CN102115718B - 一种表达β-半乳糖苷酶的重组菌株及其构建方法和应用 - Google Patents
一种表达β-半乳糖苷酶的重组菌株及其构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种表达β-半乳糖苷酶的重组菌株及其构建方法和应用。克隆得到Thermus thermophilus HB27半乳糖苷酶基因bgal，并将其***到真核表达载体pPIC9K上，转化毕赤酵母菌株GS 115内，可得到β-半乳糖苷酶表达量达到14000U/ml。β-半乳糖苷酶基因bgal表达的分子量为58Dk，最适温度为70℃，其最适温度下很稳定。在pH6.5时该乳糖酶水解活力最高，而且稳定性较好。高效表达的β-半乳糖苷酶可直接用于乳制品的巴氏消毒法，可以做到灭菌的同时降解乳糖，避免了灭菌后添加酶所造成的二次污染。在60度，30分钟，HB27半乳糖苷酶可以降解牛奶90％的乳糖。
Description
技术领域
本发明涉及一种表达β-半乳糖苷酶的重组菌株及其构建方法和应用，属于生物技术领域。
背景技术
β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)学名为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(以下简称半乳糖苷酶)，常用名为乳糖酶，该酶能将乳糖水解成为半乳糖与葡萄糖。
半乳糖苷酶最早用于乳制品产业，由于牛奶在西方人的饮食结构中占有很大比重，所以国外对半乳糖苷酶的研究较早，许多研究工作主要集中在低乳糖奶加工和乳糖不耐症(Lactose Intolerance)的诊断治疗上。乳糖是哺乳动物乳汁中特有的糖类，哺乳动物乳汁中乳糖含量因种类而异，人乳中乳糖含量为6.7％.，牛乳中乳糖平均含量为4.5-5％。尽管牛乳及其乳制品具有“近乎完美的食物”的美誉，但在我国，乳制品的发展仍处于初级阶段，其中乳糖不耐症是限制其发展的主要原因之一。由于乳糖需经过由小肠粘膜上皮细胞分泌的半乳糖苷酶水解成半乳糖和葡萄糖后才能被人体吸收利用，所以乳糖不耐症的病因主要是由于小肠粘膜上半乳糖苷酶活力较低所致。牛乳中乳糖得不到水解，小肠内乳糖浓度提高，使渗透压增高，从而导致进入肠腔内的水分含量提高，其产生的症状是腹部压力增高、气胀、腹痛和腹泻。绝大多数哺乳动物出生之后小肠粘膜乳糖酶活性较高，可以消化吸收来自母乳或其他乳制品的乳糖，断乳之后，乳糖酶活性随年龄增长逐渐下降，到成人之后半乳糖苷酶活性仅为正常婴儿水平的5-10％，并逐渐发展成为乳糖不耐症。据统计乳糖不耐症影响着全世界约70％的人(尤其是亚洲和非洲人)对乳的摄入。
生产低乳糖奶，是目前克服乳糖不耐症的最好方法。经典方法是将新鲜牛乳经巴氏灭菌后，冷却至40-45℃，加入半乳糖苷酶并保温，使乳糖水解。研究发现当乳糖水解率为70-80％时，既能解决乳糖不耐症问题，又能生产出风味良好的产品。低乳糖奶的生产国外早已商业化，国内则刚起步。低乳糖奶的生产方式有多种，上述只是其中多生产方法中的一种。从理论上讲，低乳糖奶生产方法有物理去除法、化学酸水解法、酶水解法和基因工程技术方法。其中酶水解法由于反应条件温和，产物简单，不破坏牛乳中其他营养成分，生成的副反应产物较少，而且口感较好，得到了广泛的推广。迄今为止，酶水解法是生产低乳糖牛乳最安全、实用、有效的方法。酶水解法生产低乳糖奶的过程中，酶的添加有2种方式。一种是将原料乳经过巴氏杀菌后冷却至半乳糖苷酶作用的最佳温度，添加酶并在此温度下保温一段时间，使其达到所要求的乳糖水解度，然后将产品进行灭菌，进行无菌灌装。这种方法操作简单，产品不容易受到污染，但灭菌处理时发生的美拉德反应(食物中的还原糖与胺类物质在高温下产生黑褐色物质的一种反应)容易引起产品的褐变，从而影响产品的感官质量，而且耗时较长。另一种方法是将原料乳灭菌、冷却后，在产品灌装前按一定比例将半乳糖苷酶加入到产品中，在贮存过程中，半乳糖苷酶将牛乳中的乳糖分解为葡萄糖和半乳糖。这种方法所需设备投资低，产品的色泽变化不大，但是添加酶时，灭菌后的牛乳容易受到微生物的污染，而且酶的作用时间较难控制，酶反应后可能需要额外的杀菌步骤，例如UHT或UV等。
Thermus thermophilus HB27是一种研究十分广泛的嗜热菌种，其中的基因资源十分丰富。由于它的生存环境温度高，营养贫乏，造成其代谢途径中的酶系的性质及其特殊。目前为止，已经有许多来自Thermus thermophilus HB27的基因被克隆并在不同的表达***中表达出来，包括许多糖苷水解酶，例如淀粉酶和葡萄糖苷酶等。这些酶的耐热性都很高，最适温度在60-95度之间。目前还没有任何来自Thermus thermophilus HB27的β-半乳糖苷酶基因被克隆并表达的报道，且此酶的蛋白质序列与其它物种差异较大，即使是与同一亚种的Thermus thermophilus A4菌种的同源性也不大于30％。利用Thermusthermophilus HB27的β-半乳糖苷酶的耐高温的性质，可以建立适用于乳制品巴氏消毒法工艺。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种表达β-半乳糖苷酶的重组菌株，该菌株所表达的耐高温β-半乳糖苷酶适用于乳制品巴氏消毒法。
本发明还要解决的技术问题是提供上述重组菌株的构建方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述重组菌株在生产耐高温β-半乳糖苷酶中的应用。
一种表达β-半乳糖苷酶的重组菌株，该菌株为基因组DNA上整合了来源于嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)HB27的β-半乳糖苷酶基因bgal的毕赤酵母。
上述表达β-半乳糖苷酶的重组菌株的构建方法，将来自嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)HB27的β-半乳糖苷酶基因bgal克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中，利用SacI限制性内切酶线性化载体后，将其转化至毕赤酵母中，利用G418抗生素进行多拷贝转化子筛选得到。
上述表达β-半乳糖苷酶的重组菌株高效表达β-半乳糖苷酶的方法，其特征在于以甲醇为诱导剂诱导培养重组菌株产酶。以3L发酵液培养菌体生长35h，OD600达到450后，以流加形式加入甲醇，加入总量为1.0～1.5L，诱导时间为40～48小时。
上述表达β-半乳糖苷酶的重组菌株在发酵生产β-半乳糖苷酶中的应用。本发明的重组菌株所产的β-半乳糖苷酶水解乳糖的条件为：最适pH为6.5，在pH5.3和7.6处该β-半乳糖苷酶达到最大酶活的一半，该pH范围符合大部分食品的酸碱范围；最适温度为70℃，当温度继续增高时，酶蛋白的变性作用使酶活剧烈下降。无论是否外加半胱氨酸，该酶的最适温度都没有明显变化。
本发明所用的毕赤酵母是一种高效的真核表达***，用它来高效表达半乳糖苷酶有着多方面的优势：(1)毕赤酵母曾作为单细胞蛋白广泛应用，本身就具有很好的安全性，并且，酵母培养基中不含有毒物质和致热源。(2)毕赤酵母具有高效的蛋白分泌***。我们采用酵母的a因子信号肤序列将表达的半乳糖苷酶直接分泌到培养基中，这样将大大简化酶的纯化工艺，降低酶的生产成本。(3)它的高细胞密度、低成本发酵方法已经被普遍采用，发酵培养基中所使用的碳源、氮源、盐、微量元素等都为普通工业原料，便宜易得。利用毕赤酵母作为半乳糖苷酶表达的生物反应器为工业化大规模、低成本发酵生产半乳糖苷酶奠定了基础。(4)表达的外源蛋白在总的分泌蛋白中含量高。本发明中的半乳糖苷酶基因bgal在酵母中分泌表达，杂蛋白很少。这样就简化了目的蛋白的分离纯化工艺，降低了成本。
有益效果：本发明构建的重组菌株所产的β-半乳糖苷酶具有较高的热稳定性，借助固定化的嗜热的β-半乳糖苷酶，可以做到灭菌的同时降解乳糖，避免了灭菌后添加酶所造成的二次污染，不需要额外的杀菌步骤，并且不容易发生美拉德反应引起产品的褐变。这样做可以改善产品外观，降低生产成本。
附图说明
图1重组质粒pPIC9K-bgal构建示意图。
图2β-半乳糖苷酶表达过程中菌体生长及溶氧。
图3β-半乳糖苷酶最适pH的测定。
图4β-半乳糖苷酶最适温度的测定。
图5β-半乳糖苷酶的热稳定性。
图6乳糖标准品HPLC检测图谱。
图7市售牛奶中乳糖降解曲线，即乳糖剩余量和反应时间的关系。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
bgal基因的克隆：PCR反应采用Biometra公司PCR仪。DNA酶切、连接、转化和细菌感受态制备等基本基因操作技术参照有关公司提供的操作手册进行。采用上海华舜生物工程有限公司的试剂盒，提取T.thermophilus HB27基因组DNA。以其为模板，引物为G-sense和G-anti，进行PCR扩增。PCR在50μL体系中进行，反应条件为：94℃变性5min，按如下参数循环34次：94℃变性1min，55℃退火50s，72℃延伸1.5min。最后72℃延伸10min。PCR反应产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳分析结果。PCR大量扩增目的基因后，凝胶电泳分离纯化PCR产物，从凝胶中回收目的基因后，将目的基因连接到T-vector上。在确认的阳性重组子中挑选两个送上海博亚公司测序。将测序结果和所报道的序列用ClustalW软件进行序列比对分析。
菌种与载体：嗜热栖热菌Thermus thermophilus HB27，购自中国微生物工业菌种保藏中心。bgal基因克隆载体pMD18-T Vector(以下简称T-Vector)，购自Takara公司。毕赤酵母表达载体pPIC9K，购自Invitrogen公司；毕赤酵母表达菌株GSl15，购自Invitrogen公司；
培养基的配制：
10x YNB(134g/L的无氨基酸酵母氮源)：134gYNB固体溶于1L去离子水，过滤灭菌，4℃保存；
500x B溶液(0.2g/L生物素)：生物素20mg溶于100mL去离子水，过滤灭菌，4℃保存；
10x D溶液(200g/L葡萄糖)：200g D-葡萄糖溶于1000mL水，过滤灭菌，4℃保存；
10x GY(100g/L的甘油)：100mL甘油溶于900mL水，过滤灭菌，4℃保存；
100x AA(含0.5g/L每种氨基酸)：称取L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸各500g溶于100mL水，过滤灭菌，4℃保存；
1mol/L的磷酸缓冲液印(pH6.0)：将132mL1mol/L的磷酸氢二钾和868ml 1mol/L的磷酸二氢钾混合，然后用磷酸和氢氧化钾溶液调pH至6.0，过滤灭菌，常温保存；
1mol/L的山梨醇溶液：将182.1g的D-山梨醇溶于1L的水中，过滤灭菌，4℃保存；
YPD培养基：10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖；
MM固体培养基：13.4g/LYNB，0.0004g/L生物素，2％葡萄糖，1.5％琼脂，0.005％谷氨酸，0.005％甲硫氨酸，0.005％赖氨酸，0.005％亮氨酸，0.005％异亮氨酸，2％琼脂粉，所有氨基酸均为L型；
MD固体培养基：13.4g/L YNB，0.0004g/L生物素，2％葡萄糖，1.5％琼脂，0.5～4mg/L的G418硫酸盐(依照筛选过程采用不同的浓度)；
发酵培养基：26.7mL/L 85％H3PO4，0.93g/L CaSO4·2H2O，18.2g/LK2SO4，14.9g/LMgSO4·7H2O，4.13g/L KOH，40g/L甘油，酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，用25％的氨水调pH值到5.0。
PTM1营养盐：CuSO4·5H2O 6g/L，NaI 0.09g/L，MnCl2·4H2O 3g/L，H3BO30.02g/L，Na2MoO4·2H2O 0.2g/L，CoCl20.5g/L，ZnCl242.2g/L，FeSO4·H2O 65g/L，biotin 0.2g/L，H2SO45.0mL/L。(1L发酵培养基中加入4.35mLPTM1营养盐)
流加液：25％氨水：500mL，维持发酵pH在5.0。50％甘油：500mL甘油加去离子水至1L，灭菌后加营养盐12mL。100％甲醇：1L甲醇，加12mL营养盐。
引物：根据bgal基因序列信息，用Prime premier软件设计PCR扩增引物。
上游引物(9K-sense，EcoRI)为：5’-cggaattcatgcggctggaccccaaccacc-3’；
下游引物(9K-anti，NotI)为：5’-gccaccttgcggccgcctactccgcgagaa-3’。
所有引物均由上海申能***公司合成。
毕赤酵母重组表达质粒的构建：用9K-sense和9K-anti引物对重组质粒T-bgal进行PCR扩增，PCR在50μL体系中进行，反应条件为：94℃变性5min，按如下参数循环34次：94℃变性1min，55℃退火50s，72℃延伸1.5min。最后72℃延伸10min。回收约1.8kb的片段(bgal基因)，以EcoRI、NotI双酶切毕赤酵母表达载体pPIC9K并回收。16℃连接，CaCl2法转化大肠杆菌DH5α，涂于LB(Amp+)平板，挑取单菌落培养并提取质粒，双酶切鉴定筛选毕赤酵母重组表达质粒，命名为pPIC9K-bgal。表达载体的构建过程详见图1。
毕赤酵母感受态细胞的制备：挑取毕赤酵母受体菌GS115(His-，Mut+)的单菌落接种于10mLYPD液体培养基中，30℃摇床培养过夜，再以1％(v/v)的接种量转接于100mLYPD培养基中，30℃培养至OD600＝1.3-1.5。4℃5000rpm离心5min，弃去上清，用100mL冰预冷的无菌水将菌体重悬，再次4℃5000m离心10min，弃去上清，用50mL冰预冷的无菌水将菌体重悬，4℃5000rpm离心10mln，再用20mL 1mol/L山梨醇洗涤1次，溶于20mL 1mol/L冰预冷的山梨醇中，以备转化。
毕赤酵母的电击转化：用SacI内切酶单酶切重组表达质粒pPIC9K-bgal，使质粒线性化。细胞中单位点多基因***确实可自发形成，虽然比例低，占所有HIS+转化子的1-10％，但却是可测的。多拷贝***事件的发生是因为基因可在AOX1、aox1::AGR4位点或his4位点进行***。结果在GS115中产生Mut+表型，在KM71中产生Muts表型。取80μL感受态细胞与线性化质粒(1～5μg)混合后转移到事先用冰浴预冷的0.2cm的电击杯中，电击转化酵母感受态细胞.(2.5KV，5ms)，立即向电击杯中加入1mL冰冷的1mol/L的山梨醇溶液，混匀后，以每块平板200μL菌液涂布到MM固体平板上，28℃培养直到长出转化子。将MM平板上生长的His+转化菌落按先后顺序分别点种于酵母选择培养基MD平板的相应位置。
毕赤酵母高效表达子的筛选和表达：挑取在MM平板上生长良好的转化子编号后分别接种于含有不同浓度G418硫酸盐的MD固体平板中(浓度为0.5mg/L，1.0mg/L，1.5mg/L，2.0mg/L，2.5mg/L，3.0mg/L，3.5mg/L)，于28℃保温箱培养24～72h(不同G418浓度的平板生长时间不同)，分别挑取不同浓度G418平板中的单菌落，进行下一步的诱导表达。为检测表达条件是否有效，以导入空白pPIC9K质粒的GS115转化子作为分泌表达的空白对照。
挑取单克隆接种于种子培养基YPD中，摇瓶培养24h后，转接于5L的发酵罐中，搅拌转速1000rpm，通气量4VVM，在罐中培养到23.5小时DO％上升至80％，开始流加甘油，在培养至35h时，OD600达到450，开始流加甲醇，通过提高溶氧和添加有机氮源的策略，重组毕赤酵母GS115在5L的NBS发酵罐中，OD600达到700，发酵液中酶活性可达到14000U/L。
实施例2：
粗酶液的制备：取诱导表达后的菌液于8000rpm，4℃离心10min，弃上清。沉淀用磷酸缓冲(100mM，pH 6.0)洗涤两次，洗涤后的沉淀重悬于裂解缓冲液(100mM的磷酸缓冲液1.0mM PMSF)中，置冰浴中超声破碎。以10mm探头，于冰上200w超声破碎，超声时间3s，间隔5s，总共超声8min。经超声处理后的菌液于12000rpm，4℃离心15min。取上清液即为粗酶液。
表达产物分析：用浓缩胶质量分数为5％，分离胶质量分数为10％的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳考察蛋白的表达情况。
半乳糖苷酶酶活测定方法：称取280mg邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)，先溶于1mL甲醇中，再用100mM pH6.0的磷酸缓冲液定容至100mL，配成20mM的ONPG母液。通过分别加入不同量的ONPG母液和100mM pH6.0的磷酸缓冲液来得到不同浓度的ONPG水溶液。测量酶活前，ONPG溶液会在相应的温度下水浴一段时间，以保证温度的准确性。测量时加入待测粗酶液，使总体积为200μl，保温一段时间，然后测定其在420nm的光吸收值，体系通过加入1800μl 100mM稀硫酸中止反应。1单位酶活(U)定义为每分钟水解1nmONPG。
结果该β-半乳糖苷酶水解邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)的最适pH为6.5。这个结果与一些来自其它酵母和细菌的半乳糖苷酶类似，大部分来自酵母和细菌的B-半乳糖苷酶的最适pH都在6.5至7.5之间。在pH5.3和7.6处该β-半乳糖苷酶达到最大酶活的一半，该pH范围符合大部分食品的酸碱范围，这说明该酶有用于水解牛奶或甜炼乳中乳糖的潜力。来自T.thermophilus的β-半乳糖苷酶的最适温度为70℃，在其最适温度下很稳定。
实施例3：牛奶中乳糖降解实验。
市售牛奶，经高效液相色谱检测，乳糖含量为42g/L。采用Ultimate 3000色谱***，示差折光检测器(RID)，示差温度35度，色谱柱为汉邦NH2柱，流动相为80％乙腈，流速1ml/min，检测时间30min，出峰时间18min。
乳糖标准曲线测定：
市售的乳糖，用容量瓶配成0g/L-50g/L浓度的乳糖溶液，用上述高效液相检测示差值。所得标准曲线，y＝0.609x+0.0452，R2＝0.9991。图6为乳糖标准品HPLC检测图谱。
市售牛奶中乳糖降解实验
将牛***浴加热至60℃，加入乳糖酶(即实施例1和实施例2中得到的粗酶液)，其单位活力达30000U/L，每5分钟取样，液相色谱测定乳糖的含量。30分钟后，牛奶中乳糖降解达85％以上。图7是乳糖降解曲线，即乳糖剩余量和反应时间的关系。
Claims (1)
1.利用表达β-半乳糖苷酶的重组菌株高效表达β-半乳糖苷酶的方法，其特征在于以甲醇为诱导剂诱导培养重组菌株产酶，每3L发酵液培养菌体生长35h，OD600达到450后，以流加形式加入甲醇，加入总量为1.0～1.5L的甲醇，诱导时间为40～48h；
其中，所述的表达β-半乳糖苷酶的重组菌株，为基因组DNA上整合了来源于嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)HB27的β-半乳糖苷酶基因bgal的毕赤酵母。
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Citations (2)
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| CN1258452A (zh) * | 1998-12-25 | 2000-07-05 | 浙江医科大学 | 用固相化嗜热菌乳糖酶生产低乳糖牛奶的方法 |
| CN1446909A (zh) * | 2002-03-27 | 2003-10-08 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种重组毕赤酵母乳糖酶及其应用 |
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2010
- 2010-12-16 CN CN2010105914345A patent/CN102115718B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Also Published As
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