CN111944824B - 美国白蛾速激肽受体基因及dsRNA和防治美国白蛾中应用 - Google Patents

美国白蛾速激肽受体基因及dsRNA和防治美国白蛾中应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种美国白蛾速激肽受体基因及dsRNA和防治美国白蛾中应用。所述的速激肽受体基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白质。所述的速激肽受体基因dsRNA，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。所述的美国白蛾速激肽受体基因dsRNA在防治或制备防治美国白蛾产品中的应用。本发明能够降低美国白蛾幼虫取食量，同时幼虫耐饥饿能力显著下降，弱化美国白蛾生命力，最终达到防治的效果。

Description

美国白蛾速激肽受体基因及dsRNA和防治美国白蛾中应用
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种美国白蛾速激肽受体基因(Tachykinin receptor)及dsRNA和防治美国白蛾中应用。
背景技术
美国白蛾Hyphantria cunea(Drury)属鳞翅目(Lepidoptera)灯蛾科(Arctiidae)，原产北美(Morris,1963)。1979年由辽宁省丹东市传入我国，寄主包括49科108属175种植物(杨忠岐和张永安,2007)。因该虫传播速度快，繁殖力强，危害寄主植物多、取食量大，常常暴发成灾，成为世界性检疫害虫。目前，主要采用灭幼脲III号(董蔚,2000)、3.6％烟碱·苦参碱微囊悬浮剂(张华伟等,2013)和杀铃脲(齐鲁芹等,2009)等化学农药进行防治，但长期使用而带来的“3R”问题不容忽视。近年来，利用生物防治的方法来防治美国白蛾备受青睐(赵海燕等,2012；郭君慧等,2003)，如：杨忠岐等(2005)通过天敌昆虫周氏啮小蜂(Chouioia cunea Yang)防治美国白蛾，其寄生率高达92.67％；赵海燕等(2012)采用HcNPV(4.5×106PIBs/mL)防治白蜡树林的2～3龄的美国白蛾幼虫，防效高达90.41％。由于美国白蛾核型多角体病毒HcNPV因其对宿主专一、对天敌昆虫安全而备受关注，但存在杀虫谱窄、杀虫速度慢、作用活性低等弊端。针对这些问题，切需要找到针对该物种的杀虫剂新靶点，然后开发新型昆虫杀虫剂，随着生物技术的迅猛发展，利用RNAi技术控制害虫的危害已成为植物保护工作者研究的重点和热点，且技术已经在农林害虫防治中得到应用。一方面通过基因工程手段将害虫靶标基因dsRNA转入植物体内，当有害生物取食转基因植物时，引发害虫体内发生基因沉默失去功能，降低害虫的取食能力；基于RNAi技术具有对人畜安全，对防治靶标对象专一，对非靶标生物安全、无害虫抗药性等特点，解决了化学农药长期施用导致“3R”这一难题。
神经肽是细胞传递信号的重要分子，参与无脊椎动物生理过程的调节和协调(Broeck,2001；Grimmelikhuijzen and Hauser,2012)。它通过激活其特异性G蛋白偶联受体(GPCR)(Altstein and Nassel,2010)，GPCR把胞外信号传递到胞内，进而对产生细胞功能活性，对昆虫的发育、生长、生殖、代谢以及行为等生理过程其重要的调控作用，因其在各个生命阶段的基本功能，昆虫神经肽的多重功能使得它们成为基于干扰其内源性活性来开发新型昆虫控制剂的主要潜在目标(Altstein,2001)。由于昆虫神经肽家族及受体基因具有这些重要的生理功能，昆虫神经肽是当今昆虫生理学和昆虫神经学研究的热点之一。目前，有关通过抑制昆虫神经肽受体家族基因转录水平来防治重大检疫害虫美国白蛾未见报道。
发明内容
基于以上不足之处，本发明提供一种美国白蛾速激肽受体基因(Tachykininreceptor)及dsRNA和基于该防治美国白蛾中应用，解决了以上现有技术的缺点，能够影响美国白蛾幼虫取食量，同时幼虫耐饥饿能力下降，弱化美国白蛾生命力，最终达到防治的效果。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种美国白蛾速激肽受体，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白质。
本发明的另一目的是：提供一种美国白蛾速激肽受体基因dsRNA，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
本发明的另一目的是：提供一种美国白蛾速激肽受体基因dsRNA在防治或制备防治美国白蛾幼虫产品中的应用。
该应用的特点是，降低美国白蛾幼虫取食量的产品。
该应用的特点是，所述速激肽受体基因dsRNA的注射剂量为2μg。
用于防治美国白蛾幼虫的产品中，其活性成分为如上述的dsRNA。
上述dsRNA在防治美国白蛾中的应用，主要表现为调控美国白蛾应对耐饥饿的能力，显著降低美国白蛾幼虫的取食量，导致幼虫饥饿逆境下存活率显著降低。将该dsRNA微量注射入美国白蛾4龄幼虫体内，结果表明：速激肽受体基因沉默美国白蛾幼虫取食量，与对照组dsRNAEGFP处理组相比，显著降低，饥饿处理下，速激肽受体基因沉默处理组的存活率显著降低。RNAi技术可以高效特异的沉默美国白蛾体内速激肽受体基因的mRNA表达。
本发明的优点及有益效果在于：本发明是国内外首次公开美国白蛾速激肽受体全长核酸序列，将dsRNA注入美国白蛾4龄幼虫体腔内，高效的沉默了舞毒蛾的靶标基因速激肽受体，能够导致美国白蛾幼虫取适量降低，表现为饥饿致使幼虫存活率显著降低，影响美国白蛾幼虫对饥饿逆境的存活，最终达到防治的效果，为此本发明为防治美国白蛾提供了新的有效途径，且速激肽受体基因dsRNA具有广阔的应用前景。实验结果表明：与注射EGFP基因dsRNA对照相比，当美国白蛾幼虫注射速激肽受体基因dsRNA后有较强的沉默效果，致使美国白蛾幼虫取食受到抑制。因此本发明提出可利用速激肽受体的沉默技术来防治重大检疫害虫美国白蛾及具有相似结构域的鳞翅目害虫，为绿色防治林业害虫提供了一个新的思路和技术。
附图说明
图1为美国白蛾速激肽受体基因电泳图；
图2为注射dsRNA美国白蛾4龄幼虫速激肽受体基因表达水平；
图3为注射速激肽受体dsRNA美国白蛾4龄幼虫取食量影响图；
图4为注射速激肽受体dsRNA美国白蛾饥饿存活率图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
实施例1：美国白蛾速激肽受体基因全长克隆
美国白蛾速激肽受体基因核苷酸序列2379bp，开放阅读框1230bp，编码409个氨基酸，分子量大小为47.29kDa，理论等电点PI为9.31。
提取美国白蛾总RNA，使用反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit(TaKaRa)合成cDNA第一条链，再以cDNA第一链为模板，根据美国白蛾幼虫转录组序列在基因编码区序列的两侧设计引物(正向引物：5’-ATGAGGATGCTTGACGACCTGG-3’；反向引物：5’-TCATGCAGAACTCACCAGAGTC-3’)。
反应体系:5×PrimeScript buffer 2μL、PrimeScript RT Enzyme Mix I0.5μL、Oligo d(T)primer(50μM)0.5μL、Random 6mers(100μM)0.5μL、Total RNA 0.5μg RNaseFree ddH2O补足10μL。PCR扩增程序如下：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。将PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，用胶回收试剂盒回收1230bp的条带。将回收得到的条带与pMD18-T载体连接过夜，将连接产物转化DH5α感受态细胞。通过菌液PCR检测的阳性克隆菌液，送至北京华大生物技术有限公司测序以验证读码框。
实施例2：美国白蛾速激肽受体基因dsRNA的合成
根据实施例1中所克隆的美国白蛾速激肽受体基因全长，设计合成速激肽受体基因dsRNA正向引物(5’-GTACAACGTCTGTTTCATGGT-3’)和反向引物(5’-GTGCTGGTACCATTCTTCC-3’)，扩增得到片段长度为492bp的序列，通过体外dsRNA合成试剂盒获得速激肽受体基因的dsRNA。
具体地合成过程是，在每条特异性引物的5′端加有一段20bp左右的T7启动子序列，用EGFP作为对照组。通过PCR法扩增目的条带，反应程序为:94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，35个循环；72℃7min，扩增产物经电泳检测确认后作为模板合成dsRNA(参照MEGAscript RNAi Kit试剂盒说明书)，于紫外分光光度计检测dsRNA浓度，并取0.5μLdsRNA于1％琼脂糖凝胶电泳检测确认，-80℃保存备用。
实施例3：美国白蛾速激肽受体基因沉默效果的检测
将实施例2合成的速激肽受体基因和EGFP基因的dsRNA(2μg)，微注射入美国白蛾4龄幼虫，分别于48和72h选取活泼的4龄幼虫，采用RNeasy Mini动物组织总RNA提取试剂盒(Qiagen)提取总RNA，采用PrimeScriptTM RT试剂盒(TaKaRa)合成cDNA第一条链，以此为模板，运用荧光定量RT-PCR检测注射后速激肽受体基因的表达量。注射dsRNA美国白蛾4龄幼虫速激肽受体基因表达水平如图2所示。结果表明，外源对照基因EGFP的dsRNA注入美国白蛾幼虫体内会影响速激肽受体基因的表达。与对照EGFP基因相比，速激肽受体基因沉默效果高于对照。注射48h，dsRNA速激肽受体处理组较dsRNAEGFP处理组速激肽受体表达量降低了72.53％，随着时间的增加，dsRNA速激肽受体的沉默效果有所下降，处理72h时，沉默效应依然存在，沉默效率为36.38％(P<0.05,内参基因为RPL13和EF1α，引物见表1)。
表1 RNAi干扰中的相关引物
Figure BDA0002646470750000051
克隆以上实施例中所述的美国白蛾速激肽受体的方法是本领域中所常采用的方法。以上实施例中所述的提取美国白蛾幼虫总RNA、合成cDNA第一条链、合成dsRNA、实时荧光定量RT-PCR等方法都是本领域成熟的技术，试剂盒Qiagen、PrimeScriptTM RT、MEGAscript RNAi Kit、SYBR Green Real-time PCR Master Mix(Toyobo)等都可以从生产商家购买。
实施例4：速激肽受体基因的dsRNA沉默对美国白蛾幼虫取食的影响
将实施例2中体外合成的dsRNA微量注射入美国白蛾4龄幼虫体内，同时记录美国白蛾幼虫取食量的影响。更具体的地说，是将2μg的dsRNA速激肽受体、dsRNAEGFP分别注入到上述饥饿处理的美国白蛾4龄第一天幼虫体内，每组处理30头，每十头幼虫为一组称重，每个处理重复3次，每天按时称量饲料鲜重。
由图3可知：经微量注射dsRNA速激肽受体实验组与对照组dsRNAEGFP相比，经过饲喂后，在食物摄入量上两者存在显著差异。其中，微注射速激肽受体基因dsRNA处理组经人工饲料饲喂第1天美国白蛾4龄幼虫表现出取食量显著降低(P<0.05)，较注射EGFP对照组下降了64.54％(P<0.05)；饲喂第2天，dsRNA速激肽受体实验组取食量为0.31g，仅为对照dsRNAEGFP的60.98％(P<0.05)。
实施例5：速激肽受体基因的dsRNA沉默对美国白蛾幼虫耐饥饿能力的影响
将实施例2中体外合成的dsRNA微量注射入美国白蛾4龄幼虫体内，并放在没有任何饲料(采用无菌水棉花球补给水源)，同时记录美国白蛾幼虫死亡情况。
与对照组dsRNAEGFP相比，dsRNA速激肽受体处理组饥饿条件，缩短了中位寿命，存活率显著降低。饥饿处理96h，dsRNA速激肽受体处理组死亡率为46.67％，显著高于对照组dsRNAEGFP(30.00％)，饥饿处理120h，dsRNA速激肽受体处理组死亡率为93.33％，而对照组dsRNAEGFP仅为63.33％(P<0.05,图4)
本实施例利用分子生物学手段干扰美国白蛾潜在的防御基因速激肽受体，不仅降低了昆虫的生存能力，在美国白蛾防治中的应用具有广阔的前景并为其他鳞翅目害虫防治提供了理论依据，而且使美国白蛾速激肽受体有效的沉默，影响美国白蛾幼虫取食，同时降低美国白蛾幼虫在饥饿应激下的存活率，为防治美国白蛾提供了新思路和新材料。
序列表
<110> 东北林业大学
<120> 美国白蛾速激肽受体基因及dsRNA和防治美国白蛾中应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2379
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cttagcgccc acgaacacga gtcgaaccgg gcactggctg aacgctttgt tgtcgtagcg 60
ttacaaaaag ttgaagatag agaaaaaaaa attatctgtg agtaaatttt aagtgatgaa 120
tattaattga taaaatcata acataataag tggacactgt tcttatcaca gactttccat 180
atttcacaaa gttgtagaaa taaaataaaa cttgtaggca tacaattaaa atactatctt 240
aaatattata acattctaca attcatattc ttttaaatta agaatactca tttgtttcat 300
actctttaat ttgaaatata ttcatttgtt tcttaaacaa aagtttgtta aaatgatcag 360
tggttgaaat ttatttgtgt ttgtgctatc ttacgaaatg ttaaagtatt ttctacacaa 420
ttgaataaag tgtctagaca gtcatttatc attctgtatc cttgaatcaa ctaggtgcag 480
agaacaggac ataccgacat agtccgctca catatgagga tgcttgacga cctggtgcca 540
acgacagcgt ccaacaggtc cactgcgccg ggattcgagc acaacttttt cgtaacattc 600
tacgatgaac tcagtaacaa atatgttaac acttcacaaa actacacaga gacgtaccag 660
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gtcgtggcca ccgtgggcaa tcttgtcgtc atatggatag tccttgcaaa caaacgaatg 780
aggagtgtca ccaactactt cttggtgaat ctatcggtgg cagacgcgat ggtatcaaca 840
ttgaacgtga ctttcaattt tacgtacatg ctgaattctg attggccctt tggacacttc 900
tactgcaagt tttgtcagtt cgtagcagta ctcagcatat cggcgtctgt attcactcta 960
ctagccatca gcgtagacag gtatgtggcc atcatgagcc cgctaagacc ccgattgggt 1020
aagcgagcta cacttggcat cacggcagct atctgggtgt ggagttccat tctcagcagt 1080
ccgaacctaa tctactttac tacagataac gacattttac ctgatgggtc aataaggaaa 1140
gtgtgtttct ccgaatggcc tgatggaatg actacaaggt caaaactcga atactggtac 1200
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tccagggttg gcatcgagct gtggggttct caatcgattg gcgaatgcac gcagaggcaa 1320
ctcgataatg tcaagagtaa gcgcagggtg gtaaaaatga tgatagtggt ggtggtaata 1380
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gtggtcaact acgagcacat acaagagata tacttggcta tctactggct ggcaatgagt 1500
aactccatgt acaatcctat catttactgc tggatgaatt ccaagtttag acgaggattt 1560
aagcagttct tctggtgctg tggtgctttt ggtcacggtg gtctggatag gcgtagagga 1620
ttcggcacgg atcgcatcga tcgatcagtc cgttcattgt cacccagccg gaagaatggt 1680
accagcacca tgcgaatttc gatgcatagc acttacaacc agactctggt gagttctgca 1740
tgacagcggc gcgccgcggg agggactgcg gcagggtcgt gcgcgagtga cggcgcttcc 1800
agcgctgccg ttgaacgcac gtggatctga cgtgagcgcg cgccccgaac gcctcccact 1860
ccgcacgacc tatacgccta gccgccacat ggccataaag aaaactgaca actgggtata 1920
tgtattttag tattaaactt ttcttacgtt ataaacgtac atggttttga actgcgaaaa 1980
gtgacatact agtcgtcaag tatttagggg tttaatcatt gtggatgttt tataaactta 2040
tatttatgtt taaaattccg taagaaagta taatgttaat attgtattgg tgtttatact 2100
taacttaatt aatgaattaa ataggcaact tatagttatt tcttccattt atttttaaat 2160
tggctgttgt gtgtataaaa taagtatttc acattcaagt ttcttttttt cttaaatttt 2220
gtataactgt ctgtttgtag aactttttac acttaataaa tgtgtatacc aattttataa 2280
ataaaaaata agttttcgaa taaaatataa gacaagattg taaacataat gtaaatatta 2340
taaattacaa tttaaaatat attgatgtac agatttttt 2379
<210> 2
<211> 409
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Arg Met Leu Asp Asp Leu Val Pro Thr Thr Ala Ser Asn Arg Ser
1 5 10 15
Thr Ala Pro Gly Phe Glu His Asn Phe Phe Val Thr Phe Tyr Asp Glu
20 25 30
Leu Ser Asn Lys Tyr Val Asn Thr Ser Gln Asn Tyr Thr Glu Thr Tyr
35 40 45
Gln Ser Phe Ile Leu Pro Trp Trp Arg Gln Val Leu Trp Thr Val Leu
50 55 60
Phe Ala Gly Met Val Val Val Ala Thr Val Gly Asn Leu Val Val Ile
65 70 75 80
Trp Ile Val Leu Ala Asn Lys Arg Met Arg Ser Val Thr Asn Tyr Phe
85 90 95
Leu Val Asn Leu Ser Val Ala Asp Ala Met Val Ser Thr Leu Asn Val
100 105 110
Thr Phe Asn Phe Thr Tyr Met Leu Asn Ser Asp Trp Pro Phe Gly His
115 120 125
Phe Tyr Cys Lys Phe Cys Gln Phe Val Ala Val Leu Ser Ile Ser Ala
130 135 140
Ser Val Phe Thr Leu Leu Ala Ile Ser Val Asp Arg Tyr Val Ala Ile
145 150 155 160
Met Ser Pro Leu Arg Pro Arg Leu Gly Lys Arg Ala Thr Leu Gly Ile
165 170 175
Thr Ala Ala Ile Trp Val Trp Ser Ser Ile Leu Ser Ser Pro Asn Leu
180 185 190
Ile Tyr Phe Thr Thr Asp Asn Asp Ile Leu Pro Asp Gly Ser Ile Arg
195 200 205
Lys Val Cys Phe Ser Glu Trp Pro Asp Gly Met Thr Thr Arg Ser Lys
210 215 220
Leu Glu Tyr Trp Tyr Asn Val Cys Phe Met Val Leu Thr Tyr Phe Leu
225 230 235 240
Pro Ile Thr Ser Met Thr Tyr Thr Tyr Ser Arg Val Gly Ile Glu Leu
245 250 255
Trp Gly Ser Gln Ser Ile Gly Glu Cys Thr Gln Arg Gln Leu Asp Asn
260 265 270
Val Lys Ser Lys Arg Arg Val Val Lys Met Met Ile Val Val Val Val
275 280 285
Ile Phe Ala Val Cys Trp Leu Pro Phe His Val Tyr Phe Leu Val Thr
290 295 300
Ser Tyr Tyr Pro Asp Val Val Asn Tyr Glu His Ile Gln Glu Ile Tyr
305 310 315 320
Leu Ala Ile Tyr Trp Leu Ala Met Ser Asn Ser Met Tyr Asn Pro Ile
325 330 335
Ile Tyr Cys Trp Met Asn Ser Lys Phe Arg Arg Gly Phe Lys Gln Phe
340 345 350
Phe Trp Cys Cys Gly Ala Phe Gly His Gly Gly Leu Asp Arg Arg Arg
355 360 365
Gly Phe Gly Thr Asp Arg Ile Asp Arg Ser Val Arg Ser Leu Ser Pro
370 375 380
Ser Arg Lys Asn Gly Thr Ser Thr Met Arg Ile Ser Met His Ser Thr
385 390 395 400
Tyr Asn Gln Thr Leu Val Ser Ser Ala
405
<210> 3
<211> 492
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtacaacgtc tgtttcatgg tgctaacgta ctttttgcct atcacgtcga tgacgtacac 60
ttactccagg gttggcatcg agctgtgggg ttctcaatcg attggcgaat gcacgcagag 120
gcaactcgat aatgtcaaga gtaagcgcag ggtggtaaaa atgatgatag tggtggtggt 180
aatatttgcc gtctgttggt tgccattcca cgtgtacttc cttgtcactt cgtactatcc 240
agatgtggtc aactacgagc acatacaaga gatatacttg gctatctact ggctggcaat 300
gagtaactcc atgtacaatc ctatcattta ctgctggatg aattccaagt ttagacgagg 360
atttaagcag ttcttctggt gctgtggtgc ttttggtcac ggtggtctgg ataggcgtag 420
aggattcggc acggatcgca tcgatcgatc agtccgttca ttgtcaccca gccggaagaa 480
tggtaccagc ac 492

Claims (6)

1.一种美国白蛾速激肽受体基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白质。
2.权利要求1所述的一种美国白蛾速激肽受体基因的dsRNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
3.权利要求2所述的一种美国白蛾速激肽受体基因的dsRNA在防治美国白蛾幼虫或制备防治美国白蛾幼虫产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品为降低美国白蛾幼虫取食量的产品。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述速激肽受体基因的dsRNA的注射剂量为2 μg。
6.一种用于防治美国白蛾幼虫的产品，其特征在于：其活性成分为权利要求2所述的dsRNA。
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