CN109337883A

CN109337883A - 一种α-1,2-岩藻糖基转移酶及其在奶粉中的应用

Info

Publication number: CN109337883A
Application number: CN201811496691.3A
Authority: CN
Inventors: 赵超; 李姗姗; 王莹; 刘丹; 钟汝婷; 袁思男
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2018-12-07
Filing date: 2018-12-07
Publication date: 2019-02-15

Abstract

本发明提供一种α‑1,2‑岩藻糖基转移酶及其在奶粉中的应用，属于基因工程技术领域。本发明涉及来自嗜热聚球藻Thermosynechococcussp.NK55a的核酸以及氨基酸序列，编码一种α‑1,2‑岩藻糖基转移酶，分离获得的基因构建表达载体pET15b‑Tnfuct，并转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中实现高效表达。利用α‑1,2‑岩藻糖基转移酶生成岩藻糖基化寡糖、糖肽、糖蛋白的方法，在婴幼儿乳粉、食品与医药工业领域具有应用前景。

Description

一种α-1,2-岩藻糖基转移酶及其在奶粉中的应用

技术领域

本发明涉及一种α-1,2-岩藻糖基转移酶及其在奶粉中的应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

母乳是新生儿最好的食物，不但能为新生儿提供最佳的营养，还能为其提供生长发育所需的生物活性物质。这些天然活性物质有利于新生儿肠道内微生物的定殖、免疫***和***的成熟以及认知能力的发展。大量研究发现，人乳寡糖（Human milkoligosaccharides，HMOS）是母乳中重要的活性因子，在婴幼儿的健康成长中发挥着极其重要的作用，可促进婴儿肠道益生菌的增殖，抵抗致病菌和病毒的入侵，以及调节免疫***。以岩藻糖基化寡糖为主的中性寡糖约占90%，其中α-1, 2-岩藻糖基化寡糖约占73%，针对其合成的研究具有巨大的科研价值和商业价值。

寡糖的获取可通过分离纯化和/或体外合成，但因其在生物体内含量甚微，分离纯化较为困难，而化学合成方法操作繁琐，涉及大量复杂的化学反应，且产率低下。因此，酶法合成被广泛关注。在酶法合成中，岩藻糖基转移酶是一类非常重要的糖基转移酶，这些酶具有较高的底物特异性和立体选择性，不需要对底物进行化学保护或去保护，其作用是将糖基供体GDP-Fucose上的岩藻糖转移到Gal上形成α-1,2连接，或者转移到GlcNAc上形成α-1,3，α-1,4，或α-1,6连接。α-1,2-岩藻糖基转移酶属于糖基转移酶家族11，负责将岩藻糖转移到受体上，形成一个α-1,2-键，这些酶往往表现出广泛的受体特异性，这为其在寡糖的合成中提供了巨大优势。

目前只有来源于嗜热蓝绿藻（Thermosynechococcus elongatus）、幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）和大肠杆菌（Escherichia coli）等的α-1,2-岩藻糖基转移酶基因能在细菌中活性表达，因此发现高效稳定且有特异性的新型α-1,2-岩藻糖基转移酶具有重要的现实意义。本发明利用PCR技术从嗜热聚球藻Thermosynechococcussp. NK55a基因组DNA中获得α-1,2-岩藻糖基转移酶基因，并连接到pET15载体中，转化到大肠杆菌BL21(DE3)表达***，对该新型基因进行高效表达，为岩藻糖基化寡糖的大量合成奠定基础。本发明还提供了岩藻糖基化寡糖的配方奶粉，其组分为α-1,2-岩藻糖基化寡糖、脱盐乳清粉、乳糖、植物油、浓缩乳清蛋白粉、低聚半乳糖、低聚果糖、膳食纤维、矿物质预混料、花生四烯酸、二十二碳六烯酸、维生素预混料、酪蛋白磷酸肽、乳铁蛋白、L-酪氨酸、L-抗坏血酸钠、核苷酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸、牛磺酸。

发明内容

本发明目的在于提供一种α-1,2-岩藻糖基转移酶及其在奶粉中的应用，能够高效合成岩藻糖基化系列寡糖，以达到制备接近母乳的人乳寡糖婴幼儿配方奶粉的目的。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种α-1,2-岩藻糖基转移酶，所述的糖基转移酶氨基酸如SEQ ID NO.2所示。

编码所述α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因，核苷酸如SEQ ID NO.1所示。

所述基因的制备方法，设计基因扩增引物，上游引物为：GTATACTAGTAGCAAGCA，下游引物为：GGATCCTTACAGCACGGTCCAACC；然后以嗜热聚球藻Thermosynechococcussp.NK55a（NCBI: NC_023033.1）基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应进行基因扩增，获得α-1,2-岩藻糖基转移酶基因序列。

一种重组表达载体，包含所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶基因的核苷酸序列。

一种基因工程菌，由所述的重组表达载体转化至宿主细胞中获得。

所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶的制备方法，包括以下步骤：将所述基因工程菌接种至培养基中培养，在异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的诱导下表达α-1,2-岩藻糖基转移酶，并采用咪唑梯度洗脱的方法纯化所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶。

所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶在制备α-1,2-岩藻糖基化寡糖中的应用，制备方法如下：利用所述的基因工程菌进行诱导表达，提供GDP-岩藻糖供体底物以及包括单糖或寡糖的受体底物，通过生物酶法合成体系催化岩藻糖残基从所述供体底物转移到所述受体底物，由此获得α-1, 2-岩藻糖基化寡糖，所述寡糖包含以下各项的一种或多种：Lacto-N-tetraose、Lacto-N-neotetraose、Galβ1,3GalNAcαProN₃、Galβ1,3GalNAcβProN₃、Galβ1,3GlcNAcαProN₃、Galβ1,3GlcNAcβProN₃、乳糖、乳果糖、D-半乳糖、β-苄基乳糖，以及Galβ1,3-为起始的寡糖。

所述GDP-岩藻糖通过在宿主细胞中同时表达的酶或通过宿主细胞的代谢而提供。

利用所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶制备α-1,2-岩藻糖基化寡糖在婴幼儿奶粉中的应用。

所述婴幼儿奶粉，由以下重量百分比的物料组成：α-1,2-岩藻糖基化寡糖0.01-5%、脱脂乳粉10-30%、脱盐乳清粉20-45%、乳糖15-30%、植物油10-30%、浓缩乳清蛋白粉2-10%、低聚半乳糖1-5%、低聚果糖1-5%、膳食纤维0.1-6%、矿物质预混料0.8-1.5%、花生四烯酸0.3-1.8%、二十二碳六烯酸0.2-1.0%、维生素预混料0.1-0.3%、酪蛋白磷酸肽0.10-0.22%、乳铁蛋白0.02-0.1%、L-酪氨酸0.02-0.09%、L-抗坏血酸钠0.03-0.12%、核苷酸0.018-0.05%、L-色氨酸0.01-0.05%、L-蛋氨酸0.01-0.05%、牛磺酸0.01-0.04%，以上原料之和为百分之百。

本发明的优点在于：

1、本发明提供了一种生物酶法制备新型α-1,2-岩藻糖基转移酶的方法，所制备的酶活性高，产率高，该法较现有技术更高效，大幅度降低成本，还可达到规模化生产的需求。

2、本发明提供的婴幼儿配方奶粉添加了由α-1,2-岩藻糖基转移酶制备的寡糖，与现有婴幼儿奶粉相比，更接近母乳，具有调节肠道菌群、抗病毒感染、增强免疫力、减少炎症以及促进婴儿大脑发育的作用，有巨大的商业价值。

附图说明

图1 重组质粒pET15b-TnFucT物理图谱。

图2 重组质粒pET15b-TnFucT双酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图，泳道从左至右依次是：pET15b-TnFuct、DNA marker。

图3 咪唑梯度洗脱岩藻糖基转移酶SDS-PAGE分析，泳道从左至右依次是Maeker、0%Elute Buffer洗脱状况、8%Elute Buffer洗脱状况、10%Elute Buffer洗脱状况、20%Elute Buffer洗脱状况。

图4 以Galβ1,3GlcNAcβProN₃为受体底物时反应活性分析。

具体实施方式

实施例 1

(1)根据NCBI数据库提供的嗜热聚球藻Thermosynechococcus sp.NK55a（NCBI: NC_023033.1）基因组DNA 为模板，设计引物GATCCATATGTTCCAGCCGCTGCTGGAT和AAGGGATCCTTACTTCTTAACCAGT，引物委托上海生工生物工程公司合成。以目的基因为模板，利用聚合酶链式反应进行基因扩增，反应体系为：5×rTaq PCR Buffer10μL；dNTP(2.5mmol/L)4 μL；上游引物(20mmol/L)1 μL；下游引物(20mmol/L)1 μL；rTaq 酶(2.5U/μL)0.25 μL；DNA模板1μL；补足去离子水至50μL。PCR扩增条件为：94℃预变性4min，94℃变性45s ，58℃退火30s ，72℃延伸90s，共30个循环，再72℃延伸10min，4℃保温。得到大小为891 bp的目的基因片段(图2)。

将目的基因与质粒pET15b（购于上海生工）均用两种限制性内切酶（NdeI和BamHI）酶切。酶切体系为：目的基因与质粒pET15b各0.1 μL，NdeI和BamHI酶各0.5 μL；酶切缓冲液（R buffer）2 μL，另加去离子水补足至20 μL，在37℃下进行酶切（约2 h）。产物进行琼脂糖凝胶电泳，再用凝胶回收试剂盒回收凝胶上的目的条带。将酶切过的目的基因与载体用DNA连接酶连接，反应于金属浴中进行，反应时间不少于7 h，获得pET15b-Tnfuct (图1)。

(2)用上述将验证正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，按如下步骤进行：取大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，冰浴30min融化，吸取50 μL感受态细胞与2μL100ng/ml的 pET15b-Tnfuct质粒混合，42℃热击90s，立即冰浴2min，加入500 mL新鲜LB培养基，37℃、100rpm条件下复苏培养45min，之后取80μL菌液涂布于含有氨苄青霉素(100ug/ml)的LB平板，37℃恒温培养箱培养16h后挑取单菌落，PCR鉴定重组子，证明重组表达载体构建成功。

(3)挑取上述平板上的阳性转化子，转接到种子培养基中，置于37℃、200 rpm/min摇床上振荡培养17h，得种子液；再以1%(v/v)的接种量将种子液接种到发酵培养基中，于37℃振荡培养，经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖(IPTG)苷诱导，IPTG终浓度0.2mmol/L，于18℃诱导22h，转速150 rpm。诱导时刻为发酵液OD600为0.7。所述种子培养基和发酵培养基为LB培养基。

(4)诱导表达后，将发酵液于4000r/min、4℃离心1h收集菌体。将菌体用10mMpH7.0 Trsi-HC1缓冲液重悬后，以plus on 2s / off 3s的频率下超声6min中以破碎菌体；将破碎后液体于10000r/min、4℃离心30h去除细胞碎片后收集上清液，利用Ni柱亲和层析法纯化得到可溶性岩藻糖基转移酶，咪唑洗脱浓度为200 mM。SDS-PAGE分析目的蛋白表达情况，基因工程菌经诱导后有明显的特异表达条带，条带分子量与预期大小分子量34.4 kD基本一致（图3）。获得的目的蛋白即为α-1,2-岩藻糖基转移酶TnFucT，其氨基酸氨基酸如SEQ ID NO.2所示，编码所述α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因，核苷酸如SEQ ID NO.1所示。

(5)纯化后的α-1,2-岩藻糖基转移酶TnFucT，以GDP-岩藻糖为供体，岩藻糖基转移酶活性中以Galβ1,3GlcNAcβProN3为受体时反应活性最高，产率高达97-100%。高分辨质谱对产物进行分析，在M/Z：635.2 (M-H)+有离子峰，反应合成α-1,2-岩藻糖基化寡糖Fucα-1,2Galβ1-3GlcNAcαProN3（图4）。

实施例2 在奶粉中的应用

一种人乳寡糖婴幼儿配方奶粉，其配方包括以下原料组分：α-1,2-岩藻糖基化寡糖0.01-5%，脱脂乳粉10-30%、脱盐乳清粉20-45%、乳糖15-30%、植物油10-30%、浓缩乳清蛋白粉2-10%、低聚半乳糖1-5%、低聚果糖1-5%、膳食纤维0.1-6%、矿物质预混料0.8-1.5%、花生四烯酸0.3-1.8%、二十二碳六烯酸0.2-1.0%、维生素预混料0.1-0.3%、酪蛋白磷酸肽0.10-0.22%、乳铁蛋白0.02-0.1%、L-酪氨酸0.02-0.09%、L-抗坏血酸钠0.03-0.12%、核苷酸0.018-0.05%、L-色氨酸0.01-0.05%、L-蛋氨酸0.01-0.05%、牛磺酸0.01-0.04%，以上原料之和为百分之百。其制备过程具体包括以下步骤：

（1）配料：将按预定比例称取的α-1,2-岩藻糖基化寡糖、脱脂奶粉、脱盐乳清粉、乳糖、水解乳清蛋白、浓缩乳清蛋白粉、低聚半乳糖、低聚果糖、矿物质预混料、水解酪蛋白、水溶性维生素预混料、牛磺酸，加入所称物料总量3倍的45℃水中，混合均匀后打入暂存罐Ⅰ；将按预定比例称取的植物油和脂溶性维生素预混料混匀后打入暂存罐Ⅱ；

（2）均质：将暂存罐Ⅰ和暂存罐Ⅱ的物料混合，在高压均质机内均质，均质压力为20-22Mpa；

（3）杀菌：均质后的物料进行预杀菌，杀菌温度85℃，杀菌时间16s。

（4）浓缩：将物料送入蒸发室进行杀菌浓缩，杀菌温度90℃，杀菌时间24s，第一效蒸发温度70℃，第二效蒸发温度50℃，蒸发压力-0.09Mpa，杀菌压力0.03Mpa；出料浓度19.0°Bé；

（5）喷雾干燥：在压力16MPa，进风温度170℃，排风温度为85℃条件下进行喷雾干燥；

（6）流化床干燥冷却：进行流化床干燥及冷却，控制物料中含水量为3.0wt%，冷却至降温，得基料粉；

（7）混料：按预定比例称取花生四烯酸、二十二碳六烯酸、酪蛋白磷酸肽、乳铁蛋白、L-酪氨酸、L-抗坏血酸钠、核苷酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸进行预混后，加入至基料粉中搅拌混匀，即得人乳寡糖婴幼儿配方奶粉；

（8）包装：采用真空充氮包装。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种α-1,2-岩藻糖基转移酶及其在奶粉中的应用

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 882

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgatcatcg tgcggttgta cggcggcctt ggcaatcaga tgttccaata cgcagcgggg 60

ttggcgctat cccttcggca tgccgtgccg ctgcgctttg atctcgattg gttcgatggt 120

gtgcgtttgc accagggcct ggaattgcac cgggtattcg acctcgacct gccacgggcg 180

gccccttcgg agatgcggca ggtgcttgga agtttttccc atccgctcgt gcggcgcttg 240

ctcgttcgca gacgtctgcg ctggctgctg ccgcaaggct atgccctgga gccgcatttt 300

cactattggc ctgggtttga ggcgctgggt ccgaaggcgt atctcgacgg ctactggcag 360

tctgaacggt acttttcgga atatcaggac gccgtgcgcg cagcctttcg ttttgcgcag 420

cctttggacg agaggaaccg gcagatcgtc gaggagatgg cggcatgcga aagcgtctcc 480

ctgcacgtga ggaggggaga cttcgtccag gatccggtcg ttcgccgtgt gcatggcgtg 540

gatttatcgg cctattaccc gcgcgccgtc gcactactga tggagcgcat gcgcgaaccc 600

cgcttttatg tcttttccga cgaccccgat tgggtgcgcg ccaatttgaa gctccctgcg 660

cctatgatcg tgatcgacca caaccgtggt gaacacagct tccgcgacat gcagctcatg 720

agcgcctgtc gtcaccatat cctggccaac agcagcttca gttggtgggg cgcgtggctg 780

aattcgcagc cgcacaagct cgtgatcgcg ccgaagcgtt ggttcaacgt cgatgacttc 840

gacacgcgtg atctgtattg ctcggggtgg actgtgctgt ga 882

<210> 2

<211> 293

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ile Ile Val Arg Leu Tyr Gly Gly Leu Gly Asn Gln Met Phe Gln

1 5 10 15

Tyr Ala Ala Gly Leu Ala Leu Ser Leu Arg His Ala Val Pro Leu Arg

20 25 30

Phe Asp Leu Asp Trp Phe Asp Gly Val Arg Leu His Gln Gly Leu Glu

35 40 45

Leu His Arg Val Phe Asp Leu Asp Leu Pro Arg Ala Ala Pro Ser Glu

50 55 60

Met Arg Gln Val Leu Gly Ser Phe Ser His Pro Leu Val Arg Arg Leu

65 70 75 80

Leu Val Arg Arg Arg Leu Arg Trp Leu Leu Pro Gln Gly Tyr Ala Leu

85 90 95

Glu Pro His Phe His Tyr Trp Pro Gly Phe Glu Ala Leu Gly Pro Lys

100 105 110

Ala Tyr Leu Asp Gly Tyr Trp Gln Ser Glu Arg Tyr Phe Ser Glu Tyr

115 120 125

Gln Asp Ala Val Arg Ala Ala Phe Arg Phe Ala Gln Pro Leu Asp Glu

130 135 140

Arg Asn Arg Gln Ile Val Glu Glu Met Ala Ala Cys Glu Ser Val Ser

145 150 155 160

Leu His Val Arg Arg Gly Asp Phe Val Gln Asp Pro Val Val Arg Arg

165 170 175

Val His Gly Val Asp Leu Ser Ala Tyr Tyr Pro Arg Ala Val Ala Leu

180 185 190

Leu Met Glu Arg Met Arg Glu Pro Arg Phe Tyr Val Phe Ser Asp Asp

195 200 205

Pro Asp Trp Val Arg Ala Asn Leu Lys Leu Pro Ala Pro Met Ile Val

210 215 220

Ile Asp His Asn Arg Gly Glu His Ser Phe Arg Asp Met Gln Leu Met

225 230 235 240

Ser Ala Cys Arg His His Ile Leu Ala Asn Ser Ser Phe Ser Trp Trp

245 250 255

Gly Ala Trp Leu Asn Ser Gln Pro His Lys Leu Val Ile Ala Pro Lys

260 265 270

Arg Trp Phe Asn Val Asp Asp Phe Asp Thr Arg Asp Leu Tyr Cys Ser

275 280 285

Gly Trp Thr Val Leu

290

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gatccatatg ttccagccgc tgctggat 28

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aagggatcct tacttcttaa ccagt 25

Claims

1.一种α-1,2-岩藻糖基转移酶，其特征在于，所述的糖基转移酶氨基酸如SEQ ID NO.2所示。

2. 一种编码权利要求1所述α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸如SEQ ID NO.1所示。

3.一种如权利要求2所述基因的制备方法，其特征在于，设计基因扩增引物，上游引物为：GTATACTAGTAGCAAGCA，下游引物为：GGATCCTTACAGCACGGTCCAACC；然后以嗜热聚球藻Thermosynechococcus sp. NK55a基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应进行基因扩增，获得α-1,2-岩藻糖基转移酶基因序列。

4.一种重组表达载体，其特征在于，所述载体包含权利要求2所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶基因的核苷酸序列。

5.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌由权利要求4所述的重组表达载体转化至宿主细胞中获得。

6.一种如权利要求1所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求5所述基因工程菌接种至培养基中培养，在异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的诱导下表达α-1,2-岩藻糖基转移酶，并采用咪唑梯度洗脱的方法纯化所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶。

7. 如权利要求1所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶在制备α-1,2-岩藻糖基化寡糖中的应用，其特征在于：制备方法如下：利用权利要求5所述的基因工程菌进行诱导表达，提供GDP-岩藻糖供体底物以及包括单糖或寡糖的受体底物，通过生物酶法合成体系催化岩藻糖残基从所述供体底物转移到所述受体底物，由此获得α-1, 2-岩藻糖基化寡糖，所述寡糖包含以下各项的一种或多种：Lacto-N-tetraose、Lacto-N-neotetraose、Galβ1,3GalNAcαProN₃、Galβ1,3GalNAcβProN₃、Galβ1,3GlcNAcαProN₃、Galβ1,3GlcNAcβProN₃、乳糖、乳果糖、D-半乳糖、β-苄基乳糖，以及Galβ1,3-为起始的寡糖。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述GDP-岩藻糖通过在宿主细胞中同时表达的酶或通过宿主细胞的代谢而提供。

9.利用权利要求1所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶制备α-1,2-岩藻糖基化寡糖在婴幼儿奶粉中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述婴幼儿奶粉，由以下重量百分比的物料组成：α-1,2-岩藻糖基化寡糖0.01-5%、脱脂乳粉10-30%、脱盐乳清粉20-45%、乳糖15-30%、植物油10-30%、浓缩乳清蛋白粉2-10%、低聚半乳糖1-5%、低聚果糖1-5%、膳食纤维0.1-6%、矿物质预混料0.8-1.5%、花生四烯酸0.3-1.8%、二十二碳六烯酸0.2-1.0%、维生素预混料0.1-0.3%、酪蛋白磷酸肽0.10-0.22%、乳铁蛋白0.02-0.1%、L-酪氨酸0.02-0.09%、L-抗坏血酸钠0.03-0.12%、核苷酸0.018-0.05%、L-色氨酸0.01-0.05%、L-蛋氨酸0.01-0.05%、牛磺酸0.01-0.04%，以上原料之和为百分之百。