CN111748537B - 一种尿苷磷酸酶突变体及其应用 - Google Patents

一种尿苷磷酸酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种尿苷磷酸酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，能够有效催化核糖‑1‑磷酸与烟酰胺反应生成烟酰胺核糖，并可与嘌呤核苷磷酸化酶和烟酰胺核糖激酶一起构成三酶体系联合催化原料鸟苷、磷酸盐、烟酰胺和ATP反应一锅法合成β‑烟酰胺单核苷酸，具有较好的工业化开发和应用前景。

Description

一种尿苷磷酸酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于基因工程和酶催化技术领域，具体地说，涉及一种尿苷磷酸酶突变体、及其在合成烟酰胺核糖和β-烟酰胺单核苷酸中的用途。
背景技术
β-烟酰胺单核苷酸(β-nicotinamide mononucleotide，简称β-NMN或者NMN)广泛存在于自然界的生物中，是NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，又叫辅酶I)的直接前体，而NAD是细胞内众多生化反应进行的重要辅酶。NMN摄入机体细胞后，可在NMNAT酶催化作用下，合成NAD，通过NAD来体现其功能。经研究，NMN具有增强免疫力、抗衰老、修复DNA损伤、增强耐力、解酒护肝、增强胰岛素敏感性、保护视力和听力等作用。
目前，文献报道的β-NMN的制备方法有三种，包括化学合成、酶催化法以及微生物发酵法。化学合成方法以烟酰胺和核糖为原料，核糖经基团保护获得四乙酰核糖，然后再与烟酰胺反应，再经脱保护获得烟酰胺核糖(NR)，最后在磷酸化获得NMN，反应体系成分复杂、分离提取难度大，收率低，生产过程涉及较多的有机溶剂，如三氟甲磺酸三甲硅酯、甲醇、二氯甲烷等，生产环保压力较大。酶催化有两种方案，一是以NR、ATP(三磷酸腺苷二钠)为底物，在其激酶的催化下合成NMN；另一种是以核苷、烟酰胺和ATP为底物多酶体系下催化合成NMN，但由于NMN在细胞内容易被降解，因此多采用纯酶体系来催化，这导致了较高的生产成本。微生物发酵法仅有少量文献报道，产量均在毫克每升，还没有工业应用的价值。
随着近年来对NMN功能的深入了解，NMN的需求也呈现快速的增长，但高昂的价格也限制了其广泛应用，因此开发高效、低廉的NMN酶法合成工艺成为该产品的关键。我们在研究中发现，尿苷磷酸酶可以与嘌呤核苷磷酸化酶和烟酰胺核糖激酶一起构成三酶体系联合催化原料鸟苷、磷酸盐、烟酰胺和ATP反应一锅法合成β-烟酰胺单核苷酸，但现有技术的尿苷磷酸酶的低酶活力成为了酶促合成NMN的制约因素。
发明内容
本发明为了克服尿苷磷酸酶对烟酰胺底物活性低的问题，本发明利用基因工程技术对大肠杆菌来源的尿苷磷酸酶(又称尿嘧啶核苷磷酸化酶，Uridine phosphorylase)进行改造和筛选，对其烟酰胺底物特异性及催化活力进行了改进，同时与嘌呤核苷磷酸化酶和烟酰胺核糖激酶共同作用实现多酶体系联合催化一锅合成NMN。具体来说，本发明包括如下技术方案：
一种尿苷磷酸酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3：
MSKSDVFHLGLTKNDLQGATLAIVPGDPDRVEKIAALMDKPVKLASHREFTTWRAELDGKPVIVCSTGIGGPSTSIAVEELAQLGIRTFLRIGTTGAIQPHINVGDVLVTTASVRLDGASLHFAPLEFPAVADFECTTALVEAAKSIGATTHVGVTASSDTGYPGQERYDTYSGRVVRHFKGSMEEWQAMGVMNAEMESATLLTMCASQGLRAGMVAGVGSNRTQQEIPNAETMKQTESHAVKIVVEAARRLL(SEQ ID NO:3)。
其为大肠杆菌Escherichia coli K-12来源的尿苷磷酸酶SEQ ID NO:1(GenBank序列号为P12758)第162位的F替换为G、第195位的Y替换为A、第220位的I替换为G的突变体、第221位的V替换为S的突变体。
本发明的第二个方面在于提供编码上述尿苷磷酸酶突变体的基因。
优选地，编码上述尿苷磷酸酶突变体SEQ ID NO:3的基因可以是下述核苷酸序列SEQ ID NO:4：
ATGTCTAAATCTGACGTTTTCCACCTGGGTCTGACCAAAAACGACCTGCAGGGTGCTACCCTGGCTATCGTTCCGGGTGACCCGGACCGTGTTGAAAAAATCGCTGCTCTGATGGACAAACCGGTTAAACTGGCTTCTCACCGTGAATTCACCACCTGGCGTGCTGAACTGGACGGCAAACCGGTTATCGTGTGCAGCACCGGTATCGGTGGTCCGTCTACCTCTATCGCTGTTGAAGAACTGGCTCAGCTGGGTATCCGTACCTTCCTGCGTATCGGTACCACCGGTGCTATCCAGCCGCACATCAACGTTGGTGACGTTCTGGTTACCACCGCTTCTGTTCGTCTGGACGGTGCTTCTCTGCACTTCGCTCCGCTGGAATTCCCGGCTGTTGCTGACTTCGAATGCACCACCGCTCTGGTTGAAGCTGCTAAATCTATCGGTGCTACCACCCACGTTGGTGTTACCGCTTCTTCTGACACCGGTTACCCGGGTCAGGAACGTTACGACACCTACTCTGGTCGTGTTGTTCGTCACTTCAAAGGTTCTATGGAAGAATGGCAGGCTATGGGTGTTATGAACGCAGAAATGGAATCTGCTACCCTGCTGACCATGTGCGCTTCTCAGGGTCTGCGTGCTGGTATGGTTGCTGGTGTTGGTTCTAACCGTACCCAGCAGGAAATCCCGAACGCTGAAACCATGAAACAGACCGAATCTCACGCTGTTAAAATCGTTGTTGAAGCTGCTCGTCGTCTGCTG(SEQ ID NO:4)。
本发明的第三个方面在于提供表达上述编码基因的微生物，所述微生物选自大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。
通过上述微生物的发酵，可获得尿苷磷酸酶突变体。例如，在微生物发酵后，菌体用缓冲液重悬，超声破碎，离心，收集上清过柱层析，洗脱目的蛋白，即得尿苷磷酸酶突变体。
本发明的第四个方面在于提供一种生产β-NMN的前体化合物烟酰胺核糖的方法，其以核糖-1-磷酸和烟酰胺为底物，使用上述尿苷磷酸酶突变体催化合成烟酰胺核糖。
本发明的第五个方面在于提供一种生产β-烟酰胺单核苷酸(β-NMN)的方法，其以鸟苷、磷酸盐、烟酰胺和ATP为底物，使用由嘌呤核苷磷酸化酶、烟酰胺核糖激酶和上尿苷磷酸酶突变体构成的三酶体系，催化一锅法合成β-烟酰胺单核苷酸。
Figure BDA0002617241080000031
Figure BDA0002617241080000041
上述生产β-NMN的反应体系可以为缓冲液体系比如磷酸盐缓冲液，pH5.0-9.0，例如pH6.0-8.0，优选pH6.5-7.5。反应温度可以为30-40℃，例如32-38℃，优选35-37℃。
优选地，上述烟酰胺核糖激酶可以是酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288C来源的烟酰胺核糖激酶，其编码基因是已经公布的核酸GenBank序列号为NM_001182967.1，即SEQ ID NO:5。
与大肠杆菌来源的野生型尿苷磷酸酶SEQ ID NO:1相比，本发明构建的尿苷磷酸酶突变体的酶活性有明显提高，能够有效催化核糖-1-磷酸和烟酰胺合成烟酰胺核糖，并且与嘌呤核苷磷酸化酶和烟酰胺核糖激酶组成三酶体系，催化鸟苷、磷酸盐、烟酰胺和ATP一锅法合成NMN，具有工业化开发应用前景。
附图说明
图1为用于表达野生型尿苷磷酸酶的重组质粒pET24a-EcUP的结构示意图。
图2为用于表达野生型烟酰胺核糖激酶的重组质粒pET24a-ScNrK的结构示意图。
图3为pET24a-EcUP/BL21(DE3)、pET24a-mEcUP/BL21(DE3)和pET24a-ScNrK/BL21(DE3)三个菌株摇瓶发酵菌体破碎上清的SDS-PAGE跑胶照片。其中，条带1：Marker；条带2-3：pET24a-ScNrK/BL21(DE3)诱导后发酵全菌；条带4-5：pET24a-EcUP/BL21(DE3)诱导后发酵全菌；条带6-7：pET24a-mEcUP/BL21(DE3)诱导后发酵全菌；条带8：pET24a-mEcUP/BL21(DE3)诱导前。
具体实施方式
为了获得酶性能更高的尿苷磷酸酶，本发明对大肠杆菌来源的尿苷磷酸酶SEQ IDNO:1的基因序列SEQ ID NO:2进行点突变。通过定点组合突变技术获得一种个别位点氨基酸发生替换(F162G、Y195A、I220G、V221S)的新蛋白质，即本发明中具有氨基酸序列SEQ IDNO:3的突变体。由于功能不变，为方便起见，本文中也可将该尿苷磷酸酶突变体简称尿苷磷酸酶。野生型尿苷磷酸酶SEQ ID NO:1来源于Escherichia coli K-12，氨基酸GenBank序列号为P12758：
MSKSDVFHLGLTKNDLQGATLAIVPGDPDRVEKIAALMDKPVKLASHREFTTWRAELDGKPVIVCSTGIGGPSTSIAVEELAQLGIRTFLRIGTTGAIQPHINVGDVLVTTASVRLDGASLHFAPLEFPAVADFECTTALVEAAKSIGATTHVGVTASSDTFYPGQERYDTYSGRVVRHFKGSMEEWQAMGVMNYEMESATLLTMCASQGLRAGMVAGVIVNRTQQEIPNAETMKQTESHAVKIVVEAARRLL(SEQ ID NO:1)。
为表述方便起见，蛋白质的氨基酸缩写既可以使用英文三字母、也可以采用英文单字母，这是本领域技术人员熟知的，这些缩写列于下表1中：
表1、氨基酸中英文对照及缩写
丙氨酸 Alanine A或Ala 脂肪族类
精氨酸 Arginine R或Arg 碱性氨基酸类
天冬酰胺 Asparagine N或Asn 酰胺类
天冬氨酸 Aspartic acid D或Asp 酸性氨基酸类
半胱氨酸 Cysteine C或Cys 含硫类
谷氨酰胺 Glutamine Q或Gln 酰胺类
谷氨酸 Glutamic acid E或Glu 酸性氨基酸类
甘氨酸 Glycine G或Gly 脂肪族类
组氨酸 Histidine H或His 碱性氨基酸类
异亮氨酸 Isoleucine I或Ile 脂肪族类
亮氨酸 Leucine L或Leu 脂肪族类
赖氨酸 Lysine K或Lys 碱性氨基酸类
蛋氨酸 Methionine M或Met 含硫类
苯丙氨酸 Phenylalanine F或Phe 芳香族类
脯氨酸 Proline P或Pro 亚氨基酸
丝氨酸 Serine S或Ser 羟基类
苏氨酸 Threonine T或Thr 羟基类
色氨酸 Tryptophan W或Trp 芳香族类
酪氨酸 Tyrosine Y或Tyr 芳香族类
缬氨酸 Valine V或Val 脂肪族类
在本文中，为了与突变体SEQ ID NO:3相区别和表述方便起见，在本发明中可以将野生型尿苷磷酸酶称为“野生(型)尿苷磷酸酶”或者“野生(型)酶”，它们表示相同的意义，都是指原始尿苷磷酸酶的野生序列SEQ ID NO:1。
本发明的尿苷磷酸酶突变体的氨基酸数量只有253个，且结构明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。
这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。
上述转化体宿主可以使任何适合表达尿苷磷酸酶的微生物，包括细菌和真菌。优选微生物是枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、或者大肠杆菌，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。
为了在不同微生物中进行蛋白质SEQ ID NO:3的最佳表达，可以针对特定的微生物比如大肠杆菌、毕赤酵母、或者枯草芽孢杆菌进行密码子优化。密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组tRNA库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以被用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的DNA序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。在本文中所提供的基因序列SEQ ID NO:4是针对尿苷磷酸酶突变体SEQ ID NO:3经过密码子优化的核苷酸序列，但本发明的尿苷磷酸酶突变体SEQ ID NO:3表达基因不限于此。
当作为生物催化剂用于生产烟酰胺核糖时，本发明的尿苷磷酸酶呈现酶的形式。当作为生物催化剂用于生产烟酰胺单核苷酸(NMN)时，嘌呤核苷磷酸化酶、烟酰胺核糖激酶、本发明的尿苷磷酸酶都呈酶的形式。上述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、载体固定的酶等。
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
实施例
材料和方法
实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由苏州金唯智生物科技有限公司完成。
实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。
LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，pH7.2。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
TB培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K2HPO4.3H2O、2.31g/LKH2PO4、5g/L甘油，pH7.0-7.5。(TB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
HPLC检测方法：C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相A：25mmol/L乙酸铵水溶液；流动相B：乙腈；流速0.9ml/min；柱温30℃，检测波长254nm；
流动相梯度：
时间/min A％ B％
0.01 95 5
5 95 5
11 5 95
15 5 95
16 95 5
25 95 5
实施例1野生型尿苷磷酸酶基因重组大肠杆菌的构建
对于Escherichia coli K-12substr.MG1655来源的野生型尿苷磷酸酶(已经公布的氨基酸GenBank序列号为P12758)即SEQ ID NO:1，以此为基础进行密码子优化，全基因合成编码基因序列SEQ ID NO:2，并在基因两端设计限制性内切酶位点Nde I和XhoI，亚克隆到载体pET24a(Novagen)的相应位点，获得重组质粒pET24a-EcUP，质粒图谱见图1。将重组质粒pET24a-EcUP转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达野生型尿苷磷酸酶SEQ IDNO:1的重组大肠杆菌pET24a-EcUP/BL21(DE3)。
实施例2烟酰胺核糖激酶重组大肠杆菌的构建
对于酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288C来源的烟酰胺核糖激酶编码基因(已经公布的核酸GenBank序列号为NM_001182967.1)即SEQ ID NO:5，全基因合成，并在基因两端设计限制性内切酶位点Nde I和XhoI，亚克隆到载体pET24a(Novagen)的相应位点，获得重组质粒pET24a-ScNrK，质粒图谱见图2。将重组质粒pET24a-ScNrK转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达烟酰胺核糖激酶的重组大肠杆菌pET24a-ScNrK/BL21(DE3)。
实施例3尿苷磷酸酶突变体重组大肠杆菌的构建
采用定点组合突变的方式对野生型尿苷磷酸酶进行突变。
pET24a-EcUP质粒为模板，分别以162F/195R和195F/220&221R为引物对，进行PCR扩增，设计引物如下：
162F：5’-GTGTTACCGCTTCTTCTGACACCGGTTACCCGGGTCAGGAAC-3’，
195F：5’-GCAGGCTATGGGTGTTATGAACGCAGAAATGGAATCTGCTACCCTG-3’，
195R：5’-CAGGGTAGCAGATTCCATTTCTGCGTTCATAACACCCATAGCCTGC-3’，
220&221R：
5’-GATTTCCTGCTGGGTACGGTTAGAACCAACACCAGCAACCATACCA-3’。
PCR反应体系包括：引物各50pmol，质粒模板10ng，1×KOD neo plus buffer，0.2mM dNTP，1.5mM MgSO4，KOD neo plus 1U，补ddH2O至总体系50μL。
PCR扩增条件为：95℃5min；98℃15s，57℃30s，68℃30s/kbp，30个循环；68℃10min。
PCR反应结束后，用琼脂糖凝胶电泳进行分析，Axygen胶回收试剂盒分别回收160bp和130bp左右的特异条带。
然后以上述两个胶回收片段为模板，162F/220&221R为引物扩增长度约为230bp的突变片段。PCR反应体系包括：引物各50pmol，模板(片段各0.3μM)，1×KOD FX buffer，0.4mM dNTP，KOD FX 1U，补ddH2O至总体系50μL。
PCR扩增条件为：95℃2min；98℃15s，55℃30s，68℃30s/kbp，25个循环；68℃10min。
PCR反应结束后，用琼脂糖凝胶电泳进行分析，Axygen胶回收试剂盒回收目的条带。
胶回收230bp突变片段作为引物，用KOD-plus DNA聚合酶做MegaPrimer PCR：94℃5min；98℃10s，60℃30s，68℃2min/kbp，25个循环；68℃10min。DpnI消化质粒模板，转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达尿苷磷酸酶突变体SEQ ID NO:3的重组大肠杆菌pET24a-mEcUP/BL21(DE3)。
实施例4重组菌株的发酵及纯酶制备
将pET24a-EcUP/BL21(DE3)、pET24a-mEcUP/BL21(DE3)和pET24a-ScNrK/BL21(DE3)三个菌株分别在其LB培养平板上挑取单菌落，接种至5ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养过夜。取2ml过夜培养物接种至200ml TB培养基中，于37℃，250rpm培养2-3h，至OD600 0.6-0.8时，加入0.1mM IPTG，于28℃，200rpm培养过夜。然后于4℃，10000rpm，离心10min，分别收集菌体。三个菌株发酵菌体破碎上清的SDS-PAGE跑胶照片如图3所示。
菌体用50ml平衡缓冲液(20mM磷酸钾盐缓冲液，200mM NaCl，pH7.0)重悬，然后超声破碎，破碎后的菌体于4℃，12000rpm，离心20min，收集上清。将上清以1ml/min的速率加入含10ml Ni-NAT基质的亲和层析柱中，然后用含有10mM咪唑的平衡缓冲液冲洗柱料，洗脱杂质。最后用含有300mM咪唑的平衡缓冲液冲洗脱目的蛋白，收集峰值洗脱液。
洗脱液经截留分子量为10kDa的超滤管进行脱盐处理，最终获得野生尿苷磷酸酶EcUP(SEQ ID NO:1)、尿苷磷酸酶突变体mEcUP(SEQ ID NO:3)及烟酰胺核糖激酶ScNrK三种蛋白纯酶。
实施例5三酶体系催化一锅法合成NMN
配制反应体系：5mM鸟苷，10mM烟酰胺，10mM ATP，20mM磷酸钾盐缓冲液。然后加入适量的下述酶种类，pH7.0，37℃进行反应12h，HPLC检测产物β-烟酰胺单核苷酸产量。结果如表2所示。
表2、酶法催化合成NMN的比较
Figure BDA0002617241080000091
实验结果表明，相对于野生型EcUP，尿苷磷酸酶突变体mEcUP的酶活力有了显著提高；尿苷磷酸酶突变体能够与烟酰胺核糖激酶和嘌呤核苷磷酸化酶组合一起，能够有效地联合催化β-烟酰胺单核苷酸的一锅法合成，具有进一步开发前景。
序列表
<110> 浙江华睿生物技术有限公司
<120> 一种尿苷磷酸酶突变体及其应用
<130> SHPI2010372
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 253
<212> PRT
<213> Escherichia coli K-12
<400> 1
Met Ser Lys Ser Asp Val Phe His Leu Gly Leu Thr Lys Asn Asp Leu
1 5 10 15
Gln Gly Ala Thr Leu Ala Ile Val Pro Gly Asp Pro Asp Arg Val Glu
20 25 30
Lys Ile Ala Ala Leu Met Asp Lys Pro Val Lys Leu Ala Ser His Arg
35 40 45
Glu Phe Thr Thr Trp Arg Ala Glu Leu Asp Gly Lys Pro Val Ile Val
50 55 60
Cys Ser Thr Gly Ile Gly Gly Pro Ser Thr Ser Ile Ala Val Glu Glu
65 70 75 80
Leu Ala Gln Leu Gly Ile Arg Thr Phe Leu Arg Ile Gly Thr Thr Gly
85 90 95
Ala Ile Gln Pro His Ile Asn Val Gly Asp Val Leu Val Thr Thr Ala
100 105 110
Ser Val Arg Leu Asp Gly Ala Ser Leu His Phe Ala Pro Leu Glu Phe
115 120 125
Pro Ala Val Ala Asp Phe Glu Cys Thr Thr Ala Leu Val Glu Ala Ala
130 135 140
Lys Ser Ile Gly Ala Thr Thr His Val Gly Val Thr Ala Ser Ser Asp
145 150 155 160
Thr Phe Tyr Pro Gly Gln Glu Arg Tyr Asp Thr Tyr Ser Gly Arg Val
165 170 175
Val Arg His Phe Lys Gly Ser Met Glu Glu Trp Gln Ala Met Gly Val
180 185 190
Met Asn Tyr Glu Met Glu Ser Ala Thr Leu Leu Thr Met Cys Ala Ser
195 200 205
Gln Gly Leu Arg Ala Gly Met Val Ala Gly Val Ile Val Asn Arg Thr
210 215 220
Gln Gln Glu Ile Pro Asn Ala Glu Thr Met Lys Gln Thr Glu Ser His
225 230 235 240
Ala Val Lys Ile Val Val Glu Ala Ala Arg Arg Leu Leu
245 250
<210> 2
<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
atgtctaaat ctgacgtttt ccacctgggt ctgaccaaaa acgacctgca gggtgctacc 60
ctggctatcg ttccgggtga cccggaccgt gttgaaaaaa tcgctgctct gatggacaaa 120
ccggttaaac tggcttctca ccgtgaattc accacctggc gtgctgaact ggacggcaaa 180
ccggttatcg tgtgcagcac cggtatcggt ggtccgtcta cctctatcgc tgttgaagaa 240
ctggctcagc tgggtatccg taccttcctg cgtatcggta ccaccggtgc tatccagccg 300
cacatcaacg ttggtgacgt tctggttacc accgcttctg ttcgtctgga cggtgcttct 360
ctgcacttcg ctccgctgga attcccggct gttgctgact tcgaatgcac caccgctctg 420
gttgaagctg ctaaatctat cggtgctacc acccacgttg gtgttaccgc ttcttctgac 480
accttctacc cgggtcagga acgttacgac acctactctg gtcgtgttgt tcgtcacttc 540
aaaggttcta tggaagaatg gcaggctatg ggtgttatga actacgaaat ggaatctgct 600
accctgctga ccatgtgcgc ttctcagggt ctgcgtgctg gtatggttgc tggtgttatc 660
gttaaccgta cccagcagga aatcccgaac gctgaaacca tgaaacagac cgaatctcac 720
gctgttaaaa tcgttgttga agctgctcgt cgtctgctg 759
<210> 3
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 3
Met Ser Lys Ser Asp Val Phe His Leu Gly Leu Thr Lys Asn Asp Leu
1 5 10 15
Gln Gly Ala Thr Leu Ala Ile Val Pro Gly Asp Pro Asp Arg Val Glu
20 25 30
Lys Ile Ala Ala Leu Met Asp Lys Pro Val Lys Leu Ala Ser His Arg
35 40 45
Glu Phe Thr Thr Trp Arg Ala Glu Leu Asp Gly Lys Pro Val Ile Val
50 55 60
Cys Ser Thr Gly Ile Gly Gly Pro Ser Thr Ser Ile Ala Val Glu Glu
65 70 75 80
Leu Ala Gln Leu Gly Ile Arg Thr Phe Leu Arg Ile Gly Thr Thr Gly
85 90 95
Ala Ile Gln Pro His Ile Asn Val Gly Asp Val Leu Val Thr Thr Ala
100 105 110
Ser Val Arg Leu Asp Gly Ala Ser Leu His Phe Ala Pro Leu Glu Phe
115 120 125
Pro Ala Val Ala Asp Phe Glu Cys Thr Thr Ala Leu Val Glu Ala Ala
130 135 140
Lys Ser Ile Gly Ala Thr Thr His Val Gly Val Thr Ala Ser Ser Asp
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Pro Gly Gln Glu Arg Tyr Asp Thr Tyr Ser Gly Arg Val
165 170 175
Val Arg His Phe Lys Gly Ser Met Glu Glu Trp Gln Ala Met Gly Val
180 185 190
Met Asn Ala Glu Met Glu Ser Ala Thr Leu Leu Thr Met Cys Ala Ser
195 200 205
Gln Gly Leu Arg Ala Gly Met Val Ala Gly Val Gly Ser Asn Arg Thr
210 215 220
Gln Gln Glu Ile Pro Asn Ala Glu Thr Met Lys Gln Thr Glu Ser His
225 230 235 240
Ala Val Lys Ile Val Val Glu Ala Ala Arg Arg Leu Leu
245 250
<210> 4
<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
atgtctaaat ctgacgtttt ccacctgggt ctgaccaaaa acgacctgca gggtgctacc 60
ctggctatcg ttccgggtga cccggaccgt gttgaaaaaa tcgctgctct gatggacaaa 120
ccggttaaac tggcttctca ccgtgaattc accacctggc gtgctgaact ggacggcaaa 180
ccggttatcg tgtgcagcac cggtatcggt ggtccgtcta cctctatcgc tgttgaagaa 240
ctggctcagc tgggtatccg taccttcctg cgtatcggta ccaccggtgc tatccagccg 300
cacatcaacg ttggtgacgt tctggttacc accgcttctg ttcgtctgga cggtgcttct 360
ctgcacttcg ctccgctgga attcccggct gttgctgact tcgaatgcac caccgctctg 420
gttgaagctg ctaaatctat cggtgctacc acccacgttg gtgttaccgc ttcttctgac 480
accggttacc cgggtcagga acgttacgac acctactctg gtcgtgttgt tcgtcacttc 540
aaaggttcta tggaagaatg gcaggctatg ggtgttatga acgcagaaat ggaatctgct 600
accctgctga ccatgtgcgc ttctcagggt ctgcgtgctg gtatggttgc tggtgttggt 660
tctaaccgta cccagcagga aatcccgaac gctgaaacca tgaaacagac cgaatctcac 720
gctgttaaaa tcgttgttga agctgctcgt cgtctgctg 759
<210> 5
<211> 720
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae S288C
<400> 5
atgacttcga aaaaagtgat attagttgca ttgagtggat gctcctccag tggtaagacg 60
acaattgcga aacttacagc aagtttattc acgaaggcta cattaattca tgaagatgac 120
ttttacaaac atgataatga agtgccagta gatgctaaat ataacattca aaattgggat 180
tcgccagaag ctcttgattt taaacttttc ggtaaagaat tagatgtgat caaacaaact 240
ggtaaaatag ccaccaaact tatacacaat aacaacgtag atgatccctt tacaaagttc 300
cacattgata gacaagtttg ggacgagtta aaggctaagt atgactctat taatgacgac 360
aaatatgaag ttgtaattgt agatgggttt atgattttca ataatactgg aatatcaaaa 420
aaatttgatt tgaagatatt agtgcgtgct ccctatgaag tactaaaaaa aaggagggct 480
tccagaaaag gataccagac tttggattct ttctgggtgg atccgccgta ttatttcgac 540
gaatttgtgt atgaatctta tcgtgcaaat catgcgcagt tatttgttaa tggagacgta 600
gaaggtttac tagacccaag gaagtcaaag aatataaaag agttcataaa tgatgatgac 660
actccaattg cgaaaccttt aagctgggtg tgccaagaga ttctaaagct ttgtaaggat 720

Claims (10)

1.一种尿苷磷酸酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
2.编码如权利要求1所述尿苷磷酸酶突变体的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
4.一种微生物，其表达如权利要求3所述的基因。
5.如权利要求4所述的微生物，其特征在于，所述微生物选自大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌。
6.一种生产如权利要求1所述尿苷磷酸酶突变体的方法，其特征在于，通过如权利要求5所述微生物的发酵获得。
7.一种生产烟酰胺核糖的方法，其特征在于，以核糖-1-磷酸和烟酰胺为底物，使用如权利要求1所述的尿苷磷酸酶突变体催化合成烟酰胺核糖。
8.一种生产β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，以鸟苷、磷酸盐、烟酰胺和ATP为底物，使用由嘌呤核苷磷酸化酶、烟酰胺核糖激酶和如权利要求1所述的尿苷磷酸酶突变体构成的三酶体系，催化一锅法合成β-烟酰胺单核苷酸。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，反应体系为磷酸盐缓冲液，pH5.0-9.0；反应温度为30-40℃。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述烟酰胺核糖激酶是Saccharomycescerevisiae S288C来源的烟酰胺核糖激酶。
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