CN106434591A - 一种岩藻糖基转移酶及其应用 - Google Patents

一种岩藻糖基转移酶及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种岩藻糖基转移酶及其应用，属于基因工程技术领域。本发明涉及来自螺杆菌Helicobacter acinonychis的核酸以及氨基酸序列，编码/代表一种岩藻糖基转移酶HaFucT，分离获得的HaFucT构建表达载体pET15b‑hafuct，并转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中实现高效表达。本发明还提供了利用岩藻糖基转移酶生成岩藻糖基化寡糖，在食品与医药工业领域具有应用前景。

Description

一种岩藻糖基转移酶及其应用
技术领域
本发明涉及一种岩藻糖基转移酶及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
人乳寡糖（Human milk oligosaccharides）在人乳中排在乳糖、脂类之后的第三大物质，初乳中寡糖含量达20-27 g/L，具有明显的抗感染和重要的非特异性免疫学功能，促进婴儿消化道中益生菌如双歧杆菌的增殖，并减少梭状芽孢杆菌和肠球菌的数量。此外，人乳寡糖糖及其类似物安全有效，不产生抗药性，以其为原料制备抗黏附药物成为当前药物研发的又一大热点。人乳寡糖以岩藻糖基化寡糖为主，其中α-1,2-岩藻糖在被检人乳中占总寡糖的比例平均为73%。高效稳定的新型岩藻糖基化转移酶作用合成岩藻糖基化寡糖，在最大程度上减少了寡糖制备的生产成本，达到规模制备的目的。
岩藻糖基转移酶（Fucosyltransferase）属于糖基转移酶的酶家族中的一类己糖基转移酶，催化从核苷二磷酸岩藻糖将岩藻糖基转移至受体分子，通常是二磷酸鸟苷岩藻糖（GDP-岩藻糖）转移到包括寡糖、糖蛋白、以及糖脂的受体。基于岩藻糖的添加部位的不同，岩藻糖基转移酶被分类为：α-1,2-岩藻糖基转移酶、α-1,3/4-岩藻糖基转移酶、α-1,6-岩藻糖基转移酶、以及O-岩藻糖基转移酶。α-1,2-岩藻糖基转移酶广泛地存在于脊椎动物、无脊椎动物、植物、以及细菌中，但这些酶的大多不能在细菌***中以活性形式表达，极大限制了寡糖的大规模合成制备。
目前只有来源于大肠杆菌（Escherichia coli）、嗜热蓝绿藻（Thermosynechococc us elongatus）和幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）等的α-1,2-岩藻糖基转移酶基因能在细菌中得以活性表达，新型α-1,2-岩藻糖基转移酶的获得具有重要现实意义。利用基因工程的方法，以岩藻糖为原料生产人乳岩藻糖基化寡糖，在最大程度上减少了人乳寡糖制备的生产成本，达到规模制备的目的，为人乳寡糖及其类似物的制备提供了新策略。本发明通过分子生物学手段对螺杆菌Helicobacter acinonychis中α-1,2-岩藻糖基转移酶的酶基因进行了克隆。
发明内容
本发明目的在于提供一种岩藻糖基转移酶及其应用，以达到能够高效合成岩藻糖基化寡糖的目的。
为了实现上述目的，本发明的提供一种岩藻糖基转移酶，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。本发明糖基转移酶来源于已公开的螺杆菌Helicobacter acinonychis菌株，保藏于美国典型培养物保藏中心，保藏编号为ATCC51101。
一种编码所述岩藻糖基转移酶的基因所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或编码氨基酸序列SEQ ID NO.2中所示蛋白质的核苷酸序列。
所述的基因的制备方法，设计引物，上游引物为：GATCCATATGTTCCAGCCGCTGCTGGAT，下游引物为：AAGGGATCCTTACTTCTTAACCAGT；然后以螺杆菌Helicobacter acinonychis基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应进行基因扩增，获得岩藻糖基转移酶基因序列。
一种重组表达载体，所述载体包含所述的岩藻糖基转移酶基因的核苷酸序列。
一种基因工程菌，所述基因工程菌由所述的重组表达载体转化至宿主微生物中获得。
所述的岩藻糖基转移酶的制备方法，将所述基因工程菌接种至LB培养基中培养，在异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的诱导下，表达获得岩藻糖基转移酶。
所述的岩藻糖基转移酶在岩藻糖基化寡糖制备中的应用。
所述的基因工程菌在岩藻糖基化寡糖制备中的应用。
本发明的优点在于：本发明获得的岩藻糖基转移酶为新型酶，构建的产岩藻糖基转移酶工程菌株生物发酵产生的岩藻糖基转移酶酶活高，为将其应用在酶法催化产生岩藻糖基转移酶中奠定了基础，通过其能以节约时间和成本的方式有效的制备人乳功能性寡糖。
附图说明
图1 扩增岩藻糖基转移酶基因的琼脂糖凝胶电泳图。
图2 重组质粒pET15b-hafuct物理图谱。
图3 岩藻糖基转移酶重组表达SDS-PAGE图。
具体实施方式
实施例1
（1）将编码岩藻糖基转移酶hafucT的基因密码子优化并且通过Biomatik公司（USA）合成，并将岩藻糖基转移酶hafucT克隆到pBSK(+) Simple-Amp载体中。使用引物GATCCATATGTTCCAGCCGCTGCTGGAT和AAGGGATCCTTACTTCTTAACCAGT从含有基因hafucT的pBSK(+) Simple-Amp中扩增hafucT的多核苷酸序列，PCR扩增条件如下，得到大小为1374 bp的目的基因片段（图1）。通过PCR法引入NdeI/BamHI的限制性酶切位点用于hafucT随后连接，将基因hafucT另外克隆到编码N端His-标记的表达载体pET15b（Novagen，UK）中，得到重组表达载体pET15b-hafuct（图2）。
PCR 扩增条件为：94℃预变性4min，94℃变性45s，58℃退火30s，72℃延伸90s，
共30个循环，再72℃延伸10min，4℃保温。反应体系中各成分用量（50 μL)：
上游引物为：GATCCATATGTTCCAGCCGCTGCTGGAT，下游引物为：AAGGGATCCTTACTTCTTAACCAGT；
（2）用上述将验证正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，按如下步骤进行：取大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，冰浴30min 融化，吸取50 μL感受态细胞与1-2微升pET15b-hafuct质粒混合，42℃热击90s，立即冰浴2min，加入400-600 mL新鲜LB培养基，37℃、100rpm条件下复苏培养45min，之后取60-100 μL菌液涂布于含有氨苄青霉素（100μg/ml）的LB平板，37℃恒温培养箱培养14-18h后挑取单菌落，PCR鉴定重组子，证明pET15b-hafuct构建成功。
（3）挑取上述平板上的阳性转化子，转接到种子培养基中，置于37℃、200 rpm/min摇床上振荡培养16-18h，得种子液；再以1%（v/v）的接种量将种子液接种到发酵培养基中，于37℃振荡培养，经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖（IPTG）苷诱导，IPTG终浓度0.1-0.3mmol/L，于16-20℃诱导20-24 h，转速160-200 rpm。诱导时刻为发酵液OD600为0.6-0.8。所述种子培养基和发酵培养基为LB培养基。
（4）诱导表达后，将发酵液于4000r/min、4℃离心1h收集菌体。将菌体用10mMpH7.0 Trsi-HCl缓冲液重悬后，以plus on 2s / off 3s的频率下超声5-7min中以破碎菌体；将破碎后液体于10000r/min、4℃离心30h去除细胞碎片后收集上清液，利用Ni+柱亲和层析法纯化得到可溶性岩藻糖基转移酶，洗脱浓度为200 mM咪唑，SDS-PAGE分析目的蛋白表达情况，基因工程菌经诱导后有明显的特异表达条带（图3），条带分子量与预期大小分子量52.3 kD基本一致。
（5）纯化后的重组酶HaFucT，以GDP-岩藻糖为供体，Galβ1-3GalNAcαProN3为底物，测定重组酶的岩藻糖基转移酶活性，高分辨质谱对产物进行分析，在M/Z：635.1(M-H)+有离子峰，反应合成岩藻糖基化寡糖Fucα-1,2Galβ1-3GalNAcαProN3。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 一种岩藻糖基转移酶及其应用
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1374
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgttccagc cgctgctgga tgcgtacacc gactccgcgt actctgatgc gtctgaccac 60
aagccgccgc tgaacattgc tattgcgaac ggttggggtg gcaccaaagg ttttgaagca 120
tccgtgctgt atttcatcct gagctggcgt tacaaaattg cactgcatga gaacccgaac 180
aaaccggcgg atctggtttt ctctaacccg ctgggtcagg ctcgcaaaat tctgtcctac 240
cagaacacca aacgtgtgtt ctacaccggc gaaaacgagg cgccgaactt taacctgttc 300
gattacgcga tcggcttcga cggtctggat ttcaaggaac gttatctgcg catgccgctg 360
tactatgcat ctctgcacga caaggcgcag agcgtgaacg acaccaccgc tccgtacact 420
ctgaagtccg actctctgta cgcgctgaag aagccggcgc actgctttaa ggaagaccac 480
ccgcacctgt gctctgttgt taaaggcgaa tctgacccgt ttaagcgtgg tttcgcgtct 540
tttgtggctt ctaacgcaaa cgcgccgatc cgtaacgcat tttgtgaggc actgaactcc 600
gttgagccgg ttaccggtgg cggtgcggtg aaaaacaccc tgggttacaa cgtgactaac 660
aaatctgaat tcctgtccca gtacaaattc aacctgtgtt tcgagaacgc acagggttac 720
ggttacgtga ccgagaagat catcgacgcg tatttctctc acaccatccc gatctactgg 780
ggtagcccgt ctgttgcgca ggattttaac ccgaaatcct ttgttaacgt gcatgacttc 840
aaagactttg acggtgcgat tgactacatt cgctatctgc acacccatga aaacgcgtac 900
ctggacatgc tgtacgaaaa cccgctgaac gtgatcgacg gcaaagcgtg cttctaccag 960
gacctgtctt tcaaaaagat tctggacttt ttcaagacta tcctggagaa cgataccatc 1020
taccacaaca acccgttcgt ttttgaccgt gacctgcacg aaccgctggt ttctatcgac 1080
aacctgcgtg cggacctgct gctgctgaag gacaactatg acggcctgaa aactgactac 1140
gatggcctga agaccgatta tgatggtctg aagactgatt acgacggcct gaaaactgac 1200
tacgatggtc tgaagaccga ttatgatggt ctgaagaccg actatgatca cctgttcaag 1260
tctgctctgc cgctgctgga gctgagccag actacctctt ttaagattta ccataaaatc 1320
tatcagaaga ctctgccgct gctgtgcatg gcacgtaaac tggttaagaa gtaa 1374
<210> 2
<211> 458
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Phe Gln Pro Leu Leu Asp Ala Tyr Thr Asp Ser Ala Tyr Ser Asp
1 5 10 15
Ala Ser Asp His Lys Pro Pro Leu Asn Ile Ala Ile Ala Asn Gly Trp
20 25 30
Gly Gly Thr Lys Gly Phe Glu Ala Ser Val Leu Tyr Phe Ile Leu Ser
35 40 45
Trp Arg Tyr Lys Ile Ala Leu His Glu Asn Pro Asn Lys Pro Ala Asp
50 55 60
Leu Val Phe Ser Asn Pro Leu Gly Gln Ala Arg Lys Ile Leu Ser Tyr
65 70 75 80
Gln Asn Thr Lys Arg Val Phe Tyr Thr Gly Glu Asn Glu Ala Pro Asn
85 90 95
Phe Asn Leu Phe Asp Tyr Ala Ile Gly Phe Asp Gly Leu Asp Phe Lys
100 105 110
Glu Arg Tyr Leu Arg Met Pro Leu Tyr Tyr Ala Ser Leu His Asp Lys
115 120 125
Ala Gln Ser Val Asn Asp Thr Thr Ala Pro Tyr Thr Leu Lys Ser Asp
130 135 140
Ser Leu Tyr Ala Leu Lys Lys Pro Ala His Cys Phe Lys Glu Asp His
145 150 155 160
Pro His Leu Cys Ser Val Val Lys Gly Glu Ser Asp Pro Phe Lys Arg
165 170 175
Gly Phe Ala Ser Phe Val Ala Ser Asn Ala Asn Ala Pro Ile Arg Asn
180 185 190
Ala Phe Cys Glu Ala Leu Asn Ser Val Glu Pro Val Thr Gly Gly Gly
195 200 205
Ala Val Lys Asn Thr Leu Gly Tyr Asn Val Thr Asn Lys Ser Glu Phe
210 215 220
Leu Ser Gln Tyr Lys Phe Asn Leu Cys Phe Glu Asn Ala Gln Gly Tyr
225 230 235 240
Gly Tyr Val Thr Glu Lys Ile Ile Asp Ala Tyr Phe Ser His Thr Ile
245 250 255
Pro Ile Tyr Trp Gly Ser Pro Ser Val Ala Gln Asp Phe Asn Pro Lys
260 265 270
Ser Phe Val Asn Val His Asp Phe Lys Asp Phe Asp Gly Ala Ile Asp
275 280 285
Tyr Ile Arg Tyr Leu His Thr His Glu Asn Ala Tyr Leu Asp Met Leu
290 295 300
Tyr Glu Asn Pro Leu Asn Val Ile Asp Gly Lys Ala Cys Phe Tyr Gln
305 310 315 320
Asp Leu Ser Phe Lys Lys Ile Leu Asp Phe Phe Lys Thr Ile Leu Glu
325 330 335
Asn Asp Thr Ile Tyr His Asn Asn Pro Phe Val Phe Asp Arg Asp Leu
340 345 350
His Glu Pro Leu Val Ser Ile Asp Asn Leu Arg Ala Asp Leu Leu Leu
355 360 365
Leu Lys Asp Asn Tyr Asp Gly Leu Lys Thr Asp Tyr Asp Gly Leu Lys
370 375 380
Thr Asp Tyr Asp Gly Leu Lys Thr Asp Tyr Asp Gly Leu Lys Thr Asp
385 390 395 400
Tyr Asp Gly Leu Lys Thr Asp Tyr Asp Gly Leu Lys Thr Asp Tyr Asp
405 410 415
His Leu Phe Lys Ser Ala Leu Pro Leu Leu Glu Leu Ser Gln Thr Thr
420 425 430
Ser Phe Lys Ile Tyr His Lys Ile Tyr Gln Lys Thr Leu Pro Leu Leu
435 440 445
Cys Met Ala Arg Lys Leu Val Lys Lys Glx
450 455
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gatccatatg ttccagccgc tgctggat 28
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aagggatcct tacttcttaa ccagt 25

Claims (8)

1.一种岩藻糖基转移酶，其特征在于，所述岩藻糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
2. 一种编码权利要求1所述岩藻糖基转移酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或编码氨基酸序列SEQ ID NO.2中所示蛋白质的核苷酸序列。
3. 一种如权利要求2所述的基因的制备方法，其特征在于，设计引物，上游引物为：GATCCATATGTTCCAGCCGCTGCTGGAT，下游引物为：AAGGGATCCTTACTTCTTAACCAGT；然后以螺杆菌Helicobacter acinonychis基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应进行基因扩增，获得岩藻糖基转移酶基因序列。
4.一种重组表达载体，其特征在于，所述载体包含权利要求2所述的岩藻糖基转移酶基因的核苷酸序列。
5.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌由权利要求4所述的重组表达载体转化至宿主微生物中获得。
6.一种如权利要求1所述的岩藻糖基转移酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求5所述基因工程菌接种至LB培养基中培养，在异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的诱导下，表达获得岩藻糖基转移酶。
7.如权利要求1所述的岩藻糖基转移酶在岩藻糖基化寡糖制备中的应用。
8.如权利要求5所述的基因工程菌在岩藻糖基化寡糖制备中的应用。
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