CN109456977B

CN109456977B - 舞毒蛾BURS基因、其编码蛋白及其dsRNA在害虫防治中的应用

Info

Publication number: CN109456977B
Application number: CN201811602688.5A
Authority: CN
Inventors: 问荣荣; 王步勇; 周天华; 刘玉梅; 李秀伟
Original assignee: Heze University
Current assignee: Heze University
Priority date: 2018-12-26
Filing date: 2018-12-26
Publication date: 2021-09-28
Anticipated expiration: 2038-12-26
Also published as: CN109456977A

Abstract

舞毒蛾BURS基因、其编码蛋白及其dsRNA在害虫防治中的应用，涉及分子生物学领域，尤其涉及舞毒蛾BURS基因、其编码蛋白及其应用。本发明是要解决现有舞毒蛾的化学防治存在抗药性和污染环境的问题。舞毒蛾BURS基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。其编码区CDS编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。舞毒蛾BURS基因dsRNA能够显著抑制BURS基因的表达，导致舞毒蛾雌性、雄性成虫翅表型均出现不能正常伸展现象，翅发育畸形。本发明用于舞毒蛾害虫防治领域。

Description

舞毒蛾BURS基因、其编码蛋白及其dsRNA在害虫防治中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及舞毒蛾BURS基因、其编码蛋白及其应用。

背景技术

舞毒蛾(Lymantria dispar Linnaeus)是一种的重要农林食叶害虫，具有分布范围较广、取食植物种类多、传播快、繁殖量大及周期性爆发等特点。据国内报道可舞毒蛾可危害约500多种植物，不仅给林业造成巨大的经济损失，而且使其生态效益受损。目前，尽管天敌性微生物、昆虫或是物理方法被应用于舞毒蛾害虫防治中，但是对于这种爆发性害虫防治效果不显著，化学农药凭借其高效、快速灭虫特性使其在舞毒蛾害虫的防治中依旧是占据着主要的防治手段。化学农药的长时间、高频率、使用量不断的增加，导致害虫出现抗药性、再增猖撅，以及农药残留等环境污染问题。化学农药使用后弊端的产生推动了新一代害虫防治研究的展开。分子生物学技术的快速发展，并使其被广泛应用于害虫的生理机制研究及防治，其中RNA干扰技术凭借其高效沉默、特异性强、操作简便、节省时间及实验规模较小，以及能够阻碍昆虫的正常生理机制运行的特点成为植物保护者通过沉默功能基因导致害虫正常发育受阻来达到害虫防治的重要手段。在通过RNAi进行害虫防治研究中，重要靶基因中有效基因片段是其成功的关键。

因此，为解决现有舞毒蛾的化学防治存在抗药性和污染环境的问题，采用生物学手段进行病虫害防治的研究至关重要。

发明内容

本发明是要解决现有舞毒蛾的化学防治存在抗药性和污染环境的问题，提供一种舞毒蛾BURS基因、其编码蛋白及其dsRNA在害虫防治中的应用。

本发明舞毒蛾BURS基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。其编码区CDS的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

本发明舞毒蛾BURS基因的编码区CDS编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO：3所示。

本发明舞毒蛾BURS基因的dsRNA序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。

本发明以舞毒蛾BURS基因片段为模板，并设计特异dsRNA引物对，通过MEGAscriptRNAi试剂盒(Ambion)合成BURS基因dsRNA。

本发明舞毒蛾BURS基因的dsRNA在害虫防治中的应用。

具体方法为：将舞毒蛾BURS基因的dsRNA注射入饥饿12h后的舞毒蛾6龄幼虫体内。所述注射剂量为24μg。

本发明的有益效果：

鞣化激素是由BURS(α亚基)和PBURS(β亚基)构成的异源二聚体，在特定条件下与其受体结合，发挥调节昆虫蜕皮后新表皮的鞣化、翅的伸展和成熟、肌肉收缩、卵子边缘细胞的迁移等功能，主要在胸腹神经节中合成。在某种情况下BURS和PBURS分别具有独立的生物学活性，其同源二聚体的生物学功能未知。

本发明通过RNA干扰技术抑制鞣化激素α亚基BURS基因转录水平，导致舞毒蛾成虫翅的发育畸型来防治农林重要害虫舞毒蛾。

本发明公开了舞毒蛾BURS基因全长核酸序列以及应用于合成dsRNA的序列，根据本发明提供的基因全长及用于合成dsRNA的序列能够显著抑制BURS基因的表达，导致舞毒蛾雌性、雄性成虫翅表型均出现不能正常伸展现象，翅发育畸形间接影响舞毒蛾成虫的飞行能力、交配及产卵量，为舞毒蛾害虫防治提供新方法，且不会存在抗药性和污染环境的问题。

附图说明

图1为注射dsRNA后舞毒蛾6龄幼虫BURS基因表达水平；

图2为RNAi对舞毒蛾雄性成虫翅表型的影响；其中左图为对照雄虫，右图为处理雄虫；

图3为RNAi对舞毒蛾雌性成虫翅表型的影响；其中左图为对照雌虫，右图为处理雌虫；

图4为dsRNA阻碍舞毒蛾雌性成虫翅的发育正面及反面照片；其中左图为对照雌虫，右图为处理雌虫。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式舞毒蛾BURS基因的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO：1所示，其编码区CDS的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

具体实施方式二：本实施方式舞毒蛾BURS基因的编码区CDS编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。

具体实施方式三：本实施方式舞毒蛾BURS基因的dsRNA序列如序列表中SEQ IDNO：4所示。

具体实施方式四：本实施方式舞毒蛾BURS基因的dsRNA在害虫防治中的应用。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是：舞毒蛾BURS基因的dsRNA用于害虫防治的具体方法为：将舞毒蛾BURS基因的dsRNA注射入饥饿12h后的舞毒蛾6龄幼虫体内。其它与具体实施方式四相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式五不同的是：注射剂量为24μg。其它与具体实施方式五相同。

下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：舞毒蛾BURS基因全长克隆

按照Invitrogen公司TRIzol RNA动植物组织总RNA提取试剂操作说明进行舞毒蛾幼虫总RNA提取，对所提取的RNA进行DNA消化，紫外分光光度计及电泳检测RNA，选取质量合格的RNA按照TaKaRa公司PrimeScript^TMRT-PCR Kit(型号DRR014A)反转录试剂盒操作步骤进行cDNA第一链的合成。根据舞毒蛾幼虫转录组文库的注释基因BURS核酸序列，设计引物(正向引物：5’-TCGGAGTAAACAAACATAGCAAAG-3’；反向引物：5’-TAGGGGTCCTTCTTCAGCAT-3’)，以cDNA第一链为模板，采用RT-PCR方法，克隆BURS序列，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。按照E.Z.N.A.胶回收试剂盒操作方法回收BURS基因片段，将回收得到的PCR产物与T-18(pMD18-T质粒连接克隆试剂盒)连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过菌液PCR检测将阳性克隆菌液送于上海生工进行测序，验证舞毒蛾BURS基因编码框。

舞毒蛾BURS基因核酸序列为646bp，如序列表中SEQ ID NO：1所示。编码区域CDS长为480bp，如序列表中SEQ ID NO：2所示。编码159个氨基酸，如序列表中SEQ ID NO：3所示。编码蛋白质的分子量为17.79479kDa，pI(理论等电点)为7.97，为一碱性蛋白。

实施例2：舞毒蛾BURS基因dsRNA合成

根据实施例1中所克隆得到的舞毒蛾BURS基因全长，设计合成BURS基因dsRNA引物，在每条特异性引物的5′端均加上大小为20bp的T7启动子的序列，正向引物(5’-TAATACGACTCACTATAGGGTGTTTCGTTTTGACGACTTTGT-3’)和反向引物(5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGGGGTCCTTCTTCAGCATA-3’)；以cDNA第一链为模板，通过PCR法扩增得到长度为451bp的片段序列，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并采用E.Z.N.A.胶回收试剂盒操作方法回收该451bp的目的片段。以回收的451bp目的片段为模板，通过体外dsRNA合成试剂盒(MEGAscript T7Kit试剂盒)获得BURS基因的dsRNA。紫外分光光度计及2％琼脂糖凝胶电泳检测dsRNA的浓度与质量。-80℃冰箱保存备用。

实施例3：舞毒蛾BURS基因沉默效果的检测

将实施例2合成的BURS基因的dsRNA(24μg)，微注射入舞毒蛾6龄幼虫，以RNase-free水处理组为对照，分别于12、24、36、48和72h选取活泼的幼虫提取总RNA，经DNase I(Promega)消化DNA，采用PrimeScriptTM RT试剂盒(TaKaRa)合成cDNA第一链，将合成cDNA稀释成100μL，用作实时荧光定量RT-PCR模板，设计荧光定量检测引物(正向引物：5’-GTAAGGGCGCAATCAGTGGA-3’；反向引物：5’-CATGTGCGTTCCATTTGCCA-3’)用于检测注射dsRNA后BURS基因的表达量。注射dsRNA后舞毒蛾6龄幼虫BURS基因的表达水平如图1所示(图1中

表示CK，

表示注射dsRNA)，结果表明：以RNase-free水处理组为对照，注射dsRNA后，BURS基因mRNA表达量在12、24、36、48和72h时分别为对照的26.22％、7.18％、10.17％、45.55％和39.65％，被显著沉默，显示RNAi干扰效率高，其中在12h BURS表达量达到最低，沉默效果最好。

实时荧光定量PCR使用试剂盒SYBR Green Real-time PCR Master mix Plus(Toyobo)。内参基因为Actin、EF1α、TUB，引物序列见表1。实时荧光定量PCR反应体系为：10μL2×SYBR premix ExTaq酶、正向和反向引物(10μmol/L)各1μL、2μL cDNA模板，加去离子水补足20μL；反应条件为：94℃30s，然后进行44个循环：94℃12s，59℃30s，72℃40s，最后81℃1s读板。每处理重复3次，用2^-△△Ct方法进行基因的表达量分析。

表1RNAi相关引物序列

实施例4：舞毒蛾BURS基因的dsRNA阻碍舞毒蛾成虫翅的发育

将实施例2中体外合成的dsRNA(24μg)微量注射入饥饿12h后的舞毒蛾6龄幼虫体内，每组处理30条幼虫，重复3次，以RNase-free水处理过的幼虫为对照，每天更换新鲜叶片，同时记录其对舞毒蛾成虫翅表型的影响。图2为RNAi对舞毒蛾雄性成虫翅表型的影响；左图为正常雄蛾，右图为dsRNA注射后的雄蛾。图3为RNAi对舞毒蛾雌性成虫翅表型的影响；左图为正常雌蛾，右图为dsRNA注射后的雌蛾。图4为dsRNA阻碍舞毒蛾雌性成虫翅的发育正面及反面照片，左图为正面，右图为反面。

结果显示：通过微量注射dsRNA使BURS基因表达下调导致舞毒蛾雌雄成虫翅的发育出现畸形，阻碍了成虫的翅的伸展，影响其飞行能力。因此舞毒蛾BURS基因的dsRNA可应用于舞毒蛾害虫防治。

序列表

<110> 菏泽学院

<120> 舞毒蛾 BURS基因、其编码蛋白及其dsRNA在害虫防治中的应用

<160>16

<210> 1

<211> 646

<212> DNA

<213>舞毒蛾（Lymantria dispar Linnaeus）

<220>

<223>舞毒蛾 BURS基因全长

<400> 1

cttcggagta aacaaacata gcaaagttta agttcgcttc tttatactaa gatgtttcgt 60

tttgacgact ttgttatttt aagttttgta tttgcatttg cttgtcatat acatgatagg 120

ccagtaaggg cgcaatcagt ggaagtgccc ttatcaattg gtcaagaatg tcagatgaca 180

cctgttattc atgtcctaaa acatccagga tgtataccta aagctatacc ttcatttgcc 240

tgtatcggaa agtgtaccag ttacgtgcag gtttccggta gtaaaatttg gcaaatggaa 300

cgcacatgta actgttgcca agaatctggt gagcgggaag cttctgttgt actattgtgc 360

cctaaagcta agagcgaaga taagaagtta agaaggatta caaccaaagc tccccttgaa 420

tgtatgtgca gaccatgtgg tagtattgaa gaaagcgcta ttattcctca agaagtagct 480

ggatatgctg aagaaggacc cctatataat catttcagaa aaacattgta aaaaggttat 540

attcaaattt gtcaatgtgt tagtgattat taaattatta tccgatattg aagttattgt 600

agtaccatgt gaatttgata catactaaat aaataccttt gaccaa 646

<210> 2

<211> 480

<212> DNA

<213>舞毒蛾（Lymantria dispar Linnaeus）

<220>

<223>舞毒蛾 BURS基因CDS序列

<400> 2

atgtttcgtt ttgacgactt tgttatttta agttttgtat ttgcatttgc ttgtcatata 60

catgataggc cagtaagggc gcaatcagtg gaagtgccct tatcaattgg tcaagaatgt 120

cagatgacac ctgttattca tgtcctaaaa catccaggat gtatacctaa agctatacct 180

tcatttgcct gtatcggaaa gtgtaccagt tacgtgcagg tttccggtag taaaatttgg 240

caaatggaac gcacatgtaa ctgttgccaa gaatctggtg agcgggaagc ttctgttgta 300

ctattgtgcc ctaaagctaa gagcgaagat aagaagttaa gaaggattac aaccaaagct 360

ccccttgaat gtatgtgcag accatgtggt agtattgaag aaagcgctat tattcctcaa 420

gaagtagctg gatatgctga agaaggaccc ctatataatc atttcagaaa aacattgtaa 480

<210> 3

<211> 159

<212> PRT

<213>舞毒蛾（Lymantria dispar Linnaeus）

<220>

<223>BURS基因编码蛋白

<400> 3

Met Phe Arg Phe Asp Asp Phe Val Ile Leu Ser Phe Val Phe Ala

5 10 15

Phe Ala Cys His Ile His Asp Arg Pro Val Arg Ala Gln Ser Val

20 25 30

Glu Val Pro Leu Ser Ile Gly Gln Glu Cys Gln Met Thr Pro Val

35 40 45

Ile His Val Leu Lys His Pro Gly Cys Ile Pro Lys Ala Ile Pro

50 55 60

Ser Phe Ala Cys Ile Gly Lys Cys Thr Ser Tyr Val Gln Val Ser

65 70 75

Gly Ser Lys Ile Trp Gln Met Glu Arg Thr Cys Asn Cys Cys Gln

80 85 90

Glu Ser Gly Glu Arg Glu Ala Ser Val Val Leu Leu Cys Pro Lys

95 100 105

Ala Lys Ser Glu Asp Lys Lys Leu Arg Arg Ile Thr Thr Lys Ala

110 115 120

Pro Leu Glu Cys Met Cys Arg Pro Cys Gly Ser Ile Glu Glu Ser

125 130 135

Ala Ile Ile Pro Gln Glu Val Ala Gly Tyr Ala Glu Glu Gly Pro

140 145 150

Leu Tyr Asn His Phe Arg Lys Tyr Leu

155 159

<210>4

<211> 451

<212> DNA

<213>舞毒蛾（Lymantria dispar Linnaeus）

<220>

<223>舞毒蛾 BURS基因dsRNA序列

<400> 4

tgtttcgttt tgacgacttt gttattttaa gttttgtatt tgcatttgct tgtcatatac 60

atgataggcc agtaagggcg caatcagtgg aagtgccctt atcaattggt caagaatgtc 120

agatgacacc tgttattcat gtcctaaaac atccaggatg tatacctaaa gctatacctt 180

catttgcctg tatcggaaag tgtaccagtt acgtgcaggt ttccggtagt aaaatttggc 240

aaatggaacg cacatgtaac tgttgccaag aatctggtga gcgggaagct tctgttgtac 300

tattgtgccc taaagctaag agcgaagata agaagttaag aaggattaca accaaagctc 360

cccttgaatg tatgtgcaga ccatgtggta gtattgaaga aagcgctatt attcctcaag 420

aagtagctgg atatgctgaa gaaggacccc t 451

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> BURS基因克隆正向引物

<400> 5

tcggagtaaacaaacatagcaaag 24

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> BURS基因克隆反向引物

<400> 6

taggggtccttcttcagcat 20

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> BURS基因dsRNA正向引物

<400> 7

taatacgactcactatagggtgtttcgttttgacgactttgt 42

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> BURS基因dsRNA反向引物

<400> 8

taatacgactcactatagggaggggtccttcttcagcata 40

<210>9

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> Actin正向引物

<400> 9

atgttagtatgatcgagcgtatcg 24

<210>10

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> Actin反向引物

<400> 10

gcatgatctgaggagcatctt 21

<210>11

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> EF1α正向引物

<400> 11

tttgccttccttgcgctcaaca 22

<210>12

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> EF1α反向引物

<400> 12

tgtaaagcagctgatcgtgggt 22

<210>13

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> TUB正向引物

<400> 13

aatgcaagaaagccttgcgcct 22

<210>14

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> TUB反向引物

<400> 14

atgaaggaggtcgacgagcaaa 22

<210>15

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> q BURS正向引物

<400> 15

gtaagggcgcaatcagtgga 20

<210>16

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> q BURS反向引物

<400> 16

catgtgcgttccatttgcca 20

Claims

1.舞毒蛾 BURS基因，其特征在于该基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，其编码区CDS的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

2.权利要求1所述舞毒蛾 BURS基因的编码蛋白，其特征在于舞毒蛾 BURS基因的编码区CDS编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。

3. 权利要求1所述舞毒蛾 BURS基因在影响舞毒蛾成虫翅膀发育中的应用；所述影响舞毒蛾成虫翅膀发育是指抑制 BURS基因的表达，导致舞毒蛾成虫翅膀发育畸形，不能正常伸展。

4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于抑制 BURS基因的表达的具体方法为：将舞毒蛾 BURS基因的dsRNA注射入饥饿12h后的舞毒蛾6龄幼虫体内；所述舞毒蛾 BURS基因的dsRNA序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于注射剂量为24μg/条。