CN110923240B - 一种昆虫成虫盘生长因子的功能及其dsRNA的应用 - Google Patents

一种昆虫成虫盘生长因子的功能及其dsRNA的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110923240B
CN110923240B CN201911332131.9A CN201911332131A CN110923240B CN 110923240 B CN110923240 B CN 110923240B CN 201911332131 A CN201911332131 A CN 201911332131A CN 110923240 B CN110923240 B CN 110923240B
Authority
CN
China
Prior art keywords
dsrna
growth factor
insect
disc growth
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911332131.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110923240A (zh
Inventor
李大琪
张建琴
陆俊姣
任美凤
董晋明
李涛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
INSTITUTE OF PLANT PROTECTION SHANXI ACADEMY OF AGRICULTURE SCIENCE
Original Assignee
INSTITUTE OF PLANT PROTECTION SHANXI ACADEMY OF AGRICULTURE SCIENCE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by INSTITUTE OF PLANT PROTECTION SHANXI ACADEMY OF AGRICULTURE SCIENCE filed Critical INSTITUTE OF PLANT PROTECTION SHANXI ACADEMY OF AGRICULTURE SCIENCE
Priority to CN201911332131.9A priority Critical patent/CN110923240B/zh
Publication of CN110923240A publication Critical patent/CN110923240A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110923240B publication Critical patent/CN110923240B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N57/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds
    • A01N57/10—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-oxygen bonds or phosphorus-to-sulfur bonds
    • A01N57/16—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-oxygen bonds or phosphorus-to-sulfur bonds containing heterocyclic radicals

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供一种昆虫成虫盘生长因子(IDGF)的功能及其dsRNA的应用，它可协助昆虫抵御病菌入侵，当其被dsRNA沉默后，昆虫抵抗力下降导致死亡。对小地老虎的成虫盘生长因子基因进行克隆、测序后，得到的序列为SEQ ID NO：1；在此基础上选择序列为SEQ ID NO：2的片段，用于双链RNA(dsRNA)的合成。将该dsRNA注入昆虫的体腔后，昆虫的发育过程中表现抵抗力下降，易感染病菌，出现黑化等现象，死亡率大大上升。本发明为害虫防治提供新的靶标。

Description

一种昆虫成虫盘生长因子的功能及其dsRNA的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种昆虫成虫盘生长因子(IDGF)的功能及其dsRNA的应用。
背景技术
农业害虫是威胁着我国粮食安全生产。目前长期施用化学杀虫剂防治，导致昆虫抗药性出现；间接致使农药用量越来越大，产生了环境污染、威胁人类身体健康等一系列问题。随着我国化肥农药减施等行动的开展，迫切需要新型的害虫防治方法和策略。
RNA干扰（RNAi）应用于害虫防治，近年来成为热门，并正在高速发展。该方法具有专一防治、绿色安全等优势。研究昆虫基因的功能可为基于RNAi害虫防治提供更广阔的舞台。针对昆虫特有功能基因设计害虫防治方案，即安全可靠，又高效除害，同时减少化学农药的施用。
昆虫对外来入侵病菌主要依靠体液免疫，若能发现关键基因在体液免疫的功能，针对其设计防治方法，就可降低免疫力，使得害虫在自然界死亡率上升，从而达到农药减施的目的。昆虫成虫盘生长因子(imaginal disk growth factor ,IDGF)是昆虫特有的类几丁质酶基因，其虽然有几丁质酶的保守结构域，但无几丁质酶固有的作用，其功能有待研究。有研究表明，IDGF可影响赤拟谷盗翅发育。本研究中首次发现IDGF在体液免疫时起到关键作用，利用其重要生物学功能来进行害虫防治，省时省力，安全高效。
发明内容
本发明的目的提供一种昆虫成虫盘生长因子的功能及其dsRNA的应用。
本发明提供的一种昆虫成虫盘生长因子基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO：1。该序列是通过对小地老虎转录组的搜索，得到1条小地老虎成虫盘生长因子基因片段，通过进一步克隆获得全长cDNA序列。该序列长1610bp，包含1302 bp开放阅读框，编码434个氨基酸。其功能为可提高昆虫体液免疫，防止病菌感染。
本发明提供的一种小地老虎成虫盘生长因子基因片段，其核苷酸序列是SEQ IDNO：2 ，是根据SEQ ID NO：1设计上游引物SEQ ID NO：3和下游引物SEQ ID NO：4，通过PCR扩增获得SEQ ID NO：2，其含有T7启动子。进一步利用试剂盒合成dsRNA。
SEQ ID NO：2合成的dsRNA的害虫防治中的应用：注射上述dsRNA到昆虫体腔，结果表明：SEQ ID NO：2合成的dsRNA可以特异性地沉默小地老虎成虫盘生长因子基因AiIDGF的mRNA表达，并导致小地老虎因病菌感染而死亡。
附图说明
图1：6龄小地老虎注射SEQ ID NO：2合成的dsRNA后出现病菌感染而死亡的表型，左侧为注射dsGFP的对照，右侧为注射SEQ ID NO：2合成的dsRNA。
图2：小地老虎注射SEQ ID NO：2合成的dsRNA 24小时后，成虫盘生长因子AiIDGF的mRNA沉默情况，β-actin做为内参基因。**P<0.01。
实施例1
小地老虎成虫盘生长因子基因AiIDGF的序列的获得
（1）小地老虎成虫盘生长因子基因AiIDGF的序列在小地老虎转录组数据库的搜索
基于小地老虎转录组数据库，采用生物信息学方法对小地老虎成虫盘生长因子基因AiIDGF的序列进行搜索，经过序列分析及比对后，共获得1条飞小地老虎成虫盘生长因子基因AiIDGF的序列。
（2）小地老虎成虫盘生长因子基因AiIDGF的序列的验证
基于已获得小地老虎成虫盘生长因子基因AiIDGF的序列，采用primerpremier5.0 软件设计引物验证其全长mRNA序列。所用引物均由上海生工生物有限公司合成。提取小地老虎6龄若虫总RNA，反转录为cDNA模板，用于序列调取。经PCR后，将得到产物纯化，克隆转化到大肠杆菌中，送去测序。结果分析后，验证了小地老虎成虫盘生长因子基因AiIDGF的序列，其序列为SEQ ID NO：1。
实施例2
小地老虎成虫盘生长因子基因dsRNA合成
（1）小地老虎成虫盘生长因子基因dsRNA引物的设计
基于本研究所得到小地老虎成虫盘生长因子基因的序列SEQ ID NO：1 ，采用primer premier5.0 软件设计。设计dsRNA引物，其序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。所用引物均由上海生工生物有限公司合成。
（2）小地老虎成虫盘生长因子基因dsRNA的合成
上述dsRNA引物合成PCR产物，经Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）试剂盒纯化后按照T7 RiboMAX™ Express RNAi System（Promega）试剂盒说明体外转录合成dsRNA。dsRNA浓度采用酶标仪SpectraMax 190测定，并浓缩至终浓度为3μg/μl。
实施例3
小地老虎成虫盘生长因子基因dsRNA在害虫防治的应用
（1）小地老虎成虫盘生长因子基因dsRNA注射
将5μL（15μg）的dsRNA用25μL规格微量注射器注射到6龄小地老虎第2日龄幼虫七、八腹节之间，共注射30只，雌雄各半。注射相同体积浓度的dsGFP至对照组体内。将注射后小地老虎置于27℃恒温生化培养箱中饲养，并于1日后添加土壤基质。
（2）小地老虎成虫盘生长因子基因沉默效率检测
6龄小地老虎dsRNA注射后，选择注射后24h沉默效率检测，整虫虫体作为RNA 提取对象，每组设置3 个生物学重复。提取各样品的总RNA 并反转录成第一链cDNA，Real-timePCR 检测目的基因（AiIDGF）和管家基因（β-actin）的相对表达量，以计算目的基因的沉默效率。由图2可知，24小时小地老虎成虫盘生长因子基因沉默效率可达87.4%。
（3）注入dsRNA后6龄小地老虎表型的观察
6龄小地老虎幼虫经注射dsRNA 1日后，对照组与处理组均发育良好，无显著不适症状。添加土壤基质后，dsGFP对照组幼虫均可于6日前后开始预蛹，并成功化蛹。但dsRNA处理组添加土壤基质后，30头若虫出现病菌感染逐日增多，至6日时，已有17头幼虫出现发育迟缓，体色出现黑化，并逐步死去图（2），最终只有8头幼虫成功化蛹。基因沉默后，幼虫死亡率提升了73.3%。

Claims (3)

1.一种昆虫成虫盘生长因子基因，其特征在于核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
2.一种dsRNA，其特征在于，所述dsRNA是由核苷酸序列是SEQ ID NO：2的昆虫成虫盘生长因子基因片段合成的。
3.如权利要求2所述的dsRNA在防治小地老虎中的应用。
CN201911332131.9A 2019-12-21 2019-12-21 一种昆虫成虫盘生长因子的功能及其dsRNA的应用 Active CN110923240B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911332131.9A CN110923240B (zh) 2019-12-21 2019-12-21 一种昆虫成虫盘生长因子的功能及其dsRNA的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911332131.9A CN110923240B (zh) 2019-12-21 2019-12-21 一种昆虫成虫盘生长因子的功能及其dsRNA的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110923240A CN110923240A (zh) 2020-03-27
CN110923240B true CN110923240B (zh) 2021-07-09

Family

ID=69861718

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911332131.9A Active CN110923240B (zh) 2019-12-21 2019-12-21 一种昆虫成虫盘生长因子的功能及其dsRNA的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110923240B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108085310B (zh) * 2017-12-15 2021-03-30 安徽农业大学 一种小菜蛾识别蛋白PxIDGF制品及其制备方法和应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0973888A1 (en) * 1997-02-06 2000-01-26 Human Genome Sciences, Inc. Dendritic cell-derived growth factor
CN110452908A (zh) * 2011-04-20 2019-11-15 德福根有限公司 在昆虫害虫中下调基因表达
CN104293810B (zh) * 2014-09-01 2018-02-02 太原理工大学 基于基因沉默技术的舞毒蛾几丁质酶基因及dsRNA
CN104212823A (zh) * 2014-09-01 2014-12-17 太原理工大学 基于基因沉默技术舞毒蛾几丁质酶10基因及dsRNA

Also Published As

Publication number Publication date
CN110923240A (zh) 2020-03-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101805746B (zh) 昆虫几丁质酶基因及其dsRNA的应用
CN103937822A (zh) 蝗虫Ⅰ型几丁质酶基因的序列及其dsRNA的应用
CN104673812B (zh) 一种昆虫细胞色素p450基因及其应用
CN112662690B (zh) 飞蝗Rab5基因及其dsRNA在飞蝗防治中的应用
CN103088031A (zh) 一种昆虫翅盘异常发育基因片段及其dsRNA和应用
CN110923240B (zh) 一种昆虫成虫盘生长因子的功能及其dsRNA的应用
CN112662689B (zh) 飞蝗Rab11A基因及其dsRNA在飞蝗防治中的应用
CN101831444B (zh) 昆虫几丁质合成酶1基因片段及其dsRNA和应用
CN104293810B (zh) 基于基因沉默技术的舞毒蛾几丁质酶基因及dsRNA
CN104789571A (zh) Retroactive基因及其dsRNA在害虫防治中的应用
CN101818159B (zh) 一种昆虫几丁质合成酶1基因片段及其dsRNA和应用
CN117230065A (zh) 蚜虫FKBP12基因的dsRNA及其制备方法和应用
CN109456976B (zh) 舞毒蛾JHAMT基因、其编码蛋白及其dsRNA在害虫防治中的应用
CN110172463B (zh) 飞蝗Knickkopf 3-5′基因dsRNA在害虫防治中的应用
CN101831447A (zh) 一种昆虫几丁质合成酶1A基因片段及其dsRNA和应用
CN102876691B (zh) 昆虫β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因及其应用
CN104404042B (zh) 一种东亚飞蝗ATP合酶β亚基基因及其dsRNA在害虫防治中的应用
CN110106177B (zh) 一种飞蝗脂肪酸延伸酶基因LmElo的dsRNA及其制备方法和应用
CN104212823A (zh) 基于基因沉默技术舞毒蛾几丁质酶10基因及dsRNA
CN113621620A (zh) 具有调控小菜蛾免疫功能的基因及其制备方法和应用
CN112695045A (zh) 一种鳞翅目昆虫Hpx12基因及应用
CN115029357B (zh) 昆虫m6A甲基化阅读蛋白elF3-S6基因的dsRNA及其应用
CN117467667A (zh) 调控灰茶尺蠖体色和成虫羽化的ebony基因、dsRNA应用及制备方法
CN105400807B (zh) 基于基因沉默技术的舞毒蛾β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因
CN115011577B (zh) 昆虫m6A甲基化转移酶METTL3基因片段及其dsRNA和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant