将多个RF驱动信号同时施加到AOD，而是将包含驱动信号的频率斜升施加到AOD使得激光束的频率随着时间从起始频率(f1)变化至结束频率(f2)。对于频率斜升中的每个驱动频率，激光束的频率偏移该驱动频率，并且由频移激光束照射样品以从样品引出荧光辐射。换句话说，在该模式中，操作该***以通过在时间间隔内以从中心激光频率偏移的多个频率连续照射样品来从样品获得荧光辐射。由AOD生成的频移伴随着角度偏转，使得使用相同的光路，光束以高速度扫描穿过样品。
更具体地，在该操作模式中，采用RF频率合成器10将施加到AOD 18的驱动信号从起始频率(f1)斜升到结束频率(f2)。通过举例的方式，驱动信号被斜升的频率范围可以为从约50MHz至约250MHz。在一些实施方案中，驱动信号从约100MHz斜升至约150MHz。在该实施方案中，驱动频率随着时间连续变化，例如，以实现高速度。在其他实施方案中，驱动频率可以按离散步长从起始频率(f1)变化至结束频率(f2)。
选择驱动频率使得频移光束将错过镜子28并沿着由透镜26、透镜30、镜子40/42、分束器44、透镜46、镜子56、透镜50、镜子58和物镜52限定的光路传播，以照射流过样品支架的样品的一部分。斜升率优选地是足够快的以便改善并优选地防止当样品流过光束时在基于发射的荧光辐射生成的荧光图像的竖直方向上的任何模糊。例如，这可以通过使斜升率与样品的流速相匹配来实现。样品处的激光光斑尺寸可以用于估计适当的斜升率。通过举例的方式，对于1微米的激光光斑尺寸，对于0.1米/秒的样品流速，穿过1条线的扫描时间应为10微秒或更少以避免图像模糊。
以上面讨论的方式收集和检测响应于激发辐射的照射从样品发射的荧光辐射。具体地，参考图10，荧光辐射由光检测器64检测。检测到的荧光由放大器70放大，并且放大的信号由分析模块72进行分析以重建样品的荧光图像。通过将水平像素位置分配到在从开始频率(f1)到结束频率(f2)的扫描周期内的特定时间来执行图像的重建。与在上述操作模式中分析频率分量的幅度以获得像素值相反，在该操作模式中使用的解调制方法仅使用检测到的荧光信号的时域值来将值分配到图像的像素。当样品在竖直方向上流动时可以重复该过程，以便获得样品的二维荧光图像。
由样品发射的荧光辐射(如果有的话)由光检测器64收集。参考图10，检测到的荧光辐射由放大器70放大。分析模块72接收放大的信号。在该操作模式中，分析模块分析荧光信号以确定样品(例如细胞/颗粒)的荧光含量。由于在该操作模式中仅存在一个激发样品的光束，因此不会响应于激发样品而生成拍频。因此，在荧光信号的频域中没有图像信息。当然，检测到的荧光信号具有在时域中编码的图像信息。在该操作模式中，可以使用检测到的荧光信号的时间值作为水平像素坐标，并且使用荧光信号的数字化电压值作为像素值(亮度)来数字化地重建图像。施加到AOD的驱动频率的每次扫描产生图像的一条水平线(行)。当样品流过照射区域(点)时，经由连续扫描实现图像重建。
在又另一种操作模式中，***10可以***作以通过单个激发频率同时照射样品的多个位置，该单个激发频率可以例如通过使激光束的中心频率偏移一个射频来生成。更具体地，再次参考图1，在这种操作模式中，可以将单个驱动射频施加到AOD 18，以生成具有相对于进入AOD 18的激光束偏移的频率的激光束。此外，频移激光束相对于进入AOD的激光束表现出角度偏移，使得射频激光束被镜子28拦截和反射，经由透镜32和镜子33和35朝向顶帽型光束整形器34。离开顶帽型光束整形器的光束被分束器44反射，并被透镜46聚焦到中间图像平面48上。在该平面中，如图15A中示意性所示，激光束1000显示沿水平方向的拉伸轮廓。
水平拉伸的激光束被镜子56反射到正透镜50。在通过透镜50之后，激光束被镜子58反射到物镜52。如上所讨论，正透镜50和物镜52形成望远镜，该望远镜用于将来自中间图像平面48的顶帽型轮廓的激光束传递到流过流动池54的样品上。
水平拉伸的激光束照射样品的水平范围，以沿着该水平范围激发感兴趣的荧光团(如果存在于样品中)。因此，在该操作模式中，与以不同激发频率照射样品的多个水平位置的第一操作模式不同，以相同的激发频率照射样品的多个水平位置。该操作模式让用户不能获得流过的细胞或颗粒的图像。然而，在该操作模式中，典型地可以向样品施加比在其他两种操作模式中更高的光功率，如果不需要图像，这对于获得更高的信噪比数据是有用的。仅通过改变驱动声光偏转器的电子信号就可进入该操作模式，而不需要对***进行任何机械改变。
因此，***10可以按三种不同的操作模式操作以从样品引出荧光辐射。
在一些实施方案中，可以在样品上的每个空间位置处执行荧光寿命测量，例如，通过将射频偏移和本机振荡器光束中的每一个的节拍的相位与检测到的荧光信号中的相应射频分量的相位进行比较。通过举例的方式，图15B显示了***10'，即上面讨论的***10的修改版本，其允许这种荧光寿命测量(为简洁起见，在该图中未描绘图1中所示的某些部件)。具体地，入射在分束器44上的RF梳状光束的一部分被分束器反射到会聚透镜400上(通过说明的方式，在该实施方案中，透镜400具有200mm的焦距，但是也可以使用其他焦距)。透镜400将RF梳状光束的该部分聚焦到光电二极管402上，该光电二极管检测激发光束。分析模块72可以接收光电二极管402的输出(参见图10)。分析模块可以提供激发光束的频率解复用(例如，使用上面讨论的解调制技术之一)，并且确定激发光束中每个射频分量的相位。这可以为检测到的荧光信号中的每个射频分量提供参考相位，可以将该射频分量的相位与该参考相位进行比较。例如，可以采用激发信号的FFT的实和虚分量或者锁定型解调制的I和Q分量。可选地，检测样品/流动池的明视场图像的检测器的输出可以用于获得参考相位，可以将荧光拍频的相位与该参考相位进行比较。
更具体地，分析模块72可以例如按上面讨论的方式提供检测到的荧光信号的频率解复用。如本领域技术人员将理解的，对于荧光信号中的每个拍频，可以将射频分量的相位与激发光束的相应参考相位进行比较，以获得空间分辨的荧光寿命测量和荧光寿命图像。
在某些实施方案中，主题***包括采用上述光学配置的流式细胞术***，该流式细胞术***用于检测由在流动流中的样品发射的光。在某些实施方案中，主题***是流式细胞术***，该流式细胞术***包括在以下中描述的流式细胞仪的一个或多个部件：美国专利号3,960,449；4,347,935；4,667,830；4,704,891；4,770,992；5,030,002；5,040,890；5,047,321；5,245,318；5,317,162；5,464,581；5,483,469；5,602,039；5,620,842；5,627,040；5,643,796；5,700,692；6,372,506；6,809,804；6,813,017；6,821,740；7,129,505；7,201,875；7,544,326；8,140,300；8,233,146；8,753,573；8,975,595；9,092,034；9,095,494；和9,097,640，这些专利的公开内容通过引用以其全文并入本文。
如上所讨论，在一些实施方案中，主题***被配置成用于使作为流动流(如在流式细胞仪的流动流中)流动的样品中的颗粒(例如，细胞)成像。颗粒在流动流中的流速可以为0.00001m/s或更多、如0.00005m/s或更多、如0.0001m/s或更多、如0.0005m/s或更多、如0.001m/s或更多、如0.005m/s或更多、如0.01m/s或更多、如0.05m/s或更多、如0.1m/s或更多、如0.5m/s或更多、如1m/s或更多、如2m/s或更多、如3m/s或更多、如4m/s或更多、如5m/s或更多、如6m/s或更多、如7m/s或更多、如8m/s或更多、如9m/s或更多、如10m/s或更多、如15m/s或更多并且包括25m/s或更多。例如，取决于流动流的尺寸(例如，流动喷嘴孔口)，流动流可以在主题***中具有以下流速：0.001μL/min或更多、如0.005μL/min或更多、如0.01μL/min或更多、如0.05μL/min或更多、如0.1μL/min或更多、如0.5μL/min或更多、如1μL/min或更多、如5μL/min或更多、如10μL/min或更多、如25μL/min或更多、如50μL/min或更多、如100μL/min或更多、如250μL/min或更多并且包括500μL/min或更多。
在一些方面，公开了用于提供颗粒(例如，细胞)的一个或多个特征的估计的方法和***。通过举例的方式，图16A呈现了描绘根据本传授内容的实施方案的用于确定颗粒的一个或多个特征的一个示例性方法中的各个步骤的流程图。当颗粒流过流式细胞术***时，用射频调制的光束照射颗粒，以便从该颗粒引出至少一个辐射响应(步骤1)。通过举例的方式，射频调制的光束可以包括具有彼此偏移一个射频的光学频率的至少两个小束。在一些实施方案中，射频偏移可以在约10MHz至约250MHz的范围内。例如，射频偏移可以在约55MHz至约225MHz、如从约60MHz至约200MHz、如从约65MHz至约175MHz、如从70MHz至约150MHz并且包括从约75MHz至约125MHz的范围内。通过举例的方式，在一些实施方案中，射频调制的光束可以例如以上面讨论的方式通过将激光束引入声光偏转器(AOD)并将在一个或多个射频处的一个或多个驱动信号施加于AOD来生成，以便生成多个在角度上分离的小束，这些小束具有相对于彼此偏移所述射频的光学频率。
在一些实施方案中，响应于由射频调制的光束照射颗粒而从颗粒引出的辐射响应可以是荧光和/或散射辐射中的任何一种。
继续参考图16A的流程图，可以检测从颗粒发出的辐射响应(步骤2)，并且可以生成与辐射响应相关的时间波形数据(步骤3)。可以使用各种辐射检测模态和检测器(如上面讨论的那些)来检测引出的辐射响应。在一些实施方案中，生成的波形可以是荧光和/或散射波形数据。可以处理波形数据以获得颗粒的至少一个特征的估计。在许多实施方案中，在并未基于波形数据生成颗粒的图像的情况下可以执行对波形数据的这种处理以获得颗粒的至少一个特征的估计。在一些实施方案中，该处理步骤包括分析调制时间波形数据的一个或多个拍频，以获得颗粒的至少一个特征的估计。在一些实施方案中，该处理步骤足够快地进行，使得与获得颗粒的至少一个特征的估计相关的延迟时间小于约100微秒。
在一些实施方案中，可以使用上述方法来获得颗粒的任何维度尺寸的估计、颗粒沿两个不同维度的尺寸比率、由与颗粒相关的两种或更多种标记发射的荧光辐射的共定位、或辐射响应的点状度(例如，由颗粒发射的荧光辐射的点状度)等等。
可以使用上述方法来获得各种不同颗粒的一个或多个特征的估计。通过举例的方式，颗粒可以是以下中的任何一种：细胞、小生物体(例如，线虫秀丽隐杆线虫(c.elegan))、珠粒、微粒、纳米颗粒、病毒颗粒、细菌、外来体或药物制品。
图16B示意性地描绘了用于估计颗粒(如细胞)的至少一个特征的根据实施方案的***3000。示例性***3000包括照射***3002，用于利用射频调制的光学激光束照射流过流式细胞术***的池的一个或多个颗粒。检测器3004可以响应于其照射来检测颗粒的辐射响应(例如荧光和/或散射辐射)，并生成指示辐射响应的一个或多个信号。分析器3006可以从检测器接收一个或多个信号并生成时间波形数据并对该波形数据进行操作，以便推导出颗粒的一个或多个特征的估计。
分析器3006可以采用各种不同的方法用于分析波形数据以获得颗粒(如细胞)的一个或多个特征的估计。通过举例的方式，在一些实施方案中，可以用至少两种荧光标记染色颗粒，其中每种标记被配置成响应于通过射频调制的光学辐射的照射而发射荧光辐射。可以检测荧光辐射并将其数字化以生成荧光波形，每个荧光波形对应于一种标记。分析仪可以对荧光波形进行操作，以获得从这些标记发出的荧光辐射的共定位的量度。具体地，分析器可以将高通或带通滤波器应用于至少一个波形以生成至少一个滤波波形、随后进行波形的逐点乘法以生成合成乘法波形，对乘法波形进行积分以获得积分值，并将积分值与预定阈值进行比较以获得共定位的量度。通过另一举例的方式，在一些实施方案中，可以获得沿着与流式细胞术***中的颗粒流动的方向垂直或平行的方向的颗粒尺寸的估计。例如，在一些此类实施方案中，可以通过以下方式来获得在与颗粒流方向垂直的方向上的粒度的估计：将与响应于射频调制的光束照射从颗粒发射的荧光辐射对应的荧光波形平方，将带通滤波器应用于平方过的波形，对滤波波形进行积分，并将积分值与预定阈值进行比较。此外，在一些实施方案中，分析器可以使用散射数据来获得在与颗粒流方向平行的方向上的颗粒尺寸的估计。
如下所讨论，可以采用流过流式细胞术***的颗粒的一个或多个估计的特征来得出关于该颗粒的分选决定，即是否对该颗粒进行分选。下面在使用流过流式细胞仪的细胞的特征的估计来得出有关那些细胞的分选决定的背景下讨论可以用于对波形数据进行操作以获得颗粒的至少一个特征的估计的处理方法的一些例子。应当理解，这种处理方法可以用于获得除细胞之外的颗粒的特征的估计，并且进一步估计的特征可以不用于分选目的。
在相关方面，公开了用于基于颗粒的一个或多个特征自动门控(例如，计算机辅助门控)流过流式细胞仪的颗粒(例如细胞)群体的方法。通过举例的方式，这种方法可以基于颗粒的尺寸在预定范围内来门控流过流式细胞仪的多个颗粒的子集。例如，参考图16AA的流程图，这种方法可以包括将含有多个颗粒的样品引入流式细胞仪(步骤1)，并从一个或多个流式细胞仪测量中获得多个颗粒的至少一个颗粒特征的估计(步骤2)。获得至少一个颗粒特征的步骤可以包括当颗粒流过流式细胞仪时用具有彼此偏移一个射频的至少两个光学频率的辐射照射颗粒以从颗粒引出辐射响应，检测来自颗粒的辐射响应以生成与响应相关的时间波形数据，并通过分析调制所述时间波形数据的一个或多个拍频来处理所述时间波形数据以获得所述至少一个颗粒特征的值。该方法可以进一步包括经由计算机处理器鉴别门控，该门控指示颗粒特征的值位于预定范围内的一个或多个颗粒。通过举例的方式，可以门控具有在预定范围内的维度尺寸(例如，侧向尺寸)的颗粒。
可以采用***(如图16B中所描绘的***)来执行上述门控方法。例如，分析器3006可以被编程为例如基于响应于射频调制的光束的照射而由那些颗粒发射的荧光辐射中的一个或多个拍频的分析来确定多个颗粒的至少一个特征的估计，并确定颗粒特征的估计是否在预定范围内以便得出关于该颗粒的门控决定(例如，如果确定的特征在预定范围内，则颗粒将被门控)。在一些实施方案中，如基于本传授内容修改的，标题为“NeighborhoodThresholding in Mixed Model Density Gating”的美国专利号8,990,047的传授内容可以用于对流过流式细胞仪的颗粒进行门控。美国专利号8,990,047通过引用以其全文特此并入。
在一些方面，公开了用于基于经由射频调制的光学辐射(例如，包括彼此分离一个或多个射频的两个或更多个光学频率的光学辐射束)对那些细胞的询问来分选细胞的方法和***。在一些实施方案中，光束可以包括多个在角度或空间上分离的小束，每个小束相对于另一个具有射频偏移。在一些情况下，这种光束的使用允许以不同的射频偏移光学频率照射颗粒(例如，细胞)内的不同位置。如下面更详细讨论的，此类方法可以通过采用响应于光束照射而由细胞生成的时变信号来提供分选决定，而不需要基于一个或多个检测到的信号计算荧光图像。虽然下面在分选细胞(例如，在流式细胞术***中)的背景下讨论了根据本传授内容的方法的各种实施方案，但是本文描述的方法也可以用于分选其他类型的颗粒，如小生物体(例如，线虫秀丽隐杆线虫(c.elegan))、珠粒、微粒、纳米颗粒、病毒颗粒、细菌、外来体或药物制品。在一些实施方案中，可以使用本传授内容分选的颗粒具有在约50纳米至约1毫米的范围内(例如在约100纳米至约1微米的范围内)的尺寸(例如，最大尺寸)。
此外，在许多实施方案中，可以采用本文所讨论的分选方法来在低延迟时间的情况下提供分选决定，例如，使得可以使用以高颗粒通量操作(例如，可以执行每秒超过1000次分选操作)的分选装置对细胞或其他颗粒进行分选。通过举例的方式，本文描述的方法可以用于在以下延迟时间的情况下作出分选决定，该延迟时间等于或小于约100微秒，例如，在约10微秒至约100微秒的范围内、或在约20微秒至约80微秒的范围内、或在约30微秒至约70或50微秒的范围内。术语“延迟时间”在本文中用于指示在用询问辐射照射颗粒(例如细胞)与得出颗粒特征和/或关于该颗粒的分选决定之间的时间流逝。
通过举例的方式，图16C的流程图描绘了用于基于与从颗粒发出的两种或更多种荧光团(例如，外源和/或内源荧光团)对应的荧光信号的共定位程度来分选颗粒(例如，细胞)的根据实施方案的方法。在不失一般性的情况下，在下面的讨论中假定颗粒是细胞。在步骤(1)中，经由用光学辐射束的照射光学地询问细胞，该光学辐射束包括彼此分离一个或多个射频的两个或更多个光学频率。在一些情况下，光束可以包括多个在角度或空间上分离的小束，每个小束相对于另一个具有射频偏移。这种光束的使用允许以不同的光学频率照射细胞内的不同位置，这些光学频率彼此偏移一个或多个射频。可以选择光学频率以激发预期与细胞相关的两种或更多种荧光团。例如，荧光团可以是荧光染料分子，细胞例如经由染色用这些荧光染料分子标记。通过举例的方式，在一些实施方案中，辐射束的光学频率可以在约300THz至约1000THz的范围内，并且光学频率之间的射频分离可以是例如在约50MHz至约250MHz的范围内。
然后可以在两个(或更多个)分离的荧光通道中收集从激发的细胞发出的荧光辐射，每个荧光通道对应于由一个荧光团发射的荧光辐射(步骤2)。例如，这可以通过采用上面结合图9A讨论的检测器布置来实现。可以将每个通道中收集的荧光辐射数字化(步骤3)并表示为信号值的时间序列(荧光强度)。在该实施方案和其他实施方案中，可以编码存在于荧光辐射中的拍频的这种信号值的时间序列被称为时频波形。将对应于两个或更多个荧光通道的数字化时频波形在时间上同步(步骤4)并进行归一化(步骤5)。例如，可以通过将每个波形除以其最大值并将该波形乘以比例因子来实现归一化。
可以将高通或带通滤波器应用于至少一个波形以生成至少一个滤波波形(步骤6)。在一些实施方案中，应用低通滤波器，其允许小于约1MHz的频率通过并且基本上阻挡更高的频率。合适的低通滤波器的一些例子包括但不限于时域有限脉冲响应(FIR)滤波器或傅里叶域滤波器。
然后可以对波形进行逐点乘法以获得乘法波形，并且可以对乘法波形进行积分以获得积分值(步骤7)。通过说明的方式，图17显示了表示在一个荧光通道中检测到的滤波归一化时间序列化数字化荧光信号的阵列1700，以及表示在另一荧光通道中检测到的滤波归一化时间序列化数字化荧光信号的阵列1701，阵列1701与阵列1700在时间上同步(为简单起见，在该说明性例子中，荧光通道的数量选择为2并且阵列元素的数量选择为十，应当理解的是荧光通道的数量可以超过2并且阵列元素的数量可以超过10)。该数据在本文被称为时频波形。经由阵列1700和1701中的数据的逐点乘法获得合成阵列1702。
来自每个通道的时间荧光信号包括与光学辐射束的射频分离光学频率的干扰对应的拍频。因此，它们各自的数字化数据的乘法将表现出那些频率的和与差。如果在两个或更多个荧光通道中的信号源自于激发细胞内的基本相似的空间位置，则经由那些信号的乘法获得的合成时域数据将包括基于信号在从激发细胞发出的不同荧光通道中的共定位程度在DC处或接近DC处的频率分量。
在步骤(8)中，将积分结果与预定阈值进行比较，以确定询问细胞是否表现出足够的荧光信号共定位以具备满足分选标准的细胞的资格。例如，如果积分结果等于或超过预定阈值，则将选择细胞用于分选。否则，将不选择细胞用于分选。
通过对上述共定位方法进一步说明的方式，图18A显示了标记为A、B、C和D的四种细胞的荧光图像，其中A和B细胞是用抗CD45-FITC和碘化丙啶(PI)染色的人白细胞，并且细胞C和D是用钙黄绿素AM(Calcein AM)染色的HeLa细胞。这些图像集包含通过检测来自用上述染色剂染色的细胞的荧光获得的双色荧光图像、以及明视场和暗视场图像。图18B显示了测量的绿色(FITC)荧光时域信号，并且图18C显示了测量的红色(碘化丙锭)荧光时域信号，其响应于用以20MHz-60MHz的频率拍打的光学辐射照射这些细胞而从细胞A、B、C和D获得。图18D显示，对于每种细胞，通过将归一化的红色和绿色荧光波形相乘并使合成的波形通过低通滤波器(傅里叶域低通滤波器)以生成滤波信号来获得共定位时域波形。
图19显示了针对细胞A、B、C和D中的每一种细胞的积分滤波信号的值。该图中的虚线表示分选阈值。虽然细胞A和B的积分信号低于分选阈值，但是细胞C和D的积分信号高于分选阈值。因此，对细胞C和D采用阳性分选决定(即，选择细胞C和D用于分选)，并且对细胞A和B采用阴性分选决定。
基于荧光共定位的上述分选方法可以用于各种应用，例如，用于易位分析。
在另一个方面，提供了一种基于细胞尺寸的估计用于在流式细胞术***中分选细胞的方法，其中经由对由细胞发射的荧光辐射进行分析来获得细胞尺寸的估计。例如，该方法利用从细胞发出的荧光脉冲的持续时间来估计细胞沿着流动方向的维度，并分析通过使荧光信号的平方通过低通滤波器所获得的低通滤波信号中包含的功率以基于对细胞的横向维度的估计(例如，与细胞流的方向正交的细胞的维度)执行分选决定。
更具体地，参考图19，在一个实施方案中，经由用光学辐射束的照射光学地询问细胞，该光学辐射束包括彼此分离一个或多个射频的两个或更多个光学频率(步骤1)。类似于先前的实施方案，光束可以包括例如多个在角度或空间上分离的小束，每个小束相对于另一个具有射频偏移。可以选择光学频率以激发与细胞相关的一种或多种外源和/或内源荧光团。细胞通过光学辐射束并响应于光束的激发而发射荧光。在不失一般性的情况下，在该实施方案中，假设细胞通过照射光束在竖直方向上流动，并且在与细胞的流动方向基本正交的横向(水平)方向上检测发射的荧光。
然后检测从细胞发出的荧光信号并将其数字化以生成时频波形(步骤2)。然后可以分析检测到的荧光辐射以估计细胞尺寸，如下所讨论。在一些实施方案中，从细胞发出的光散射脉冲的持续时间可以用于估计沿流动方向的细胞尺寸。
从细胞发出的荧光脉冲的持续时间与细胞在询问光学辐射束内的停留时间有关，该停留时间进而与光束在与流动方向平行的方向上的维度、在流动方向上的细胞尺寸和细胞的流速有关。如果照射细胞的光束具有直径(H)，并且细胞的流速为V并且细胞在流动方向上具有尺寸D(例如，直径)，那么尺寸D可以通过以下关系近似估计：
D＝V*T-2*H 公式(2)
其中T是检测到的光学脉冲宽度。因此，在步骤(3)中，例如，使用上述关系，基于从细胞发出的荧光或光散射脉冲的时距来估计在流动方向上的细胞尺寸。
继续参考图20的流程图，为了估计细胞的侧向尺寸，将数字化荧光数据平方(步骤4)并将带通滤波器应用于平方的荧光数据(步骤5)。然后对滤波数据进行积分以获得积分脉冲功率的量度(步骤6)。积分脉冲功率可以提供细胞侧向尺寸的量度。更具体地，基于落入带通滤波器的频带内的差频(由于平方操作而生成)中存在的功率，积分脉冲功率可以提供细胞侧向尺寸的量度。
在步骤(7)中，可以采用在流动方向上的细胞尺寸的估计和/或与滤波数据相关的积分脉冲功率来作出关于细胞的分选决定。例如，在一些实施方案中，可以将在流动方向上的估计的细胞尺寸与第一阈值进行比较，并且可以将积分脉冲功率与第二阈值进行比较以作出分选决定。通过举例的方式，在一些情况下，如果在流动方向上的估计的细胞尺寸和积分脉冲功率都超过相应阈值，则作出正分选决定(即，选择细胞)。可选地，分选决定可以仅依赖于在流动方向上的细胞尺寸的估计或积分脉冲功率。如下面进一步讨论的，在一些情况下，可以采用估计的竖直和水平细胞尺寸的比率来作出分选决定。
通过对基于细胞侧向尺寸的估计作出分选决定进一步说明的方式，图21A示意性地描绘了由假设光束照射的假设细胞，该假设光束包括多个射频调制的小束，这些小束具有从15MHz延伸到25MHz的射频调制，彼此分离1MHz。虚线示意性地描绘了在与照射方向正交的平面中被照射细胞的横截面视图。从细胞收集并被数字化的荧光辐射可以是处于数字化荧光值的时间序列阵列2100的形式，如图21B中示意性所示(这里显示的阵列仅用于说明目的，并不是限制可能存在于实际荧光波形中的阵列元素的数量)。将波形2100平方以获得波形2101。然后将带通滤波器应用于平方的荧光波形2101，其中该滤波器允许在两个频率f1和f2(其中f2>f1)之间的所选调制频率的通过，同时基本上阻挡低于f1或大于f2的那些调制频率。通过举例的方式，带通滤波器可以是FIR带通滤波器，但是也可以采用本领域中已知的其他合适的滤波器。滤波数据指示在f1与f2之间的调制频率下检测到的荧光脉冲中存在的功率。然后对滤波数据进行积分以获得在f1与f2之间的频率下的总脉冲功率的量度。然后可以将该积分结果与阈值进行比较以作出分选决定。例如，基于积分结果小于预定阈值的事实，可以估计细胞的侧向尺寸为小于特定值。
在该例子中，细胞尺寸导致通过具有范围从约18MHz至约21MHz的射频调制的光学辐射照射细胞。因此，在荧光数据的平方中的最大和最小调制频率之间的差将为约6MHz。如果希望检测具有较大尺寸的细胞，这些尺寸将导致其荧光数据的平方中的差异频率在约10MHz至约15MHz的范围内，则可以将与低于10MHz且高于15MHz的频率区分的带通滤波器应用于荧光数据的平方。在这个例子中，因为荧光数据的平方中的差异调制频率低于10MHz，将这种带通滤波器应用于荧光数据的平方不会产生足够大的信号以指示具有所希望的侧向尺寸的细胞的存在。
基于细胞尺寸的上述分选方法可以具有多种不同的应用，例如，通过循环肿瘤细胞(CTC)的尺寸进行分离。
在另一个方面，公开了一种用于基于细胞纵横比来分选细胞的方法。例如，参考图22的流程图，通过光学询问区域的细胞被辐射激发，并且由细胞发射的荧光辐射被收集并数字化(步骤1)以生成数字化的时频波形。然后以上面讨论的方式分析数字化的荧光数据，以估计竖直(沿着流动方向)细胞尺寸(步骤2)和水平(沿着与流动方向正交的方向)细胞尺寸(步骤3)。更具体地，可以使用由细胞发射的荧光或光散射(或光透射)脉冲的时间宽度来估计细胞的竖直尺寸(步骤2)，并且可以使用例如上面讨论的方法基于将带通滤波器应用于荧光数据的平方来估计细胞的水平尺寸(步骤3)。在步骤(4)中，确定细胞的竖直和水平尺寸的估计的比率，并将其与预定阈值进行比较以作出关于该细胞的分选决定。例如，在一些情况下，如果比超过阈值，则可以作出关于该细胞的正分选决定。
基于细胞纵横比的上述分选方法可以用于例如细胞周期分析、DNA分析等。
在另一个方面，公开了一种确定细胞的细胞核尺寸相对于其细胞质尺寸的比率的方法。在一些实施方案中，可以采用这样的比率来作出分选决定。参考图23A的流程图，在一个这样的实施方案中，用两种荧光标记标记(例如，染色)细胞，其中一种将位于细胞的膜上(细胞质的边界)，且另一种可以渗透细胞膜进入细胞质和染色细胞的细胞核(例如，经由细胞的内部机器)(步骤1)。将与细胞膜结合的荧光标记的一些例子包括用与膜蛋白结合的荧光团(如抗CD45-FITC或抗EpCAM-PE)标记的任何抗体。可以用于将荧光标记结合到细胞膜上的其他常见表面蛋白包括例如CD3、CD4、CD8等。合适的细胞核荧光染色剂的一些例子包括但不限于碘化丙啶、SYTO16、7-AAD和DAPI。
然后用辐射照射细胞以激发两种类型的荧光标记(步骤2)，并且在与来自细胞膜和来自其细胞核的荧光发射对应的两个通道中检测发射的荧光和将其数字化(步骤3)。例如以上面讨论的方式将与细胞膜对应的荧光数据用于获得细胞质尺寸的估计，并且将与细胞核对应的荧光数据用于获得细胞核尺寸的估计(步骤4)。例如，可以采用每个通道中的荧光或光散射脉冲的宽度，例如以上面讨论的方式，以估计沿一个维度(即，沿流动方向)的细胞尺寸。此外，可以通过以上面讨论的方式将带通滤波器应用于相应通道中的荧光数据的平方来估计细胞质或细胞核的侧向尺寸。对该带通滤波数据进行积分的结果提供了与预定阈值进行比较的值，以便对大于或小于阈值的细胞进行分选。此外，可以组合在两个维度中的细胞的尺寸估计，例如，通过获得竖直和水平尺寸估计的平方和的平方根，以基于总细胞尺寸的估计得出分选决定。
在步骤(5)中，获得细胞质和细胞核的尺寸估计的比率，例如，在竖直或水平方向上的尺寸比率、或组合尺寸的比率。
参考图23B的流程图，在一些实施方案中，细胞的细胞核尺寸相对于其细胞质尺寸的比率可以用于作出分选决定，该比可以例如按上面讨论的方式确定并且在图23B的流程图的步骤(1)-(5)中表示。例如，可以将该比与预定阈值进行比较以作出分选决定(步骤6)。通过举例的方式，如果该比超过该阈值，则作出正分选决定(即，选择细胞)。
通过举例的方式，基于细胞核与细胞质尺寸比率的上述分选方法可以用于循环肿瘤细胞的分类。
在另一个方面，公开了一种估计从细胞发射的荧光辐射的细胞粒度(荧光点状)的方法，其在一些实施方案中可以用于分选细胞。换句话说，可以基于从细胞发射的荧光辐射是否可以表征为从发射中心的扩散细胞内分布发出，或者是否可以表征为从不扩散地分布在细胞内的发射中心发出而作出分选决定。
更具体地，参考图24A中描绘的流程图，在一个实施方案中，具有一个或多个外源和/或内源荧光标记的细胞用具有彼此分离一个或多个射频的两个或更多个光学频率的光学辐射照射，以便从一种或多种标记中引出荧光辐射(步骤1)。类似于先前的实施方案，在一些情况下，光束可以包括多个在角度或空间上分离的小束，每个小束相对于另一个具有射频偏移。通过举例的方式，参考图25，在说明性的示例性实施方案中，光学辐射束可以包括可以跨越例如从10MHz(f1)至15MHz(f5)、分离0.5MHz的调制频率f1、f2、f3、f4、f5。如下面更详细讨论的，发射的荧光辐射的点状可以依据发射的荧光辐射表现出除用于调制光束的调制频率以外(例如，在该实施方案中除f1、f2、f3、f4、f5以外)的调制频率的程度来估计。其他频率(其可以是在用于调制光束的频率之间的频率)在本文被称为“断像素频率”。换句话说，荧光功率“泄漏”到断像素频率中指示发射的荧光的点状度；泄漏越多，发射的荧光的点状就越多。
再次参考图24A的流程图，可以收集荧光辐射并将其数字化以生成时频波形(步骤2)。在步骤(3)中，获得整个波形的傅里叶变换，例如快速傅里叶变换(FFT)。随后，将所生成的FFT归一化为固定值用于细胞间比较(步骤4)，例如，通过将时域波形除以其最大值并然后将波形按所希望的常数重新换算。确定FFT的“断像素”区间的总和(即，与照射光学辐射中存在的调制频率之间的频率对应的区间)(步骤5)。该总和指示荧光功率向断像素频率的“泄漏”度，因此是发射的荧光辐射的点状度的量度。
参考图24B，在一些实施方案中，发射的荧光辐射的点状度的量度，其可以按上面讨论的方式确定并且在图24B的流程图的步骤(1)-(5)中表示，可以用于分选细胞。特别地，在步骤(6)中，可以将指示荧光功率向断像素频率的“泄漏”度的FFT“断像素”区间的总和与预定阈值进行比较以作出分选决定。例如，当希望对表现出相对高的荧光点状度的细胞进行分选时，如果该总和大于该阈值，则对细胞进行分选(选择)。可选地，当希望对表现出漫射荧光的细胞进行分选时，如果该总和小于该阈值，则对细胞进行分选。
基于对发射的荧光辐射的分析，这种细胞分选可以用于多种应用，如光斑计数、荧光原位杂交(FISH)、细胞内转运和定位、以及基于液滴的单细胞分析。
用于针对颗粒(例如，在流式细胞术***中流动的细胞)作出分选决定的上述方法可以按各种方式实现。通过举例的方式，图26示意性地描绘了用于分选细胞的示例性***2600，其可以使用本传授内容来作出分选决定。***2600可以包括用于存储其中悬浮有多个细胞的悬浮液流体的容器(container)2601。细胞悬浮液容器2601经由入口2602流体地联接到样品导管2603，该样品导管可以由刚性金属(如不锈钢)形成。样品导管2603被设置在器皿(vessel)2604内，该器皿包括上圆柱形部分2604a，该上圆柱形部分经由锥形部分2604b延伸到具有较小直径的下圆柱形部分2604c，该下圆柱形部分在其远侧端部包括喷嘴2605。器皿2604流体地联接到鞘流体源2606。将声学振动器2608(例如，压电驱动器)联接到喷嘴并且配置成在由发生器2610赋能时引起喷嘴的振动。通过举例的方式，振动频率可以是约60kHz，但是也可以使用其他振动频率。
在使用中，存储在容器2601中的悬浮液经由入口2602引入导管2603中。离开容器2603的含有细胞的流体的细流被鞘流体夹带并被带到喷嘴2605。喷嘴的振动运动可以按本领域中已知的方式配置，以将通过喷嘴的流分成多个液滴D，每个液滴D含有单个细胞颗粒。至少一些细胞与一种或多种内源和/或外源荧光团相关，这些荧光团可以响应于激发辐射的照射而发射荧光辐射。可以使用范围广泛的荧光团。在一些情况下，荧光团可以附着于识别细胞上的靶标(例如受体)的抗体。在一些情况下，荧光团可以附着于对细胞膜或另一种细胞结构(例如细胞的细胞核)具有亲和力的化学实体上。此外，在一些情况下，可以用不同荧光团的组合标记细胞。
继续参考图26，当每个细胞通过询问区域2612时，该细胞被照射***2616生成的激光束2614照射，以引出来自与该细胞相关的一个或多个荧光团的荧光辐射。如上所讨论，激光束可以包括多个光学频率，这些光学频率相对于彼此偏移一个或多个射频。通过举例的方式，光束可以是处于多个在角度或空间上分离的小束的形式，这些小束相对于彼此具有射频偏移。从细胞发射的荧光辐射可以由检测***2618检测，该检测***可以包括一个或多个光检测器。可以通过分析模块2620以上面讨论的方式分析检测到的荧光，以作出关于该细胞的分选决定。
通过举例的方式，检测***的照射可以是上面例如结合图1至图12讨论的那些。然而，应当理解，用于分选颗粒的本传授内容的实践不限于使用任何特定的照射和检测***。相反，可以采用各种不同的***，只要它们提供必要的数据(例如，荧光和/或散射数据)用于上述用于作出分选决定的方法中。
再次参考图26，***2600进一步包括充电套环2622，该充电套环由充电电路2623赋能，该充电电路进而在分析模块2620的控制下。当细胞液滴穿过充电套环时，该套环可以向该细胞液滴赋予正电荷或负电荷。可选地，该套环可以允许细胞液滴通过而不向其赋予电荷。
更具体地，分析模块2620可以采用上述传授内容来作出关于细胞的分选决定。基于该决定，分析模块可以确定细胞液滴是否需要充电，并且如果需要，则应该向细胞赋予哪种电荷极性。然后，分析模块可以控制充电电路2623，以经由套环2622将必要的电荷赋予细胞液滴。然后，细胞通过在一对偏转板2624之间的间隙，这对偏转板被设置在套环2622的下游。电压源2625将电压施加到至少一个板2624上以在板之间建立电场。该电场可以沿着不同方向使负的和正的细胞液滴的路径偏转，使得它们可以分别通过细胞收集器2626的管2626b和2626c收集。未通过套环2622带电的细胞不会偏转并被细胞收集器的管2626a捕获。
在本文讨论的分析/控制模块(如分析/控制模块2620)可以使用本领域中已知的技术并根据本传授内容以各种不同的方式在硬件、固件和/或软件中实现。通过举例的方式，图27示意性地描绘了分析/控制模块2620的示例性实现方式2700，该实现方式包括模数转换器2702，用于从检测***2618接收一个或多个荧光信号并将一个或多个信号数字化以生成数字化荧光数据。分析/控制模块2700可以进一步包括处理器2704，用于根据本传授内容处理荧光数据以得出关于询问下的细胞的分选决定。分析/控制模块2700还可以包括ROM(只读存储器)2706、RAM(随机存取存储器)2708和永久存储器2710。通信总线2712促进分析模块的各种部件之间的通信。存储器模块可以用于存储用于分析一个或多个荧光信号的指令和分析结果。例如，在一些实施方案中，根据本传授内容的用于分析荧光数据以得出分选决定的指令可以存储在ROM 2706中。处理器2704可以采用这些指令来操作存储在RAM 2708中的数字化荧光数据，以便确定分选决定。在一些实施方案中，该处理器可以作为ASIC(专用集成电路)实现，该ASIC被配置成执行根据本传授内容的用于对荧光数据进行操作以得出分选决定的指令。在该实施方案中，分析/控制模块2700可以进一步包括通信/控制模块2714，用于基于分选决定向充电电路发送适当的信号以便向询问下的细胞赋予合适的电荷。
如上所讨论，根据本传授内容的方法对时间荧光数据进行操作以得出针对颗粒(例如，细胞)的分选决定，而不需要形成细胞的逐像素荧光图像。这进而允许在低延迟时间(例如，小于约100微秒)的情况下分选细胞，其进而允许以高速率分选细胞。例如，根据本传授内容的分选方法可以允许以等于或大于每秒1000个细胞(例如，在每秒约1000个至约100,000个细胞的范围内)的速率分选细胞。
尽管不限于任何特定的照射或检测技术，如上所述，在一些实施方案中，根据本传授内容的细胞分选方法可以有效地用于流式细胞术***中，该流式细胞术***采用频域多路复用来激发一行像素，每个像素在例如通过两个频移的激光束的拍打生成的独特射频下“被标记”。使用频域多路复用，可以使用例如针对每种荧光颜色或散射方向的单个光电倍增管(PMT)来检测和读出来自图像的单行中的数百个像素的荧光(或散射)辐射。由于在独特的拍频下调制图像的一行中的每个像素的激发，因此像素率与***的总RF带宽成比例，这可以在大于100MHz的像素率下提供散粒噪声限制的灵敏度。如上所讨论，根据本传授内容的分选方法可以采用以时频格式编码的图像数据，以在实际上不计算图像的情况下执行分选决定。
此外，上述***可以用于基于响应于照射从颗粒发出的散射辐射对颗粒(例如，细胞)进行分选。可以例如按上面讨论的方式检测和分析散射辐射，以得出分选决定。
通过进一步举例的方式，以下美国专利提供了关于分选***的信息，这些分选***可以根据本传授内容进行修改以实施本文公开的分选方法和***：标题为“ParticleSeparator”的美国专利号3,380,584，标题为“Flow Cytometer and Flow Cytometry”的美国专利号9,034,259和标题为“System and Process for Sorting BiologicalParticles”的美国专利号7,417,734，其每一个都通过引用以其全文并入本文。
通过进一步阐明的方式，附录A提供了关于本传授内容的各个方面的附加信息。
本领域普通技术人员将理解，在不脱离本传授内容的范围的情况下可以进行各种改变。特别地，上面讨论的实施方案的各种特性、结构或特征可以按合适的方式进行组合。例如，结合一个实施方案讨论的检测***可以用于另一个实施方案中。
附录A
如上所讨论，在一些实施方案中，具有射频幅度调制的两个或更多个小束照射在空间不同位置的样品。在样品与每个小束之间的相互作用可以产生散射信号、透射信号和荧光发射信号中的至少一种，每种信号都用小束的对应射频进行幅度调制。所收集的信号可以表示为每个调制小束的贡献之和：
S(t)＝∑iPi(t)·(1+Amcos(ωit+φi))公式(3)
其中S(t)表示收集的信号，Pi(t)表示与第i小束相关的时间相关的散射、透射或荧光发射信号，Am表示小束的调制深度，并且ωi和分别表示小束的射频调制的角频率和相位。可以通过将每个小束分配给图像的不同列以及将的每个时间矩分配给图像的不同行来推导出颗粒的图像表示。该图像表示经由傅里叶变换与收集的信号连接：
Im(x，y)＝R·W·F·S(t)公式(4)
其中F是实现短时傅里叶变换的矩阵，W是将傅里叶分量映射到图像像素的矩阵，并且R是执行任何所希望的线性图像域后处理(如滤波、背景减去、和图案校正)的矩阵。颗粒的任何线性特性可以通过图像上的矩阵乘法来表示。因此，对于计算任何所希望的线性特性的矩阵M，可以经由以下方式从收集的信号直接计算该特性，即，不需要首先计算图像：
M·Im(x，y)＝M·R·W·F·S(t)＝Q·S(t) 公式(5)
Q＝M·R·W·F 公式(6)
其中Q是表示从当前颗粒表示转换到所希望的线性特性的矩阵。因此，可以通过最初计算矩阵Q(例如在预处理步骤中离线)，然后执行如公式(5)中所示的点积(例如在线)以提取所希望的特性来计算任何线性特性。在许多实施方案中，对于所有特性，希望还减去背景信号对特性的贡献。这个过程可以总结如下：
计算：Q＝M·R·W·F
计算：Qbkg＝M·R·Wbkg·F
在收集数据时：
如果检测到颗粒：
计算：D＝Q·S(t)
否则：
计算：Dbkg(i)＝Qbkg·S(t)
计算：Dbkg＝平均(Dbkg(i))
产生：D-Dbkg
如上所讨论，在一些实施方案中，可以采用颗粒的一个或多个计算特性来作出关于该颗粒的分选决定。通过另一举例的方式，图28显示了描绘这种分选方法中的各个步骤的流程图。在初始步骤(1)中，可以基于所希望的颗粒特性(特征)来计算上述Q和Q_bkg矩阵。随后，可以收集例如来自用射频调制的光学辐射照射的流式细胞仪的流动池的散射、透射或发射的光学信号并将其数字化(步骤2)。可以将信号与阈值交叉进行比较以确定信号是否来自颗粒，即颗粒是否存在(步骤3)。如果确定颗粒存在，则将每个数字化的样品信号乘以Q(步骤4)，随后将该结果积分为单个值(步骤5)。从积分值中减去背景信号(步骤6)以获得颗粒的所希望特性(特征)的估计。可以经由将特征的估计与阈值进行比较来作出分选决定(步骤7)。继续参考图28的流程图，在不存在颗粒的情况下获得的一个或多个数字化信号可以乘以Q_bkg(步骤8)，并且可以对几个背景测量值进行平均以获得步骤(6)中采用的背景估计。
在一些实施方案中，接收信号的各种矩可以用于获得关于散射辐射、透射辐射或发射辐射的空间分布的信息。图像矩是表示像素根据它们与任意原点的距离(取一些任意幂)的加权和的一类线性图像特性：
每个图像矩编码关于散射光、透射光或发射光的空间分布的不同信息。高阶矩根据像素与原点的距离更多地对像素进行加权，其中每个矩提供关于信号分布的不同信息。在各种实施方案中，通过预先计算适当的Q可以直接从测量信号S(t)计算所有这些特性。
可以按相同的方式计算空间傅里叶分量，其中M定义如下：
M(u，v)＝exp(-j2π(ux+vy)) 公式(8)
可以在实验之前选择所希望的部件，并且可以针对每个部件预先计算单独的Q。通过举例的方式，傅里叶分量可以用于确定颗粒是否处于照射辐射的焦点。
一些图像特性涉及在特性提取之前对数据的非线性转换。对于此类特性的子集，有可能将它们表示为线性特性的非线性组合。计算此类特性可以涉及首先如先前部分中一样并行地计算多个特性，然后以非线性方式将结果进行组合。有许多有用的图像特性可以通过图像矩的非线性组合来表达。例如，像素的质心可以通过一阶矩和零阶矩的比率来计算：
可以用这种方式表示几个其他颗粒特征。非详尽列表示于下表1中。
表1.
在一些实施方案中，中心二阶矩可以用于区分双峰。在散射或透射光信号中具有高二阶矩的颗粒表示更大的信号分布。通过举例的方式，图29显示了与多个血细胞的水平和竖直中心矩对应的散点图。
共定位和相似性
在一些实施方案中，颗粒与参考之间的相似性可以按与共定位相同的方式计算。在共定位情况下，两个波形对应于观察同一颗粒的不同检测器；在相似性情况下，两个波形对应于观察两个不同颗粒的相同检测器。用于检测颗粒与参考之间的相似性的示例性算法总结如下：
令R表示对应于参考颗粒的波形，Filt是仅通过调制频率的高通或带通滤波器，并且N是参考颗粒的图像表示中的像素数。然后该算法将包括：
计算
计算R’＝Filt(R)，
计算R2＝||R′||2，
对于与研究中的颗粒对应的每个入射波形S：
计算
计算S’＝Filt(S)
计算D＝S′·R′
计算S2＝||S′||2
返回作为颗粒与参考颗粒的相似性的量度。

Claims (90)

1.一种确定颗粒的一个或多个特征的方法，所述方法包括：
当颗粒流过流式细胞术***时用具有彼此偏移一个射频的至少两个光学频率的辐射照射所述颗粒以从所述颗粒引出荧光辐射，
检测来自所述颗粒的所述荧光辐射以生成时间荧光数据，并且
处理所述时间荧光数据以获得所述颗粒的至少一个特征的估计。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述处理步骤包括分析调制所述时间荧光数据的一个或多个拍频以获得所述颗粒的所述至少一个特征的所述估计。
3.如权利要求1所述的方法，其中在未基于所述时间荧光数据生成荧光图像的情况下执行所述处理步骤。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个特征与所述颗粒的内部组分相关。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个特征包括以下中的至少一个：所述颗粒的维度尺寸、所述颗粒沿两个不同维度的尺寸比率、由与所述颗粒相关的两种或更多种标记发射的荧光辐射的共定位、所述荧光辐射的点状度、所述荧光辐射的空间分布的量度、所述颗粒的位置或取向的量度、所述颗粒的偏心率的量度、所述颗粒与参考颗粒相似性的量度、所述颗粒的一个或多个空间傅里叶分量的组合、所述颗粒位于所述照射辐射焦点的程度的量度。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述处理步骤足够快使得与获得所述颗粒的至少一个特征的所述估计相关的延迟时间小于约100微秒。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述延迟时间小于约20微秒。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述照射所述颗粒的步骤包括将所述颗粒暴露于光学辐射束，所述光学辐射束包括至少两个小束，每个小束具有所述至少两个光学频率之一，这样使得所述小束照射所述颗粒内的至少两个空间位置。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述至少两个空间位置是部分重叠的。
10.如权利要求8所述的方法，所述方法进一步包括用至少两种荧光标记将所述颗粒染色，其中每种标记被配置成响应于通过具有所述光学频率之一的辐射照射而发射荧光辐射。
11.如权利要求10所述的方法，所述方法进一步包括收集从所述标记发出的荧光信号并将其数字化以生成时间荧光波形，每个时间荧光波形对应于所述标记之一。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述处理步骤包括对所述荧光波形进行操作以获得所述荧光信号的共定位量度。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述对所述波形进行操作的步骤包括将高通或带通滤波器应用于所述波形中的至少一个以生成至少一个滤波波形、随后将所述波形逐点相乘以生成合成乘法波形，对所述滤波波形进行积分以获得积分值，并且将所述积分值与预定阈值进行比较以获得所述共定位量度。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述对所述波形进行操作的步骤包括将高通或带通滤波器应用于所述波形中的至少一个以生成至少一个滤波波形、随后将所述波形逐点相乘以生成合成乘法波形，对所述乘法波形进行积分以获得积分值，从所述积分值中减去背景值并按强度换算所述合成值以生成最终值，并且将所述最终值与预定阈值进行比较以获得所述共定位量度。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述处理步骤包括获得沿着与所述流式细胞术***中的颗粒流动的方向基本上垂直的方向的所述颗粒的侧向尺寸的估计。
16.如权利要求15所述的方法，所述方法进一步包括获得沿着与所述流式细胞术***中的颗粒流动的方向平行的方向的所述颗粒尺寸的估计。
17.如权利要求16所述的方法，其中通过将所述检测到的时间荧光数据平方，将带通滤波器应用于所述平方的荧光数据，将所述滤波数据进行积分，并将所述滤波数据与预定阈值进行比较来获得所述颗粒的所述侧向尺寸的所述估计。
18.如权利要求17所述的方法，其中基于响应于所述照射步骤从所述颗粒发出的荧光辐射的脉冲的时距获得沿着与颗粒流动的方向平行的方向的所述颗粒尺寸的所述估计。
19.如权利要求18所述的方法，所述方法进一步包括利用沿着与颗粒流动的方向平行和垂直的方向的所述颗粒尺寸的所述估计来获得所述颗粒的纵横比。
20.如权利要求1所述的方法，其中所述颗粒包括以下中的任何一种：细胞、微囊泡、细胞碎片、脂质体、珠粒和小生物体。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述细胞包括哺乳动物细胞。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述细胞包括患病的细胞。
23.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括利用所述颗粒的至少一个特征的所述估计来得出关于所述颗粒的分选决定。
24.如权利要求1所述的方法，其中所述处理步骤由计算机处理器执行。
25.一种确定颗粒的特征的方法，所述方法包括：
用射频调制的光束照射颗粒以便从所述颗粒引出荧光辐射和散射辐射中的任何一种，
检测从所述颗粒发出的荧光辐射或散射辐射以生成时间荧光或散射波形数据，
在并未基于任何所述荧光或散射波形数据生成所述颗粒的图像以获得所述颗粒的至少一个特征的估计的情况下，处理任何所述荧光和散射波形数据以获得所述至少一个特征的估计。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述处理步骤包括分析调制所述荧光波形数据的一个或多个拍频以获得所述颗粒的所述至少一个特征的所述估计。
27.如权利要求25所述的方法，其中所述颗粒的所述特征包括以下中的至少一个：所述颗粒的维度尺寸、所述颗粒沿两个不同维度的尺寸比率、由与所述颗粒相关的两种或更多种标记发射的荧光辐射的共定位、所述荧光辐射的点状度、所述荧光辐射的空间分布的量度、所述颗粒的位置或取向的量度、所述颗粒的偏心率的量度、所述颗粒与参考颗粒相似性的量度、所述颗粒的一个或多个空间傅里叶分量的组合、所述颗粒位于所述照射辐射焦点的程度的量度。
28.如权利要求25所述的方法，其中所述处理步骤足够快使得与获得所述颗粒的至少一个特征的所述估计相关的延迟时间小于约100微秒。
29.如权利要求25所述的方法，所述方法进一步包括检测所述荧光辐射和所述散射辐射两者以生成荧光和散射波形数据，并且采用所述荧光波形数据获得所述颗粒在与颗粒流动的方向基本上垂直的方向上的侧向尺寸的估计，并采用所述散射波形数据获得所述颗粒在与所述流式细胞术***中的颗粒流动的方向平行的方向上的尺寸的估计。
30.如权利要求25所述的方法，其中所述颗粒包括以下中的任何一种：细胞、微囊泡、细胞碎片、脂质体、珠粒和小生物体。
31.一种确定颗粒的特征的方法，所述方法包括：
当颗粒流过流式细胞术***时用射频调制的光束照射颗粒以便从所述颗粒引出至少一个辐射响应，
检测从所述颗粒发出的所述辐射响应以生成与所述辐射响应相关的时间波形数据，
在并未基于所述波形数据生成所述颗粒的图像的情况下处理所述波形以获得所述颗粒的至少一个特征的估计。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述辐射响应包括响应于所述照射而从所述颗粒发出的荧光辐射和散射辐射中的任何一种。
33.如权利要求31所述的方法，其中所述射频调制的光束包括彼此分离至少一个射频的至少两个光学频率。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述处理步骤包括分析与在所述辐射响应中检测到的所述至少一个射频相关的至少一个拍频，以确定所述颗粒的所述至少一个特征的所述估计。
35.如权利要求31所述的方法，其中所述至少一个特征包括以下中的至少一个：所述颗粒的维度尺寸、所述颗粒沿两个不同维度的尺寸比率、由与所述颗粒相关的两种或更多种标记发射的荧光辐射的共定位、所述荧光辐射的点状度、所述荧光辐射的空间分布的量度、所述颗粒的位置或取向的量度、所述颗粒的偏心率的量度、所述颗粒与参考颗粒相似性的量度、所述颗粒的一个或多个空间傅里叶分量的组合、所述颗粒位于所述照射辐射焦点的程度的量度。
36.如权利要求31所述的方法，所述方法进一步包括利用所述颗粒的至少一个特征的所述估计来得出关于所述颗粒的分选决定。
37.一种用于执行计算机辅助流式细胞术的方法，所述方法包括：
将含有多个颗粒的样品引入流式细胞仪中，从一个或多个流式细胞仪测量值中获得所述多个颗粒的至少一个颗粒特征的估计，
其中所述获得步骤包括当颗粒流过流式细胞仪时用具有彼此偏移一个射频的至少两个光学频率的辐射照射所述颗粒以从所述颗粒引出辐射响应，检测来自所述颗粒的所述辐射响应以生成与所述响应相关的时间波形数据，并且通过分析调制所述时间波形数据的一个或多个拍频来处理所述时间波形数据以获得所述至少一个颗粒特征的值，并且经由计算机处理器鉴别如下门控，所述门控指示所述颗粒特征的值在预定范围内的所述颗粒中的一个或多个。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述辐射响应包括荧光辐射和散射辐射中的任何一种。
39.如权利要求37所述的方法，其中所述射频在约50MHz至约250MHz的范围内。
40.如权利要求37所述的方法，其中所述颗粒特征是以下中的至少一个：所述颗粒的维度尺寸、所述颗粒沿两个不同维度的尺寸比率、由与所述颗粒相关的两种或更多种标记发射的荧光辐射的共定位、所述荧光辐射的点状度、所述荧光辐射的空间分布的量度、所述颗粒的位置或取向的量度、所述颗粒的偏心率的量度、所述颗粒与参考颗粒相似性的量度、所述颗粒的一个或多个空间傅里叶分量的组合、所述颗粒位于所述照射辐射焦点的程度的量度。
41.一种用于在流式细胞术***中分选细胞的方法，所述方法包括：
用具有彼此偏移一个射频的至少两个光学频率的光学辐射束照射细胞以从所述细胞引出荧光辐射，
检测所述荧光辐射以生成时间荧光数据，并且
处理所述时间荧光数据以得出关于所述细胞的分选决定。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述处理步骤包括对所述荧光数据进行操作以获得所述细胞的特征的估计并基于所述估计作出所述分选决定。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述处理步骤包括分析与所述时间荧光数据中的所述射频相关的至少一个拍频，以获得所述细胞的特征的所述估计。
44.如权利要求41所述的方法，其中在并未基于所述荧光数据生成荧光图像的情况下，所述处理步骤得出所述分选决定。
45.如权利要求41所述的方法，其中所述细胞特征与所述细胞的内部细胞器相关。
46.如权利要求41所述的方法，其中所述细胞的所述特征包括以下中的任何一个：所述细胞的维度尺寸、所述细胞沿两个不同维度的尺寸比率、由与所述细胞相关的两种或更多种标记发射的荧光辐射的共定位、所述细胞的细胞质与细胞核的尺寸比率、从所述细胞发射的荧光辐射的点状度、所述荧光辐射的空间分布的量度、所述细胞的位置或取向的量度、所述细胞的偏心率的量度、所述细胞与参考细胞相似性的量度、所述细胞的一个或多个空间傅里叶分量的组合、所述细胞位于所述照射辐射的焦点的程度的量度。
47.如权利要求41所述的方法，其中所述处理步骤足够快使得与得出所述分选决定相关的延迟时间小于约100微秒。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述延迟时间小于约20微秒。
49.如权利要求41所述的方法，其中所述光束被配置成使得照射所述细胞内的多个空间位置中的每一个位置的光学频率对应于所述射频偏移光学频率中不同的一个。
50.如权利要求41所述的方法，其中所述细胞用至少两种荧光标记染色，并且所述光学辐射被配置成从所述标记引出荧光辐射。
51.如权利要求50所述的方法，所述方法进一步包括收集从所述标记发出的荧光辐射并将其数字化以生成时间荧光波形，每个时间荧光波形对应于所述标记之一。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述处理步骤包括对所述荧光波形进行操作以获得与所述荧光标记对应的所述荧光信号的共定位的量度并且基于所述共定位量度作出所述分选决定。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述对所述波形进行操作的步骤包括将高通或带通滤波器应用于所述波形中的至少一个以生成至少一个滤波波形、随后将所述波形逐点相乘以生成合成乘法波形，对所述滤波波形进行积分以获得积分值，并且将所述积分值与预定阈值进行比较以获得所述共定位量度。
54.如权利要求52所述的方法，其中所述对所述波形进行操作的步骤包括将高通或带通滤波器应用于所述波形中的至少一个以生成至少一个滤波波形、随后将所述波形逐点相乘以生成合成乘法波形，对所述乘法波形进行积分以获得积分值，从所述积分值中减去背景值并按强度换算所述合成值以生成最终值，并且将所述最终值与预定阈值进行比较以获得所述共定位量度。
55.如权利要求41所述的方法，其中所述处理步骤包括对所述荧光数据进行操作以获得所述细胞的尺寸的估计并且基于所述估计的细胞尺寸作出所述分选决定。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述细胞尺寸的所述估计可以是在流式细胞术***中细胞流动的方向上的所述细胞尺寸的估计和所述细胞的侧向尺寸的估计中的任何一个。
57.如权利要求56所述的方法，所述方法进一步包括基于从所述细胞发出的荧光辐射的脉冲的时距估计在细胞流动的方向上的所述细胞尺寸。
58.如权利要求56所述的方法，其中通过将所述检测到的时间荧光数据平方，将带通滤波器应用于所述平方的荧光数据，将所述滤波数据进行积分，并将所述滤波数据与预定阈值进行比较来获得所述细胞的所述侧向尺寸的所述估计。
59.如权利要求41所述的方法，其中所述处理步骤包括对所述荧光数据进行操作以获得沿两个不同维度的细胞尺寸的比率，并且利用所述比率来作出所述分选决定。
60.如权利要求41所述的方法，所述方法进一步包括：
用两种荧光标记标记所述细胞，其中一种联接到所述细胞的膜且另一种联接到所述细胞的细胞核。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述光学辐射被配置成从两种所述标记引出荧光辐射，并且其中所述检测步骤包括检测在两个不同通道中从两种标记发出的所述荧光辐射。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述处理步骤包括分析在所述通道中检测到的荧光辐射以获得所述细胞的细胞质和所述细胞的细胞核的维度尺寸的估计，并且基于所述细胞的细胞核和细胞质的所述维度尺寸估计的比率作出所述分选决定。
63.如权利要求41所述的方法，所述方法进一步包括：获得所述荧光数据的傅里叶变换，并确定所述变换中与所述射频不同的频率，获得在所述不同频率下的傅里叶变换值之和，并将所述和与预定阈值进行比较以作出所述分选决定。
64.一种用于在流式细胞术***中分选细胞的方法，所述方法包括：
用具有彼此偏移一个或多个射频的两个或更多个光学频率的辐射照射细胞以从所述细胞引出荧光辐射，
检测所述荧光辐射以生成时间荧光数据，并且
处理所述时间荧光数据以用等于或小于约100微秒的延迟时间得出关于所述细胞的分选决定。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述处理步骤包括对所述荧光数据进行操作以获得所述细胞的特征的估计并基于所述估计得出所述分选决定。
66.如权利要求64所述的方法，其中所述处理步骤包括分析在一个或多个拍频下对荧光数据的调制以得出所述分选决定。
67.一种在流式细胞术***中分选细胞的方法，所述方法包括：
将各自与至少一种荧光团相关联的多个细胞以大于每秒约100个细胞的速率一次一个地引入光学询问区域以用射频调制的光学辐射照射所述细胞中的每一个，以便从与该细胞相关联的所述至少一种荧光团引出荧光辐射，
对于每个细胞，执行以下步骤：
检测从所述细胞发射的所述荧光辐射以生成时间荧光波形，并且
处理所述时间荧光波形以得出关于所述细胞的分选决定。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述细胞以大于每秒约500个细胞的速率一次一个地引入所述光学询问区域。
69.如权利要求67所述的方法，其中所述细胞以大于每秒约1000个细胞的速率一次一个地引入所述光学询问区域。
70.如权利要求67所述的方法，所述方法进一步包括基于所述分选决定将所述细胞引入多个容器中的一个容器中。
71.一种分选颗粒的方法，所述方法包括：
用射频调制的光束照射颗粒以便从所述细胞引出荧光辐射和散射辐射中的任何一种，
检测从所述细胞发出的荧光、散射或透射辐射以生成荧光、散射或透射波形数据，
在并未基于所述数据计算所述颗粒的图像的情况下处理任何所述荧光和散射数据以作出关于所述颗粒的分选决定。
72.如权利要求71所述的方法，其中所述光束是激光束。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述光束具有在约300THz至约1000THz范围内的光学频率。
74.如权利要求72所述的方法，其中所述光束包括以在约50MHz至约250MHz范围内的一个或多个射频偏移的多个光学频率。
75.如权利要求72所述的方法，其中所述处理步骤包括分析在荧光、散射或透射辐射中的任何一种中检测到的一个或多个拍频，以得出所述分选决定。
76.如权利要求72所述的方法，其中所述射频调制的光束包括多个在角度或空间上分离的小束，每个小束相对于另一个具有射频偏移。
77.如权利要求72所述的方法，其中所述颗粒是生物颗粒中的至少一种。
78.如权利要求72所述的方法，其中所述颗粒是以下中的任何一种：细胞、微囊泡、细胞碎片、脂质体、珠粒和小生物体。
79.如权利要求77所述的方法，其中所述生物颗粒是细胞。
80.一种用于确定颗粒的特征的***，所述***包括：
照射***，其用于用射频调制的光学辐射照射颗粒，
检测***，其用于检测响应于所述照射从所述颗粒发出的荧光和散射辐射中的任何一种以生成荧光或散射数据，
与所述检测***通信的分析模块，其用于接收所述荧光和散射数据并处理所述数据以计算至少一个特征的估计。
81.如权利要求80所述的***，其中在并未基于所述荧光或散射数据形成所述颗粒的图像的情况下，所述分析模块计算所述颗粒的至少一个特征的估计。
82.如权利要求80所述的***，其中所述颗粒的所述至少一个特征包括以下中的至少一个：所述颗粒的维度尺寸、所述颗粒沿两个不同维度的尺寸比率、由与所述颗粒相关的两种或更多种标记发射的荧光辐射的共定位、从所述颗粒发射的荧光辐射的点状度、所述荧光辐射的空间分布的量度、所述颗粒的位置或取向的量度、所述颗粒的偏心率的量度、所述颗粒与参考颗粒相似性的量度、所述颗粒的一个或多个空间傅里叶分量的组合、所述颗粒位于所述照射辐射焦点的程度的量度。
83.如权利要求80所述的***，其中所述颗粒包括以下中的任何一种：细胞、微囊泡、细胞碎片、脂质体、珠粒和小生物体。
84.如权利要求80所述的***，其中所述颗粒包括细胞并且所述至少一个特征是所述细胞的细胞质和细胞核的尺寸的比率。
85.如权利要求80所述的***，其中所述照射***生成光束，所述光束包括多个在角度上分离的小束，所述小束具有彼此分离至少一个射频的光学频率。
86.如权利要求80所述的***，其中所述照射***包括：
用于生成激光束的源，
接收所述激光束的单个声光偏转器(AOD)，以及
射频(RF)梳状发生器，其用于向所述AOD施加多个RF驱动信号以将所述接收的激光束衍射成所述多个在角度上分离的小束。
87.一种用于分选颗粒的***，所述***包括：
照射***，其用于用射频调制的光学辐射照射颗粒，
检测***，其用于检测响应于所述照射从所述颗粒发出的荧光和散射辐射中的任何一种以生成荧光或散射数据，
与所述检测***通信的分析模块，其用于接收任何所述荧光和散射数据并处理所述数据以得出关于所述颗粒的分选决定，以及
致动器，其能够基于所述分选决定将所述颗粒从其流动路径转移到单独的容器。
88.如权利要求87所述的***，其中在并未基于所述荧光或散射数据形成所述颗粒的图像的情况下，所述分析模块得出所述分选决定。
89.如权利要求87所述的***，其中所述照射***生成光束，所述光束包括多个在角度上分离的小束，所述小束具有彼此分离至少一个射频的光学频率。
90.如权利要求89所述的***，其中所述照射***包括：
用于生成激光束的源，
接收所述激光束的单个声光偏转器(AOD)，以及
射频(RF)梳状发生器，其用于向所述AOD施加多个RF驱动信号以将所述接收的激光束衍射成所述多个在角度上分离的小束。
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