JP7125936B2

JP7125936B2 - 試料観察装置及び試料観察方法

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Publication number: JP7125936B2
Application number: JP2019529455A
Authority: JP
Inventors: 範和杉山; 正典松原; 諭山本
Original assignee: Hamamatsu Photonics KK
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Priority date: 2017-07-11
Filing date: 2018-04-18
Publication date: 2022-08-25
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Description

本開示は、試料観察装置及び試料観察方法に関する。

細胞などの試料を観察する技術として例えば非特許文献１に記載の手法がある。この従来の手法では、細胞核を蛍光物質で染色し、蛍光物質を励起して得られた蛍光画像に基づいて細胞核の位置を特定している。そして、特定された細胞核の位置に基づいて試料の存在領域を推定し、解析領域を設定している。

Perkin Elmer APPLICATION NOTE, "Image-based Quantification of Apoptosisusing the Operetta"

上述した従来の手法では、細胞核の位置に基づいて試料の存在領域を推定しているに過ぎず、解析領域を特定する精度が十分であるとは言い難い。蛍光強度に基づいて試料の分析を精度良く実施するためには、解析領域を十分な精度で特定できる技術が必要となる。

本開示は、上記課題の解決のためになされたものであり、解析領域を十分な精度で特定できる試料観察装置及び試料観察方法を提供することを目的とする。

本開示の一側面に係る試料観察装置は、蛍光を用いて試料容器に保持された試料を観察する試料観察装置であって、試料に向けて面状光を照射する照射部と、面状光の照射面に対して試料を一方向に走査する走査部と、面状光の照射によって試料で発生した蛍光及び散乱光をそれぞれ結像する結像部と、結像部によって結像された蛍光の光像の少なくとも一部を撮像して第１の画像データを出力し、結像部によって結像された散乱光の光像の少なくとも一部を撮像して第２の画像データを出力する撮像部と、一方向について得られた複数の第１の画像データに基づいて蛍光画像を生成し、一方向について得られた複数の第２の画像データに基づいて散乱光画像を生成する画像処理部と、散乱光画像に基づいて蛍光画像における試料の存在領域を特定し、試料の存在領域に基づいて蛍光画像における解析領域を設定し、解析領域における蛍光の強度を解析する解析部と、を備える。

この試料観察装置では、試料からの蛍光に基づいて蛍光画像を生成し、試料からの散乱光に基づいて散乱光画像を生成する。散乱光画像からは、試料の輪郭形状を特定することが可能である。したがって、散乱光画像に基づいて特定された試料の輪郭形状から試料の存在領域を十分な精度で特定できる。蛍光画像において、特定された試料の存在領域に基づいて解析領域を設定し、解析領域における蛍光強度を求めることにより、試料の分析を精度良く実施することができる。

また、結像部は、蛍光を透過する第１の光フィルタと、散乱光を透過する第２の光フィルタとを結像光路上で切り替える切替部を有していてもよい。この場合、蛍光と散乱光との分割を簡単な構成で実現できる。

また、結像部は、蛍光と散乱光とを分割する光分割素子を有し、撮像部は、光分割素子によって分割された蛍光の少なくとも一部を撮像する第１の光検出器と、光分割素子によって分割された散乱光の少なくとも一部を撮像する第２の光検出器とを有していてもよい。この場合、蛍光と散乱光との分割を簡単な構成で実現できる。

また、結像部は、蛍光と散乱光とを分割する光分割素子を有し、撮像部は、光分割素子によって分割された蛍光の少なくとも一部を撮像する第１の撮像領域、及び光分割素子によって分割された散乱光の少なくとも一部を撮像する第２の撮像領域を含む受光面を有する光検出器を備えていてもよい。この場合、蛍光と散乱光との分割を簡単な構成で実現できる。

また、結像部は、照射面に対して傾斜する観察軸を有していてもよい。この場合、視野選択動作が不要となり、試料の走査と撮像とを同時進行することが可能となる。したがって、蛍光画像及び散乱光画像を得るまでのスループットの向上が図られる。

また、本開示の一側面に係る試料観察方法は、蛍光を用いて試料容器に保持された試料を観察する試料観察方法であって、試料に向けて面状光を照射する照射ステップと、面状光の照射面に対して試料を一方向に走査する走査ステップと、面状光の照射によって試料で発生した蛍光及び散乱光をそれぞれ結像する結像ステップと、結像ステップによって結像された蛍光の光像の少なくとも一部を撮像して第１の画像データを出力し、結像ステップによって結像された散乱光の光像の少なくとも一部を撮像して第２の画像データを出力する撮像ステップと、一方向について得られた複数の第１の画像データに基づいて蛍光画像を生成し、一方向について得られた複数の第２の画像データに基づいて散乱光画像を生成する画像処理ステップと、散乱光画像に基づいて蛍光画像における試料の存在領域を特定し、試料の存在領域に基づいて蛍光画像における解析領域を設定し、解析領域における蛍光の強度を解析する解析ステップと、を備える。

この試料観察方法では、試料からの蛍光に基づいて蛍光画像を生成し、試料からの散乱光に基づいて散乱光画像を生成する。散乱光画像からは、試料の輪郭形状を特定することが可能である。したがって、散乱光画像に基づいて特定された試料の輪郭形状から試料の存在領域を十分な精度で特定できる。蛍光画像において、特定された試料の存在領域に基づいて解析領域を設定し、解析領域における蛍光強度を求めることにより、試料の分析を精度良く実施することができる。

また、蛍光を透過する第１の光フィルタと、散乱光を透過する第２の光フィルタとを結像光路上で切り替える切替ステップをさらに有していてもよい。この場合、蛍光と散乱光との分割を簡単な構成で実現できる。

また、光分割素子によって、蛍光と散乱光を分割する光分割ステップをさらに有し、撮像ステップは、光分割素子によって分割された蛍光の少なくとも一部を撮像する第１の撮像ステップと、光分割素子によって分割された散乱光の少なくとも一部を撮像する第２の撮像ステップとを有していてもよい。この場合、蛍光と散乱光との分割を簡単な構成で実現できる。

また、光分割素子によって、蛍光と散乱光とを分割する光分割ステップをさらに有し、撮像ステップでは、第１の撮像領域及び第２の撮像領域を含む受光面を有する光検出器によって、光分割素子によって分割された蛍光の少なくとも一部を第１の撮像領域で撮像し、光分割素子によって分割された散乱光の少なくとも一部を第２の撮像領域で撮像していてもよい。この場合、蛍光と散乱光との分割を簡単な構成で実現できる。

また、結像ステップは、照射面に対して傾斜する観察軸を有する結像部を用いて、面状光の照射によって試料で発生した蛍光及び散乱光をそれぞれ結像していてもよい。この場合、視野選択動作が不要となり、試料の走査と撮像とを同時進行することが可能となる。したがって、蛍光画像及び散乱光画像を得るまでのスループットの向上が図られる。

本開示によれば、解析領域を十分な精度で特定できる。

試料観察装置の一実施形態を示すブロック図である。図１に示した試料観察装置における照射部、試料容器、及び結像部の構成例を示す概略図である。撮像部の構成例を示す図である。試料観察装置を構成するコンピュータの機能的な構成要素の一例を示すブロック図である。（ａ）は第１の画像データの一例を示す図であり、（ｂ）は第２の画像データの一例を示す図である。（ａ）は第１の画像データの別例を示す図であり、（ｂ）は第２の画像データの別例を示す図である。（ａ）は蛍光画像の一例を示す図であり、（ｂ）は散乱光画像の一例を示す図である。蛍光画像における解析領域の設定の様子を示す図である。図１に示した試料観察装置を用いた試料観察方法の一例を示すフローチャートである。結像部の変形例を示す概略図である。結像部の更なる変形例を示す概略図である。蛍光画像における解析領域の設定の様子の変形例を示す図である。

以下、図面を参照しながら、本開示の一側面に係る試料観察装置及び試料観察方法の好適な実施形態について詳細に説明する。

図１は、試料観察装置の一実施形態を示すブロック図である。この試料観察装置１は、試料Ｓで発生した蛍光又は散乱光を結像面に結像させて試料Ｓの観察画像データを取得し、当該観察画像データに基づいて試料Ｓの解析及び評価を行う装置である。

この種の試料観察装置としては、スライドガラスに保持される試料Ｓの画像を取得し表示するスライドスキャナ、あるいはマイクロプレートに保持される試料Ｓの画像データを取得し、画像データを解析するプレートリーダなどがある。観察対象となる試料Ｓとしては、例えば一或いは動物の細胞、組織などが挙げられる。試料Ｓは、面状光Ｌ２（図２参照）によって励起される蛍光物質によって染色されている。蛍光物質としては、例えば生きている細胞を特異的に染色するカルセインＡＭ、細胞の表面抗原と特異的に結合する蛍光抗体（例えば蛍光物質フルオレセインによってラべルされた抗体）などが挙げられる。なお、試料Ｓは、異なる種類の複数の蛍光物質によって染色されていてもよい。

試料Ｓは、図２に示すように、試料容器２に保持されている。試料容器２は、例えばマイクロプレートである。試料容器２は、試料Ｓが配置される複数のウェル３が一直線状（或いはマトリクス状）に配列された板状の本体部４と、本体部４の一面側においてウェル３の一端側を塞ぐように設けられた板状の透明部材５とを有している。

透明部材５は、ウェル３内に配置された試料Ｓに対する面状光Ｌ２の入力面５ａを有している。透明部材５の材質は、面状光Ｌ２の波長に対する透過率が高い（例えば透過率が７０％以上）部材であれば特に限定はされないが、例えばガラス、石英、或いは合成樹脂である。なお、ウェル３の他端側は、外部に開放された状態となっている。ウェル３内への試料Ｓの配置にあたっては、ウェル３内が水などの媒体で充填されていてもよい。

試料観察装置１は、図１に示すように、照射部１１と、走査部１２と、撮像部１３と、コンピュータ１４とを備えて構成されている。照射部１１は、面状光Ｌ２を励起光として試料Ｓに向けて照射する。照射部１１は、図２に示すように、光源１５と、面状光形成部１６とによって構成されている。光源１５は、面状光Ｌ２の形成元となる光Ｌ１を出力する。光源１５としては、例えばレーザダイオード、固体レーザ光源といったレーザ光源などが挙げられる。また、光源１５は、発光ダイオード、スーパールミネッセントダイオード、ランプ系光源であってもよい。光源１５から出力された光Ｌ１は、面状光形成部１６に導光される。

面状光形成部１６は、光源１５から出力された光Ｌ１を面状光Ｌ２に整形し、整形された面状光Ｌ２を光軸Ｐ１に沿って試料Ｓに照射する。本実施形態では、面状光形成部１６の光軸が面状光Ｌ２の光軸Ｐ１となっている。面状光形成部１６は、例えばシリンドリカルレンズ、アキシコンレンズ、或いは空間光変調器などの光整形素子を含んで構成され、光源１５に対して光学的に結合されている。面状光形成部１６は、対物レンズ、光シャッタなどを含んで構成されていてもよい。

試料Ｓの厚さ方向に観察を行う場合、分解能を考慮して、面状光Ｌ２は、厚さ２ｍｍ以下の薄い面状光であることが好ましい。また、試料Ｓの厚さが非常に小さい場合、すなわち、Ｚ方向解像度以下の厚さの試料Ｓを観察する場合には、面状光Ｌ２の厚さは分解能に影響しない。この場合には、厚さ２ｍｍを超える面状光Ｌ２を用いてもよい。照射部１１によって形成された面状光Ｌ２は、試料容器２に保持された試料Ｓに照射される。面状光Ｌ２の照射により、面状光Ｌ２の照射面Ｒでは、観察光が発生する。観察光には、例えば面状光Ｌ２によって試料Ｓで励起された蛍光Ｊ１、試料Ｓの表面で散乱した面状光Ｌ２の散乱光Ｊ２がそれぞれ含まれる。

走査部（スキャナ）１２は、面状光Ｌ２の照射面Ｒに対して試料Ｓを走査する機構である。走査部１２は、例えば試料Ｓを保持する試料容器２を移動させる移動ステージを含んで構成されている。移動ステージは、コンピュータ１４からの制御信号に従い、予め設定された方向に試料容器２を走査する。本実施形態では、移動ステージは、面状光Ｌ２の光軸Ｐ１と直交する平面内の一方向に試料容器２を走査する。以下の説明では、図２に示すように、面状光Ｌ２の光軸Ｐ１方向をＺ軸、移動ステージによる試料容器２の走査方向をＹ軸、面状光Ｌ２の光軸Ｐ１と直交する平面内においてＹ軸に直交する方向をＸ軸と称する。試料Ｓに対する面状光Ｌ２の照射面Ｒは、ＸＺ平面内の面となる。

本実施形態では、面状光Ｌ２の照射によって試料Ｓで発生した蛍光Ｊ１及び散乱光Ｊ２をそれぞれ結像する結像部１７が設けられている。結像部１７は、例えばコリメータレンズ１８と、結像レンズ１９と、第１の光フィルタ２０Ａと、第２の光フィルタ２０Ｂと、切替部Ｙとによって構成されている。

コリメータレンズ１８は、照射面Ｒで生じた蛍光Ｊ１或いは散乱光Ｊ２を平行光化するレンズである。また、結像レンズ１９は、コリメータレンズ１８によって平行光化された蛍光Ｊ１或いは散乱光Ｊ２を結像するレンズである。第１の光フィルタ２０Ａは、蛍光Ｊ１を透過し、それ以外の波長の光をカットする光フィルタである。第２の光フィルタ２０Ｂは、散乱光Ｊ２を透過し、それ以外の波長の光をカットする光フィルタである。

切替部Ｙは、例えば第１の光フィルタ２０Ａ及び第２の光フィルタ２０Ｂが載置される切替ステージを有している。切替ステージは、コリメータレンズ１８と結像レンズ１９との間の結像光路上に配置されている。切替部Ｙは、コンピュータ１４からの制御信号に従って、光源１５の駆動に同期して結像部１７の光軸と交差する方向に切替ステージを駆動し、蛍光Ｊ１を透過する第１の光フィルタ２０Ａと、散乱光Ｊ２を透過する第２の光フィルタ２０Ｂとを結像光路上で切り替える。切替部Ｙによって第１の光フィルタ２０Ａが結像光路上に進出しているときには、蛍光Ｊ１のみが結像部１７によって結像する。一方、切替部Ｙによって第２の光フィルタ２０Ｂが結像光路上に進出しているときには、散乱光Ｊ２のみが結像部１７によって結像する。なお、切替部Ｙは、第１の光フィルタ２０Ａ及び第２の光フィルタ２０Ｂが載置されるフィルタホイールを有してもよい。

結像部１７の光軸は、蛍光Ｊ１及び散乱光Ｊ２の観察軸Ｐ２となっている。この観察軸Ｐ２は、面状光Ｌ２の照射面Ｒに対して傾斜角度θをもって傾斜している。傾斜角度θは、試料Ｓに向かう面状光Ｌ２の光軸Ｐ１と観察軸Ｐ２とがなす角とも一致する。傾斜角度θは、例えば１０°～８０°となっている。観察画像の解像度を向上させる観点から、傾斜角度θは、２０°～７０°であることが好ましい。また、観察画像の解像度の向上及び視野の安定性の観点から、傾斜角度θは、３０°～６５°であることが更に好ましい。

撮像部１３は、結像部１７によって結像された蛍光Ｊ１の光像の少なくとも一部及び散乱光Ｊ２の光像の少なくとも一部を撮像する。撮像部１３を構成する光検出器としては、例えばＣＭＯＳイメージセンサ、ＣＣＤイメージセンサといったエリアイメージセンサが挙げられる。これらのエリアイメージセンサは、結像部１７による結像面に配置され、例えばグローバルシャッタ或いはローリングシャッタによって光像を撮像し、二次元画像データを生成する。

撮像部１３は、蛍光Ｊ１の光像の少なくとも一部に基づく第１の画像データ、及び散乱光Ｊ２の光像の少なくとも一部に基づく第２の画像データをコンピュータ１４にそれぞれ出力する。上述したように、試料観察装置１では、照射面Ｒに対して試料容器２がＹ軸方向（一方向）に走査されると共に、照射面Ｒからの蛍光Ｊ１の光像及び散乱光Ｊ２の光像が撮像部１３によって撮像される。すなわち、撮像部１３では、Ｙ軸方向について複数の第１の画像データ（ＸＺ画像）及び複数の第２の画像データ（ＸＺ画像）が生成される。

撮像部１３では、光検出器にラインスキャン方式を適用し、照射面Ｒからの蛍光Ｊ１及び散乱光Ｊ２を部分的に撮像してもよい。例えば図３（ａ）に示すように、エリアイメージセンサ２１の撮像面においてサブアレイを設定してもよい。この場合、サブアレイに含まれる画素列２１ａのみを読み出すことができるので、蛍光Ｊ１或いは散乱光Ｊ２による光像を部分的に撮像できる。また、図３（ｂ）に示すように、エリアイメージセンサ２１の全ての画素列を読み出しエリアとし、その後の画像処理によって二次元画像の一部を抽出してもよい。

さらに、図３（ｃ）に示すように、エリアイメージセンサ２１に代えてラインセンサ２２などの光検出器を用い、撮像面自体を一の画素列に限定して部分的な撮像を行ってもよい。図３（ｄ）に示すように、蛍光Ｊ１或いは散乱光Ｊ２の一部のみを透過させるスリット２３をエリアイメージセンサ２１の前面に配置し、スリット２３に対応する画素列２１ａの画像データを取得してもよい。スリット２３を用いる場合、エリアイメージセンサに代えて光電子増倍管などのポイントセンサなどの光検出器を用いてもよい。

コンピュータ１４は、物理的には、ＲＡＭ、ＲＯＭ等のメモリ、及びＣＰＵ等のプロセッサ（演算回路）、通信インターフェイス、ハードディスク等の格納部、ディスプレイ等の表示部を備えて構成されている。かかるコンピュータ１４としては、例えばパーソナルコンピュータ、マイクロコンピュータ、クラウドサーバ、スマートデバイス（スマートフォン、タブレット端末など）などが挙げられる。コンピュータ１４は、メモリに格納されるプログラムをコンピュータシステムのＣＰＵで実行することにより、光源１５、走査部１２、切替部Ｙ、及び撮像部１３の動作を制御するコントローラとして機能する。

コントローラとしてのコンピュータ１４は、ユーザによる測定開始の操作の入力を受け、光源１５、走査部１２、及び撮像部１３を同期させて駆動する。これにより、面状光Ｌ２の照射面Ｒに対して試料容器２がＹ方向に走査され、照射面Ｒからの蛍光Ｊ１及び散乱光Ｊ２の複数のＸＺ画像が撮像部１３によって撮像される。コンピュータ１４は、走査部１２による試料容器２の移動中に、光源１５が光Ｌ１を連続的に出力するように光源１５を制御してもよく、撮像部１３による撮像に合わせて光源１５による光Ｌ１の出力のＯＮ／ＯＦＦを制御してもよい。また、照射部１１が光シャッタを備えている場合、コンピュータ１４は、当該光シャッタの制御によって光Ｌ１の照射をＯＮ／ＯＦＦさせてもよい。

また、コンピュータ１４は、機能的な構成要素として、図４に示すように、撮像結果受信部３１と、画像処理部３２と、解析部３３とを備えている。撮像結果受信部３１は、撮像部１３から撮像データを受信する部分である。すなわち、撮像結果受信部３１は、撮像部１３から蛍光Ｊ１の光像の少なくとも一部に基づく第１の画像データ、及び散乱光Ｊ２の光像の少なくとも一部に基づく第２の画像データを受信し、画像処理部３２に出力する。

図５（ａ）は、第１の画像データの一例を示す図である。第１の画像データＧ１は、試料Ｓで生じた蛍光Ｊ１のＸＺ像に対応する。蛍光Ｊ１は、試料Ｓを染色する蛍光物質が面状光Ｌ２によって励起されて生じる。したがって、第１の画像データＧ１には、試料Ｓに対応する蛍光像Ｍ１が出現し得る。図５（ｂ）は、第２の画像データの一例を示す図である。第２の画像データＧ２は、試料Ｓで生じた散乱光Ｊ２のＸＺ像に対応する。散乱光Ｊ２は、試料Ｓの表面で面状光が散乱して生じる。したがって、第２の画像データＧ２には、主として試料Ｓの輪郭形状に対応する散乱光像Ｍ２が出現し得る。

図６（ａ）は、第１の画像データの別例を示す図である。この例では、試料Ｓの一部で蛍光Ｊ１が生じている。また、蛍光Ｊ１が生じない試料Ｓも存在する。このため、この別例では、第１の画像データＧ１において、試料の一部に対応する蛍光像Ｍ１が出現し得る。図６（ｂ）は、第２の画像データの別例を示す図である。試料Ｓの一部で蛍光Ｊ１が生じている場合であっても、散乱光Ｊ２は、試料Ｓの表面で面状光が散乱することにより、図５（ｂ）と同様に生じる。したがって、この別例では、第１の画像データＧ１における蛍光像Ｍ１と、第２の画像データＧ２における散乱光像Ｍ２とが一致しない状態となっている。

画像処理部３２は、蛍光画像及び散乱光画像を生成する。画像処理部３２は、Ｙ軸方向について得られた複数の第１の画像データＧ１と、Ｙ軸方向について得られた複数の第２の画像データＧ２とを撮像結果受信部３１から受信する。画像処理部３２は、受信した複数の第１の画像データＧ１及び複数の第２の画像データＧ２をＺ方向に圧縮する。Ｚ軸方向に圧縮された複数の第１の画像データＧ１は、Ｘ軸方向についての蛍光輝度を示し、Ｚ軸方向に圧縮された複数の第２の画像データＧ２は、Ｘ軸方向についての散乱光輝度を示す。画像処理部３２は、第１の画像データＧ１及び第２の画像データＧ２のそれぞれについて、Ｚ軸方向に圧縮された複数の画像データをＹ軸方向に合成し、各画像データにおける蛍光輝度及び散乱光強度を積算することで、蛍光画像及び散乱光画像を生成する。画像処理部３２は、生成した蛍光画像及び散乱光画像を解析部３３に出力する。

図７（ａ）は、蛍光画像の一例を示す図である。蛍光画像Ｆ１は、Ｚ軸方向に圧縮された複数の第１の画像データＧ１をＹ軸方向に合成したものであり、蛍光画像Ｆ１に出現する蛍光像Ｎ１は、試料Ｓに対応する蛍光のＸＹ像となる。図７（ａ）中には、試料Ｓの一部で蛍光Ｊ１が生じているもの及び試料Ｓで蛍光Ｊ１が生じないものも含まれている。また、図７（ｂ）は、散乱光画像の一例を示す図である。散乱光画像Ｆ２は、Ｚ軸方向に圧縮された複数の第２の画像データＧ２をＹ軸方向に合成したものであり、散乱光画像Ｆ２に出現する散乱光像Ｎ２は、試料Ｓの輪郭形状に対応する散乱光のＸＹ像となる。

解析部３３は、解析領域Ｎ５における蛍光の強度を解析する。解析部３３は、画像処理部３２から蛍光画像Ｆ１及び散乱光画像Ｆ２を受信すると、まず、散乱光画像Ｆ２に出現する散乱光像Ｎ２の輪郭形状を試料Ｓの存在領域Ｎ４として抽出する（図７（ｂ）参照）。次に、解析部３３は、図８に示すように、試料Ｓの存在領域Ｎ４を解析領域Ｎ５として蛍光画像Ｆ１に割り当て、蛍光画像Ｆ１における解析領域Ｎ５を設定する。そして、解析部３３は、設定した解析領域Ｎ５における蛍光の強度を蛍光画像Ｆ１に基づいて解析する。

次に、上述した試料観察装置１を用いた試料観察方法について説明する。図９は、図１に示した試料観察装置１を用いた試料観察方法の一例を示すフローチャートである。

この試料観察方法は、図９に示すように、準備ステップ（ステップＳ０１）と、照射ステップ（ステップＳ０２）と、走査ステップ（ステップＳ０３）と、結像ステップ（ステップＳ０４）、撮像ステップ（ステップＳ０５）と、画像処理ステップ（ステップＳ０６）と、解析ステップ（ステップＳ０７）とを備えて構成されている。

準備ステップでは、試料容器２への試料Ｓの保持を行う。ここでは、蛍光物質によって試料Ｓを染色し、ウェル３内に保持する。ウェル３への試料Ｓの保持の後、試料容器２を走査部１２にセットする。

照射ステップでは、試料容器２のウェル３に向けて面状光Ｌ２を照射する。ユーザによって測定開始の操作が試料観察装置１に入力されると、コンピュータ１４からの制御信号に基づいて光源１５が駆動し、面状光Ｌ２の形成元である光Ｌ１が照射される。光源１５から出力した光Ｌ１は、面状光形成部１６によって整形されて面状光Ｌ２となり、試料容器２に保持された試料Ｓに照射される。

走査ステップでは、面状光Ｌ２の照射面Ｒに対して試料容器２を走査する。ユーザによって測定開始の操作が入力されると、コンピュータ１４からの制御信号に基づいて、光源１５の駆動と同期して走査部１２が駆動する。これにより、試料容器２がＹ軸方向に一定の速度で直線的に駆動し、面状光Ｌ２の照射面Ｒに対してウェル３内の試料Ｓが走査される。

結像ステップでは、面状光Ｌ２の照射によって試料Ｓで発生した蛍光Ｊ１及び散乱光Ｊ２を結像する。結像ステップでは、照射面Ｒに対して傾斜する観察軸Ｐ２により、蛍光Ｊ１及び散乱光Ｊ２を光検出器の受光面に対して結像する。結像ステップでは、コンピュータ１４からの制御信号に従って切替部Ｙを駆動し、結像光路上の第１の光フィルタ２０Ａ及び第２の光フィルタ２０Ｂの切り替えを行ってもよい（切替ステップ）。第１の光フィルタ２０Ａが結像光路上に進出しているときには、蛍光Ｊ１のみが結像部１７によって結像する。一方、第２の光フィルタ２０Ｂが結像光路上に進出しているときには、散乱光Ｊ２のみが結像部１７によって結像する。

撮像ステップでは、結像部１７によって結像された蛍光Ｊ１の光像の少なくとも一部及び散乱光Ｊ２の光像の少なくとも一部を撮像する。撮像ステップでは、蛍光Ｊ１の光像の少なくとも一部に基づく第１の画像データＧ１、及び散乱光Ｊ２の光像の少なくとも一部に基づく第２の画像データＧ２をＹ軸方向についてそれぞれ複数生成し、コンピュータ１４にそれぞれ出力する。

画像処理ステップでは、蛍光画像Ｆ１及び散乱光画像Ｆ２を生成する。画像処理ステップでは、まず、撮像ステップで得られた複数の第１の画像データＧ１及び複数の第２の画像データＧ２をＺ方向に圧縮する。次に、第１の画像データＧ１及び第２の画像データＧ２のそれぞれについて、Ｚ軸方向に圧縮された複数の画像データをＹ軸方向に合成し、各画像データにおける蛍光輝度或いは散乱光輝度を積算する。これにより、試料Ｓに対応する蛍光のＸＹ像である蛍光画像Ｆ１と、試料Ｓの輪郭形状に対応する散乱光のＸＹ像である散乱光画像Ｆ２とが生成される。

解析ステップでは、解析領域Ｎ５における蛍光の強度を解析する。解析ステップでは、まず、散乱光画像Ｆ２に出現する散乱光像Ｎ２の輪郭形状を試料Ｓの存在領域Ｎ４として抽出する。次に、試料Ｓの存在領域Ｎ４を解析領域Ｎ５として蛍光画像Ｆ１に割り当て、蛍光画像Ｆ１における解析領域Ｎ５を設定する。そして、設定した解析領域Ｎ５における蛍光の強度を蛍光画像Ｆ１に基づいて解析する。

試料観察装置１では、試料Ｓからの蛍光Ｊ１に基づいて蛍光画像Ｆ１を生成し、試料Ｓからの散乱光Ｊ２に基づいて散乱光画像Ｆ２を生成する。散乱光画像Ｆ２からは、試料Ｓの輪郭形状を特定することが可能である。したがって、散乱光画像Ｆ２に基づいて特定した試料Ｓの輪郭形状を蛍光画像Ｆ１に適用することにより、蛍光画像Ｆ１において試料Ｓの存在領域Ｎ４を十分な精度で特定できる。蛍光画像Ｆ１において、特定された試料Ｓの存在領域Ｎ４の蛍光強度を求めることにより、試料Ｓの分析を精度良く実施することができる。

また、試料観察装置１では、結像部１７において、蛍光Ｊ１を透過する第１の光フィルタ２０Ａと、散乱光Ｊ２を透過する第２の光フィルタ２０Ｂとを結像光路上で切り替える切替部Ｙが設けられている。これにより、蛍光Ｊ１と散乱光Ｊ２との分割を簡単な構成で実現できる。

また、試料観察装置１では、光源１５からの光Ｌ１が面状光形成部１６によって面状光Ｌ２に整形される。これにより、撮像部１３において、第１の画像データＧ１及び第２の画像データＧ２を２次元データとして取得することが可能となる。さらに、試料観察装置１では、結像部１７が面状光Ｌ２の照射面Ｒに対して傾斜する観察軸Ｐ２を有している。これにより、視野選択動作が不要となり、試料Ｓの走査と撮像とを同時進行することが可能となる。したがって、蛍光画像Ｆ１及び散乱光画像Ｆ２を得るまでのスループットの向上が図られる。

本開示は、上記実施形態に限られるものではない。例えば結像ステップでは、面状光Ｌ２の照射によって試料Ｓで発生した蛍光Ｊ１及び散乱光Ｊ２を光分割素子によって分割してもよい（光分割ステップ）。この場合、結像部１７は、図１０に示すように、コリメータレンズ１８と、結像レンズ１９Ａ，１９Ｂと、ビームスプリッタ（光分割素子）４１と、ミラー４２と、第１の光フィルタ２０Ａと、第２の光フィルタ２０Ｂとによって構成されていてもよい。同図の例では、撮像部１３は、第１の光検出器４３Ａと、第２の光検出器４３Ｂとを備えている。ビームスプリッタ４１としては、例えばダイクロイックミラーを用いることができる。

ビームスプリッタ４１及び第１の光フィルタ２０Ａは、コリメータレンズ１８と結像レンズ１９Ａとの間の結像光路上に配置されている。蛍光Ｊ１は、コリメータレンズ１８によって平行光化され、ビームスプリッタ４１及び第１の光フィルタ２０Ａを透過する。第１の光フィルタ２０Ａを透過した蛍光Ｊ１は、結像レンズ１９Ａによって第１の光検出器４３Ａの受光面に結像する。第１の光検出器４３Ａは、蛍光Ｊ１の光像の少なくとも一部を撮像し、第１の画像データＧ１をコンピュータ１４に出力する。

第２の光フィルタ２０Ｂ及びミラー４２は、コリメータレンズ１８と結像レンズ１９Ｂとの間の結像光路上に配置されている。散乱光Ｊ２は、コリメータレンズ１８によって平行光化され、ビームスプリッタ４１で反射した後、第２の光フィルタ２０Ｂを透過する。第２の光フィルタ２０Ｂを透過した散乱光Ｊ２は、ミラー４２で反射し、結像レンズ１９Ｂによって第２の光検出器４３Ｂの受光面に結像する。第２の光検出器４３Ｂは、散乱光Ｊ２の光像の少なくとも一部を撮像し、第２の画像データＧ２をコンピュータ１４に出力する。このような構成においても、蛍光Ｊ１と散乱光Ｊ２との分割を簡単な構成で実現できる。

また、結像部は、図１１に示すような光分割装置５１によって構成されていてもよい。この光分割装置５１は、筐体５２内に、コリメータレンズ５３と、結像レンズ５４と、ビームスプリッタ（光分割素子）５５と、ミラー５６と、第１の光フィルタ２０Ａと、第２の光フィルタ２０Ｂと、結像レンズ移動機構５７とを備えて構成されている。筐体５２における光の入射端には、視野絞り５８が設けられている。視野絞り５８は、観察軸Ｐ２に対して垂直な方向の幅が可変となっている。ビームスプリッタ５５としては、例えばダイクロイックミラーを用いることができる。

ビームスプリッタ５５及び第１の光フィルタ２０Ａは、コリメータレンズ５３と結像レンズ５４との間の結像光路上に配置されている。視野絞り５８を通って筐体５２内に入射した蛍光Ｊ１は、コリメータレンズ５３によって平行光化され、ビームスプリッタ５５及び第１の光フィルタ２０Ａを透過して結像レンズ５４に導光される。また、第２の光フィルタ２０Ｂ及びミラー５６は、コリメータレンズ５３と結像レンズ５４との間の結像光路上に配置されている。視野絞り５８を通って筐体５２内に入射した散乱光Ｊ２は、コリメータレンズ５３によって平行光化され、ビームスプリッタ５５で反射した後、第２の光フィルタ２０Ｂを透過する。第２の光フィルタ２０Ｂを透過した散乱光Ｊ２は、ミラー５６で反射して結像レンズ５４に導光される。

ここで、結像レンズ５４は、結像レンズ移動機構５７により、蛍光Ｊ１の光軸に対して所定距離だけずれた状態となっている。また、撮像部１３における光検出器５９は、第１の撮像領域（図１０における光検出器５９の下半分領域）５９Ａ及び第２の撮像領域（図１０における光検出器５９の上半分領域）５９Ｂを含む受光面を有する。これにより、結像レンズ５４で結像した蛍光Ｊ１は、撮像部１３における光検出器５９の第１の撮像領域５９Ａに結像するのに対し、結像レンズ５４で結像した散乱光Ｊ２は、撮像部１３における光検出器５９の第２の撮像領域５９Ｂに結像する。光検出器５９は、第１の撮像領域５９Ａにおいて蛍光Ｊ１の光像の少なくとも一部を撮像し、第２の撮像領域５９Ｂにおいて散乱光Ｊ２の光像の少なくとも一部を撮像する。このような構成においても、蛍光Ｊ１と散乱光Ｊ２との分割を簡単な構成で実現できる。

また、例えば上記実施形態では、面状光Ｌ２を出力する照射部１１とラインスキャン方式を採用した撮像部１３とを組み合わせているが、試料容器２におけるウェル３の深さ方向の断面を一度に測定できるものであれば他の方式を採用してもよい。例えば米国特許第８５８２２０３号に記載のOblique Plane Microscopyの光学系を採用することも可能である。

試料Ｓが異なる種類の複数の蛍光物質で染色されている場合、照射部１１から各蛍光物質を励起する複数の面状光Ｌ２を出力してもよく、撮像部１３は、それぞれの蛍光物質から発せられた複数の蛍光の像をそれぞれ撮像してもよい。この場合、解析部３３は、散乱光画像Ｆ２に基づいて試料Ｓの存在領域Ｎ４を特定した後、複数の蛍光の像から得られた各蛍光画像Ｆ１に対し、試料Ｓの存在領域Ｎ４に基づく解析領域Ｎ５をそれぞれ設定する。これにより、試料Ｓに染色された各蛍光物質から発せられる蛍光強度等を精度良く解析できる。なお、試料Ｓが異なる種類の複数の蛍光物質で染色されている場合においても、複数の蛍光物質が同じ波長で励起される場合には、照射部１１から単一の面状光Ｌ２を出力してもよい。また、試料Ｓが異なる種類の複数の蛍光物質で染色されている場合においても、複数の蛍光物質が同じ波長の蛍光を発する場合は、複数回の撮像により、各蛍光物質から発せられた蛍光を撮像してもよい。

また、試料Ｓの存在領域Ｎ４と解析領域Ｎ５とは、必ずしも一致していなくてもよい。例えば図１２に示すように、蛍光画像Ｆ１に出現する蛍光像Ｎ１の内側（試料Ｓの存在領域Ｎ４の内側）に部分的に解析領域Ｎ５が設定されていてもよい。

１…試料観察装置、２…試料容器、３…ウェル、１１…照射部、１２…走査部、１３…撮像部、１７…結像部、２０Ａ…第１の光フィルタ、２０Ｂ…第２の光フィルタ、３２…画像処理部、３３…解析部、４１…ビームスプリッタ（光分割素子）、４３Ａ…第１の光検出器、４３Ｂ…第２の光検出器、５１…光分割装置（結像部）、５５…ビームスプリッタ（光分割素子）、５９…光検出器、５９Ａ…第１の撮像領域、５９Ｂ…第２の撮像領域、Ｌ２…面状光、Ｊ１…蛍光、Ｊ２…散乱光、Ｇ１…第１の画像データ、Ｇ２…第２の画像データ、Ｆ１…蛍光画像、Ｆ２…散乱光画像、Ｎ４…試料の存在領域、Ｎ５…解析領域、Ｓ…試料、Ｒ…照射面、Ｐ２…観察軸、Ｙ…切替部。

Claims

蛍光を用いて試料容器に保持された試料を観察する試料観察装置であって、
前記試料に向けて面状光を照射する照射部と、
前記面状光の照射面に対して前記試料を一方向に走査する走査部と、
前記面状光の照射によって前記試料で発生した蛍光及び散乱光をそれぞれ結像する結像部と、
前記結像部によって結像された前記蛍光の光像の少なくとも一部を撮像して第１の画像データを出力し、前記結像部によって結像された前記散乱光の光像の少なくとも一部を撮像して第２の画像データを出力する撮像部と、
前記一方向について得られた複数の前記第１の画像データに基づいて蛍光画像を生成し、前記一方向について得られた複数の前記第２の画像データに基づいて散乱光画像を生成する画像処理部と、
前記散乱光画像に基づいて前記蛍光画像における前記試料の存在領域を特定し、前記試料の存在領域に基づいて前記蛍光画像における解析領域を設定し、前記解析領域における蛍光の強度を解析する解析部と、を備え、
前記走査部は、ＸＺ平面内の面である前記面状光の照射面に対し、前記ＸＺ平面に直交するＹ方向に前記試料を走査する試料観察装置。
前記結像部は、前記蛍光を透過する第１の光フィルタと、前記散乱光を透過する第２の光フィルタとを結像光路上で切り替える切替部を有する請求項１記載の試料観察装置。
前記結像部は、前記蛍光と前記散乱光とを分割する光分割素子を有し、
前記撮像部は、前記光分割素子によって分割された前記蛍光の少なくとも一部を撮像する第１の光検出器と、前記光分割素子によって分割された前記散乱光の少なくとも一部を撮像する第２の光検出器とを有する請求項１記載の試料観察装置。
前記結像部は、前記蛍光と前記散乱光とを分割する光分割素子を有し、
前記撮像部は、前記光分割素子によって分割された前記蛍光の少なくとも一部を撮像する第１の撮像領域、及び前記光分割素子によって分割された前記散乱光の少なくとも一部を撮像する第２の撮像領域を含む受光面を有する光検出器を備える請求項１記載の試料観察装置。
前記結像部は、前記照射面に対して傾斜する観察軸を有する請求項１～４のいずれか一項記載の試料観察装置。
前記照射面に対する前記観察軸の傾斜角度が２０°～７０°となっている請求項５記載の試料観察装置。
前記照射面に対する前記観察軸の傾斜角度が３０°～６５°となっている請求項５又は６記載の試料観察装置。
蛍光を用いて試料容器に保持された試料を観察する試料観察方法であって、
前記試料に向けて面状光を照射する照射ステップと、
前記面状光の照射面に対して前記試料を一方向に走査する走査ステップと、
前記面状光の照射によって前記試料で発生した蛍光及び散乱光をそれぞれ結像する結像ステップと、
前記結像ステップによって結像された前記蛍光の光像の少なくとも一部を撮像して第１の画像データを出力し、前記結像ステップによって結像された前記散乱光の光像の少なくとも一部を撮像して第２の画像データを出力する撮像ステップと、
前記一方向について得られた複数の前記第１の画像データに基づいて蛍光画像を生成し、前記一方向について得られた複数の前記第２の画像データに基づいて散乱光画像を生成する画像処理ステップと、
前記散乱光画像に基づいて前記蛍光画像における前記試料の存在領域を特定し、前記試料の存在領域に基づいて前記蛍光画像における解析領域を設定し、前記解析領域における蛍光の強度を解析する解析ステップと、を備え、
前記走査ステップでは、ＸＺ平面内の面である前記面状光の照射面に対し、前記ＸＺ平面に直交するＹ方向に前記試料を走査する試料観察方法。