CN109295027B

CN109295027B - 一种糖基转移酶突变体

Info

Publication number: CN109295027B
Application number: CN201811311058.2A
Authority: CN
Inventors: 范文超; 高书良; 王金刚; 梁岩; 袁圣伦; 任亮
Original assignee: Zhejiang Huarui Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Huarui Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-11-06
Filing date: 2018-11-06
Publication date: 2020-12-29
Anticipated expiration: 2038-11-06
Also published as: CN109295027A

Abstract

本发明通过定向进化的方法获得了酶活力提高的糖基转移酶突变体SEQ ID NOs:3‑6，这些突变体或者其表达微生物能高效催化原人参二醇通过糖基转移反应来制备人参皂苷CK，具有工业化开发和应用前景。

Description

一种糖基转移酶突变体

技术领域

本发明属于生物催化领域，具体地说，涉及一种糖基转移酶突变体及其在合成人参皂苷CK中的用途。

背景技术

人参皂苷是从人参及其同属植物(如三七、西洋参等)中分离到的皂苷的总称，属于三萜类皂苷，是人参中的主要有效成份。目前，已经从人参中分离出了至少60种皂苷，其中一些人参皂苷被证实具有广泛的生理功能和药用价值：包括抗肿瘤、免疫调节、抗疲劳、护心、护肝等功能。根据苷元配基的形式，人参皂苷通常被分为三类，齐墩果烷型，原人参二醇型(PPD型)和原人参三醇型(PPT型)。其中，如下式I所示的人参皂苷compound K(CK)是PPD型人参皂苷最具生物和药学活性的成分。人参皂苷CK具有很好的抗肿瘤活性，可以诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞转移。它与放疗和化疗结合试验，可以增强放疗和化疗的效果。除此之外，人参皂苷CK还有具有抗过敏活性，抗炎活性，并且可以起到神经保护作用，抗糖尿病作用和抗皮肤衰老作用。人参皂苷CK的药理活性具有多靶点、高活性和低毒性的特点。

一直以来人参皂苷类化合物主要来源是通过植物人参中直接提取，由于人参生长周期长、生长环境要求苛刻，无法满足社会需求。目前已可通过酶催化或微生物工程菌发酵合成人参皂苷化合物，但产量较低，有待更多的优化工作提高发酵产量。人参皂苷CK在人参中含量极低，它是原人参二醇型皂苷(PPD型)在人体肠道中被微生物水解后产生的主要代谢产物。研究表明，多数原人参二醇型皂苷只有被代谢为CK后才能被人体吸收，所以人参皂苷CK是直接被体内吸收和发挥作用的真正实体，而其他皂苷只是药物前体。

原人参二醇(PPD)在UDP糖基转移酶(尿苷5’-二磷酸葡萄糖基转移酶，UGT)的作用下可生成CK。因此开发特异性高、酶活力高的糖基转移酶成为一种生产人参皂苷CK的有效途径。

发明内容

为了开发催化效率高的UDP糖基转移酶(UGT)，本发明以人参Panax ginseng来源的尿苷5’-二磷酸(UDP)糖基转移酶UGT1(GenBank:AIE12479.1，即SEQ ID NO:1)为基础，通过易错PCR的方法建立糖基转移酶基因突变库，再通过筛选基因突变库获得酶活力明显提高的糖基转移酶突变体。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种糖基转移酶，其氨基酸序列为：

SEQ ID NO:3，其为SEQ ID NO:1第82位的H替换为A、第175位的S替换为A的突变体，即：

MKSELIFLPAPAIGHLVGMVEMAKLFISRHENLSVTVLIAKFYMDTGVDNYNKSLLTNPTPRLTIVNLPETDPQNYMLKPRAAIFPSVIETQKTHVRDIISGMTQSESTQVVGLLADLLFINIMDIANEFNVPTYVYSPAGAGHLGLAFHLQTLNDKKQDVTEFRNSDTELLVPAFANPVPAEVLPSMYVDKEGGYDYLFSLFRRCRESKAIIINTFEELEPYAINSLRMDSMIPPIYPVGPILNLNGDGQNSDEAAVILGWLDDQPPSSVVFLCFGSYGSFQENQVKEIAMGLERSGHRFLWSLRPSIPKGETKLQLKYSNLKEILPVGFLDRTSCVGKVIGWAPQVAVLGHESVGGFLSHCGWNSTLESVWCGVPVATWPMYGEQQLNAFEMVKELGIAVEIEVDYKKDYFNMKNDFIVRAEEIETKIKKLMMDENNSEIRKKVKEMKEKSRAAMSENGSSYNSLAKLFEEIM(SEQ ID NO:3)；

SEQ ID NO:4，其为SEQ ID NO:1第82位的H替换为A、第88位的V替换为A、第122位的N替换为K、第129位的E替换为T的突变体，即：

MKSELIFLPAPAIGHLVGMVEMAKLFISRHENLSVTVLIAKFYMDTGVDNYNKSLLTNPTPRLTIVNLPETDPQNYMLKPRAAIFPSAIETQKTHVRDIISGMTQSESTQVVGLLADLLFIKIMDIANTFNVPTYVYSPAGAGHLGLAFHLQTLNDKKQDVTEFRNSDTELLVPSFANPVPAEVLPSMYVDKEGGYDYLFSLFRRCRESKAIIINTFEELEPYAINSLRMDSMIPPIYPVGPILNLNGDGQNSDEAAVILGWLDDQPPSSVVFLCFGSYGSFQENQVKEIAMGLERSGHRFLWSLRPSIPKGETKLQLKYSNLKEILPVGFLDRTSCVGKVIGWAPQVAVLGHESVGGFLSHCGWNSTLESVWCGVPVATWPMYGEQQLNAFEMVKELGIAVEIEVDYKKDYFNMKNDFIVRAEEIETKIKKLMMDENNSEIRKKVKEMKEKSRAAMSENGSSYNSLAKLFEEIM(SEQ ID NO:4)；

SEQ ID NO:5，其为SEQ ID NO:1第82位的H替换为A、第88位的V替换为A、第122位的N替换为K、第129位的E替换为T、第315位的K替换为D的突变体，即：

MKSELIFLPAPAIGHLVGMVEMAKLFISRHENLSVTVLIAKFYMDTGVDNYNKSLLTNPTPRLTIVNLPETDPQNYMLKPRAAIFPSAIETQKTHVRDIISGMTQSESTQVVGLLADLLFIKIMDIANTFNVPTYVYSPAGAGHLGLAFHLQTLNDKKQDVTEFRNSDTELLVPSFANPVPAEVLPSMYVDKEGGYDYLFSLFRRCRESKAIIINTFEELEPYAINSLRMDSMIPPIYPVGPILNLNGDGQNSDEAAVILGWLDDQPPSSVVFLCFGSYGSFQENQVKEIAMGLERSGHRFLWSLRPSIPKGETDLQLKYSNLKEILPVGFLDRTSCVGKVIGWAPQVAVLGHESVGGFLSHCGWNSTLESVWCGVPVATWPMYGEQQLNAFEMVKELGIAVEIEVDYKKDYFNMKNDFIVRAEEIETKIKKLMMDENNSEIRKKVKEMKEKSRAAMSENGSSYNSLAKLFEEIM(SEQ ID NO:5)；或者

SEQ ID NO:6，其为SEQ ID NO:1第82位的H替换为A、第88位的V替换为A、第122位的N替换为K、第129位的E替换为T、第175位的S替换为A的突变体，即：

MKSELIFLPAPAIGHLVGMVEMAKLFISRHENLSVTVLIAKFYMDTGVDNYNKSLLTNPTPRLTIVNLPETDPQNYMLKPRAAIFPSAIETQKTHVRDIISGMTQSESTQVVGLLADLLFIKIMDIANTFNVPTYVYSPAGAGHLGLAFHLQTLNDKKQDVTEFRNSDTELLVPAFANPVPAEVLPSMYVDKEGGYDYLFSLFRRCRESKAIIINTFEELEPYAINSLRMDSMIPPIYPVGPILNLNGDGQNSDEAAVILGWLDDQPPSSVVFLCFGSYGSFQENQVKEIAMGLERSGHRFLWSLRPSIPKGETKLQLKYSNLKEILPVGFLDRTSCVGKVIGWAPQVAVLGHESVGGFLSHCGWNSTLESVWCGVPVATWPMYGEQQLNAFEMVKELGIAVEIEVDYKKDYFNMKNDFIVRAEEIETKIKKLMMDENNSEIRKKVKEMKEKSRAAMSENGSSYNSLAKLFEEIM(SEQ ID NO:6)。

优选上述糖基转移酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:6。

本发明的第二个目的在于提供编码上述糖基转移酶的基因。

优选地，编码上述糖基转移酶SEQ ID NO:6的基因具有下述碱基序列：

ATGAAAAGCGAGCTCATCTTTCTGCCAGCGCCAGCGATTGGCCATCTGGTGGGCATGGTGGAAATGGCCAAGCTGTTCATTAGCCGTCACGAGAACCTCAGTGTGACGGTGCTGATCGCCAAGTTTTACATGGACACGGGCGTGGACAACTATAACAAGAGTCTGCTGACCAATCCGACCCCGCGCCTCACGATTGTGAACCTCCCGGAAACCGACCCGCAGAATTACATGCTGAAGCCACGCGCCGCGATTTTCCCGAGCGCGATTGAAACGCAAAAGACCCACGTGCGCGACATCATCAGCGGCATGACCCAGAGCGAAAGCACCCAAGTGGTTGGTCTGCTGGCGGATCTGCTGTTCATCAAGATCATGGATATCGCCAACACGTTCAACGTGCCAACGTATGTGTACAGTCCAGCGGGTGCCGGTCATCTGGGTCTGGCCTTCCATCTGCAAACCCTCAACGACAAGAAGCAAGATGTGACCGAGTTCCGCAATAGCGATACGGAACTGCTCGTGCCAGCCTTCGCGAATCCAGTTCCAGCGGAGGTTCTGCCAAGCATGTACGTGGACAAAGAGGGCGGCTATGACTATCTGTTTAGTCTGTTCCGCCGCTGTCGCGAAAGCAAGGCCATCATCATCAACACCTTTGAAGAACTCGAGCCGTACGCGATTAACAGTCTGCGCATGGACAGCATGATTCCGCCGATCTATCCAGTTGGTCCGATCCTCAATCTGAACGGCGATGGCCAAAACAGTGATGAAGCCGCGGTGATCCTCGGCTGGCTGGATGATCAACCGCCAAGCAGCGTTGTGTTCCTCTGCTTCGGCAGCTATGGCAGCTTTCAAGAAAACCAAGTTAAAGAGATCGCGATGGGTCTGGAACGTAGCGGCCATCGCTTTCTCTGGAGTCTGCGTCCGAGCATCCCAAAGGGCGAAACGAAGCTGCAACTGAAGTACAGCAATCTGAAGGAAATCCTCCCAGTGGGTTTTCTGGATCGCACCAGCTGCGTTGGCAAAGTGATTGGTTGGGCCCCACAAGTTGCGGTTCTGGGTCACGAAAGCGTTGGTGGCTTTCTGAGCCATTGTGGCTGGAACAGTACGCTGGAAAGCGTGTGGTGCGGCGTTCCAGTTGCCACGTGGCCAATGTATGGCGAACAGCAGCTGAACGCCTTCGAGATGGTTAAGGAACTGGGCATCGCCGTGGAGATCGAAGTTGACTACAAGAAAGATTACTTTAACATGAAGAATGACTTCATCGTGCGCGCCGAGGAGATCGAGACCAAAATCAAAAAACTGATGATGGATGAAAATAATAGCGAAATCCGCAAGAAAGTGAAAGAGATGAAGGAAAAAAGCCGTGCGGCGATGAGCGAGAATGGCAGCAGCTACAATAGTCTGGCCAAGCTCTTCGAGGAAATCATGTAA(SEQ IDNO:7)。

本发明的第三个目的在于提供包含上述基因的质粒。

本发明的第四个目的在于提供转化了上述质粒的微生物。

优选地，上述微生物选自大肠杆菌、酵母、枯草杆菌。更优选大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明的第五个目的在于提供上述糖基转移酶在生产人参皂苷CK中的用途。

在一种实施方式中，上述用途是以原人参二醇为底物原料，在糖基转移酶催化下通过糖基转移反应来合成人参皂苷CK。

优选地，上述的酶催化反应在pH8.0，温度35℃进行。

本发明构建的突变体SEQ ID NOs:4-6明显提高了糖基转移反应催化活力，可高效率地催化底物原人参二醇生成人参皂苷CK，该酶催化反应条件温和，具备工业化开发和应用前景。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

本文的实施例中，如果对于反应温度或操作温度没有做出具体说明，则该温度通常指室温(15-30℃)。

为简要起见，本文中的氨基酸缩写既可以使用英文三字母、也可以采用英文单字母，这是本领域技术人员熟知的，这些缩写列于下表中：

表1氨基酸中英文对照及缩写

丙氨酸	Alanine	A或Ala	脂肪族类
				精氨酸	Arginine	R或Arg	碱性氨基酸类
天冬酰胺	Asparagine	N或Asn	酰胺类
				天冬氨酸	Aspartic acid	D或Asp	酸性氨基酸类
半胱氨酸	Cysteine	C或Cys	含硫类
				谷氨酰胺	Glutamine	Q或Gln	酰胺类
谷氨酸	Glutamic acid	E或Glu	酸性氨基酸类
				甘氨酸	Glycine	G或Gly	脂肪族类
组氨酸	Histidine	H或His	碱性氨基酸类
				异亮氨酸	Isoleucine	I或Ile	脂肪族类
亮氨酸	Leucine	L或Leu	脂肪族类
				赖氨酸	Lysine	K或Lys	碱性氨基酸类
蛋氨酸	Methionine	M或Met	含硫类
				苯丙氨酸	Phenylalanine	F或Phe	芳香族类
脯氨酸	Proline	P或Pro	亚氨基酸
				丝氨酸	Serine	S或Ser	羟基类
苏氨酸	Threonine	T或Thr	羟基类
				色氨酸	Tryptophan	W或Trp	芳香族类
酪氨酸	Tyrosine	Y或Tyr	芳香族类
				缬氨酸	Valine	V或Val	脂肪族类

作为构建糖基转移酶突变体的基础模板，来源于人参Panax ginseng的野生型尿苷5’-二磷酸(UDP)糖基转移酶UGT1(GenBank:AIE12479.1)的氨基酸序列为SEQ ID NO:1：

MKSELIFLPAPAIGHLVGMVEMAKLFISRHENLSVTVLIAKFYMDTGVDNYNKSLLTNPTPRLTIVNLPETDPQNYMLKPRHAIFPSVIETQKTHVRDIISGMTQSESTQVVGLLADLLFINIMDIANEFNVPTYVYSPAGAGHLGLAFHLQTLNDKKQDVTEFRNSDTELLVPSFANPVPAEVLPSMYVDKEGGYDYLFSLFRRCRESKAIIINTFEELEPYAINSLRMDSMIPPIYPVGPILNLNGDGQNSDEAAVILGWLDDQPPSSVVFLCFGSYGSFQENQVKEIAMGLERSGHRFLWSLRPSIPKGETKLQLKYSNLKEILPVGFLDRTSCVGKVIGWAPQVAVLGHESVGGFLSHCGWNSTLESVWCGVPVATWPMYGEQQLNAFEMVKELGIAVEIEVDYKKDYFNMKNDFIVRAEEIETKIKKLMMDENNSEIRKKVKEMKEKSRAAMSENGSSYNSLAKLFEEIM(SEQ ID NO:1)。

在以大肠杆菌为宿主表达该野生型糖基转移酶SEQ ID NO:1时，进行了密码子优化，编码基因序列为SEQ ID NO:2：

ATGAAATCTGAATTAATCTTTTTACCAGCACCAGCTATTGGTCACTTGGTCGGTATGGTCGAGATGGCTAAGTTGTTTATTTCAAGACATGAAAATTTGTCAGTCACTGTTTTGATTGCAAAATTCTATATGGACACTGGTGTTGATAACTATAATAAGTCTTTATTAACAAATCCAACTCCAAGATTAACTATTGTTAATTTGCCAGAAACTGACCCACAAAACTACATGTTGAAACCAAGACATGCTATTTTTCCATCTGTTATTGAAACTCAGAAAACTCATGTTAGAGATATTATTTCTGGTATGACACAATCTGAGTCTACACAAGTTGTCGGTTTGTTGGCAGACTTGTTATTTATAAATATTATGGATATTGCTAATGAGTTTAACGTTCCTACTTACGTTTACTCACCAGCTGGTGCTGGTCATTTGGGTTTGGCTTTCCACTTGCAAACTTTAAATGATAAAAAACAAGATGTTACAGAATTTAGAAACTCTGATACTGAATTATTGGTTCCATCTTTCGCAAACCCCGTTCCCGCTGAGGTTTTGCCATCTATGTACGTTGATAAGGAGGGTGGTTACGATTACTTATTTTCTTTGTTCAGAAGATGTAGAGAATCTAAGGCAATTATTATTAATACTTTTGAGGAATTAGAGCCATACGCAATTAATTCTTTAAGAATGGACTCTATGATTCCACCAATTTATCCAGTCGGTCCTATATTGAACTTGAACGGTGACGGTCAAAACTCTGACGAGGCTGCTGTCATTTTGGGTTGGTTGGACGACCAACCACCTTCTTCTGTCGTCTTTTTATGTTTTGGTTCTTACGGTTCATTCCAAGAAAATCAAGTTAAAGAGATTGCAATGGGTTTGGAGCGTTCTGGTCATAGGTTCTTGTGGTCTTTAAGACCATCTATTCCTAAGGGTGAGACTAAATTGCAATTAAAATACTCTAACTTAAAAGAAATTTTGCCAGTTGGTTTTTTGGATAGAACTTCATGCGTTGGTAAAGTCATTGGTTGGGCTCCACAAGTTGCTGTCTTGGGTCATGAATCTGTTGGTGGTTTTTTGTCACACTGTGGTTGGAACTCTACTTTGGAATCAGTCTGGTGCGGTGTTCCAGTTGCTACTTGGCCAATGTACGGTGAACAGCAATTGAATGCTTTTGAAATGGTTAAAGAATTAGGTATTGCTGTTGAAATAGAGGTTGATTACAAAAAAGATTATTTTAATATGAAAAATGATTTTATTGTCAGAGCTGAAGAAATTGAAACAAAGATTAAGAAATTAATGATGGATGAGAATAATTCTGAGATTAGAAAAAAGGTTAAAGAAATGAAGGAAAAATCCCGTGCTGCTATGTCTGAAAACGGTTCTTCTTATAACTCTTTGGCTAAATTATTCGAAGAAATTATGTAG(SEQ IDNO:2)。

为了获得酶活性更高的糖基转移酶突变体，本发明对糖基转移酶的基因序列SEQID NO:2进行点突变。通过易错PCR技术获得一个或多个氨基酸位点取代的突变体氨基酸序列，筛选出几个可提高酶活力的位点，然后以定点组合突变的方式，获得3株酶活力明显提高的突变体。

在本文中，“糖基转移酶”具体是指“尿苷5’-二磷酸(UDP)糖基转移酶”，亦可称为“UDP-糖基转移酶”或者简写为“UGT”。

在本文中，术语“野生(型)”、“野生酶”、“野生型酶”和“WT”表示相同的意义，都是指未经基因工程改造的糖基转移酶UGT1(SEQ ID NO:1)。

在本文中，术语“原人参二醇型皂苷”有时简称为“原人参二醇”或者“PPD”。

本发明筛选出的4个糖基转移酶突变体SEQ ID NOs:3-6具有共同的特点，即相对于SEQ ID NO:1，都有一个位点的正向突变H82A，预示着至少第82位氨基酸的定点突变可能会引起酶活性的变化；SEQ ID NOs:4-6具有共同的特点，即相对于SEQ ID NO:1，都有四个位点的正向突变H82A、V88A、N122K和E129T。

本发明的糖基转移酶突变体(SEQ ID NOs:3-6)由于氨基酸序列明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。

上述转化体宿主可以是任何适合表达糖基转移酶突变体的微生物，括细菌和真菌。优选微生物是大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、或者枯草杆菌，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。

当作为生物催化剂用于生产人参皂苷CK时，本发明的糖基转移酶可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等；所述菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体。

本发明的糖基转移酶的分离纯化、包括固定化酶制备技术也是本领域技术人员所熟知的。

实施例

材料和方法

本文中的全基因合成由苏州金唯智生物科技有限公司完成；表达载体由浙江华睿生物技术有限公司亚克隆制备。引物合成及测序皆由生工生物工程上海股份有限公司完成。

本文中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。

1.PPD和CK含量的高效液相色谱(HPLC)测定

Shimadzu LC-20A液相色谱仪，Shodex C18-120-5 4E column(5μm,4.6mm×250mm)色谱柱，柱温35℃，流动相A水，流动相B乙腈，梯度洗脱：0min(35％B),55min(90％B),50-55min(90％B)and 55-65min(35％B)。流速：0.8ml/min，波长203nm。

PPD购自武汉ChemFaces生物技术有限公司。CK标准品购自Sigma-Aldrich公司。

2.UDP糖基转移酶(UGT)酶活力测定

在100μL反应体系(可按比例放大)中进行UGT酶活力测定。100μL反应体系包括：100mM磷酸缓冲液(pH8.0)，1％Tween-20，5mM UDP-葡萄糖(UDP-glucose)，5mM底物PPD，35℃反应过夜。加入等体积的正丁醇终止反应，并进行混匀抽提1h。12000rpm离心10min，吸取上层有机相，真空蒸干，产物溶解于甲醇溶液中，用高效液相色谱对底物和产物CK进行定量分析。

酶活定义：在pH8.0、温度35℃条件下，每分钟催化PPD产生1微摩尔(μmol)人参皂苷CK所需要的酶量定义为1个单位(U)。

3.糖基转移酶突变体的高通量筛选反应：

参照文献(Gantt,RW；Peltier-Pain,P；Cournoyer,WJ；Thorson,JS.Using simpledonors to drive the equilibria of glycosyltransferase-catalyzedreactions.Nature Chemical Biology.2011,7(10):685–691.)的方法，在100μl的20mMTris-HCl缓冲液(pH 8.0)中包含0.25mM的底物PPD、0.5mM的2-氯-4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(2-chloro-4-nitrophenylβ-D-glucopyranoside)、1mM的UDP-葡萄糖(UDP-glucose)、1％(v/v)吐温80、11μM OleD突变体TDP-16(包含突变P67T S132F A242LQ268V)、50μl糖基转移酶溶液。微孔板30℃孵育，反应过程在410nm条件下，监测20min。

4.培养基

发酵培养基：蛋白胨20g/L，酵母浸粉5g/L，甘油4.0mL/L，反丁烯二酸(富马酸)2g/L，磷酸二氢钾1g/L，NH₄NO₃ 8g/L，氨水调节pH至7.5，121℃灭菌20min。

LB培养基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠，pH7.2，121℃高温灭菌20min。(固体培养基另加20g/L琼脂粉)。

TB培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K₂HPO₄.3H₂O、2.31g/LKH₂PO₄、5g/L甘油，pH7.0-7.5，121℃高温灭菌20min。

20X电转母液：80g/L甘氨酸，2％吐温80。

实施例1野生型UGT1表达菌株的构建

合成编码UGT1的基因序列SEQ ID NO:2，两端设计酶切位点NdeI和BamHI，克隆到pSH质粒上相应位点，得到重组质粒pSH-UGT1，然后用电转化法转化入大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)感受态细胞中，涂含卡那霉素的LB培养基平板，37℃培养过夜，挑选单菌落，接种到含有LB培养基的试管中，培养过夜，离心收集菌体，抽提质粒，基因测序确定正确，得到表达野生型UGT1的重组基因工程菌株BL21(DE3)/pSH-UGT1。

氨基酸序列测定为UGT1。

从含有UGT1工程菌种的平板挑选单克隆，接种到5mL LB培养基中，37℃培养过；1％v/v接种到含有100mL发酵培养基的1000mL摇瓶中培养4-6小时，OD₆₀₀达到1.2-1.5，加入0.2mM的IPTG诱导，降温到25℃培养10-16小时，离心获得菌体，-80℃冻存24小时备用。

实施例2易错PCR法构建UGT1随机突变点库

以pSH-UGT1为模板，应用易错PCR技术构建随机突变体库。

正向引物UGT1-Nde-F：5’-CAT ATGAAATCTGAATTAATCTTTT-3’，

反向引物UGT1-Bam-R：5’-GGATCC CTACATAATTTCTTCGAATAAT-3’。

50μL易错PCR反应体系包括：50ng质粒模板pSH-UGT1，30pmol一对引物UGT1-Nde-F和UGT1-Bam-R，1X Taq buffer，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mM dTTP，7mM MgCl₂，(0mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM)MnCl₂，2.5个单位的Taq酶(fermentas)。PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min/kbp；30个循环；72℃10min。胶回收2.0kb随机突变片段作为大引物，用KOD-plus DNA聚合酶做MegaPrimer PCR：94℃5min，；98℃10s，60℃30s，68℃2min/kbp，25个循环；68℃10min。DpnI消化质粒模板，电转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，得到超过10⁴个克隆的随机突变库。

实施例3UGT1突变体库的高通量筛选

3.1选取UGT1突变体库中的转化子接种到含700μL LB培养基的96孔深孔培养板中，培养基中含100μg/mL卡那霉素，37℃培养6h后，加入终浓度0.1mM IPTG后，降温至25℃，培养过夜。5000rpm离心10min，弃上清，置于-70℃冷冻1h，室温融化30min。加入200μL裂解液(组分为20mM Tris-HCl,pH8.0，2mM 1,4-二硫苏糖醇，4000U溶菌酶)，重悬菌体，37℃孵育1h，充分离心，获得上清酶液。

使用上述获得的酶液，转移到酶反应的96孔板，按前文所述“糖基转移酶突变体的高通量筛选反应”方法实施筛选，以野生型UGT1(UGT1-WT)为阴性对照，根据吸光值评估反应强度。

在随机突变库，通过对约2000个突变体克隆筛选，筛选的较优突变体如表1中所示。对这几株突变体克隆做进一步验证。

表1、突变体相对酶活力

菌株编号	相对酶活力(％)
		UGT1-WT	100
UGT1-533	354
		UGT1-764	548
UGT1-988	452

3.2高酶活突变体的活力验证

挑取待验证克隆，接种到含有100μg/mL卡那霉素的LB培养基，250ml三角瓶装液25ml培养基，37℃培养6h，加入终浓度0.1mM IPTG后，降温至25℃，培养过夜。收集菌体，弃上清，按每5ml菌液的菌体，加1ml裂解液(组分为20mM Tris-HCl,pH8.0，2mM1,4-二硫苏糖醇，20000U溶菌酶)，重悬菌体，37℃孵育1h，充分离心，获得上清酶液。

使用上清酶液，参照前文“UDP糖基转移酶酶活力测定”方法，使用1ml反应体系，进行酶活验证反应。

同时对克隆进行抽提质粒，质粒送苏州金维智进行测序，确认突变位点。

根据对产物CK和底物PPD的定量检测，突变体相对酶活力验证结果如表2所示。

表2、突变体酶活力验证

菌株编号	突变氨基酸位点	相对酶活力(％)
			UGT1-WT	-	100
UGT1-533	H82A,S175A	432
			UGT1-764	H82A,V88A,N122K,E129T	530
UGT1-988	H82A,V88A,N122K,E129T,K315D	478

实施例4组合突变体的构建

根据表2中鉴定的氨基酸突变位点，设计了组合H82A、V88A、N122K、E129T、S175A共5个位点的突变体蛋白质序列UGT1sm，并由苏州金维智进行全基因合成，进行大肠杆菌表达密码子优化，得到的编码基因序列为SEQ ID NO:7。编码基因序列两端设计酶切位点NdeI和BamHI，克隆到pSH质粒上相应位点，得到重组质粒pSH-UGT1sm，然后用电转化法转化入大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)感受态细胞中，涂含卡那霉素的LB培养基平板，37℃培养过夜。挑选单菌落，接种到含有LB培养基的试管中，培养过夜。离心收集菌体，抽提质粒，基因测序确定正确，得到表达野生型UGT1的重组基因工程菌株BL21(DE3)/pSH-UGT1sm。

参照与实施例3相同的方法，对该突变体SEQ ID NO:6进行酶活力测定，结果相对活力如表3所示。

表3、突变体SEQ ID NO:6酶活力验证

菌株编号	突变氨基酸位点	相对酶活力(％)
			UGT1-WT	-	100
UGT1sm	H82A,V88A,N122K,E129T,S175A	620

由表2和表3的实验结果可以看出，相比野生型糖基转移酶UGT1，突变体SEQ IDNOs:4-6都明显提高了酶活力，其中SEQ ID NOs:6的酶活力提高了5倍多，可高效率地催化底物原人参二醇PPD生成人参皂苷CK，具备工业化开发潜力。

序列表

<110> 浙江华睿生物技术有限公司

<120> 一种糖基转移酶突变体

<130> SHPI1812099

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 475

<212> PRT

<213> GenBank: AIE12479.1

<400> 1

Met Lys Ser Glu Leu Ile Phe Leu Pro Ala Pro Ala Ile Gly His Leu

1 5 10 15

Val Gly Met Val Glu Met Ala Lys Leu Phe Ile Ser Arg His Glu Asn

20 25 30

Leu Ser Val Thr Val Leu Ile Ala Lys Phe Tyr Met Asp Thr Gly Val

35 40 45

Asp Asn Tyr Asn Lys Ser Leu Leu Thr Asn Pro Thr Pro Arg Leu Thr

50 55 60

Ile Val Asn Leu Pro Glu Thr Asp Pro Gln Asn Tyr Met Leu Lys Pro

65 70 75 80

Arg His Ala Ile Phe Pro Ser Val Ile Glu Thr Gln Lys Thr His Val

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Arg Asp Ile Ile Ser Gly Met Thr Gln Ser Glu Ser Thr Gln Val Val

100 105 110

Gly Leu Leu Ala Asp Leu Leu Phe Ile Asn Ile Met Asp Ile Ala Asn

115 120 125

Glu Phe Asn Val Pro Thr Tyr Val Tyr Ser Pro Ala Gly Ala Gly His

130 135 140

Leu Gly Leu Ala Phe His Leu Gln Thr Leu Asn Asp Lys Lys Gln Asp

145 150 155 160

Val Thr Glu Phe Arg Asn Ser Asp Thr Glu Leu Leu Val Pro Ser Phe

165 170 175

Ala Asn Pro Val Pro Ala Glu Val Leu Pro Ser Met Tyr Val Asp Lys

180 185 190

Glu Gly Gly Tyr Asp Tyr Leu Phe Ser Leu Phe Arg Arg Cys Arg Glu

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Ser Lys Ala Ile Ile Ile Asn Thr Phe Glu Glu Leu Glu Pro Tyr Ala

210 215 220

Ile Asn Ser Leu Arg Met Asp Ser Met Ile Pro Pro Ile Tyr Pro Val

225 230 235 240

Gly Pro Ile Leu Asn Leu Asn Gly Asp Gly Gln Asn Ser Asp Glu Ala

245 250 255

Ala Val Ile Leu Gly Trp Leu Asp Asp Gln Pro Pro Ser Ser Val Val

260 265 270

Phe Leu Cys Phe Gly Ser Tyr Gly Ser Phe Gln Glu Asn Gln Val Lys

275 280 285

Glu Ile Ala Met Gly Leu Glu Arg Ser Gly His Arg Phe Leu Trp Ser

290 295 300

Leu Arg Pro Ser Ile Pro Lys Gly Glu Thr Lys Leu Gln Leu Lys Tyr

305 310 315 320

Ser Asn Leu Lys Glu Ile Leu Pro Val Gly Phe Leu Asp Arg Thr Ser

325 330 335

Cys Val Gly Lys Val Ile Gly Trp Ala Pro Gln Val Ala Val Leu Gly

340 345 350

His Glu Ser Val Gly Gly Phe Leu Ser His Cys Gly Trp Asn Ser Thr

355 360 365

Leu Glu Ser Val Trp Cys Gly Val Pro Val Ala Thr Trp Pro Met Tyr

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Gly Glu Gln Gln Leu Asn Ala Phe Glu Met Val Lys Glu Leu Gly Ile

385 390 395 400

Ala Val Glu Ile Glu Val Asp Tyr Lys Lys Asp Tyr Phe Asn Met Lys

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Asn Asp Phe Ile Val Arg Ala Glu Glu Ile Glu Thr Lys Ile Lys Lys

420 425 430

Leu Met Met Asp Glu Asn Asn Ser Glu Ile Arg Lys Lys Val Lys Glu

435 440 445

Met Lys Glu Lys Ser Arg Ala Ala Met Ser Glu Asn Gly Ser Ser Tyr

450 455 460

Asn Ser Leu Ala Lys Leu Phe Glu Glu Ile Met

465 470 475

<210> 2

<211> 1428

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

atgaaatctg aattaatctt tttaccagca ccagctattg gtcacttggt cggtatggtc 60

gagatggcta agttgtttat ttcaagacat gaaaatttgt cagtcactgt tttgattgca 120

aaattctata tggacactgg tgttgataac tataataagt ctttattaac aaatccaact 180

ccaagattaa ctattgttaa tttgccagaa actgacccac aaaactacat gttgaaacca 240

agacatgcta tttttccatc tgttattgaa actcagaaaa ctcatgttag agatattatt 300

tctggtatga cacaatctga gtctacacaa gttgtcggtt tgttggcaga cttgttattt 360

ataaatatta tggatattgc taatgagttt aacgttccta cttacgttta ctcaccagct 420

ggtgctggtc atttgggttt ggctttccac ttgcaaactt taaatgataa aaaacaagat 480

gttacagaat ttagaaactc tgatactgaa ttattggttc catctttcgc aaaccccgtt 540

cccgctgagg ttttgccatc tatgtacgtt gataaggagg gtggttacga ttacttattt 600

tctttgttca gaagatgtag agaatctaag gcaattatta ttaatacttt tgaggaatta 660

gagccatacg caattaattc tttaagaatg gactctatga ttccaccaat ttatccagtc 720

ggtcctatat tgaacttgaa cggtgacggt caaaactctg acgaggctgc tgtcattttg 780

ggttggttgg acgaccaacc accttcttct gtcgtctttt tatgttttgg ttcttacggt 840

tcattccaag aaaatcaagt taaagagatt gcaatgggtt tggagcgttc tggtcatagg 900

ttcttgtggt ctttaagacc atctattcct aagggtgaga ctaaattgca attaaaatac 960

tctaacttaa aagaaatttt gccagttggt tttttggata gaacttcatg cgttggtaaa 1020

gtcattggtt gggctccaca agttgctgtc ttgggtcatg aatctgttgg tggttttttg 1080

tcacactgtg gttggaactc tactttggaa tcagtctggt gcggtgttcc agttgctact 1140

tggccaatgt acggtgaaca gcaattgaat gcttttgaaa tggttaaaga attaggtatt 1200

gctgttgaaa tagaggttga ttacaaaaaa gattatttta atatgaaaaa tgattttatt 1260

gtcagagctg aagaaattga aacaaagatt aagaaattaa tgatggatga gaataattct 1320

gagattagaa aaaaggttaa agaaatgaag gaaaaatccc gtgctgctat gtctgaaaac 1380

ggttcttctt ataactcttt ggctaaatta ttcgaagaaa ttatgtag 1428

<210> 3

<211> 475

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 3

Met Lys Ser Glu Leu Ile Phe Leu Pro Ala Pro Ala Ile Gly His Leu

1 5 10 15

Val Gly Met Val Glu Met Ala Lys Leu Phe Ile Ser Arg His Glu Asn

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Leu Ser Val Thr Val Leu Ile Ala Lys Phe Tyr Met Asp Thr Gly Val

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Asp Asn Tyr Asn Lys Ser Leu Leu Thr Asn Pro Thr Pro Arg Leu Thr

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Ile Val Asn Leu Pro Glu Thr Asp Pro Gln Asn Tyr Met Leu Lys Pro

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Gly Leu Leu Ala Asp Leu Leu Phe Ile Asn Ile Met Asp Ile Ala Asn

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Leu Gly Leu Ala Phe His Leu Gln Thr Leu Asn Asp Lys Lys Gln Asp

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Val Thr Glu Phe Arg Asn Ser Asp Thr Glu Leu Leu Val Pro Ala Phe

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Glu Gly Gly Tyr Asp Tyr Leu Phe Ser Leu Phe Arg Arg Cys Arg Glu

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<210> 4

<211> 475

<212> PRT

<213> 人工序列()

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1 5 10 15

Val Gly Met Val Glu Met Ala Lys Leu Phe Ile Ser Arg His Glu Asn

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<212> PRT

<213> 人工序列()

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Glu Gly Gly Tyr Asp Tyr Leu Phe Ser Leu Phe Arg Arg Cys Arg Glu

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Gly Pro Ile Leu Asn Leu Asn Gly Asp Gly Gln Asn Ser Asp Glu Ala

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Phe Leu Cys Phe Gly Ser Tyr Gly Ser Phe Gln Glu Asn Gln Val Lys

275 280 285

Glu Ile Ala Met Gly Leu Glu Arg Ser Gly His Arg Phe Leu Trp Ser

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Leu Met Met Asp Glu Asn Asn Ser Glu Ile Arg Lys Lys Val Lys Glu

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<210> 7

<211> 1428

<212> DNA

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agccattgtg gctggaacag tacgctggaa agcgtgtggt gcggcgttcc agttgccacg 1140

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ggcagcagct acaatagtct ggccaagctc ttcgaggaaa tcatgtaa 1428

Claims

1.一种糖基转移酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:6。

2.编码如权利要求1所述糖基转移酶的基因。

3.编码如权利要求1所述糖基转移酶的基因，其序列为SEQ ID NO:7。

4.包含如权利要求2或3所述基因的质粒。

5.转化了如权利要求4所述质粒的微生物。

6.如权利要求5所述的微生物，所述微生物选自大肠杆菌、酵母、枯草杆菌。

7.如权利要求5所述的微生物，其为大肠杆菌BL21(DE3)。

8.如权利要求1所述糖基转移酶或者如权利要求5所述微生物在合成人参皂苷CK中的用途。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，以原人参二醇为底物原料，在糖基转移酶催化下通过糖基转移反应来制备人参皂苷CK。