CN109504718B - 一种l-异亮氨酸的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种L‑异亮氨酸的生产方法，涉及生物化工领域，将膜分离法、沉降法与离子交换法相结合，避免了膜处理法及离子交换法中膜及离子交换树脂易受污染的问题，并解决了发酵过程中废液铵氮含量高、反渗透膜处理过程及离子交换过程中使用大量酸碱及废液废弃问题，稳定、高效且环保，得到的L‑异亮氨酸具有高纯度及高产率的特点。

Description

一种L-异亮氨酸的生产方法
技术领域
本发明涉及生物化工领域，具体涉及一种L-异亮氨酸的生产方法。
背景技术
L-异亮氨酸作为哺乳动物八种必须氨基酸之一，是合成人体激素及酶类的原料，能够促进蛋白质合成并抑制其分解。
L-异亮氨酸的生产方法包括提取法、化学合成法以及发酵法三类，提取法主要将蛋白质在酸性条件下水解后，碱中和使亮氨酸沉淀，再使用β-萘矾酸沉淀结晶后，采用离子交换法及层析分离法分离亮氨酸，分离效率高、操作简单且生产周期短，但提取率低、原材料需求量大、成本高、分离纯化困难；化学合成法包括α-卤代酸法、相转移催化法以及Storeker法，此类方法原料来源有限、步骤复杂且污染环境，很难实现工业化生产；发酵法指通过微生物发酵来生产L-异亮氨酸，该方法反应条件温和、易于大规模生产，但操作复杂、成本高。目前为止，发酵法是生产L-异亮氨酸最主要的方法。
发酵法主要包括：离子交换法、沉降法和膜分离法。目前，离子交换法是发酵法工业生产中最普遍使用的方法，污染小、反应条件温和，但前期由于发酵液有大量杂质，离子交换树脂易受到污染，而处理后期会产生大量铵废水，处理成本较高；沉降法操作简单、产品纯度高，但沉淀法中经常使用苯类物质作为沉淀剂，易滞留在产品中，具有致癌性，同时影响产品纯度，且该方法过程中会使用强酸提取，具有安全隐患；膜分离法能够提高产品质量、减少污染，通常包括微滤、超滤、纳滤以及反渗透，但膜分离过程中易产生膜污染，进而导致膜通量下降，影响分离效果。
申请号为201610655330.3的专利公开了一种全膜提取L-异亮氨酸的方法，该发明包括微滤膜过滤和絮凝除杂、超滤膜过滤、反渗透膜浓缩以及浓缩结晶过程，将膜分离法与絮凝技术结合，简单易行，同时提高了产品的纯度和收率。但该方法中使用的膜材料，如微滤膜，易被粒状物质及凝胶物质堵塞并沉积在膜内部，进而受到污染，导致更换清洗较为频繁，进而影响提取过程的稳定性、产品的纯度以及分离纯化效率。
申请号为201610655172.1的专利公开了一种制备L-异亮氨酸的方法，主要包括：微滤膜过滤和絮凝除杂、超滤膜过滤和浓缩结晶，其中，絮凝除杂使用了新型絮凝剂，除杂效果好、环保无污染，减轻了膜处理的负担，同时该发明简单可行，制备出的L-异亮氨酸具有较高的收率和纯度。但该发明同样也存在微滤膜易受到污染、需要清洗更换的问题，此外，该发明未使用离子交换树脂或反渗透膜作进一步处理，发酵液中的一些盐分如钙、镁离子等难以被去除，会影响L-异亮氨酸的纯度。
申请号为200510123082.X的专利公开了一种离子交换法从发酵液中提取L-异亮氨酸的清洁生产工艺，主要包括：L-异亮氨酸的制备、离子交换柱再生以及再生后硫酸铵溶液的循环利用。其中，L-异亮氨酸通过加热过滤、絮凝过滤、两次离子交换与洗脱、脱色、浓缩、结晶与干燥得到，离子交换柱经由水冲洗去杂质以及氨水洗脱后用硫酸进行再生，流出的硫酸铵溶液一部分直接用于发酵培养基的配液，另一部分则用于离子交换柱的洗脱液，形成闭路循环，降低了废水处理难度，提高了经济效益。该发明以离子交换法作为处理的主要手段，分离纯化困难，在此过程中，离子交换树脂需要使用大量热水洗去杂质，氨水洗脱以及大量酸碱进行再生。
目前为止，L-异亮氨酸的生产过程存在膜及离子交换树脂易受污染、分离纯化困难、酸碱消耗量大等问题，进而影响产品生产过程的稳定性、产品的纯度以及分离纯化效率等。因此，需要寻找一种L-异亮氨酸的生产方法，在解决膜处理及离子交换过程中膜及离子交换树脂易受污染等问题，保证制备出具有高纯度、高产率L-异亮氨酸的同时，避免大量酸碱的消耗及废水的产生，达到稳定、高效以及环保的目的。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种L-异亮氨酸的生产方法，将膜分离法、沉降法与离子交换法相结合，避免了膜处理法及离子交换法中膜及离子交换树脂易受污染的问题，并解决了发酵过程中废液铵氮含量高、反渗透膜处理过程及离子交换过程中使用大量酸碱及废液废弃问题，稳定、高效且环保，得到的L-异亮氨酸具有高纯度及高产率的特点。
为实现上述目的，本发明主要采用以下技术方案：
L-异亮氨酸的生产方法，包括以下步骤：
(1)发酵：
S1：斜面培养：将黄色短杆菌ATCC 14067划线接种于斜面培养基上，得到孢子悬液；
S2：种子培养：将步骤S1得到的孢子悬液接种于种子活化培养基中，得到种子液；
S3：发酵培养：将步骤S2得到的种子液转入发酵培养基中，发酵5-16h补加玉米浆和葡萄糖；发酵15-28h补加氨水溶液；发酵30-48h补加玉米浆；发酵60-72h补加NaOH溶液；
(2)分离提纯：
S4：预处理：将发酵液加热并过滤得到滤液1和沉淀1，调节滤液1的pH后，加入絮凝剂，搅拌、静置并过滤得到滤液2和沉淀2；
S5：微滤：将步骤S4得到的滤液2经过微滤处理，得到微滤透析液和菌体蛋白；
S6：超滤：步骤S5得到的微滤透析液经过超滤处理，得到超滤透析液和超滤浓缩液；
S7：反渗透：步骤S6得到的超滤透析液经过反渗透处理，得到反渗透浓缩液和反渗透废液；
S8：离子交换：将步骤S7得到的反渗透浓缩液经离子交换树脂处理后，再进行浓缩、结晶、干燥后得到L-异亮氨酸。
在一些具体的实施方案中，步骤S1所述的斜面培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖5g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠3g/L和琼脂18g/L；
进一步地，步骤S1所述的斜面培养，培养温度为31℃，培养周期为15h，pH为7。
在一些具体的实施方案中，步骤S2所述的种子活化培养基组分按质量浓度计，包括：玉米浆20mL/L、葡萄糖30g/L、尿素2g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、七水硫酸镁0.5g/L、七水硫酸亚铁0.002g/L、一水硫酸锰0.001g/L、VH2mg/L和VB3mg/L；
进一步地，步骤S2所述的种子培养，培养温度为31℃，转速为250r/min，培养周期为12h，pH为7。
进一步地，步骤S3所述的种子液以体积比为10％的接种量转入发酵培养基中；所述的发酵培养基，发酵温度为30℃，发酵周期为80h，pH为7，转速为200r/min。
进一步地，步骤S3中所述的氨水溶液为质量浓度为70％的氨水溶液，补加时，保持发酵液pH为6-6.5，补加周期为10-20h；所述的NaOH溶液，浓度为0.1-5mol/L，补加时，保持发酵液pH为7-7.5，补加周期为2-5h；所述的发酵5-16h补加玉米浆和葡萄糖，保持发酵液中玉米浆浓度为15-30g/L，葡萄糖浓度为30-40g/L，补加周期为8-12h；所述的发酵30-48h补加玉米浆，保持发酵液中玉米浆浓度为15-30g/L，补加周期为1-2h；
进一步地，步骤S3所述的发酵培养基组分按质量浓度计，包括：玉米浆20-35g/L、葡萄糖70-90g/L、磷酸氢二钾1-2g/L、七水硫酸镁0.5-1.5g/L、七水硫酸亚铁0.01-0.02g/L、一水硫酸锰0.01-0.02g/L、硫酸铵3-8g/L、VB50-120μg/L、VH2-8mg/L和混合有机酸2-10g/L；
优选地，所述的发酵培养基组分按质量浓度计，包括：玉米浆30g/L、葡萄糖80g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、七水硫酸镁1g/L、七水硫酸亚铁0.015g/L、一水硫酸锰0.015g/L、硫酸铵5g/L、VB100μg/L、VH6mg/L和混合有机酸5g/L。
进一步地，所述的混合有机酸为胰高血糖素与有机酸按照质量比1:4的比例混合而成，所述的有机酸为柠檬酸、苹果酸、酒石酸和草酸中的一种或多种；优选地，所述的有机酸为柠檬酸与酒石酸按照质量比1:1的比例混合而成。
进一步地，步骤S4所述的加热，温度为60-80℃，保持10-30min；所述的调节pH，pH调节为2-2.5；所述的搅拌，转速为200r/min，时间为15min，静置2h。
进一步地，步骤S4中所述的絮凝剂为硫酸铝、氯化铝、硫酸铁、氯化铁和壳聚糖中的一种或多种；优选地，所述的絮凝剂为壳聚糖。
进一步地，步骤S5所述的微滤，微滤膜为无机陶瓷膜，截留分子量为10000Da，膜面流速为2.5-4m/s，温度为50℃，可以去除大胶体和大颗粒；步骤S6所述的超滤，超滤膜为聚丙烯腈膜，超滤截留分子量200Da，温度40℃，可去除细菌、大分子有机物、悬浮物和胶体；步骤S7所述的反渗透，反渗透膜为醋酸纤维素膜，温度为40℃，能有效截留所有溶解盐份及分子量大于100的有机物。
优选地，步骤S8所述的离子交换树脂为330型阴离子交换树脂。
进一步地，步骤S8所述的离子交换树脂处理主要包括，反渗透浓缩液经过离子交换树脂脱色、除杂后流出，上柱流速为120mL/h，收集阴离子交换树脂的流出液，采用蒸发浓缩得到L-异亮氨酸浓缩液，然后向L-异亮氨酸浓缩液中加入乙醇进行醇沉育晶，收集晶体，干燥后得到L-异亮氨酸。
进一步地，将步骤S4中的沉淀1、沉淀2与步骤S6中的超滤浓缩液混合后烘干可用以生产饲料蛋白；将步骤S5中所述的菌体蛋白烘干后可以作为优质菌体蛋白使用或销售；步骤S7中的反渗透浓缩液可回用于生产。
本发明所取得的有益效果是：
1.本发明优化了发酵液的补加方式及成分，通过在发酵前期补加玉米浆及葡萄糖，在发酵中期补加玉米浆，补充氮源、碳源的同时，增加了各物质的利用率，此外，在发酵中期补加氨水，在发酵后期补加氢氧化钠溶液，能够增加细胞活性、缩短发酵时间，同时降低发酵废液中铵氮的含量。
2.发酵过程中，混合有机酸的使用有助于抑制丙酮酸激酶的活性，改变碳价物质的代谢流，减少丙酮酸的积累，提高L-异亮氨酸的产率和转化率。
3.将沉降法、离子交换法及膜处理法相互结合并优化，使用加热、絮凝等方式进行预处理，率先去除发酵液中大颗粒杂质，减少了后续膜处理与离子交换法的负担，提高了膜及离子交换树脂的使用寿命，同时，本发明中L-异亮氨酸的纯度和产率都有所增加；此外，反渗透具有较高的机械强度及使用寿命，对盐分具有较好的去除效果，降低了离子交换的处理负担，减少再生频率、延长使用周期，进而减少了大量酸碱的使用，离子交换再生剂的用量可减少90％左右。而阴离子交换树脂的进一步处理，提高了分离纯化过程的稳定性，代替活性炭脱色，简化了工艺，同时流速较高，减少了处理时间，提高了分离纯化效率。
4.本发明中加热及絮凝产生的沉淀与超滤产生的浓缩液混合后烘干可用以生产饲料蛋白；菌体蛋白烘干后可以作为优质菌体蛋白使用或销售；反渗透浓缩液可回用于生产。
5.本发明能够稳定、高效且环保地分离纯化获得L-异亮氨酸，所得的L-异亮氨酸拥有较高的纯度及产率。
具体实施方式
实施例1
L-异亮氨酸的生产方法，包括以下步骤：
(1)发酵：
S1：斜面培养：将黄色短杆菌ATCC 14067划线接种于斜面培养基上，得到孢子悬液；
斜面培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖5g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠3g/L和琼脂18g/L；
斜面培养条件：培养温度为31℃，培养周期为15h，pH为7；
S2：种子培养：将步骤S1得到的孢子悬液接种于种子活化培养基中，得到种子液；
种子活化培养基组分按质量浓度计，包括：玉米浆20mL/L、葡萄糖30g/L、尿素2g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、七水硫酸镁0.5g/L、七水硫酸亚铁0.002g/L、一水硫酸锰0.001g/L、VH2mg/L和VB3mg/L；
种子培养条件：培养温度为31℃，转速为250r/min，培养周期为12h，pH为7；
S3：发酵培养：将步骤S2得到的种子液以体积比为10％的接种量转入发酵培养基中，发酵5h补加玉米浆和葡萄糖，保持发酵液中玉米浆浓度为15g/L，葡萄糖浓度为30g/L，补加周期为8h；发酵15h补加质量浓度为70％的氨水溶液，保持发酵液pH为6，补加周期为10h；发酵30h补加玉米浆，保持发酵液中玉米浆浓度为15g/L，补加周期为1h；发酵60h补加浓度为0.1mol/L的NaOH溶液，保持发酵液pH为7，补加周期为2h；
所述的发酵培养基组分按质量浓度计，包括：玉米浆20g/L、葡萄糖70g/L、磷酸氢二钾1g/L、七水硫酸镁0.5g/L、七水硫酸亚铁0.01g/L、一水硫酸锰0.01g/L、硫酸铵3g/L、VB50μg/L、VH2mg/L和混合有机酸2g/L。
所述的混合有机酸为胰高血糖素与柠檬酸按照质量比1:4的比例混合而成；
发酵培养条件：培养温度为30℃，培养周期为80h，pH为7，转速为200r/min；
(2)分离提纯：
S4：预处理：将发酵液加热至60℃保持10min后过滤得到滤液1和沉淀1，调节滤液1的pH至2后，加入硫酸铝搅拌，转速为200r/min，时间为15min，静置2h后过滤得到滤液2和沉淀2；
S5：微滤：将步骤S4得到的滤液2经过无机陶瓷膜处理，膜面流速为2.5m/s，得到微滤透析液和菌体蛋白；
S6：超滤：步骤S5得到的微滤透析液经过聚丙烯腈膜处理，得到超滤透析液和超滤浓缩液；
S7：反渗透：步骤S6得到的超滤透析液经过醋酸纤维素膜处理，得到反渗透浓缩液和反渗透废液；
S8：离子交换：将步骤S7得到的反渗透浓缩液经330型阴离子交换树脂脱色、除杂后流出，上柱流速为120mL/h，收集阴离子交换树脂的流出液，采用蒸发浓缩得到L-异亮氨酸浓缩液，然后向L-异亮氨酸浓缩液中加入乙醇进行醇沉育晶，收集晶体，干燥后得到L-异亮氨酸。
将步骤S4中的沉淀1、沉淀2与步骤S6中的超滤浓缩液混合后烘干可用以生产饲料蛋白；将步骤S5中所述的菌体蛋白烘干后可以作为优质菌体蛋白使用或销售；步骤S7中的反渗透浓缩液可回用于生产。
实施例2
L-异亮氨酸的生产方法，包括以下步骤：
(1)发酵：
S1：斜面培养：将黄色短杆菌ATCC 14067划线接种于斜面培养基上，得到孢子悬液；
斜面培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖5g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠3g/L和琼脂18g/L；
斜面培养条件：培养温度为31℃，培养周期为15h，pH为7；
S2：种子培养：将步骤S1得到的孢子悬液接种于种子活化培养基中，得到种子液；
种子活化培养基组分按质量浓度计，包括：玉米浆20mL/L、葡萄糖30g/L、尿素2g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、七水硫酸镁0.5g/L、七水硫酸亚铁0.002g/L、一水硫酸锰0.001g/L、VH2mg/L和VB3mg/L；
种子培养条件：培养温度为31℃，转速为250r/min，培养周期为12h，pH为7；
S3：发酵培养：将步骤S2得到的种子液以体积比为10％的接种量转入发酵培养基中，发酵16h补加玉米浆和葡萄糖，保持发酵液中玉米浆浓度为30g/L，葡萄糖浓度为40g/L，补加周期为12h；发酵28h补加质量浓度为70％的氨水溶液，保持发酵液pH为6.5，补加周期为20h；发酵48h补加玉米浆，保持发酵液中玉米浆浓度为30g/L，补加周期为2h；发酵72h补加浓度为5mol/L的NaOH溶液，保持发酵液pH为7.5，补加周期为5h；
所述的发酵培养基组分按质量浓度计，包括：玉米浆35g/L、葡萄糖90g/L、磷酸氢二钾2g/L、七水硫酸镁1.5g/L、七水硫酸亚铁0.02g/L、一水硫酸锰0.02g/L、硫酸铵8g/L、VB120μg/L、VH8mg/L和混合有机酸10g/L。
所述的混合有机酸为胰高血糖素与苹果酸按照质量比1:4的比例混合而成；
发酵培养条件：培养温度为32℃，培养周期为80h，pH为7，转速为200r/min；
(2)分离提纯：
S4：预处理：将发酵液加热至80℃保持30min后过滤得到滤液1和沉淀1，调节滤液1的pH至2.5后，加入氯化铝搅拌，转速为200r/min，时间为15min，静置2h后过滤得到滤液2和沉淀2；
S5：微滤：将步骤S4得到的滤液2经过无机陶瓷膜处理，膜面流速为4m/s，得到微滤透析液和菌体蛋白；
S6：超滤：步骤S5得到的微滤透析液经过聚丙烯腈膜处理，得到超滤透析液和超滤浓缩液；
S7：反渗透：步骤S6得到的超滤透析液经过醋酸纤维素膜处理，得到反渗透浓缩液和反渗透废液；
S8：离子交换：将步骤S7得到的反渗透浓缩液经330型阴离子交换树脂脱色、除杂后流出，上柱流速为120mL/h，收集阴离子交换树脂的流出液，采用蒸发浓缩得到L-异亮氨酸浓缩液，然后向L-异亮氨酸浓缩液中加入乙醇进行醇沉育晶，收集晶体，干燥后得到L-异亮氨酸。
将步骤S4中的沉淀1、沉淀2与步骤S6中的超滤浓缩液混合后烘干可用以生产饲料蛋白；将步骤S5中所述的菌体蛋白烘干后可以作为优质菌体蛋白使用或销售；步骤S7中的反渗透浓缩液可回用于生产。
实施例3
L-异亮氨酸的生产方法，包括以下步骤：
(1)发酵：
S1：斜面培养：将黄色短杆菌ATCC 14067划线接种于斜面培养基上，得到孢子悬液；
斜面培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖5g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠3g/L和琼脂18g/L；
斜面培养条件：培养温度为31℃，培养周期为15h，pH为7；
S2：种子培养：将步骤S1得到的孢子悬液接种于种子活化培养基中，得到种子液；
种子活化培养基组分按质量浓度计，包括：玉米浆20mL/L、葡萄糖30g/L、尿素2g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、七水硫酸镁0.5g/L、七水硫酸亚铁0.002g/L、一水硫酸锰0.001g/L、VH2mg/L和VB3mg/L；
种子培养条件：培养温度为31℃，转速为250r/min，培养周期为12h，pH为7；
S3：发酵培养：将步骤S2得到的种子液以体积比为10％的接种量转入发酵培养基中，发酵10h补加玉米浆和葡萄糖，保持发酵液中玉米浆浓度为20g/L，葡萄糖浓度为35g/L，补加周期为10h；发酵20h补加质量浓度为70％的氨水溶液，保持发酵液pH为6，补加周期为15h；发酵40h补加玉米浆，保持发酵液中玉米浆浓度为20g/L，补加周期为1.5h；发酵68h补加浓度为3mol/L的NaOH溶液，保持发酵液pH为7，补加周期为3.5h；
所述的发酵培养基组分按质量浓度计，包括：玉米浆30g/L、葡萄糖80g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、七水硫酸镁1g/L、七水硫酸亚铁0.015g/L、一水硫酸锰0.015g/L、硫酸铵5g/L、VB100μg/L、VH6mg/L和混合有机酸5g/L；
所述的混合有机酸为胰高血糖素与有机酸按照质量比1:4的比例混合而成，所述的有机酸为柠檬酸与酒石酸按照质量比1:1的比例混合而成；
发酵培养条件：培养温度为30℃，培养周期为80h，pH为7，转速为200r/min；
(2)分离提纯：
S4：预处理：
将发酵液加热至70℃保持20min后过滤得到滤液1和沉淀1，调节滤液1的pH至2后，加入壳聚糖搅拌，转速为200r/min，时间为15min，静置2h后过滤得到滤液2和沉淀2；
S5：微滤：将步骤S4得到的滤液2经过无机陶瓷膜处理，膜面流速为3m/s，得到微滤透析液和菌体蛋白；
S6：超滤：步骤S5得到的微滤透析液经过聚丙烯腈膜处理，得到超滤透析液和超滤浓缩液；
S7：反渗透：步骤S6得到的超滤透析液经过醋酸纤维素膜处理，得到反渗透浓缩液和反渗透废液；
S8：离子交换：将步骤S7得到的反渗透浓缩液经330型阴离子交换树脂脱色、除杂后流出，上柱流速为120mL/h，收集阴离子交换树脂的流出液，采用蒸发浓缩得到L-异亮氨酸浓缩液，然后向L-异亮氨酸浓缩液中加入乙醇进行醇沉育晶，收集晶体，干燥后得到L-异亮氨酸。
将步骤S4中的沉淀1、沉淀2与步骤S6中的超滤浓缩液混合后烘干可用以生产饲料蛋白；将步骤S5中所述的菌体蛋白烘干后可以作为优质菌体蛋白使用或销售；步骤S7中的反渗透浓缩液可回用于生产。
实施例4
L-异亮氨酸的生产方法，包括以下步骤：
(1)发酵：
S1：斜面培养：将黄色短杆菌ATCC 14067划线接种于斜面培养基上，得到孢子悬液；
斜面培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖5g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠3g/L和琼脂18g/L；
斜面培养条件：培养温度为31℃，培养周期为15h，pH为7；
S2：种子培养：将步骤S1得到的孢子悬液接种于种子活化培养基中，得到种子液；
种子活化培养基组分按质量浓度计，包括：玉米浆20mL/L、葡萄糖30g/L、尿素2g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、七水硫酸镁0.5g/L、七水硫酸亚铁0.002g/L、一水硫酸锰0.001g/L、VH2mg/L和VB3mg/L；
种子培养条件：培养温度为31℃，转速为250r/min，培养周期为12h，pH为7；
S3：发酵培养：将步骤S2得到的种子液以体积比为10％的接种量转入发酵培养基中，发酵8h补加玉米浆和葡萄糖，保持发酵液中玉米浆浓度为18g/L，葡萄糖浓度为32g/L，补加周期为9h；发酵18h补加质量浓度为70％的氨水溶液，保持发酵液pH为6，补加周期为12h；发酵35h补加玉米浆，保持发酵液中玉米浆浓度为18g/L，补加周期为1.2h；发酵65h补加浓度为2mol/L的NaOH溶液，保持发酵液pH为7，补加周期为3h；
所述的发酵培养基组分按质量浓度计，包括：玉米浆25g/L、葡萄糖75g/L、磷酸氢二钾1.2g/L、七水硫酸镁0.8g/L、七水硫酸亚铁0.012g/L、一水硫酸锰0.012g/L、硫酸铵4g/L、VB80μg/L、VH5mg/L和混合有机酸3g/L；
所述的混合有机酸为胰高血糖素与酒石酸按照质量比1:4的比例混合而成；
发酵培养条件：培养温度为30℃，培养周期为80h，pH为7，转速为200r/min；
(2)分离提纯：
S4：预处理：将发酵液加热至65℃保持15min后过滤得到滤液1和沉淀1，调节滤液1的pH至2后，加入硫酸铁搅拌，转速为200r/min，时间为15min，静置2h后过滤得到滤液2和沉淀2；
S5：微滤：将步骤S4得到的滤液2经过无机陶瓷膜处理，膜面流速为2.8m/s，得到微滤透析液和菌体蛋白；
S6：超滤：步骤S5得到的微滤透析液经过聚丙烯腈膜处理，得到超滤透析液和超滤浓缩液；
S7：反渗透：步骤S6得到的超滤透析液经过醋酸纤维素膜处理，得到反渗透浓缩液和反渗透废液；
S8：离子交换：将步骤S7得到的反渗透浓缩液经330型阴离子交换树脂脱色、除杂后流出，上柱流速为120mL/h，收集阴离子交换树脂的流出液，采用蒸发浓缩得到L-异亮氨酸浓缩液，然后向L-异亮氨酸浓缩液中加入乙醇进行醇沉育晶，收集晶体，干燥后得到L-异亮氨酸。
将步骤S4中的沉淀1、沉淀2与步骤S6中的超滤浓缩液混合后烘干可用以生产饲料蛋白；将步骤S5中所述的菌体蛋白烘干后可以作为优质菌体蛋白使用或销售；步骤S7中的反渗透浓缩液可回用于生产。
实施例5
L-异亮氨酸的生产方法，包括以下步骤：
(1)发酵：
S1：斜面培养：将黄色短杆菌ATCC 14067划线接种于斜面培养基上，得到孢子悬液；
斜面培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖5g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠3g/L和琼脂18g/L；
斜面培养条件：培养温度为31℃，培养周期为15h，pH为7；
S2：种子培养：将步骤S1得到的孢子悬液接种于种子活化培养基中，得到种子液；
种子活化培养基组分按质量浓度计，包括：玉米浆20mL/L、葡萄糖30g/L、尿素2g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、七水硫酸镁0.5g/L、七水硫酸亚铁0.002g/L、一水硫酸锰0.001g/L、VH2mg/L和VB3mg/L；
种子培养条件：培养温度为31℃，转速为250r/min，培养周期为12h，pH为7；
S3：发酵培养：将步骤S2得到的种子液以体积比为10％的接种量转入发酵培养基中，发酵15h补加玉米浆和葡萄糖，保持发酵液中玉米浆浓度为25g/L，葡萄糖浓度为38g/L，补加周期为11h；发酵25h补加质量浓度为70％的氨水溶液，保持发酵液pH为6.5，补加周期为18h；发酵45h补加玉米浆，保持发酵液中玉米浆浓度为25g/L，补加周期为1.8h；发酵70h补加浓度为4mol/L的NaOH溶液，保持发酵液pH为7.5，补加周期为4h；
所述的发酵培养基组分按质量浓度计，包括：玉米浆32g/L、葡萄糖85g/L、磷酸氢二钾1.8g/L、七水硫酸镁1.2g/L、七水硫酸亚铁0.018g/L、一水硫酸锰0.018g/L、硫酸铵7g/L、VB110μg/L、VH7mg/L和混合有机酸8g/L；
所述的混合有机酸为胰高血糖素与草酸按照质量比1:4的比例混合而成；
发酵培养条件：培养温度为30℃，培养周期为80h，pH为7，转速为200r/min；
(2)分离提纯：
S4：预处理：将发酵液加热至75℃保持25min后过滤得到滤液1和沉淀1，调节滤液1的pH至2.5后，加入氯化铁搅拌，转速为200r/min，时间为15min，静置2h后过滤得到滤液2和沉淀2；
S5：微滤：将步骤S4得到的滤液2经过无机陶瓷膜处理，膜面流速为3.5m/s，得到微滤透析液和菌体蛋白；
S6：超滤：步骤S5得到的微滤透析液经过聚丙烯腈膜处理，得到超滤透析液和超滤浓缩液；
S7：反渗透：步骤S6得到的超滤透析液经过醋酸纤维素膜处理，得到反渗透浓缩液和反渗透废液；
S8：离子交换：将步骤S7得到的反渗透浓缩液经330型阴离子交换树脂脱色、除杂后流出，上柱流速为120mL/h，收集阴离子交换树脂的流出液，采用蒸发浓缩得到L-异亮氨酸浓缩液，然后向L-异亮氨酸浓缩液中加入乙醇进行醇沉育晶，收集晶体，干燥后得到L-异亮氨酸。
将步骤S4中的沉淀1、沉淀2与步骤S6中的超滤浓缩液混合后烘干可用以生产饲料蛋白；将步骤S5中所述的菌体蛋白烘干后可以作为优质菌体蛋白使用或销售；步骤S7中的反渗透浓缩液可回用于生产。
对比例1
与实施例1的区别在于，步骤S3所述的发酵培养基组分按质量浓度计，包括：玉米浆15g/L、葡萄糖60g/L、磷酸氢二钾0.8g/L、七水硫酸镁0.4g/L、七水硫酸亚铁0.005g/L、一水硫酸锰0.005g/L、硫酸铵1g/L、VB40μg/L、VH1mg/L和混合有机酸1g/L。
对比例2
与实施例1的区别在于，步骤S3所述的发酵培养基组分按质量浓度计，包括：玉米浆40g/L、葡萄糖95g/L、磷酸氢二钾3g/L、七水硫酸镁2g/L、七水硫酸亚铁0.05g/L、一水硫酸锰0.05g/L、硫酸铵10g/L、VB150μg/L、VH10mg/L和混合有机酸15g/L。
对比例3
与实施例1的区别在于，发酵3h补加玉米浆和葡萄糖；发酵10h补加质量浓度为70％的氨水溶液；发酵25h补加玉米浆；发酵50h补加浓度为0.1mol/L的NaOH溶液。
对比例4
与实施例1的区别在于，发酵20h加玉米浆和葡萄糖；发酵30h补加质量浓度为70％的氨水溶液；发酵50h补加玉米浆；发酵75h补加浓度为0.1mol/L的NaOH溶液。
对比例5
与实施例1的区别在于，发酵5h不进行玉米浆与葡萄糖的补加。
对比例6
与实施例1的区别在于，发酵30h不进行玉米浆的补加。
对比例7
与实施例1的区别在于，发酵培养基中不加入混合有机酸。
对比例8
与实施例1的区别在于，步骤S3发酵60h不补加浓度为0.1mol/L的NaOH溶液，而补加质量浓度为70％的氨水溶液。
对比例9
与实施例1的区别在于，反渗透处理步骤后不进行离子交换。
实施例1-5及对比例1-9中L-异亮氨酸的产率及纯度如表1所示。
表1 L-异亮氨酸的产率及纯度
实例 产率(％) 纯度(％)
实施例1 87.69 99.10
实施例2 87.56 99.15
实施例3 88.60 99.80
实施例4 87.85 99.27
实施例5 87.80 99.32
对比例1 84.64 99.06
对比例2 80.98 99.01
对比例3 77.15 98.94
对比例4 77.26 98.81
对比例5 71.87 98.56
对比例6 73.56 98.48
对比例7 71.43 98.85
对比例8 87.06 98.52
对比例9 87.55 92.86
由表1可知，实施例1-5的产率及纯度均优于对比例1-9，由实施例1与对比例1-7比较可知，发酵培养基的组分及其质量浓度，补加时间、成分及次数，混合有机酸的加入均影响着L-异亮氨酸的产率，但不影响L-异亮氨酸的纯度；由实施例1与对比例8较可知，补加氨水溶液与补加NaOH对L-异亮氨酸的产率及纯度影响作用效果近似；由实施例1与对比例9可知，离子交换步骤相比于活性炭处理有助于提高L-异亮氨酸的纯度。
实施例1-5及对比例1-9发酵废液中铵氮含量如表2所示。
表2发酵废液中铵氮含量
实例 铵氮含量(mg/L)
实施例1 420
实施例2 425
实施例3 410
实施例4 415
实施例5 420
对比例1 420
对比例2 425
对比例3 620
对比例4 600
对比例5 430
对比例6 420
对比例7 410
对比例8 3000
对比例9 420
由表2可知，实施例1-5、对比例1-2、对比例5-7及对比例9发酵废液中的氨氮含量较低，均在450mg/L以下；由对比例3-4可知，氨氮或NaOH的补加时间同样影响着发酵废液中的铵氮含量；对比例8中铵氮含量较高，即将补加氨水溶液替换为补加NaOH溶液，可以降低发酵废液中的铵氮含量，进而降低废液处理负担。
值得说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (7)

1.一种L-异亮氨酸的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)发酵：
S1：斜面培养：将黄色短杆菌ATCC 14067划线接种于斜面培养基上，得到孢子悬液；
S2：种子培养：将步骤S1得到的孢子悬液接种于种子活化培养基中，得到种子液；
S3：发酵培养：将步骤S2得到的种子液转入发酵培养基中，发酵5-16h补加玉米浆和葡萄糖；发酵15-28h补加氨水溶液；发酵30-48h补加玉米浆；发酵60-72h补加NaOH溶液；所述的发酵培养基组分按质量浓度计，包括：玉米浆20-35g/L、葡萄糖70-90g/L、磷酸氢二钾1-2g/L、七水硫酸镁0.5-1.5g/L、七水硫酸亚铁0.01-0.02g/L、一水硫酸锰0.01-0.02g/L、硫酸铵3-8g/L、VB50-120μg/L、
VH2-8mg/L和混合有机酸2-10g/L；所述的混合有机酸为胰高血糖素与柠檬酸、苹果酸、酒石酸和草酸中的一种或多种按照质量比1:4的比例混合而成；
(2)分离提纯：
S4：预处理：将发酵液加热并过滤得到滤液1和沉淀1，调节滤液1的pH后，加入絮凝剂，搅拌、静置并过滤得到滤液2和沉淀2；
S5：微滤：将步骤S4得到的滤液2经过微滤处理，得到微滤透析液和菌体蛋白；
S6：超滤：步骤S5得到的微滤透析液经过超滤处理，得到超滤透析液和超滤浓缩液；
S7：反渗透：步骤S6得到的超滤透析液经过反渗透处理，得到反渗透浓缩液和反渗透废液；
S8：离子交换：将步骤S7得到的反渗透浓缩液经离子交换树脂处理后，再进行浓缩、结晶、干燥后得到L-异亮氨酸。
2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于：步骤S1所述的斜面培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖5g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠3g/L和琼脂18g/L；培养温度为31℃，培养周期为15h，pH为7；步骤S2所述的种子活化培养基组分按质量浓度计，包括：玉米浆20mL/L、葡萄糖30g/L、尿素2g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、七水硫酸镁0.5g/L、七水硫酸亚铁0.002g/L、一水硫酸锰0.001g/L、VH2mg/L和VB3mg/L；培养温度为31℃，转速为250r/min，培养周期为12h，pH为7。
3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于：所述的发酵培养基组分按质量浓度计，包括：玉米浆30g/L、葡萄糖80g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、七水硫酸镁1g/L、七水硫酸亚铁0.015g/L、一水硫酸锰0.015g/L、硫酸铵5g/L、VB100μg/L、VH6mg/L和混合有机酸5g/L。
4.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于：步骤S3中所述的氨水溶液为质量浓度为70％的氨水溶液，补加时，保持发酵液pH为6-6.5，补加周期为10-20h；所述的NaOH溶液，浓度为0.1-5mol/L，补加时，保持发酵液pH为7-7.5，补加周期为2-5h；所述的发酵5-16h补加玉米浆和葡萄糖，保持发酵液中玉米浆浓度为15-30g/L，葡萄糖浓度为30-40g/L，补加周期为8-12h；所述的发酵30-48h补加玉米浆，保持发酵液中玉米浆浓度为15-30g/L，补加周期为1-2h；发酵温度为30-32℃，溶解氧浓度为40-60％。
5.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于：步骤S4中所述的絮凝剂为硫酸铝、氯化铝、硫酸铁、氯化铁和壳聚糖中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于：步骤S5所述的微滤中使用的微滤膜为无机陶瓷膜；步骤S6所述的超滤中使用的超滤膜为聚丙烯腈膜；步骤S7所述的反渗透中使用的反渗透膜为醋酸纤维素膜。
7.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于：步骤S8所述的离子交换树脂为330型阴离子交换树脂。
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