CN110172486A - 一种合成2’-岩藻糖基乳糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，涉及2’‑岩藻糖基乳糖的生产方法，尤其是一种利用基因工程菌株与酶共催化合成2’‑岩藻糖基乳糖的方法。本发明以高效表达己糖激酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖‑1磷酸鸟苷转移酶的乳酸乳球菌重组菌为生产菌株，以甘露糖为底物，合成GDP‑甘露糖，再利用GDP‑甘露糖4,6‑脱水酶、GDP‑4‑酮‑6‑脱氧甘露糖3,5‑变旋酶/4‑还原酶、α1,2‑岩藻糖基转移酶在体外对GDP‑甘露糖进行催化，从而合成2’‑岩藻糖基乳糖，为工业上生产2’‑岩藻糖基乳糖提供了一种新的方法。

Description

一种合成2’-岩藻糖基乳糖的方法

技术领域：

本发明属于基因工程领域，涉及2’-岩藻糖基乳糖的生产方法，尤其是一种利用基因工程菌株与酶共催化合成2’-岩藻糖基乳糖的方法。

背景技术：

近年来，随着食品工业和生物科技的快速发展，功能寡糖的开发已成为国际生物技术领域的重要课题，寡糖产业现已成为一个应用于食品、饲料、医药、化工等行业的新兴重要产业。人乳低聚糖不仅具有抗病毒感染、增强免疫力调节、减少炎症等生理作用，而且对于癌症和慢性复发性结肠炎等有一定的预防作用。它作为一类特殊结构的糖类物质，可作为上皮细胞的可溶性受体类似物，参与母乳喂养婴儿的非免疫防御体系的增强。人乳寡糖其含量在乳糖、脂类之后，成为人乳中第三大物质，在初乳中寡糖含量为20-27g/L，在成熟乳中也高达12-14g/L，而在其它动物乳汁中含量很低，牛初乳中寡糖仅含0.7-1.2g/L，低于人初乳20 倍之多。

除含量丰富外，人乳寡糖结构也非常复杂，根据质谱分析，估计人乳中含有900多种不同结构的寡糖，目前已至少分离出130多种结构不同的寡糖，而牛乳中仅含有18种寡糖。人乳寡糖大多数呈中性，以岩藻糖基化寡糖为主，其中α1,2-岩藻糖基化寡糖在被检人乳中占总寡糖的比例平均为73％，岩藻糖残基为1-15个不等。这种在人乳中含量最为丰富的岩藻糖基化寡糖在牛、绵羊、山羊及马等动物的成熟乳汁却未曾检测到，但在其初乳中却含有较多的中性寡糖。不同哺乳动物乳汁之间寡糖结构上的差异，也可能提示人乳寡糖具有独特的生理功能。另外，人乳低聚糖及其类似物由于功能独特，安全、有效，不产生抗药性，并且还能抵御对抗生素产生抗性的变异病原菌，以人乳寡糖及类似物为原料制备抗粘附药物成为当前药物开发的又一大热点，其在预防和治疗细菌性疾病领域及婴儿营养保健方面必将发挥巨大的作用。

目前关于人乳寡糖的功能与制备研究在我国仍未得到有效开展。我国对功能寡糖类物质的开发主要集中在天然植物和微生物多糖，采用酸、碱、酶、氧化等化学方法进行降解制备低分子量的寡糖，如壳寡糖、果寡糖等。通过化学合成法获得人乳低聚糖，由于合成路线的复杂以及糖苷供体的昂贵，大多数工艺仍无法达到规模生产，成为化学法合成寡糖不易逾越的障碍。

随着越来越多的糖苷酶及其基因的不断解析和基因工程技术的迅速发展，通过人工构建基因工程菌大量合成低聚糖已成为可能。

发明内容：

本发明的目的是提供一种利用重组菌株和混酶发酵合成2’-岩藻糖基乳糖的方法，该方法以高效表达己糖激酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1磷酸鸟苷转移酶的乳酸乳球菌重组菌为生产菌株，以甘露糖为底物，合成GDP-甘露糖，再利用GDP-甘露糖4,6-脱水酶、GDP-4-酮 -6-脱氧甘露糖3,5-变旋酶/4-还原酶、α1,2-岩藻糖基转移酶在体外对GDP-甘露糖进行催化，从而合成2’-岩藻糖基乳糖，为工业上生产2’-岩藻糖基乳糖提供了一种新的方法。

优选地，所述己糖激酶来自大肠杆菌E.coli K12，核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.1所示；

优选地，所述磷酸甘露糖变位酶来自大肠杆菌E.coli K12，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；

优选地，所述甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶来自大肠杆菌E.coli K12，核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO.3所示；

优选地，所述乳酸乳球菌重组菌的宿主细胞为乳酸乳球菌NZ3900；

优选地，所述乳酸乳球菌重组菌的的表达载体为质粒pNZ8149；

优选地，所述GDP-甘露糖4,6-脱水酶和GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖3,5-变旋酶/4-还原酶来自大肠杆菌E.coli K12，核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO.4和5所示；

优选地，所述α1,2-岩藻糖基转移酶来自幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)HPAG1，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示。

本发明生产2’-岩藻糖基乳糖的方法具体如下：

(1)细胞发酵：以上述乳酸乳球菌重组菌为生产菌株，对含有甘露糖为底物的发酵培养基进行发酵，合成GDP-甘露糖；

所述甘露糖底物的浓度为20mg/mL；

(2)细胞和混酶发酵合成人乳岩藻糖基乳糖：利用GDP-甘露糖4,6-脱水酶、GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖3,5-变旋酶/4-还原酶、α1,2-岩藻糖基转移酶催化步骤(1)中发酵得到的产物GDP- 甘露糖和外部添加的乳糖，合成2’-岩藻糖基乳糖；每mL反应体系中GDP-甘露糖4,6-脱水酶：GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖3,5-变旋酶/4-还原酶：α1,2-岩藻糖基转移酶：GDP-甘露糖：乳糖＝2U：2U：3U：1mg：2mg；

优选地，所述发酵培养基为M9培养基，组成为：Na₂HPO₄ 12.8g，KH₂PO 3g，NaCl0.5g， NH₄Cl 1g，10mL(1moL/L)MgSO₄，0.5mL(1moL/L)CaCl₂，2％的葡萄糖，无菌水定容至1L。

优选地，步骤(1)的发酵条件为：发酵温度30-37℃、摇床转速160-220r/min、发酵时间36-48h；

优选地，步骤(2)进行酶共催化的条件为：催化温度30-40℃、反应时间6-10h；

经过6-10h发酵后，2’-岩藻糖基乳糖的产量达到1.0-2.5μg/mL。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明以乳酸乳球菌和大肠杆菌为基础，运用基因工程重组技术构建 NZ3900/pNZ8149-glk-manB-manC、BL21/pET-gmd、BL21/pET-wcaG和BL21/pET-futc四种基因工程菌株，实现代谢途径中酶的高效表达，并应用发酵技术，使底物甘露糖转化为GDP- 甘露糖，以含有GDP-甘露糖的上清液和乳糖为底物，通过GDP-甘露糖4,6-脱水酶、GDP-4- 酮-6-脱氧甘露糖3,5-变旋酶/4-还原酶、α1,2-岩藻糖基转移酶进行催化合成2’-岩藻糖基乳糖，这为工业化生产人乳低聚糖的提供一条可行途径，这种生产方法降低了生产成本，提高了生产效率，不仅具有经济效益，还具有一定的社会效益。

2、本发明利用重组菌株NZ3900/pNZ8149-glk-manB-manC发酵合成GDP-甘露糖，GDP- 甘露糖是合成2’-岩藻糖基乳糖的重要前底物，GDP-甘露糖的大量积累，有利于2’-岩藻糖基乳糖的大量合成，这不仅使得批量生产人乳寡糖成为可能，同时也为天然寡糖药物的生产提供原料，具有较强的基础理论研究价值和社会经济效益，市场开发前景广阔。

附图说明：

图1目的基因glk、manB和manC的PCR验证；

其中，M:1kb DNA marker；1:glk；2:manB；3:manC；

图2目的基因gmd和wcaG的扩增PCR验证

其中，1-3:wcaG；4:1kb DNA marker；5-7:gmd；

图3目的基因futc的扩增PCR验证

其中，M:1kb DNA marker；1-2:futc；

图4重组质粒pET-gmd/wcaG/futc构建示意图；

图5重组质粒pNZ8149-glk-manB-manC构建示意图；

图6本发明利用重组菌株发酵和酶共催化合成2’-岩藻糖基乳糖的流程图；

图7a重组质粒pET-wcaG和pET-gmd酶切及PCR验证电泳图

其中，M:1kb DNAmark；1:pET-22b/HindⅢ；2：pET-wcaG/NcoⅠ+HindⅢ；3:pET-gmd/Nco Ⅰ+HindⅢ；4:pET-gmd/PCR；5：pET-wcaG/PCR；

图7b重组质粒pET-futc酶切及PCR验证电泳图

其中，M:1kb DNAladder；3:pET-futc/BamHI/HindIII；4:pET-futc/BamHI；1-2:pET-futc/PCR；

图8重组质粒pNZ-gBC酶切及PCR验证电泳图

其中，M:1kb DNA ladder；1-2:pNZ-gBC/KpnI/PstI；1-3:pNZ-gBC/PCR；

图9表达蛋白的SDS-PAGE分析

a:重组菌株BL21/pET-gmd和BL21/pET-wcaG表达蛋白的SDS-PAGE分析

其中，M:protein marker；1:BL21/pET-gmd；2:BL21/pET-wcaG；

3:BL21/pET-22b；

b:重组菌株BL21/pET-futc表达蛋白的SDS-PAGE分析

其中，M:Marker；1:BL21/pET-22b；2:BL21/pET-futc；

c:重组菌株NZ3900/pNZ8149-glk-manB-manC表达蛋白的SDS-PAGE分析

其中，M:Marker；1-2:NZ3900/pNZ8149-glk-manB-manC；3:NZ3900/pNZ8149；

图10产物HPLC检测

其中，A-标品2’-岩藻糖基乳糖的HPLC图；B-空白对照反应液的HPLC图；C-样品反应液的HPLC图；

图11GDP-岩藻糖标品和发酵液液相色谱图

其中，A:GDP-岩藻糖标品HPLC色谱图；B:重组大肠杆菌BL21/pET-22b发酵液的HPLC 色谱图。

具体实施方式：

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

本发明所涉及的利用重组菌株发酵和酶共催化合成2’-岩藻糖基乳糖的方法，首先是利用乳酸乳球菌的NICE表达***，对己糖激酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶(Glk、ManB、ManC)进行诱导表达，并催化底物甘露糖合成GDP-甘露糖；其次，利用大肠杆菌的表达***，分别对GDP-甘露糖4,6-脱水酶、GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖3,5-变旋酶/4- 还原酶、α1,2-岩藻糖基转移酶(Gmd、WcaG、Futc)进行诱导表达获得相应的酶。以乳酸乳球菌发酵合成GDP-甘露糖后的菌体破碎液离心上清为底物，并加入适量的乳糖，在Gmd、 WcaG的作用下先合成GDP-岩藻糖，再在Futc的催化作用下，合成2’-岩藻糖基乳糖。本发明利用重组菌株发酵和酶共催化合成2’-岩藻糖基乳糖的流程图如图6所示。

采用现有技术中的各种来源的己糖激酶基因glk、磷酸甘露糖变位酶基因manB、甘露糖 -1-磷酸鸟苷酰转移酶基因manC、GDP-甘露糖4,6-脱水酶基因gmd、GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖 3,5-变旋酶/4-还原酶基因wcaG、α1,2-岩藻糖基转移酶基因futc均可实现本发明所示的效果。

本发明实施例所使用的己糖激酶基因glk、磷酸甘露糖变位酶基因manB、甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶基因manC、GDP-甘露糖4,6-脱水酶基因gmd、GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖3,5-变旋酶/4-还原酶基因wcaG，均来源于E.coli K12；Genbank编号分别为ECK2384，ECUMN_2374，ECIAI39_0987，ECK2047，ECK2046，核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO.1-5所示；

本发明实施例所使用的α1,2-岩藻糖基转移酶基因futc来自幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)HPAG1，Genbank编号为HELPY_0091，核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.6所示；

本发明实施例表达己糖激酶Glk、磷酸甘露糖变位酶ManB、甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶ManC的宿主为乳酸乳球菌NZ3900，表达载体为pNZ8149；本发明实施例表达GDP-甘露糖4,6-脱水酶、GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖3,5-变旋酶/4-还原酶、α1,2-岩藻糖基转移酶的宿主，均为大肠杆菌BL21，表达载体为pET-22b。

本发明所使用的培养基如下：

M9培养基，组成为：Na₂HPO₄ 12.8g，KH₂PO 3g，NaCl 0.5g，NH₄Cl 1g，10mL(1moL/L)MgSO₄，0.5mL(1moL/L)CaCl₂，2％的葡萄糖，无菌水定容至1L。

GM₁₇培养基(g/L)：乳糖20，葡萄糖40，酵母粉5，硫酸铵5，磷酸氢二钠4，磷酸二氢钾0.5，pH 6.8。

实施例1重组乳酸乳球菌和重组大肠杆菌的构建

本发明所涉及的基因可通过基因组PCR扩增获取，也可根据基因序列通过全序列合成获取，以下以PCR扩增为例：

1、目的基因的扩增

(1)提取大肠杆菌(E.coli K12)的基因组DNA，设计如下引物依次用于扩增己糖激酶基因glk、磷酸甘露糖变位酶基因manB、甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶基因manC、GDP-甘露糖 4,6-脱水酶基因gmd、GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖3,5-变旋酶/4-还原酶基因wcaG：

(2)提取幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)HPAG1基因组DNA，设计如下引物用于扩增α1,2-岩藻糖基转移酶基因futc：

引物名称	序列5’-3’	酶切位点	SEQ ID
				futc1	GCTCTAGAATGGCTTTTAAAAGTGTGCAA	XbaI	NO.17
futc2	GGGGTACCTTAAGCGTTATACTTTTGGGATTT	KpnI	NO.18

(3)以大肠杆菌E.coliK12和HPAG1染色体DNA为模板分别对目的基因(己糖激酶基因glk、磷酸甘露糖变位酶基因manB、甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶基因manC、GDP-甘露糖4,6-脱水酶基因gmd、GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖3,5-变旋酶/4-还原酶基因wcaG、α1,2-岩藻糖基转移酶基因futc)进行PCR扩增，扩增条件如下，验证如图1、图2、图3.

a.采用20μL的PCR扩增体系：

b.用于扩增目的基因的PCR条件：

2、重组质粒pET-gmd、pET-wcaG、pET-futc、pNZ8149-glk-manB-manC的构建

重组质粒pET-gmd/wcaG/futc构建示意图如图4所示；重组质粒pNZ8149-glk-manB-manC 构建示意图如图5所示；

将质粒pET-22b、pNZ8149、步骤1中PCR扩增产物用相应的限制性内切酶进行双酶切，进行凝胶验证，用DNA纯化试剂盒(TaKaBa公司)对上述酶切后的片段进行纯化回收。获得的线性纯化的pET-22b、pNZ8149、基因片段。将获得的线性载体pET-22b、pNZ8149、基因片段进行连接，获得重组质粒pET-gmd、pET-wcaG、pET-futc、pNZ8149-glk-manB-manC。

酶切后的载体和目的基因的连接，均选用10μL连接体系(SolutionⅠ5μL，载体1μL，片段4μL)，16℃反应8h。

所得连接混合物采用热激法化转入大肠杆菌JM109，进行目的质粒的扩增，获得重组质粒pET-gmd、pET-wcaG、pET-futc、pNZ8149-glk-manB-manC。

3、重组菌株BL21/pET-gmd、BL21/pET-wcaG、BL21/pET-futc的构建及验证

(1)制备大肠杆菌BL21的感受态细胞

(2)感受态细胞的转化：向BL21感受态细胞中分别加入已经连接好的重组质粒pET-gmd、 pET-wcaG、pET-futc混合液，轻轻吹打均匀，冰浴20min；42℃水浴中热击90s，迅速***冰中，冰浴10min；在超净工作台中向EP管中加入300μLLB复苏液轻轻摇匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡培养1h；离心收集菌体，涂布到含氨苄青霉素(100μg/mL)的LA平板上，37℃倒置培养过夜(16-20h)；

(3)重组大肠杆菌转化子的验证：从平板上挑取单一菌落，接种于含氨苄青霉素(100μg/mL) 液体LB培养基中，于37℃培养12-18h，然后小量提取质粒DNA，用相应的限制性内切酶进行双酶切鉴定，验证正确，如图7a和图7b，分别获得基因工程菌株BL21/pET-gmd，BL21/ pET-wcaG，BL21/pET-futc。

4、基因工程菌株乳酸乳球菌NZ3900/pNZ8149-glk-manB-manC的构建及验证

(1)乳酸乳球菌NZ3900的感受态制备；

(2)乳酸乳球菌NZ3900的电击转化：往乳酸乳球菌NZ3900的感受态细胞中加入重组质粒pNZ8149-glk-manB-manC，吹打混匀，将混匀后的液体转入提前预冷的电转杯中；打开电击仪，设置参数：2.0kV，200Ω，25μF，进行电脉冲；电击结束后，取出电转杯，加入800 μL GM₁₇MC恢复培养基，将菌液转入EP管中，于30℃、160r/min培养3h；12000r/min离心2min，弃上清，取50μL GM₁₇培养基重悬菌体，涂布在含有氯霉素的平板上，30℃静止培养72h，长出的黄色阳性菌落即为可能的阳性转化子。

(3)重组乳酸乳球菌转化子的验证：从平板上挑取单一菌落，接种于含氯霉素(100μg/mL) 液体GM₁₇培养基中，于30℃培养12-18h，然后小量提取质粒DNA，用相应的限制性内切酶进行双酶切鉴定，验证正确，如图8，获得重组乳酸乳球菌NZ3900/ pNZ8149-glk-manB-manC。

实施例2、重组菌株的诱导表达分析

1、重组大肠杆菌诱导表达分析

(1)挑取实施例1-3获得的基因工程菌株BL21/pET-gmd，BL21/pET-wcaG，BL21/pET-futc单菌落分别转接到5mL LB液体培养基中，37℃、220r/min培养过夜；

(2)将菌液转接到50mL M9液体培养基中，控制起始菌浓OD₆₀₀＝0.1，继续培养；

(3)当菌株浓度达到OD₆₀₀为0.4时，加入40μL0.1mol/L的IPTG，在16℃下诱导4h；

(4)6000r/min离心10min，收集大肠杆菌；

(5)用PBS缓冲液洗涤菌株2次，利用超声破碎细胞仪来破碎细胞，4℃，12000r/min离心10min，收集上清，取样进行SDS-PAGE分析，结果见图9a和9b。

2、重组乳酸乳球菌诱导表达分析

(1)挑取实施例1-4获得的重组乳酸乳球菌NZ3900/pNZ8149-glk-manB-manC单菌落接种到5mL GM₁₇液体培养基中，30℃、160r/min培养过夜；

(2)将菌液接种到50mL GM₁₇液体培养基中，控制初始菌浓OD₆₀₀＝0.1，继续培养；

(3)当菌浓达到OD₆₀₀为0.4时，加入40μL0.1mg/mL的Nisin，在30℃下诱导4h；

(4)6000r/min离心10min，收集乳酸乳球菌；

(5)用PBS缓冲液洗涤细胞2次，并用400μL的溶菌酶悬浮，于37℃温浴3h，并用超声破碎细胞仪破碎细胞，4℃，12000r/min离心10min，收集上清，取样进行SDS-PAGE分析，结果见图 9c。

由图可知，在大约35kDa、50kDa、63kDa、41kDa、37kDa、33kDa处出现条带，这与己糖激酶(Glk)、磷酸甘露糖变位酶(ManB)、甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶(ManC)、GDP- 甘露糖4,6-脱水酶(Gmd)、GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖3,5-变旋酶/4-还原酶(WcaG)、α1,2-岩藻糖基转移酶(Futc)分子量大小相一致，这表明目的基因glk、manB和manC、gmd、wcaG、futc 成功实现表达。

实施例3重组工程菌株发酵和酶共催化合成2’-岩藻糖基乳糖

(1)挑取重组乳酸乳球菌NZ3900/pNZ-glk-manB-manC单菌落接种到5mL GM₁₇液体培养基中，30-37℃、160-220r/min过夜培养。将菌液接种到50mL M9发酵培养基中，控制起始菌浓OD₆₀₀＝0.1，待菌株的OD₆₀₀＝0.4时，加入20mg/mL的底物甘露糖，同时加入Nisin 做诱导剂，使其终浓度为35ng/mL，35℃、200r/min发酵40h后。破碎细胞，离心，收集上清；

(2)GDP-甘露糖4,6-脱水酶、GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖3,5-变旋酶/4-还原酶和α1,2-岩藻糖基转移酶的制备：分别挑取重组大肠杆菌BL21/pET-glk、BL21/pET-manB和BL21/pET-manC 单菌落接种到5mL LB液体培养基中，37℃、220r/min过夜培养。将菌液分别接种到50mL M9 发酵培养基中，控制起始菌浓OD₆₀₀＝0.1，待菌株的OD₆₀₀＝0.3时，分别加入诱导剂IPTG，使其终浓度为0.5mmoL/L，20℃、200r/min诱导25h后。破碎细胞，离心，收集上清。

(3)利用酶催化合成2’-岩藻糖基乳糖步骤：在1.5mL的EP管中，以步骤(1)中的细胞破碎液离心上清为底物，同时加入适量的乳糖；利用步骤(2)中获得的含有GDP-甘露糖4,6- 脱水酶、GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖3,5-变旋酶/4-还原酶和α1,2-岩藻糖基转移酶的上清来催化合成2’-岩藻糖基乳糖。按如下体系进行合成反应：1mgGDP-甘露糖：2U GDP-甘露糖4,6-脱水酶：2U GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖3,5-变旋酶/4-还原酶：3Uα1,2-岩藻糖基转移酶：2mg的乳糖。在35℃条件下，反应6h。

酶单位(U)：30-40℃，pH7.0条件下，1min内催化1μmol底物GDP-甘露糖发生反应所需要的酶量。

反应液处理：利用沸水浴煮沸反应液，终止反应，离心，取上清进行HPLC分析，结果见图10：在图10(C)所表示样品反应液的HPLC图中在21min左右出现了与图10(A)相同时间的峰，而在图10(B)所表示空白对照反应液的HPLC图中没有出现相应的峰，因此可以确定，该方法可以合成2’-岩藻糖基乳糖。用外标法计算岩藻糖基化寡糖的产量为 1.25μg/mL。

HPLC色谱条件为：色谱柱：Carbohydrate ES 5μ250mm*4.6mm，检测器：蒸发光检测器；流动相：70％的乙腈(乙腈：水)；柱温：30℃；进样量：20μL；流速：1.0mL/min。

实施例4对比例

挑取负载空质粒的重组大肠杆菌BL21/pET-22b单菌落接种到5mL GM₁₇液体培养基中， 30℃、160r/min过夜培养。将菌液接种到50mL M9发酵培养基中，控制起始菌浓OD₆₀₀＝0.1，待菌株的OD₆₀₀＝0.4时，加入20mg/mL的底物甘露糖，同时加入诱导剂IPTG，使其终浓度为35ng/mL，16℃、160r/min发酵24h后。离心，收集上清，取上清进行HPLC-ELSD分析。结果如图11所示。在图11B所表示重组大肠杆菌BL21/pET-22b发酵液的HPLC-ELSD图中没有出现GDP-岩藻糖相应的峰，因此可以判定构建的重组大肠杆菌BL21/pET-22b不能合成 GDP-岩藻糖。

通过目前已公开的基因组可知，大肠杆菌BL21基因组上包含己糖激酶Glk、磷酸甘露糖变位酶ManB、甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶ManC、GDP-甘露糖4,6-脱水酶Gmd、GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖3,5-变旋酶/4-还原酶WcaG的编码基因，并且基因序列与大肠杆菌K12上的对应基因相同，而本实施例通过验证发现重组大肠杆菌BL21/pET-22b不能以甘露糖为底物合成 GDP-岩藻糖，说明大肠杆菌本身并不具备以甘露糖为底物通过己糖激酶Glk、磷酸甘露糖变位酶ManB、甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶ManC、GDP-甘露糖4,6-脱水酶Gmd合成GDP-甘露糖，进而以GDP-甘露糖为底物通过GDP-甘露糖4,6-脱水酶Gmd、GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖3,5-变旋酶/4-还原酶WcaG合成GDP-岩藻糖的代谢通路。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种合成2'-岩藻糖基乳糖的方法

<130> 1

<141> 2019-05-14

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1033

<212> DNA

<213> 大肠杆菌E.coli K12()

<400> 1

atgtgggcgg caccaacgca cgtcttgctc tgtgtgatat tgccagtggt gaaatctcgc 60

aggctaagac ctattcaggg cttgattacc ccagcctcga agcggtcatt cgcgtttatc 120

ttgaagaaca taaggtcgag gtgaaagacg gctgtattgc catcgcttgc ccaattaccg 180

gtgactgggt ggcgatgacc aaccatacct gggcgttctc aattgccgaa atgaaaaaga 240

atctcggttt tagccatctg gaaattatta acgattttac cgctgtatcg atggcgatcc 300

cgatgctgaa aaaagagcat ctgattcagt ttggtggcgc agaaccggtc gaaggtaagc 360

ctattgcggt ttacggtgcc ggaacggggc ttggggttgc gcatctggtc catgtcgata 420

agcgttgggt aagcttgcca ggcgaaggcg gtcacgttga ttttgcgccg aatagtgaag 480

aagaggccat tatcctcgaa atattgcgtg cggaaattgg tcatgtttcg gcggagcgcg 540

tgctttctgg ccctgggctg gtgaatttgt atcgcgcaat tgtgaaagct gacaaccgcc 600

tgccagaaaa tctcaagcca aaggatatta ccgaacgcgc gctggctgac agctgcaccg 660

attgccgccg cgcattgtcg ctgttttgcg tcattatggg ccgttttggc ggcaatctgg 720

cgctcaatct cgggacattt ggcggcgtgt ttattgcggg cggtatcgtg ccgcgcttcc 780

ttgagttctt caaacctccg gtttccgtgc cgcatttgaa gataaagggc gctttaaaga 840

atatgtccat gatattccgg tgtatctcat cgtccatgac aatccgggcc ttctcggttc 900

cggtgcacat ttacgccaga ccttaggtca cattctgtaa ggatccgaat tcgagctccg 960

tcgacaagct tgcggccgca ctcgagcacc accaccacca ccactgagat ccggctgcta 1020

acaaagcccg aaa 1033

<210> 2

<211> 1412

<212> DNA

<213> 大肠杆菌E.coli K12()

<400> 2

atgatattcg cgggaaatta ggcgaagaac tgaatgaaga tatcgcctgg cgcattggtc 60

gcgcctatgg cgaatttctc aaaccgaaaa ccattgtgtt aggcggtgat gtccgcctca 120

ccagcgaaac cttaaaactg gcgctggcga aaggtttaca ggatgcgggc gttgacgtgc 180

tggatattgg tatgtccggc accgaagaga tctatttcgc cacgttccat ctcggcgtgg 240

atggcggcat tgaagttacc gccagccata atccgatgga ttataacggc atgaagctgg 300

ttcgcgaggg ggctcgcccg atcagcggag ataccggact gcgcgacgtc cagcgtctgg 360

ctgaagccaa cgactttcct cccgtcgatg aaaccaaacg cggtcgctat cagcaaatca 420

acctgcgtga cgcttacgtt gatcacctgt tcggttatat caatgtcaaa aacctcacgc 480

cgctcaagct ggtgatcaac tccgggaacg gcgcagcggg tccggtggtg gacgccattg 540

aagcccgctt taaagccctc ggcgcgcccg tggaattaat caaagtgcac aacacgccgg 600

acggcaattt ccccaacggt attcctaacc cactactgcc ggaatgccgc gacgacaccc 660

gcaatgcggt catcaaacac ggcgcggata tgggcattgc ttttgatggc gattttgacc 720

gctgtttcct gtttgacgaa aaagggcagt ttattgaggg ctactacatt gtcggcctgt 780

tggcagaagc attcctcgaa aaaaatcccg gcgcgaagat catccacgat ccacgtctct 840

cctggaacac cgttgatgtg gtgactgccg caggtggcac gccggtaatg tcgaaaaccg 900

gacacgcctt tattaaagaa cgtatgcgca aggaagacgc catctatggt ggcgaaatga 960

gcgcccacca ttacttccgt gatttcgctt actgcgacag cggcatgatc ccgtggctgc 1020

tggtcgccga actggtgtgc ctgaaagata aaacgctggg cgaactggta cgcgaccgga 1080

tggcggcgtt tccggcaagc ggtgagatca acagcaaact ggcgcaaccc gttgaggcga 1140

ttaaccgcgt ggaacagcat tttagccgtg aggcgctggc ggtggatcgc accgatggca 1200

tcagcatgac ctttgccgac tggcgcttta acctgcgcac ctccaatacc gaaccggtgg 1260

tgcgcctgaa tgtggaatcg cgcggtgatg tgccgctgat ggaagcgcga acgcgaactc 1320

tgctgacgtt gctgaacgag taaaagcttg cggccgcact cgagcaccac caccaccacc 1380

actgagatcc ggctgctaac aaagcccgaa ag 1412

<210> 3

<211> 1437

<212> DNA

<213> 大肠杆菌E.coli K12()

<400> 3

atggcaggtg gctccggtag ccgcttatgg ccgctttccc gcgtacttta tcccaagcag 60

tttttatgcc tgaaaggcga tctcaccatg ctgcaaacca ccatctgccg cctgaacggc 120

gtggagtgcg aaagcccggt ggtgatttgc aatgagcagc accgctttat tgtcgcggaa 180

cagctgcgtc aactgaacaa acttaccgag aacattattc tcgaaccggc agggcgaaac 240

acggcacctg ccattgcgct ggcggcgctg gcggcaaaac gtcatagccc ggagagcgac 300

ccgttaatgc tggtattggc ggcggatcat gtgattgccg atgaagacgc gttccgtgcc 360

gccgtgcgta atgccatgcc atatgccgaa gcgggcaagc tggtgacctt cggcattgtg 420

ccggatctac cagaaaccgg ttatggctat attcgtcgcg gtgaagtgtc tgcgggtgag 480

caggatatgg tggcctttga agtggcgcag tttgtcgaaa aaccgaatct ggaaaccgct 540

caggcctatg tggcaagcgg cgaatattac tggaacagcg gtatgttcct gttccgcgcc 600

ggacgctatc tcgaagaact gaaaaaatat cgcccggata tcctcgatgc ctgtgaaaaa 660

gcgatgagcg ccgtcgatcc ggatctcaat tttattcgcg tggatgaaga agcgtttctc 720

gcctgcccgg aagagtcggt ggattacgcg gtcatggaac gtacggcaga tgctgttgtg 780

gtgccgatgg atgcgggctg gagcgatgtt ggctcctggt cttcattatg ggagatcagc 840

gcccacaccg ccgagggcaa cgtttgccac ggcgatgtga ttaatcacaa aactgaaaac 900

agctatgtgt atgctgaatc tggcctggtc accaccgtcg gggtgaaaga tctggtagtg 960

gtgcagacca aagatgcggt gctgattgcc gaccgtaacg cggtacagga tgtgaaaaaa 1020

gtggtcgagc agatcaaagc cgatggtcgc catgagcatc gggtgcatcg cgaagtgtat 1080

cgtccgtggg gcaaatatga ctctatcgac gcgggcgacc gctaccaggt gaaacgcatc 1140

accgtgaaac cgggcgaggg cttgtcggta cagatgcacc atcaccgcgc ggaacactgg 1200

gtggttgtcg cgggaacggc aaaagtcacc attgatggtg atatcaaact gcttggtgaa 1260

aacgagtcca tttatattcc gctgggggcg acgcattgcc tggaaaaccc ggggaaaatt 1320

cgctcgattt cagaccttag gtcacattct gtaaaagctt gaattgaagt gcgctccggc 1380

tcttatctcg aagaggatga tgtggtgcgt ttcgcggatc gctacggacg ggtgtaa 1437

<210> 4

<211> 1253

<212> DNA

<213> 大肠杆菌E.coli K12()

<400> 4

atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60

atggccatgg atatgtcaaa agtcgctctc atcaccggtg taaccggaca agacggttct 120

tacctggcag agtttctgct ggaaaaaggt tacgaggtgc atggtattaa gcgtcgcgca 180

tcgtcattca acaccgagcg cgtggatcac atttatcagg atccgcacac ctgcaacccg 240

aaattccatc tgcattatgg cgacctgagt gatacctcta acctgacgcg cattttgcgt 300

gaagtacagc cggatgaagt gtacaacctg ggcgcaatga gccacgttgc ggtctctttt 360

gagtcaccag aatataccgc tgacgtcgac gcgatgggta cgctgcgcct gctggaggcg 420

atccgcttcc tcggcctgga aaagaaaact cgtttctatc aggcttccac ctctgaactg 480

tatggtctgg tgcaggaaat tccgcagaaa gagaccacgc cgttctaccc gcgatctccg 540

tatgcggtcg ccaaactgta cgcctactgg atcaccgtta actaccgtga atcctacggc 600

atgtacgcct gtaacggaat tctcttcaac catgaatccc cgcgccgcgg cgaaaccttc 660

gttacccgca aaatcacccg cgcaatcgcc aacatcgccc aggggctgga gtcgtgcctg 720

tacctcggca atatggattc cctgcgtgac tggggccacg ccaaagacta cgtaaaaatg 780

cagtggatga tgctgcagca ggaacagccg gaagatttcg ttatcgcgac cggcgttcag 840

tactccgtgc gtcagttcgt ggaaatggcg gcagcacagc tgggcatcaa actgcgcttt 900

gaaggcacgg gcgttgaaga gaagggcatt gtggtttccg tcaccgggca tgacgcgccg 960

ggcgttaaac cgggtgatgt gattatcgct gttgacccgc gttacttccg tccggctgaa 1020

gttgaaacgc tgctcggcga cccgaccaaa gcgcacgaaa aactgggctg gaaaccggaa 1080

atcaccctca gagagatggt gtctgaaatg gtggctaatg acctcgaagc ggcgaaaaaa 1140

cactctctgc tgaaatctca cgggtacgac gtggcgatcg cgctggagtc ataaaagctt 1200

gcggccgcac tcgagcacca ccaccaccac caatgagatc cggctgctaa caa 1253

<210> 5

<211> 1040

<212> DNA

<213> 大肠杆菌E.coli K12()

<400> 5

atggcgatga gtaaacaacg agtttttatt gttggtcatc gcgggatggt cggttccgcc 60

atcaggcggc agctcgaaca gcgcggtgat gtggaactgg tattacgcac ccgcgacgag 120

ctgaacctgc tggacagccg cgccgtgcat gatttctttg ccagcgaacg tattgaccag 180

gtctatctgg cggcggcgaa agtgggcggc attgttgcca acaacaccta tccggcggat 240

ttcatctacc agaacatgat gattgagagc aacatcattc acgccgcgca tcagaacgac 300

gtgaacaaac tgctgtttct cggatcgtcc tgcatctacc cgaaactggc aaaacagccg 360

atggcagaaa gcgagttgtt gcagggcacg ctggagccga ctaacgagcc ttatgctatt 420

gccaaaatcg ccgggatcaa actgtgcgaa tcatacaacc gccagtacgg acgcgattac 480

cgctcagtca tgccgaccaa cctgtacggg ccacacgaca acttccaccc gagtaattcg 540

catgtgatcc cagcattgct gcgtcgcttc cacgaggcga cggcacagaa tgcgccggac 600

gtggtggtat ggggcagcgg tacaccgatg cgcgaatttc tgcacgtcga tgatatggcg 660

gcggcgagca ttcatgtcat ggagctggcg catgaagtct ggctggagaa cacccagccg 720

atgttgtcgc acattaacgt cggcacgggc gttgactgca ctatccgcga gctggcgcaa 780

accatcgcca aagtggtggg ttacaaaggc cgggtggttt ttgatgccag caaaccggat 840

ggcacgccgc gcaaactgct ggatgtgacg cgcctgcatc agcttggctg gtatcacgaa 900

atctcactgg aagcggggct tgccagcact taccagtggt tccttgagaa tcaagaccgc 960

tttcgggggt aaaagcttgc ggccgcactc gagcaccacc accaccacca ctgagatccg 1020

gctgctaaca aagcccgaaa 1040

<210> 6

<211> 906

<212> DNA

<213> 幽门螺旋杆菌()

<400> 6

atggctttta aagtggtgca aatttgcgga gggcttggga atcaaatgtt tcaatacgct 60

ttcgctaaaa gtttgcaaaa acactctaat acgcctgtgc tgttagatat tacttctttt 120

gattggagca ataggaaaat gcaattagag cttttcccta ttgatttacc ctatgcgaat 180

gcaaaagaaa tcgctatagc taaaatgcaa cacctcccca agctagtaag agatacgctc 240

aaatacatgg gatttgatag ggtgagtcaa gaaatcgtgt ttgaatacga gcctaaattg 300

ttaaagccaa gccgcttgac ttatttttat ggctattttc aagatccacg atattttgat 360

gctatatccc ctttaatcaa gcaaactttc accctacccc accccccccc ccccgaaaat 420

ggaaataata aaaaaaaaga ggaagaatac caccgcaaac ttgctttgat tttagccgct 480

caaaacagcg tgtttgtgca tataagaaga ggggattatg tggggattgg ctgtcagctt 540

ggcattgact atcaaaaaaa ggcgcttgag tatatggcaa aacgcgtgcc aaacatggaa 600

cttttcgtgt tttgcgaaga cttagaattc acgcaaaatc ttgatcttgg ctaccctttt 660

atggacatga ccactaggga tagagaagaa gaggcgtatt gggatatgct gctcatgcaa 720

tcctgtcagc atggcattat cgctaatagc acttatagct ggtgggcggc ttatttgata 780

gaaaatccag aaaaaatcat tattggcccc aaacactggc tttttgggca tgagaatatc 840

ctttgtgagg aatgggtgaa aatagaatcc cattttgagg taaaatccca aaagtataac 900

gcttaa 906

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

ggggtaccat gacaaagtat gcattagtcg gt 32

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

gctctagatt acagaatgtg acctaaggtc tg 32

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

gctctagaat gaaaaaatta acctgcttt 29

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

cgggatcctt actcgttcag caacgtc 27

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

cgggatccat gacaaagtat gcattagtcg gt 32

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

ggggtacctt acagaatgtg acctaaggtc tg 32

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

catgccatgg atgtcaaaag tctctcatc 29

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

cccaagcttt atgactccag cgcgatc 27

<210> 15

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

catgccatgg atgagtaaac aacgagtttt tattg 35

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

cccaagcttt acccccgaaa gcggt 25

<210> 17

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

gctctagaat ggcttttaaa agtgtgcaa 29

<210> 18

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

ggggtacctt aagcgttata cttttgggat tt 32

Claims (8)

1.一种利用重组菌株和混酶发酵合成2’-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，以高效表达己糖激酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1磷酸鸟苷转移酶的乳酸乳球菌重组菌为生产菌株，以甘露糖为底物，合成GDP-甘露糖，再利用GDP-甘露糖4,6-脱水酶、GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖3,5-变旋酶/4-还原酶、α1,2-岩藻糖基转移酶在体外对GDP-甘露糖进行催化，从而合成2’-岩藻糖基乳糖。

2.如权利要求1所述的一种利用重组菌株和混酶发酵合成2’-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，乳酸乳球菌以甘露糖为底物合成GDP-甘露糖后，将细胞破碎离心取上清后用于2’-岩藻糖基乳糖的合成。

3.如权利要求1所述的一种利用重组菌株和混酶发酵合成2’-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，所述己糖激酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1磷酸鸟苷转移酶均来自大肠杆菌E.coli K12，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1-3所示。

4.如权利要求1所述的一种利用重组菌株和混酶发酵合成2’-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，所述乳酸乳球菌重组菌的宿主细胞为乳酸乳球菌NZ3900；表达载体为质粒pNZ8149。

5.如权利要求1所述的一种利用重组菌株和混酶发酵合成2’-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，所述GDP-甘露糖4,6-脱水酶、GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖3,5-变旋酶/4-还原酶、α1,2-岩藻糖基转移酶的编码基因分别如SEQ ID NO.4-6所示。

6.如权利要求1所述的一种利用重组菌株和混酶发酵合成2’-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，具体如下：

(1)细胞发酵：以乳酸乳球菌重组菌为生产菌株，对含有甘露糖为底物的发酵培养基进行发酵，合成GDP-甘露糖；

(2)细胞和混酶发酵合成人乳岩藻糖基乳糖：利用GDP-甘露糖4,6-脱水酶、GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖3,5-变旋酶/4-还原酶、α1,2-岩藻糖基转移酶催化步骤(1)中发酵得到的产物GDP-甘露糖和外部添加的乳糖，合成2’-岩藻糖基乳糖；

每mL反应体系中GDP-甘露糖4,6-脱水酶：GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖3,5-变旋酶/4-还原酶：α1,2-岩藻糖基转移酶：GDP-甘露糖：乳糖＝2U：2U：3U：1mg：2mg。

7.如权利要求6所述的一种利用重组菌株和混酶发酵合成2’-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，步骤(1)的发酵条件为：发酵温度30-37℃、摇床转速160-220r/min、发酵时间36-48h。

8.如权利要求6所述的一种利用重组菌株和混酶发酵合成2’-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，步骤(2)进行酶共催化的条件为：催化温度30-40℃、反应时间6-10h。