CN109456976B

CN109456976B - 舞毒蛾JHAMT基因、其编码蛋白及其dsRNA在害虫防治中的应用

Info

Publication number: CN109456976B
Application number: CN201811602633.4A
Authority: CN
Inventors: 问荣荣; 王步勇; 王娟; 孟欣慧
Original assignee: Heze University
Current assignee: Heze University
Priority date: 2018-12-26
Filing date: 2018-12-26
Publication date: 2021-09-28
Anticipated expiration: 2038-12-26
Also published as: CN109456976A

Abstract

舞毒蛾JHAMT基因、其编码蛋白及其dsRNA在害虫防治中的应用，涉及分子生物学领域，尤其涉及舞毒蛾JHAMT基因、其编码蛋白及其应用。本发明是要解决现有舞毒蛾的化学防治存在抗药性和污染环境的问题。舞毒蛾JHAMT基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，其编码区CDS编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。舞毒蛾JHAMT基因dsRNA致使舞毒蛾幼虫3龄蜕皮期延长，同时鲜重增长缓慢，累计死亡率达到80.00％，严重影响了舞毒蛾幼虫的正常生长发育。本发明用于舞毒蛾害虫防治领域。

Description

舞毒蛾JHAMT基因、其编码蛋白及其dsRNA在害虫防治中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及舞毒蛾JHAMT基因、其编码蛋白及其应用。

背景技术

舞毒蛾(Lymantria dispar Linnaeus)是一种重要农林食叶害虫，在我国分布范围广泛、可危害杨、柳、苹果、樟子松、落叶松等500多种植物，大爆发时可造成巨大的经济损失。目前，在舞毒蛾害虫的防治中依旧是化学防治占据着主要的地位，生物防治及物理防治通常只作为辅助防治方法。化学农药的长时间、高频率、使用量不断的增加，导致害虫出现抗药性、再增猖撅，以及农药残留等环境污染问题。化学农药使用后弊端的产生推动了新一代害虫防治研究的展开。分子生物学技术的快速发展，并使其被广泛应用于害虫的生理机制研究及防治，其中RNA干扰技术凭借其高效沉默、特异性强、操作简便、节省时间及实验规模较小等特点成为植物保护者通过沉默功能基因来进行害虫防治的重要手段。

因此，为解决现有舞毒蛾的化学防治存在抗药性和污染环境的问题，采用生物学手段进行病虫害防治的研究至关重要。

发明内容

本发明是要解决现有舞毒蛾的化学防治存在抗药性和污染环境的问题，提供一种舞毒蛾JHAMT基因、其编码蛋白及其dsRNA在害虫防治中的应用。

本发明舞毒蛾JHAMT基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。其编码区CDS的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

本发明舞毒蛾JHAMT基因的编码区CDS编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO：3所示。

本发明舞毒蛾JHAMT基因的dsRNA序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。

本发明以舞毒蛾JHAMT基因片段为模板，并设计特异dsRNA引物对，通过MEGAscript RNAi试剂盒(Ambion)合成JHAMT基因dsRNA。

本发明舞毒蛾JHAMT基因的dsRNA在害虫防治中的应用。

具体方法为：将舞毒蛾JHAMT基因的dsRNA注射入饥饿12h后的舞毒蛾3龄幼虫体内。所述注射剂量为12μg。

本发明的有益效果：

保幼激素在昆虫的幼虫生长、蛹期***、成虫生殖及其它生长和发育过程中发挥非常重要的作用。保幼激素甲基转移酶(JHAMT)是保幼激素合成过程中最重要的调控酶，采用RNA干扰技术，开展JHAMTdsRNA在害虫防治中的应用具有重要意义。

本发明公开了舞毒蛾JHAMT基因全长核酸序列以及应用于合成dsRNA的序列，根据本发明提供的基因全长及用于合成dsRNA的序列能够鲜重抑制JHAMT基因的表达，影响舞毒蛾幼虫的生长发育。

将JHAMT基因dsRNA注射入舞毒蛾3龄幼虫体内后，与对照处理相比，高效沉默了舞毒蛾的靶标基因JHAMT基因，致使舞毒蛾幼虫3龄蜕皮期延长，同时鲜重增长缓慢，累计死亡率达到80.00％，严重影响了舞毒蛾幼虫的正常生长发育。

附图说明

图1为注射dsRNA后舞毒蛾3龄幼虫JHAMT基因表达水平；

图2为注射dsRNA后舞毒蛾3龄幼虫表型；

图3为JHAMT基因沉默对舞毒蛾幼虫鲜重的影响；

图4为JHAMT基因沉默对舞毒蛾幼虫龄期的影响。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式舞毒蛾JHAMT基因的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO：1所示。其编码区CDS的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

具体实施方式二：本实施方式舞毒蛾JHAMT基因的编码区CDS编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。

具体实施方式三：本实施方式舞毒蛾JHAMT基因的dsRNA序列如序列表中SEQ IDNO：4所示。

具体实施方式四：本实施方式舞毒蛾JHAMT基因的dsRNA在害虫防治中的应用。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是：舞毒蛾JHAMT基因的dsRNA用于害虫防治的具体方法为：将舞毒蛾JHAMT基因的dsRNA注射入饥饿12h后的舞毒蛾3龄幼虫体内。其它与具体实施方式四相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式五不同的是：注射剂量为12μg。其它与具体实施方式五相同。

下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：舞毒蛾JHAMT基因全长克隆

按照Invitrogen公司TRIzol RNA动植物组织总RNA提取试剂操作说明进行舞毒蛾幼虫总RNA提取，对所提取的RNA进行DNA消化，紫外分光光度计及电泳检测RNA，选取质量合格的RNA按照TaKaRa公司PrimeScript^TMRT-PCR Kit(型号DRR014A)反转录试剂盒操作步骤进行cDNA第一链的合成。根据舞毒蛾幼虫转录组文库的注释基因JHAMT核酸序列，设计引物(正向引物：5’-TTCAACATGGATAACCCTGAAT-3’；反向引物：5’-TGAGAAAGTGGTGGGTCT-3’)，以cDNA第一链为模板，采用RT-PCR方法，克隆JHAMT序列，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。按照E.Z.N.A.胶回收试剂盒操作方法回收JHAMT基因片段，将回收得到的PCR产物与T-18(pMD18-T质粒连接克隆试剂盒)连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过菌液PCR检测将阳性克隆菌液送于上海生工进行测序，验证舞毒蛾JHAMT基因编码框。

舞毒蛾JHAMT基因核酸序列1426bp，如序列表中SEQ ID NO：1所示。编码区域CDS长为708bp，如序列表中SEQ ID NO：2所示。编码235个氨基酸，如序列表中SEQ ID NO：3所示。编码蛋白质的分子量为27.41429kDa，pI(理论等电点)为5.50，为一酸性蛋白。

实施例2：舞毒蛾JHAMT基因dsRNA合成

根据实施例1中所克隆得到的舞毒蛾JHAMT基因全长，设计合成JHAMT基因dsRNA引物，在每条特异性引物的5′端均加上大小为20bp的T7启动子的序列，正向引物(5’-TAATACGACTCACTATAGGG GTGGAAGGAGACCAAGAATAG-3’)和反向引物(5’-TAATACGACTCACTATAGGG CTCTTCGTGTTCAACTGTAATG-3’)；以cDNA第一链为模板，通过PCR法扩增得到长度为511bp的片段序列，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并采用E.Z.N.A.胶回收试剂盒操作方法回收该511bp的目的片段。以回收的511bp目的片段为模板，通过体外dsRNA合成试剂盒(MEGAscript T7 Kit试剂盒)获得JHAMT基因的dsRNA。紫外分光光度计及2％琼脂糖凝胶电泳检测dsRNA的浓度与质量。-80℃冰箱保存备用。

实施例3：舞毒蛾JHAMT基因沉默效果的检测

将实施例2合成的JHAMT基因的dsRNA(12μg)，微注射入舞毒蛾3龄幼虫，以RNase-free水处理组为对照，分别于12、24、36、48和72h选取活泼的幼虫提取总RNA，经DNase I(Promega)消化DNA，采用PrimeScriptTM RT试剂盒(TaKaRa)合成cDNA第一链，将合成cDNA稀释成100μL，用作实时荧光定量RT-PCR模板，设计荧光定量检测引物qJHAMT(正向引物：5’-GTATGAGAAAGTGGTGGGTCTC-3’；反向引物：5’-AGTTGAACACGAAGAGGTGTATTA-3’)用于检测注射dsRNA后JHAMT基因的表达量。注射dsRNA后舞毒蛾3龄幼虫JHAMT基因的表达水平如图1所示(□表示CK，■表示JHAMT dsRNA)，结果表明：以RNase-free水处理组为对照，注射dsRNA后，JHAMT基因mRNA表达量在12、24、36、48和72h时被显著沉默，显示RNAi干扰效率分别高达86.72％、15.40％、92.79％、72.02％和90.48％，其中在36h JHAMT表达量达到最低，沉默效果最好。

实时荧光定量PCR使用试剂盒SYBR Green Real-time PCR Master mix Plus(Toyobo)。内参基因为Actin、EF1α、TUB，引物序列见表1。实时荧光定量PCR反应体系为：10μL 2×SYBR premix ExTaq酶、正向和反向引物(10μmol/L)各1μL、2μL cDNA模板，加去离子水补足20μL；反应条件为：94℃30s，然后进行44个循环：94℃12s，59℃30s，72℃40s，最后81℃1s读板。每处理重复3次，用2^-△△Ct方法进行基因的表达量分析。

表1 RNAi相关引物序列

实施例4：舞毒蛾JHAMT基因的dsRNA抑制舞毒蛾的生长发育、表型、死亡率、龄期

将实施例2中体外合成的dsRNA(12μg)微量注射入饥饿12h后的舞毒蛾3龄幼虫体内，每组处理30条幼虫，重复3次，以RNase-free水处理过的幼虫为对照，每天更换新鲜叶片，同时记录其对舞毒蛾幼虫的表型、鲜重、死亡率、龄期的影响。

图3为JHAMT基因沉默对舞毒蛾幼虫鲜重的影响(图3中▲表示CK，●表示JHAMTdsRNA处理组)，由图3可知，注射JHAMT基因dsRNA导致舞毒蛾幼虫鲜重初期出现负增长，后期增长缓慢，5d前各处理对幼虫鲜重影响较小，但是在6-9d，JHAMT dsRNA处理组导致幼虫鲜重增长缓慢，与第5d鲜重相比，第9d幼虫鲜重增长量为34.62％；而对照组幼虫鲜重增长较快，与第5d鲜重相比，第9d幼虫鲜重增长了约78.36％，干扰了舞毒蛾幼虫的正常生长发育，注射dsRNA后舞毒蛾3龄幼虫表型见图2，其中左图为对照组，右图为dsRNA处理组。

图4为JHAMT基因沉默对舞毒蛾幼虫龄期的影响，由图4可知，注射JHAMT基因dsRNA导致舞毒蛾3龄幼虫龄期明显延长1.07d，RNase-free水处理过的幼虫龄期为5.81d，而JHAMT dsRNA处理后幼虫龄期为6.88d。这说明JHAMT基因沉默干扰了舞毒蛾幼虫的正常蜕皮发育，该结果JHAMT dsRNA处理后幼虫的鲜重增长缓慢有密切关系，鲜重影响见图3。

由表2可见，经微量注射JHAMTdsRNA处理后，舞毒蛾幼虫出现死亡现象，处理9d后累计死亡率为80.00％，对照组仅为16.67％，差异显著。

表2 JHAMT基因沉默对舞毒蛾幼虫累计死亡率的影响

序列表

<110> 菏泽学院

<120> 舞毒蛾 JHAMT基因、其编码蛋白及其dsRNA在害虫防治中的应用

<160>16

<210> 1

<211> 1426

<212> DNA

<213>舞毒蛾（Lymantria dispar Linnaeus）

<220>

<223>舞毒蛾 JHAMT基因全长

<400> 1

aagccctaga aaaatttgga acagtatatc aaatctttag attaacattg agtactactc 60

gctattaaat tcaaaatagg atattaaaat tagatttttt atttaattta ataaaataaa 120

aattaaataa acaatttgta tatttcaaca tggataaccc tgaattatac catcaatata 180

acaaaatgca gcgaaaacta gccaccgaag ccctagaaaa atttggaaca aaagttacgt 240

ggaaggagac caagaataga atcctagacg tgggttttgg agatggtgct gtcagtacta 300

tcctgaagaa gtatgttcca cgtgatttca cattggtcgg ctgtgattta caggagagta 360

tggtgacctt tgcgaatagt aaataccgtg atgagaaaac atccttcatt gtattggata 420

ttacaggtga tataactgga gatatgaaag agagtttcag ccacatcttc tctttctttg 480

cattgaactg cataagggat caagaaagca catttaaaaa tatttacaat atgctagagc 540

caggtggcga atgctttttg gatattgtag catactctgg gatatacgat gtataccgta 600

gctatttatc taatccgaaa tggagtacct tattatacaa tgtcgaaaaa tacatttctc 660

cttatcatga cgacaaggat ccaaagggca aaattacaaa gatgatgaaa gaaattggat 720

ttgataacat tacagttgaa cacgaagagg tgtattataa ttttgaagat atggaagata 780

tgaaaagtaa gttaaaagca aagctaagtt atttagtaat ctatgattat gttataaagg 840

taaaagcaaa taattgatta aattcggcag tacatgacag aaatccatta ttattttaaa 900

atacaaggat tccttcctgg aaaggagacc caccactttc tcatacttaa ttaatatact 960

gcatactaga atggaatgga aggaatatga gataggacta aattagaata gaggataagg 1020

cctgaaatgt gcattctttt cgtttaaatg aaactgaaaa catttgtttg aatgcggtac 1080

tttcaaataa ctaccatctg gattctaaac gaaatcttgt atcaaatagt ttgtttatat 1140

gaaaatgtta taggttataa aaatatcaga taatctctgt ttataaagaa ataaaaggtt 1200

atcatgatgc tgcaacaagg aagattcgaa gtgtttatat atagcatact agttgttcga 1260

tcagtggact taggttcata ttgacagcgt cggtgaccat cgctggtaca gtcttatgat 1320

atgaattttc agcttttata tccaattcaa ccttattaca agatgtacgc tactcgatgt 1380

tatctttatt ccgcatgctt cttctataac caggtaacga tttagt 1426

<210> 2

<211>708

<212> DNA

<213>舞毒蛾（Lymantria dispar Linnaeus）

<220>

<223>舞毒蛾JHAMT基因CDS序列

<400> 2

atggataacc ctgaattata ccatcaatat aacaaaatgc agcgaaaact agccaccgaa 60

gccctagaaa aatttggaac aaaagttacg tggaaggaga ccaagaatag aatcctagac 120

gtgggttttg gagatggtgc tgtcagtact atcctgaaga agtatgttcc acgtgatttc 180

acattggtcg gctgtgattt acaggagagt atggtgacct ttgcgaatag taaataccgt 240

gatgagaaaa catccttcat tgtattggat attacaggtg atataactgg agatatgaaa 300

gagagtttca gccacatctt ctctttcttt gcattgaact gcataaggga tcaagaaagc 360

acatttaaaa atatttacaa tatgctagag ccaggtggcg aatgcttttt ggatattgta 420

gcatactctg ggatatacga tgtataccgt agctatttat ctaatccgaa atggagtacc 480

ttattataca atgtcgaaaa atacatttct ccttatcatg acgacaagga tccaaagggc 540

aaaattacaa agatgatgaa agaaattgga tttgataaca ttacagttga acacgaagag 600

gtgtattata attttgaaga tatggaagat atgaaaagta agttaaaagc aaagctaagt 660

tatttagtaa tctatgatta tgttataaag gtaaaagcaa ataattga 708

<210> 3

<211> 235

<212> PRT

<213>舞毒蛾（Lymantria dispar Linnaeus）

<220>

<223>JHAMT基因编码蛋白

<400> 3

Met Asp Asn Pro Glu Leu Tyr His Gln Tyr Asn Lys Met Gln Arg

5 10 15

Lys Leu Ala Thr Glu Ala Leu Glu Lys Phe Gly Thr Lys Val Thr

20 25 30

Trp Lys Glu Thr Lys Asn Arg Ile Leu Asp Val Gly Phe Gly Asp

35 40 45

Gly Ala Val Ser Thr Ile Leu Lys Lys Tyr Val Pro Arg Asp Lys

50 55 60

Thr Leu Val Gly Cys Asp Leu Gln Glu Ser Met Val Thr Phe Ala

65 70 75

Asn Ser Lyd Tyr Arg Asp Glu Lys Thr Ser Phe Ile Val Leu Asp

80 85 90

Ile Thr Gly Asp Ile Thr Gly Asp Met Lys Glu Ser Phe Ser His

95 100 105

Ile Phe Ser Phe Phe Ala Leu Asn Cys Ile Arg Asp Gln Glu Ser

110 115 120

Thr Phe Lys Asn Ile Tyr Asn Met Leu Glu Pro Gly Gly Glu Cys

125 130 135

Phe Leu Asp Ile Val Ala Tyr Ser Gly Ile Tyr Asp Val Tyr Arg

140 145 150

Ser Tyr Leu Ser Asn Pro Lys Trp Ser Thr Leu Leu Tyr Asn Val

155 160 165

Glu Lys Tyr Ile Ser Pro Tyr His Asp Asp Lys Asp Pro Lys Gly

170 175 180

Lys Ile Thr Lys Met Met Lys Glu Ile Gly Phe Asp Asn Ile Thr

185 190 195

Val Glu His Glu Glu Val Tyr Tyr Asn Phe Glu Asp Met Glu Asp

200 205 210

Met Lys Ser Lys Leu Lys Ala Lys Leu Ser Tyr Leu Val Ile Tyr

215 220 225

Asp Tyr Val Ile Lys Val Lys Ala Asn Asn

230 235

<210>4

<211> 511

<212> DNA

<213>舞毒蛾（Lymantria dispar Linnaeus）

<220>

<223>舞毒蛾 BURS基因dsRNA序列

<400> 4

gtggaaggag accaagaata gaatcctaga cgtgggtttt ggagatggtg ctgtcagtac 60

tatcctgaag aagtatgttc cacgtgattt cacattggtc ggctgtgatt tacaggagag 120

tatggtgacc tttgcgaata gtaaataccg tgatgagaaa acatccttca ttgtattgga 180

tattacaggt gatataactg gagatatgaa agagagtttc agccacatct tctctttctt 240

tgcattgaac tgcataaggg atcaagaaag cacatttaaa aatatttaca atatgctaga 300

gccaggtggc gaatgctttt tggatattgt agcatactct gggatatacg atgtataccg 360

tagctattta tctaatccga aatggagtac cttattatac aatgtcgaaa aatacatttc 420

tccttatcat gacgacaagg atccaaaggg caaaattaca aagatgatga aagaaattgg 480

atttgataac attacagttg aacacgaaga g 511

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> JHAMT基因克隆正向引物

<400> 5

ttcaacatggataaccctgaat 22

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> JHAMT基因克隆反向引物

<400> 6

tgagaaagtggtgggtct 18

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>JHAMT基因dsRNA正向引物

<400> 7

taatacgactcactataggggtggaaggagaccaagaatag 41

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> JHAMT基因dsRNA反向引物

<400> 8

taatacgactcactatagggctcttcgtgttcaactgtaatg 42

<210>9

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> Actin正向引物

<400>9

atgttagtatgatcgagcgtatcg 24

<210>10

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> Actin反向引物

<400> 10

gcatgatctgaggagcatctt 21

<210>11

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> EF1α正向引物

<400> 11

tttgccttccttgcgctcaaca 22

<210>12

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> EF1α反向引物

<400> 12

tgtaaagcagctgatcgtgggt 22

<210>13

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> TUB正向引物

<400> 13

aatgcaagaaagccttgcgcct 22

<210>14

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> TUB反向引物

<400> 14

atgaaggaggtcgacgagcaaa 22

<210>15

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> qJHAMT正向引物

<400> 15

gtatgagaaagtggtgggtctc 22

<210>16

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> qJHAMT反向引物

<400> 16

agttgaacacgaagaggtgtatta 24

Claims

1.舞毒蛾JHAMT基因，其特征在于该基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，其编码区CDS的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

2.权利要求1所述舞毒蛾JHAMT基因的编码蛋白，其特征在于舞毒蛾JHAMT基因的编码区CDS编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。

3.权利要求1所述舞毒蛾JHAMT基因的dsRNA在害虫防治中的应用，具体为将JHAMT基因dsRNA注射入舞毒蛾3龄幼虫体内后，沉默了舞毒蛾的靶标基因JHAMT基因，致使舞毒蛾幼虫3龄蜕皮期延长，同时鲜重增长缓慢；dsRNA序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于舞毒蛾JHAMT基因的dsRNA用于害虫防治的具体方法为：将舞毒蛾JHAMT基因的dsRNA注射入饥饿12h后的舞毒蛾3龄幼虫体内。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于注射剂量为12μg/条。