CN113637064B - 一种索玛鲁肽的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种索玛鲁肽的合成方法，该方法包括：分别合成索玛鲁肽全保护S1‑S3片段、S4‑S6片段，用于合成索玛鲁肽树脂，并经裂解、纯化得到索玛鲁肽。该方法还包括合成索玛鲁肽20位带侧链基团的赖氨酸，该片段有利于完成索玛鲁肽主链的偶联，大大提高了索玛鲁肽粗品的纯度和收率，降低合成成本。在该方法中，制备索玛鲁肽全保护S1‑S3片段、S4‑S6片段，将其作为关键起始物料应用于索玛鲁肽固相合成中，极大降低了D‑His、D‑Glu、D‑Thr、D‑Phe消旋杂质和+Gly杂质的产生，显著降低了粗品纯化的难度，大大提高了索玛鲁肽的纯度和收率，降低了合成成本,有利于工业化大生产。
Description
技术领域
本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种制备索玛鲁肽的方法。
技术背景
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是由人肠道L细胞分泌的一种肽类激素，能够促进胰岛素的分泌、抑制胰高血糖素的分泌，具有降低血糖浓度的功效，被用于II型糖尿病的治疗。然而天然GLP-1在体内不稳定，易被二肽基肽酶-IV(DPP-IV)快速降解。
索玛鲁肽，英文名称为Semaglutide，是由丹麦诺和诺德公司开发生产的一种新型长效胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，用于治疗II型糖尿病。索玛鲁肽具有降血糖、减肥和保护心血管的功效，已于2017年12月获得FDA批准上市。索玛鲁肽的Lys侧链经PEG、Glu和十八碳二羧酸修饰后，亲水性大大提高、与白蛋白的结合力增强；同时N端第2位的Ala突变为Aib后，有效的避免了被DPP-IV酶解而失活，半衰期达到40h，患者每周只需注射一次。索玛鲁肽的CAS号为910463-68-2，分子式为C187H291N45O59，分子量为4113.64g/mol，肽序列为：
H-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-Octadecanedioic)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH。
目前已报道的索玛鲁肽的制备方法大致分为两类：一类是把含有侧链的Lys作为片段直接接入索玛鲁肽主链完成合成，专利CN104356224A公开了一种采用液相法在Lys的ε-NH2上接上侧链，随后在树脂上逐步缩合氨基酸制备索玛鲁肽的方法。另一类是分别逐个完成索玛鲁肽主链和侧链的偶联，专利CN 201511027176公开了在固相逐步合成索玛鲁肽直链肽，合成侧链修饰基团，脱去Lys的保护基，并偶联侧链修饰基团，最终裂解得到该多肽产物。由于索玛鲁肽的序列较长且有较多的疏水氨基酸，采用氨基酸逐步缩合的方法合成时，易形成折叠，导致树脂收缩严重，延长反应时间，进而粗肽中产生较多与产品性质极为接近的杂质，如[D-His]的消旋杂质
H-D-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-Octadecane-dioic)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH；+Gly
杂质
H-His-Aib-Glu-Gly-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-Octadecanedioic)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH；D-Phe
杂质
H-His-Aib-Glu-Gly-Thr-D-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Octadecanedioicacidmono-tert-butyl
ester-γ-Glu-PEG-PEG)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH；[D-His]消旋杂质与索玛鲁肽目标肽的理化性质相近，极大增加了索玛鲁肽产品的分离纯化难度，导致产品收率大大降低。因此，迫切需要一种纯度和收率高，合成成本低的索玛鲁肽的合成方法。
发明内容
为了解决现有合成过程中所存在的杂质多，纯度和收率低，成本昂贵，操作步骤繁琐，不利于工业化生产等问题，本发明提供了一种收率高、纯度高的索玛鲁肽的合成方法。采用三肽加三肽片段的策略减少D-His消旋杂质、+Gly杂质、D-Thr、D-Phe杂质的产生，具有可观的经济适用价值和广泛的应用前景。
为了实现本发明的目的，本发明提供了一种索玛鲁肽的合成方法，分别合成索玛鲁肽全保护S1-S3片段和S4-S6片段，应用于合成索玛鲁肽全保护肽树脂，并经裂解、纯化得到索玛鲁肽。
需要指出的是，在本发明中，S1为索玛鲁肽肽序中N端第一位的氨基酸，同理S2、S3、S4、S5、S6、S18、S19、S20分别为N端第2、3、4、5、6、18、19、20位氨基酸，以此类推。
优选地，全保护S1-S3片段为R1-His(R2)-Aib-Glu(OR3)-OH，全保护S4-S6片段为R4-Gly-Thr(R5)-Phe-OH，其中
R1选自Fmoc、Dde、Alloc、Boc、Trt、Dmb、Mmt、Mtt，
R2选自Fmoc、Dde、Alloc、Boc、Trt、Dmb、Mmt、Mtt，
R3选自tBu、Bzl，
R4选自Fmoc，
R5选自tBu、Bzl。
作为更优选方案，R1选自：Boc或Fmoc，R2选自：Trt或Boc，R3选自tBu，R4选自Fmoc，R5选自tBu。
在一些实施例中R1是Boc，R2是Trt，R3是tBu，R4是Fmoc，R5是tBu，即：S1-S3片段为Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-OH，S4-S6片段为Fmoc-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH。采用全保护S1-S3片段Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-OH能有效减少D-His消旋杂质的产生；采用全保护，S4-S6片段Fmoc-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH能有效减少+Gly杂质、D-Thr、D-Phe杂质的产生，两个片段的使用可明显地提高索玛鲁肽粗肽收率、纯度。
申请人意外地发现，在索玛鲁肽的制备中，20位采用单体Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic)-OH，能够使肽中间体被容易地***SPPS中，能够使氨基端氨基酸更容易与其反应，且能够明显地抑制/减少错配肽杂质(如，氨基酸缺失肽、氨基酸多余肽)、消旋肽杂质产生，明显地提高索玛鲁肽粗肽收率、纯度。
在一些实施方案中，S20为：Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic)-OH，S1-S3片段为：Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-OH，S4-S6片段为：Fmoc-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH。
本发明通过采用片段和逐步合成相结合的固相合成法，制备索玛鲁肽S1-S3片段和S4-S6片段，将其作为关键起始物料应用于索玛鲁肽固相合成中，极大降低了D-His、D-Glu、D-Thr、D-Phe消旋杂质和+Gly杂质的产生，显著降低了粗品纯化的难度，大大提高了索玛鲁肽的纯度和收率，降低了合成成本，有利于工业化大生产。
附图说明
图1为实施例8制备的索玛鲁肽粗肽的HPLC色谱图
图2为实施例11制备的索玛鲁肽精肽的HPLC色谱图
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
本发明中所使用的缩写的含义列于下表中：
实施例1 Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-OH的制备
A.将150g替代度为1.06mmol/g2-CTC树脂加入反应釜中，加入500ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，再加入500ml二氯甲烷，混合40min后，滤除二氯甲烷，最后再加入500ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，该树脂备用。
B.称取135.30gFmoc-Glu(OtBu)-OH于烧杯中，加入500mlDMF和78.83mlDIEA，将溶液于0-10℃下搅拌激活5min后，倒入步骤A所得CTC树脂中，于20-25℃条件下混合反应4h。待反应结束后，滤除DMF。加入25ml甲醇和250mlDMF的混合溶液，50mlDIEA和250mlDMF的混合溶液至树脂中,继续混合反应1h。反应结束后，抽滤，树脂用DMF洗5次，每次500ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次500ml；再用二氯甲烷洗2次，每次500ml；最后用甲醇洗3次，每次500ml，直至树脂充分分散开。
C.将步骤B所得树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。烘干后，得到211.89gFmoc-Glu(OtBu)-CTC树脂，经检测替代度为0.75mmol/g。
D.将步骤C得到的Fmoc-Glu(OtBu)-CTC树脂全部倒入反应釜中，用500mlDCM溶胀混合15min后抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液500ml，于20-30℃条件下混合5min后，抽干。加入DMF500ml，混合5min后，抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液500ml，于20-30℃条件下混合10min后，抽干。加入DMF500ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤5次，每次500ml，每次混合5min，并在第4次洗涤后，用PH试纸检测滤液，结果显示PH在6.5-7.0为合格。
E.依次称取103.39gFmoc-Aib-OH、48.16gDIC和51.57gHOBT于干净的1L烧杯中，加入体积比为1:1的DMF/DCM溶液500ml，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，继续维持温度并搅拌激活5min。将以上激活液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合反应2h。待反应结束后，抽干，加入DMF500ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤5次，每次500ml，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性，即得到Fmoc-Aib-Glu(OtBu)-CTC树脂。
F.按如上步骤D的去保护方法和步骤E的偶联方法，偶联氨基酸Boc-His(Trt)-OH。最后用二氯甲烷洗5次，每次500ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次500ml；再用二氯甲烷洗2次，每次500ml；最后用甲醇洗3次，每次500ml，直至树脂充分分散开。将该树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。得到全保护Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-CTC树脂245.31g。
G.裂解液配比为TFE:DCM＝1:4(体积比)，于15℃条件下，向200mL裂解液中加入步骤F中所得的CTC树脂的全保护肽树脂20g，升温至30℃，继续搅拌反应3小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用100mL的DCM洗涤，重复操作两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积为原始体积的30％，然后将浓缩液缓慢加入到预冷的1L异丁基醚中，沉降后离心5次，每次用异丁基醚200mL，得到白色固体粉末，先用氮气吹干后，再用真空干燥箱干燥10小时，取出称重，即得全保护Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-OH粗品7.65g。
实施例2 Fmoc-His(Boc)-Aib-Glu(OBzl)-OH的制备
A.将100g替代度为1.12mmol/g2-CTC树脂加入反应釜中，加入300ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，再加入300ml二氯甲烷，混合40min后，滤除二氯甲烷，最后再加入300ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，该树脂备用。
B.称取102.93gFmoc-Glu(OBzl)-OH于烧杯中，加入300mlDMF和55.53mlDIEA，将溶液于0-10℃下搅拌激活5min后，倒入步骤A所得CTC树脂中，于20-25℃条件下混合反应4h。待反应结束后，滤除DMF。加入20ml甲醇和150mlDMF的混合溶液，30mlDIEA和150mlDMF的混合溶液至树脂中,继续混合反应1h。反应结束后，抽滤，树脂用DMF洗5次，每次300ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次300ml；再用二氯甲烷洗2次，每次300ml；最后用甲醇洗3次，每次300ml，直至树脂充分分散开。
C.将步骤B所得树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。烘干后，得到146.54gFmoc-Glu(OBzl)-CTC树脂，经检测替代度为0.76mmol/g。
D.将步骤C得到的Fmoc-Glu(OBzl)-CTC树脂全部倒入反应釜中，用300mlDCM溶胀混合15min后抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液500ml，于20-30℃条件下混合5min后，抽干。加入DMF300ml，混合5min后，抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液300ml，于20-30℃条件下混合10min后，抽干。加入DMF300ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤5次，每次300ml，每次混合5min，并在第4次洗涤后，用PH试纸检测滤液，结果显示PH在6.5-7.0为合格。
E.依次称取72.77gFmoc-Aib-OH、33.93gDIC和36.33gHOBT于干净的1L烧杯中，加入体积比为1:1的DMF/DCM溶液300ml，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，继续维持温度并搅拌激活5min。将以上激活液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合反应2h。待反应结束后，抽干，加入DMF300ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤5次，每次300ml，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性，即得到Fmoc-Aib-Glu(OBzl)-CTC树脂。
F.按如上步骤D的去保护方法和步骤E的偶联方法，偶联氨基酸Fmoc-His(Boc)-OH。最后用二氯甲烷洗5次，每次300ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次300ml；再用二氯甲烷洗2次，每次300ml；最后用甲醇洗3次，每次300ml，直至树脂充分分散开。将该树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。得到全保护Fmoc-His(Boc)-Aib-Glu(OBzl)-CTC树脂185.76g。
G.裂解液配比为TFE:DCM＝1:4(体积比)，于15℃条件下，向300mL裂解液中加入步骤F中所得的CTC树脂的全保护肽树脂30g，升温至30℃，继续搅拌反应3小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用150mL的DCM洗涤，重复操作两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积为原始体积的30％，然后将浓缩液缓慢加入到预冷的1L异丁基醚中，沉降后离心5次，每次用异丁基醚200mL，得到白色固体粉末，先用氮气吹干后，再用真空干燥箱干燥10小时，取出称重，即得全保护Fmoc-His(Boc)-Aib-Glu(OBzl)-OH粗品12.95g。
实施例3 Fmoc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-OH的制备
A.将120g替代度为1.06mmol/g2-CTC树脂加入反应釜中，加入400ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，再加入400ml二氯甲烷，混合40min后，滤除二氯甲烷，最后再加入400ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，该树脂备用。
B.称取108.24gFmoc-Glu(OtBu)-OH于烧杯中，加入400mlDMF和63.06mlDIEA，将溶液于0-10℃下搅拌激活5min后，倒入步骤A所得CTC树脂中，于20-25℃条件下混合反应4h。待反应结束后，滤除DMF。加入20ml甲醇和200mlDMF的混合溶液，30mlDIEA和200mlDMF的混合溶液至树脂中,继续混合反应1h。反应结束后，抽滤，树脂用DMF洗5次，每次400ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次400ml；再用二氯甲烷洗2次，每次400ml；最后用甲醇洗3次，每次400ml，直至树脂充分分散开。
C.将步骤B所得树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。烘干后，得到175.21gFmoc-Glu(OtBu)-CTC树脂，经检测替代度为0.73mmol/g。
D.将步骤C得到的Fmoc-Glu(OtBu)-CTC树脂全部倒入反应釜中，用400mlDCM溶胀混合15min后抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液500ml，于20-30℃条件下混合5min后，抽干。加入DMF400ml，混合5min后，抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液400ml，于20-30℃条件下混合10min后，抽干。加入DMF400ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤5次，每次400ml，每次混合5min，并在第4次洗涤后，用PH试纸检测滤液，结果显示PH在6.5-7.0为合格。
E.依次称取82.71gFmoc-Aib-OH、38.53gDIC和41.26gHOBT于干净的1L烧杯中，加入体积比为1:1的DMF/DCM溶液400ml，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，继续维持温度并搅拌激活5min。将以上激活液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合反应2h。待反应结束后，抽干，加入DMF400ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤5次，每次400ml，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性，即得到Fmoc-Aib-Glu(OtBu)-CTC树脂。
F.按如上步骤D的去保护方法和步骤E的偶联方法，偶联氨基酸Fmoc-His(Trt)-OH。最后用二氯甲烷洗5次，每次400ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次400ml；再用二氯甲烷洗2次，每次400ml；最后用甲醇洗3次，每次400ml，直至树脂充分分散开。将该树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。得到全保护Fmoc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-CTC树脂208.64g。
G.裂解液配比为TFE:DCM＝1:4(体积比)，于15℃条件下，向200mL裂解液中加入步骤F中所得的CTC树脂的全保护肽树脂20g，升温至30℃，继续搅拌反应3小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用100mL的DCM洗涤，重复操作两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积为原始体积的30％，然后将浓缩液缓慢加入到预冷的1L异丁基醚中，沉降后离心5次，每次用异丁基醚200mL，得到白色固体粉末，先用氮气吹干后，再用真空干燥箱干燥10小时，取出称重，即得全保护Fmoc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-OH粗品8.25g。
实施例4 Fmoc-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH的制备
A.将150g替代度为1.10mmol/g2-CTC树脂加入反应釜中，加入500ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，再加入500ml二氯甲烷，混合40min后，滤除二氯甲烷，最后再加入500ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，该树脂备用。
B.称取127.85gFmoc-Phe-OH于烧杯中，加入500mlDMF和81.81mlDIEA，将溶液于0-10℃下搅拌激活5min后，倒入步骤A所得CTC树脂中，于20-25℃条件下混合反应4h。待反应结束后，滤除DMF。加入25ml甲醇和250mlDMF的混合溶液，40mlDIEA和250ml DMF的混合溶液至树脂中,继续混合反应1h。反应结束后，抽滤，树脂用DMF洗5次，每次500ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次500ml；再用二氯甲烷洗2次，每次500ml；最后用甲醇洗3次，每次500ml，直至树脂充分分散开。
C.将步骤B所得树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。烘干后，得到205.46gFmoc-Phe-CTC树脂，经检测替代度为0.80mmol/g。
D.将步骤C得到的Fmoc-Phe-CTC树脂全部倒入反应釜中，用500mlDCM溶胀混合15min后抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液500ml，于20-30℃条件下混合5min后，抽干。加入DMF500ml，混合5min后，抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液500ml，于20-30℃条件下混合10min后，抽干。加入DMF500ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤5次，每次500ml，每次混合5min，并在第4次洗涤后，用PH试纸检测滤液，结果显示PH在6.5-7.0为合格。
E.依次称取131.16gFmoc-Thr(tBu)-OH、49.98gDIC和53.51gHOBT于干净的1L烧杯中，加入体积比为1:1的DMF/DCM溶液500ml，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，继续维持温度并搅拌激活5min。将以上激活液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合反应2h。待反应结束后，抽干，加入DMF500ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤5次，每次500ml，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性，即得到Fmoc-Thr(tBu)-Phe-CTC树脂。
F.按如上步骤D的去保护方法和步骤E的偶联方法，偶联氨基酸Fmoc-Gly-OH。最后用二氯甲烷洗5次，每次500ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次500ml；再用二氯甲烷洗2次，每次500ml；最后用甲醇洗3次，每次500ml，直至树脂充分分散开。将该树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。得到全保护Fmoc-Gly-Thr(tBu)-Phe-CTC树脂236.15g。
G.裂解液配比为TFE:DCM＝1:4(体积比)，于15℃条件下，向200mL裂解液中加入步骤F中所得的CTC树脂的全保护肽树脂20g，升温至30℃，继续搅拌反应3小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用100mL的DCM洗涤，重复操作两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积为原始体积的30％，然后将浓缩液缓慢加入到预冷的1L异丁基醚中，沉降后离心5次，每次用异丁基醚200mL，得到白色固体粉末，先用氮气吹干后，再用真空干燥箱干燥10小时，取出称重，即得全保护Fmoc-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH粗品7.39g。
实施例5 Fmoc-Gly-Thr(Bzl)-Phe-OH的制备
A.将100g替代度为1.10mmol/g2-CTC树脂加入反应釜中，加入300ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，再加入300ml二氯甲烷，混合40min后，滤除二氯甲烷，最后再加入300ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，该树脂备用。
B.称取85.23gFmoc-Phe-OH于烧杯中，加入300mlDMF和54.54mlDIEA，将溶液于0-10℃下搅拌激活5min后，倒入步骤A所得CTC树脂中，于20-25℃条件下混合反应4h。待反应结束后，滤除DMF。加入20ml甲醇和150mlDMF的混合溶液，25mlDIEA和150ml DMF的混合溶液至树脂中,继续混合反应1h。反应结束后，抽滤，树脂用DMF洗5次，每次300ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次300ml；再用二氯甲烷洗2次，每次300ml；最后用甲醇洗3次，每次300ml，直至树脂充分分散开。
C.将步骤B所得树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。烘干后，得到136.84gFmoc-Phe-CTC树脂，经检测替代度为0.80mmol/g。
D.将步骤C得到的Fmoc-Phe-CTC树脂全部倒入反应釜中，用300mlDCM溶胀混合15min后抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液300ml，于20-30℃条件下混合5min后，抽干。加入DMF300ml，混合5min后，抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液300ml，于20-30℃条件下混合10min后，抽干。加入DMF300ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤5次，每次300ml，每次混合5min，并在第4次洗涤后，用PH试纸检测滤液，结果显示PH在6.5-7.0为合格。
E.依次称取87.44gFmoc-Thr(Bzl)-OH、33.32gDIC和35.67gHOBT于干净的1L烧杯中，加入体积比为1:1的DMF/DCM溶液300ml，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，继续维持温度并搅拌激活5min。将以上激活液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合反应2h。待反应结束后，抽干，加入DMF300ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤5次，每次300ml，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性，即得到Fmoc-Thr(Bzl)-Phe-CTC树脂。
F.按如上步骤D的去保护方法和步骤E的偶联方法，偶联氨基酸Fmoc-Gly-OH。最后用二氯甲烷洗5次，每次300ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次300ml；再用二氯甲烷洗2次，每次300ml；最后用甲醇洗3次，每次300ml，直至树脂充分分散开。将该树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。得到全保护Fmoc-Gly-Thr(Bzl)-Phe-CTC树脂160.86g。
G.裂解液配比为TFE:DCM＝1:4(体积比)，于15℃条件下，向200mL裂解液中加入步骤F中所得的CTC树脂的全保护肽树脂20g，升温至30℃，继续搅拌反应3小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用100mL的DCM洗涤，重复操作两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积为原始体积的30％，然后将浓缩液缓慢加入到预冷的1L异丁基醚中，沉降后离心5次，每次用异丁基醚200mL，得到白色固体粉末，先用氮气吹干后，再用真空干燥箱干燥10小时，取出称重，即得全保护Fmoc-Gly-Thr(Bzl)-Phe-OH粗品7.84g。
实施例6 Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic)-OH的制备
A.将150g替代度为1.05mmol/g2-CTC树脂加入反应釜中，加入500ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，再加入500ml二氯甲烷，混合40min后，滤除二氯甲烷，最后再加入500ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，该树脂备用。
B.称取121.44gFmoc-AEEA-OH于烧杯中，加入500mlDMF和76.18mlDIEA，将溶液于0-10℃下搅拌激活5min后，倒入步骤A所得CTC树脂中，于20-25℃条件下混合反应4h。待反应结束后，滤除DMF。加入25ml甲醇和250mlDMF的混合溶液，40mlDIEA和250mlDMF的混合溶液至树脂中,继续混合反应1h。反应结束后，抽滤，树脂用DMF洗5次，每次500ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次500ml；再用二氯甲烷洗2次，每次500ml；最后用甲醇洗3次，每次500ml，直至树脂充分分散开。
C.将步骤B所得树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。烘干后，得到140.20mmolFmoc-AEEA-CTC树脂，经检测替代度为0.73mmol/g。
D.将步骤C得到的Fmoc-AEEA-CTC树脂全部倒入反应釜中，用500mlDCM溶胀混合15min后抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液500ml，于20-30℃条件下混合5min后，抽干。加入DMF500ml，混合5min后，抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液500ml，于20-30℃条件下混合10min后，抽干。加入DMF500ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤5次，每次500ml，每次混合5min，并在第4次洗涤后，用PH试纸检测滤液，结果显示PH在6.5-7.0为合格。
E.依次称取108.07gFmoc-AEEA-OH、35.42gDIC和39.59gHOBT于干净的1L烧杯中，加入体积比为1:1的DMF/DCM溶液500ml，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，继续维持温度并搅拌激活5min。将以上激活液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合反应2h。待反应结束后，抽干，加入DMF500ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤5次，每次500ml，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性，即得到Fmoc-AEEA-AEEA-CTC树脂。
F.按如上步骤D的去保护方法和步骤E的偶联方法，依先后顺序，依次分别偶联氨基酸Fmoc-Glu(OH)-OtBu和十八烷二酸单叔丁酯。最后用二氯甲烷洗5次，每次500ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次500ml；再用二氯甲烷洗2次，每次500ml；最后用醇3次，每次500ml，直至树脂充分分散开。将该树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。得到Octadecanedioic-γ-Glu(OtBu)-AEEA-AEEA-CTC树脂255.40g。
G.裂解液配比为TFE:DCM＝1:4(体积比)，于15℃条件下，向300mL裂解液中加入步骤F中所得的CTC树脂的全保护肽树脂30g，升温至30℃，继续搅拌反应3小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用100mL的DCM洗涤，重复操作两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积为原始体积的30％，然后将浓缩液缓慢加入到预冷的2L异丁基醚中，沉降后离心5次，每次用异丁基醚300mL，得到白色固体粉末，先用氮气吹干后，再用真空干燥箱干燥10小时，取出称重，即得Octadecanedioic-γ-Glu(OtBu)-AEEA-AEEA-OH粗品11.65g。
H.将步骤G得到的Octadecanedioic-γ-Glu(OtBu)-AEEA-AEEA-OH粗品5g，溶解于10mLDCM中，加入2.2g五氟苯酚。称取2.4gDCC，溶于10mLDCM中，将DCC溶液缓慢滴加到反应溶液中，搅拌反应1.0h，TLC检测反应完全后，过滤。滤液用饱和食盐水洗涤一次，用水洗涤一次，再用无水硫酸钠干燥DCM溶液，浓缩至干燥，溶于适量的乙腈中。称取6.08gFmoc-Lys-OH.HCl溶解于乙腈/水(乙腈/水＝1/2)中，加入7.5mLDIEA，搅拌15分钟。将以上的反应溶液缓慢滴加到Fmoc-Lys-OH溶液中，搅拌反应1.5h。加入稀盐酸调pH值约为6，加入少量DCM萃取。经纯化得到Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic)-OH2.85g。
实施例7替代度为0.30mmol/g的Fmoc-Gly-Wang树脂的制备
A.将10g替代度为0.90mmol/g的Wang树脂加入反应釜中，加入100ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，再加入100ml二氯甲烷，混合40min后，滤除二氯甲烷，最后再加入100ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，该树脂备用。
B.称取5.35g的Fmoc-Gly-OH和2.92g的HOBT于烧杯中，加入100mlDMF和4.46ml的DIEA，将溶液于0-10℃下搅拌激活5min后，倒入步骤A所得Wang树脂中，加入0.16g的DMAP，于20-25℃条件下混合4h。待反应结束后，加入醋酸酐8.5ml，继续混合1h。反应结束后，抽滤，树脂用DMF洗5次，每次100ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次100ml；再用二氯甲烷洗2次，每次100ml；最后用甲醇洗3次，每次100ml，直至树脂充分分散开。
C.将步骤B所得树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。烘干后，得到12.87g的Fmoc-Gly-Wang树脂，经紫外检测替代度为0.30mmol/g。
实施例8索玛鲁肽粗肽的制备1
A.将实施例7中得到的10gFmoc-Gly-Wang树脂倒入反应釜中，用100mlDCM溶胀混合15min后抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液100ml，于20-30℃条件下混合5min后，抽干。加入DMF100ml，混合5min后，抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液100ml，于20-30℃条件下混合10min后，抽干。加入DMF100ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤8次，每次100ml，每次混合5min，并在第七次洗涤后，用PH试纸检测滤液，结果显示PH在6.5-7.0为合格。
B.依次称取3.89g的Fmoc-Arg(Pbf)-OH、2.31gTBTU和0.97gHOBT于干净的1L烧杯中，加入体积比为1:1的DMF/DCM溶液100ml，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，加入1.49mLDIEA，继续维持温度并搅拌激活5min。将以上激活液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合2h。待反应结束后，抽干，加入DMF100ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤6次，每次100ml，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性，即得到Fmoc-Arg-Gly-Wang树脂。
C.按如上步骤A的去保护方法和步骤B的偶联方法，依主链氨基酸先后顺序，依次分别偶联剩余氨基酸或肽片段，即：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、实施例7所得的Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、实施例4所得的Fmoc-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH和实施例1所得的Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-OH的偶联。偶联完成后，用二氯甲烷洗5次，每次100ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次100ml；再用二氯甲烷洗2次，每次100ml；最后用醇洗3次，每次100ml，直至树脂充分分散开。将该树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。得到索玛鲁肽肽树脂26.15g。HPLC色谱图如图1所示。
实施例9索玛鲁肽粗肽的制备2
A.将10g替代度为0.30mmol/g的Fmoc-Gly-Wang树脂倒入反应釜中，用100mlDCM溶胀混合15min后抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液100ml，于20-30℃条件下混合5min后，抽干。加入DMF100ml，混合5min后，抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液100ml，于20-30℃条件下混合10min后，抽干。加入DMF100ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤8次，每次100ml，每次混合5min，并在第七次洗涤后，用PH试纸检测滤液，结果显示PH在6.5-7.0为合格。
B.依次称取3.89g的Fmoc-Arg(Pbf)-OH、2.31gTBTU和0.97gHOBT于干净的1L烧杯中，加入体积比为1:1的DMF/DCM溶液100ml，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，加入1.49mLDIEA，继续维持温度并搅拌激活5min。将以上激活液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合2h。待反应结束后，抽干，加入DMF100ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤6次，每次100ml，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性，即得到Fmoc-Arg-Gly-Wang树脂。
C.按如上步骤A的去保护方法和步骤B的偶联方法，依主链氨基酸先后顺序，依次分别偶联剩余氨基酸或肽片段，即：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、实施例7所得的Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、实施例5所得的Fmoc-Gly-Thr(Bzl)-Phe-OH和实施例2所得的Fmoc-His(Boc)-Aib-Glu(OBzl)-OH的偶联。偶联完成后，用二氯甲烷洗5次，每次100ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次100ml；再用二氯甲烷洗2次，每次100ml；最后用醇洗3次，每次100ml，直至树脂充分分散开。将该树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。得到索玛鲁肽肽树脂27.08g。HPLC色谱图与图1相似。
实施例10索玛鲁肽粗肽的制备3
A.将实施例7中得到的10gFmoc-Gly-Wang树脂倒入反应釜中，用100mlDCM溶胀混合15min后抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液100ml，于20-30℃条件下混合5min后，抽干。加入DMF100ml，混合5min后，抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液100ml，于20-30℃条件下混合10min后，抽干。加入DMF100ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤8次，每次100ml，每次混合5min，并在第七次洗涤后，用PH试纸检测滤液，结果显示PH在6.5-7.0为合格。
B.依次称取3.89g的Fmoc-Arg(Pbf)-OH、2.31gTBTU和0.97gHOBT于干净的1L烧杯中，加入体积比为1:1的DMF/DCM溶液100ml，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，加入1.49mLDIEA，继续维持温度并搅拌激活5min。将以上激活液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合2h。待反应结束后，抽干，加入DMF100ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤6次，每次100ml，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性，即得到Fmoc-Arg-Gly-Wang树脂。
C.按如上步骤A的去保护方法和步骤B的偶联方法，依主链氨基酸先后顺序，依次分别偶联剩余氨基酸或肽片段，即：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、实施例7所得的Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、实施例4所得的Fmoc-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH和实施例3所得的Fmoc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-OH的偶联。偶联完成后，用二氯甲烷洗5次，每次100ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次100ml；再用二氯甲烷洗2次，每次100ml；最后用醇洗3次，每次100ml，直至树脂充分分散开。将该树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。得到索玛鲁肽肽树脂26.91g。HPLC色谱图与图1相似。
实施例11索玛鲁肽精肽的制备
将实施例8获得的索玛鲁肽粗品溶于稀氨水，再用磷酸调节索玛鲁肽粗品溶液的pH为8.0～8.5，过滤得到索玛鲁肽粗肽溶液。以八烷基键合硅胶为固定相、以氯化铵和乙腈为流动相对索玛鲁肽粗肽溶液进行HPLC线性梯度洗脱，收集索玛鲁肽馏分，用旋转蒸发仪旋蒸去除部分乙腈，获得索玛鲁肽的一次纯化溶液。索玛鲁肽的一次纯化溶液以八烷基键合硅胶为固定相、用磷酸调节pH的磷酸二氢钾水溶液，乙腈与异丙醇混合溶剂为流动相进行HPLC线性洗脱，收集索玛鲁肽馏分，用旋转蒸发仪旋蒸去除部分乙腈，获得索玛鲁肽的二次纯化溶液。索玛鲁肽的二次纯化液以八烷基键合硅胶为固定相、用碳酸氢铵水溶液和乙腈为流动相进行HPLC线性洗脱，收集索玛鲁肽馏分，用旋转蒸发仪旋蒸去除乙腈和大部分水，冷冻干燥，获得索玛鲁肽精肽4.86g,HPLC纯度为99.75％，HPLC色谱图如图2所示,纯化收率为68.24％。
Claims (4)
1.一种索玛鲁肽的固相合成方法，其特征在于：分别合成R1-His(R2)-Aib-Glu(OR3)-OH片段、R4-Gly-Thr(R5)-Phe-OH片段，用于合成索玛鲁肽树脂，经裂解、纯化得到索玛鲁肽，其中
R1选自Fmoc、Dde、Alloc、Boc、Trt、Dmb、Mmt、Mtt，
R2选自Fmoc、Dde、Alloc、Boc、Trt、Dmb、Mmt、Mtt，
R3选自tBu、Bzl，
R4选自Fmoc，
R5选自tBu、Bzl。
2.根据权利要求1所述的索玛鲁肽固相合成方法，其特征在于：所述R1选自：Boc或Fmoc，R2选自：Trt或Boc，R3选自tBu，R4选自Fmoc，R5选自tBu。
3.根据权利要求2所述的索玛鲁肽固相合成方法，其特征在于：所述R1是Boc，R2是Trt，R3是tBu，R4是Fmoc，R5是tBu。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，索玛鲁肽的固相合成中，S20为：Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic)-OH。
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