CN111996155B - 一种提高l-组氨酸产生菌生产能力的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高L‑组氨酸产生菌生产能力的方法，包括下述步骤：对于大肠杆菌来源的ATP磷酸核糖基转移酶进行突变，获得酶活力提高的突变体；设计编码该突变体的基因；将所述编码基因整合入大肠杆菌的基因组中，获得基因工程菌。本发明的方法能够将L‑组氨酸生产菌的L‑组氨酸生产能力提高3.5倍以上。

Description

一种提高L-组氨酸产生菌生产能力的方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种提高L-组氨酸产生菌生产能力的方法、一种L-组氨酸基因工程生产菌及其应用。
背景技术
L-组氨酸(L-histidine)是一种半必需氨基酸，对于婴幼儿及动物的成长尤其重要，随年龄增长人体开始可以自己合成它，此外它也可作为生化试剂或医药中间体，用于生产药物。据行业研究报告显示，2017年，全球的组氨酸消耗大致为，食用559.5吨，药物1516.2吨，饲料393.1吨，预计到2023年L-组氨酸消费量将达到3000-4000吨，市场需求量越来越大。
目前，L-组氨酸的制备主要有两种方法：国内主要是蛋白质水解方法制备(参见中国生化药物杂志,1982(02):12-17；CN101125831B)；国外主要通过谷氨酸棒杆菌或者大肠杆菌通过诱变获得高产L-组氨酸菌株通过微生物发酵方法制备(US8071339；CA02319283；CN1749390A；CN102286562A)。其中日本发酵公司协和和味之素的产量份额占90％以上。目前国内药用L-组氨酸主要通过进口，尚未实现微生物发酵法生产来自给。
在大肠杆菌L-组氨酸生物合成途径中，一个关键酶--ATP磷酸核糖基转移酶(HisG)受到不同的中间代谢物和终产物抑制，尤其是终产物L-组氨酸的抑制。消除HisG的反馈抑制是组氨酸育种菌株中的重要步骤。先前报道的抗反馈抑制突变酶HisGE271K被嘌呤核苷酸(特别是ADP和AMP)通过与ATP底物的竞争性抑制而被抑制，同时研究发现5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸(AICAR)也对ATP磷酸核糖基转移酶有极强的抑制(Malykh etal.,Microb Cell Fact.(2018),17:42)。通过对谷氨酸棒状杆菌中的HisG进行多个氨基酸位点突变，最后获得了N215K/L231F/T235A突变体，该突变体Ki值提高了37倍，发酵液中产物浓度由0.11mM提高到4.15mM，进而实现了组氨酸的高产(Biochimie,94(2012),p829-838)。
这些研究证明，通过基因工程手段获得更高产量的L-组氨酸生产菌株对于提高L-组氨酸生产的效益具有重要意义。
发明内容
为了构建L-组氨酸产量更高的基因工程菌株，本发明利用基因工程技术来改造产L--组氨酸的大肠杆菌。通过对组氨酸操纵子(his operon)进行改造，提高抗反馈抑制ATP磷酸核糖基转移酶的酶活力，获得L-组氨酸产量明显提高的菌株，从而提升了L-组氨酸的生产能力，具有广阔的工业化开发和应用前景。具体而言，本发明包括如下技术方案：
一种提高L-组氨酸产生菌生产能力的方法，包括以下步骤：
A.对大肠杆菌来源的ATP磷酸核糖基转移酶进行突变，获得酶活力提高的突变体；
B.设计编码步骤A中所得ATP磷酸核糖基转移酶突变体的基因；
C.将步骤B中所述基因整合入大肠杆菌的基因组中、或者替换大肠杆菌基因组中原始的ATP磷酸核糖基转移酶编码基因，获得基因工程菌。
在一种实施方式中，步骤A中所述的大肠杆菌是大肠杆菌W3110。
大肠杆菌W3110来源的ATP磷酸核糖基转移酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:18。
优选地，上述突变体可以是SEQ ID NO:18的K136E、S226Ter突变体(其中Ter为终止子)，其氨基酸序列为SEQ ID NO:20。
上述ATP磷酸核糖基转移酶突变体的编码基因可以是SEQ ID NO:21。
上述大肠杆菌W3110来源的ATP磷酸核糖基转移酶编码基因是SEQ ID NO:19。
对于原始的ATP磷酸核糖基转移酶编码基因例如SEQ ID NO:19的替换可以是：先敲除或失活大肠杆菌中的该原始基因，然后整合入ATP磷酸核糖基转移酶突变体的编码基因比如SEQ ID NO:21。
在一种实施方式中，步骤C通过基因编辑技术实现。
可选地，在另一种实施方式中，步骤C也可以通过下述步骤实现：构建表达ATP磷酸核糖基转移酶突变体的质粒例如载体pTrc99a，将质粒转入大肠杆菌感受态细胞中，筛选得到基因测序验证正确的阳性克隆。
上述基因编辑技术可以采用CRISPR-Cas***例如CRISPR/Cas9***、CRISPR-Cas相关的转座***INTEGRATE***、或者CAST***。
根据本发明的第二个方面，提供了一种基因工程菌，其按照上述的方法构建得到。
根据本发明的第三个方面，提供了上述基因工程菌在生产L-组氨酸中的应用。
优选通过上述基因工程菌的发酵来生产L-组氨酸。
当上述基因工程菌发酵时，种子液培养基组成可以为：20g/L葡萄糖，4g/L酵母提取物，3g/L蛋白胨，1.2g/L磷酸二氢钾，0.5g/L硫酸镁·7H2O，10mg/L硫酸亚铁7H2O，10mg/L一水合硫酸锰，1mg/L VB1，1mg/L VB3，1mg/L VB5，1mg/L VB12，1mg/L VH，氢氧化钠调节至pH7.0-7.2。
摇瓶发酵培养基组成可以为：20g/L葡萄糖，4g/L酵母提取物，3g/L蛋白胨，2g/L一水合柠檬酸钠，2g/L磷酸二氢钾，2g/L硫酸镁·7H2O，20mg/L硫酸亚铁，20mg/L硫酸锰，2mg/L VB1，2mg/L VB3，2mg/L VB5，2mg/L VB12，和2mg/L VH，氢氧化钠调节pH7.0-7.2之间，发酵每隔4h补加氨水至pH7.2-7.4。
本发明的方法能够将L-组氨酸生产菌尤其是大肠杆菌的L-组氨酸生产能力提高至少3.6倍，具有工业化开发价值。
附图说明
图1为质粒pTrc99a的结构示意图，该质粒由中国科学院植物分子卓越中心杨晟研究员馈赠。
图2为本发明构建的质粒pTrc99a-EchisG的结构示意图。
具体实施方式
本发明通过高通量筛选的方法，对大肠杆菌内源的野生型ATP磷酸核糖基转移酶进行定向诱变，经过酶活测定，获得抗反馈抑制的高活性ATP磷酸核糖基转移酶突变体，进而通过突变基因回补到野生型ATP磷酸核糖基转移酶突基因敲除大肠杆菌菌株中，然后进行发酵测试，得到L-组氨酸产量提高的基因工程生产菌。
本文中的术语“L-组氨酸基因工程生产菌”、“L-组氨酸生产菌”、“基因工程菌”、“L-组氨酸基因工程生产菌”表示相同的意义。
本发明的L-组氨酸生产菌的出发菌株或称原始菌株、野生型(WT)菌株是大肠杆菌W3110，有时简写为W3110。其内源的ATP磷酸核糖基转移酶(hisG)即SEQ ID NO:18简称为野生型hisG，其表达基因是SEQ ID NO:19。
在本文中，为了描述简便起见，有时会将某种蛋白比如ATP磷酸核糖基转移酶(hisG)与其编码基因(DNA)名称混用，本领域技术人员应能理解它们在不同描述场合表示不同的物质。本领域技术人员根据语境和上下文容易理解它们的含义。例如，对于hisG，用于描述ATP磷酸核糖基转移酶功能或类别时，指的是蛋白质；在作为一种基因描述时，指的是编码该ATP磷酸核糖基转移酶的基因。
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
实施例
材料和方法
实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由南京金唯智生物技术有限公司完成。
实施例中的分子生物学实验操作包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备、转化等主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。比如感受态细胞转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆实验指南》(第三版)第1章96页进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
主要培养基：
LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠。(固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
摇瓶发酵种子培养基(1L)：20g葡萄糖，4g酵母提取物，3g蛋白胨，1.2g磷酸二氢钾，0.5g硫酸镁·7H2O，10mg硫酸亚铁·7H2O，10mg一水合硫酸锰，1mg VB1，1mg VB3，1mgVB5，1mg VB12，1mg VH，氢氧化钠调节pH7.0-7.2之间。
摇瓶发酵培养基(1L)：20g葡萄糖，4g酵母提取物，3g蛋白胨，2g一水合柠檬酸钠，2g磷酸二氢钾，2g硫酸镁·7H2O，20mg硫酸亚铁·7H2O，20mg一水合硫酸锰，2mg VB1，2mgVB3，2mg VB5，2mg VB12，和2mg VH，氢氧化钠调节pH7.0-7.2之间，发酵每隔4h补加氨水至ph7.2-7.4。
以下实施例中，当使用含氨苄霉素抗性的培养基时，所述抗生素浓度为100μg/ml；使用卡那霉素和壮观霉素的培养基时，所述抗生素在培养基中的终浓度为50μg/ml。
PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。
实施例中使用的引物序列信息如表1所示。
表1、引物序列
Figure GDA0003434861340000051
表1中，名称中的“-F”代表正向；“-R”代表反向。
实施例1：野生型hisG基因工程菌构建
合成引物对99A-HisG-F和99A-HisG-R序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，以大肠杆菌W3110菌株基因组为模板进行PCR扩增(以下PCR试剂购买自东洋纺TOYOBO的KOD FX系列)。
50μL PCR扩增体系为：KOD FX 1μL，KOD FX buffer 25μL，dNTP 3μL，基因组模板0.5μL，上下游引物各2μL，ddH2O补足50μL。
PCR程序为：105℃热盖，95℃预变性5min；98℃变性30s，57℃退火30s，68℃延伸60s，30个循环；最后68℃延伸10min；16℃降温10min。
PCR扩增得到野生型hisG的基因SEQ ID NO:19。用限制性内切酶NcoI和BamHI双酶切pTrc99a质粒(参见图1，该质粒由中国科学院植物分子卓越中心杨晟研究员馈赠)，获得线性化载体。然后通过同源重组方法获得pTrc99a-hisG质粒，参见图2，然后用氯化钙法转化入大肠杆菌表达宿主W3110感受态细胞中，涂含氨苄抗性的LB培养基平板，37℃培养过夜，挑选单菌落，接种到含有氨苄抗生素的LB培养基试管中，培养过夜，离心收集菌体，抽提质粒，基因测序确定正确，得到表达野生型ATP磷酸核糖基转移酶SEQ ID NO:18的重组基因工程菌株。
实施例2：易错PCR法构建hisG随机突变点库
野生型ATP磷酸核糖基转移酶的突变采用易错PCR法。
50μL易错PCR反应体系包括：50ng实施例1中构建的pTrc99a-hisG质粒模板，30pmol HISG-EP-F和HISG-EP-R引物对SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15，1×Taq buffer，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mM dTTP，7mM MgCl2，(0mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM)MnCl2，2.5个单位的Taq酶(fermentas)。
PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min/kbp，30个循环；72℃10min。
限制性内切酶DpnI于50℃消化1小时，胶回收0.9kb突变片段与NcoI和BamHI双酶切实施例1中构建的pTrc99a线性化载体进行同源重组，然后用氯化钙法转化入大肠杆菌表达宿主W3110感受态细胞中，得到超过104个克隆的随机突变库。
实施例3：高通量筛选hisG突变体库
3.1 选取突变体库中的转化子，接种到含700μL LB培养基的96孔深孔培养板中，培养基中含100μg/mL氨苄霉素，37℃培养6h后，加入终浓度0.1mM IPTG后，降温至25℃，培养过夜。5000rpm离心10min，弃上清，置于-70℃冷冻1h，室温融化30min。加入200μL含0.1M磷酸钾盐缓冲液(pH8.0)，重悬菌体，用于hisG酶活力测定。
3.2 HisG酶活力测定
HisG酶活力测定参考(Biochimie，94，2012，P829-838)所提供的方法。酶活力测定体系：反应混合物含有100mM Tris-HCl(pH 8.5)、150mM KCl、10mM MgCl2、5mM ATP，0.5mMPRPP，1U酵母焦磷酸酶，体积为0.1mL。在96孔酶标板中进行。在290nm处用紫外分光光度计监测吸光度的增加。室温下反应4min，无酶反应混合物为空白对照。一个活性单位被定义为能够将吸光度提高0.02/min的酶量，相当于每分钟转化1.67nmol底物的最小值。
在随机突变库，通过对约1000个突变体克隆进行筛选，发现4个氨基酸位点取代的突变体酶活力提高。有3个突变体的hisG酶活显著提高，结果如表1所示。
表2、部分hisG突变体的酶活力比较
突变体 氨基酸突变 相对酶活力(％)
HisG - 100
HisG-36 A175D 185
HisG-117 K136E、S226Ter 387
HisG-833 K136E、A175S、S226Ter 316
表中突变氨基酸A175D表示野生型HisG上的第175位氨基酸A(丙氨酸，Ala)替换为D(天冬氨酸，Asp)，S226Ter表示第226个氨基酸S(丝氨酸，Ser)替换为Ter(终止密码子)，K136E表示第136个氨基酸K(赖氨酸，Lys)替换为E(谷氨酸，Glu)，A175S表示第175个氨基酸A(丙氨酸，Ala)替换为S(丝氨酸，Ser)。其中编号为HisG-117的突变体的酶活力相对于野生型提高了近3倍。下文中重点研究突变体HisG-117，其氨基酸序列为SEQ ID NO:20，编码基因是SEQ ID NO:21。
实施例4：构建W3110△hisLG基因工程菌株
4.1 制备pTarget-hisL(同时制备pTarget-intron)质粒
合成引物对HisL-N20-F/HisL-N20-R序列SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，以pTarget质粒(Addgene ID 62226，该质粒由中国科学院植物分子卓越中心杨晟研究员馈赠)为模板，PCR扩增。
50μL PCR扩增体系为：KOD FX 1μL，KOD FX buffer 25μL，dNTP 3μL，pTarget质粒0.5μL，上下游引物各2μL，ddH2O补足50μL。
PCR程序为：105℃热盖，95℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，68℃延伸2min，30个循环；最后68℃延伸10min；16℃降温10min。扩增得到约2.2Kb片段。
用DpnI于50℃消化1小时，取3μL转化DH5α感受态细胞，获得pTarget-hisL质粒，测序鉴定阳性转化子。
pTarget-intron质粒构建同上方法，通过合成引物对HisL-N20-R/His-intron-N20-F序列SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5，以pTarget质粒为模板，PCR扩增体系和程序及后续试验步骤同pTarget-hisL质粒构建。
4.2 CRISPR介导的hisLG敲除同源臂的制备
合成引物对His-intron-N20-F/HisG-KO-UP-F序列SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，以大肠杆菌W3110基因组为模板，制备hisLG敲除上游同源臂(0.5kb)。合成引物对HisG-KO-UP-R/HisG-KO-DN-F序列SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，以大肠杆菌W3110基因组为模板，制备hisLG敲除下游同源臂(0.5kb)。然后合成引物对His-intron-N20-F/HisG-KO-DN-F序列SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8，以hisLG敲除上游同源臂和下游同源臂为模板，进行overlapPCR，PCR扩增体系和程序同上，制备hisLG敲除同源臂。
4.3 大肠杆菌W3110△hisLG/pCasSac菌株制备
将大肠杆菌W3110菌株制备成氯化钙化转感受态细胞，转入pCas质粒(Addgene ID62225，该质粒由中国科学院植物分子卓越中心杨晟研究员馈赠)，取50μl涂含卡纳抗生素平板，30℃过夜培养，获得W3110/pCas单克隆菌株。
挑取W3110/pCasSac单克隆置于LB+Kan试管培养基中，在30℃，220rpm的摇床上过夜培养。接种500μL菌液到50ml的LB+Kan+100mM***糖液体培养基摇瓶中，恒温摇床上30℃，220rpm培养2-2.5h至OD600值达到1.0左右。在超净工作台上，将菌液全部转移至50ml离心管中，4℃，4500×g离心，弃上清，用10％甘油洗涤菌体，使菌体重悬，4℃，4500×g离心，重复洗涤1遍，弃上清。最后加入300μl的10％甘油，使菌体悬浮，分装到1.5ml离心管中，每90μl制备为一支感受态细胞，加入500ng pTarget-hisL质粒和1μghisLG敲除同源臂(合计不超过10μL)，混匀后转移至电转杯中，在2.5kV,200Ω的条件下进行电击，电击时间为5.5ms，电击后立即转入900μl LB液体培养基中，然后置于恒温摇床中30℃，220rpm培养1h，使菌体复苏。复苏之后取100μl菌体涂布在含含卡纳霉素和壮观霉素的LB平板，将平板倒置在30℃恒温培养箱中过夜培养，获得W3110△hisLG/pCas+pTarget-hisL单克隆菌株。使用引物对HISG-EP-F/HISG-EP-R序列SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15对转化平板单克隆进行菌落PCR鉴定，获得hisLG敲除阳性菌株。
挑阳性克隆子到LB液体(kan抗性)，加入10mM的鼠李糖，诱导导向质粒pTarget-hisL的sgRNA转录，30℃震荡培养过夜，取少许菌液于LB(kan抗性)平板划线分离单菌落，37℃静置培养12h左右，挑单克隆到LB(Spec抗性)平板，在LB(Spec抗性)平板不能生长的菌株即为pTarget-hisL消除菌株W3110△hisLG/pCas。该菌株已经不再表达大肠杆菌W3110基因组中的原始ATP磷酸核糖基转移酶编码基因SEQ ID NO:19，可用于评估HisG突变体的酶活力。
实施例5：产组氨酸基因工程菌株的构建
分别合成引物对HisG-KO-UP-F/HisG-AS-UP-R序列SEQ ID NO:6/SEQ ID NO:10、引物对HisG-KO-DN-R/HisG-AS-DN-F序列SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:13，分别以W3110基因组为模板，PCR扩增PtrchisG整合上下游同源臂序列。使用引物对HisG-AS-F/HisG-AS-R序列SEQ ID NO:11/SEQ ID NO:12，以实施例1中构建的pTrc99a-hisG质粒为模板，PCR扩增PtrchisG片段。然后使用引物对序列SEQ ID NO:6/SEQ ID NO:9，以上述hisG上下游同源臂及PtrchisG片段三片段进行overlap PCR，获得Uparm-PtrchisG-Dnarm片段。
同样地，使用引物对HisG-AS-F/HisG-AS-R序列SEQ ID NO:11/SEQ ID NO:12，以实施例3中定点突变获得的质粒pTrc99a-hisGK136E,S226Ter质粒为模板，PCR扩增PtrchisGK136E,S226Ter片段质粒。合成引物对HisG-KO-UP-F/HisG-KO-DN-R序列SEQ ID NO:6/SEQ ID NO:9，以上述hisG上下游同源臂及PtrchisGK136E,S226Ter片段进行overlap PCR，获得Uparm-PtrchisGK136E,S226Ter-Dnarm片段。
将W3110△hisLG菌株采用与实施例4相同的方法制备电转感受细胞，在两支电转感受态细胞中分别加入pTarget-intron质粒和Uparm-PtrchisG-Dnarm片段、pTarget-intron质粒和Uparm-PtrchisGK136E,S226Ter-Dnarm片段，电转复苏后，分别取100μl菌体涂布在含有卡纳霉素和壮观霉素的LB平板，将平板倒置在30℃恒温培养箱中过夜培养，获得W3110△hisLG/pCas+pTarget-intron单克隆菌株。使用引物对HisLG-KO-V-F/HisLG-KO-V-R序列SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17对转化平板单克隆进行菌落PCR扩增，扩增片段进行测序，获得PtrchisG和PtrchisGK136E,S226Ter整合菌株。
挑阳性克隆子到LB液体(kan抗性)，加入10mM的鼠李糖，诱导导向质粒pTarget-intron的sgRNA转录，37℃震荡培养过夜，取少许菌液于LB板划线分离单菌落，37℃静置培养12h左右，挑单克隆到LB(Kan抗性)平板和LB(Spec抗性)平板和LB平板，在LB上可以生长在Kan和Spec抗性平板不能生长的菌株即为不含质粒的W3110::PtrcHisG和W3110::PtrcHisGK136E,S226Ter菌株。菌株W3110::PtrcHisGK136E,S226Ter的基因组中都整合了ATP磷酸核糖基转移酶K136E、S226Ter突变体的编码基因SEQ ID NO:21。
实施例6：组氨酸生产菌株发酵及产物含量测定
6.1 种子摇瓶培养
从LB平板挑新鲜培养的菌落到种子摇瓶(30ml/500ml)，37℃，220rpm震荡过夜培养。
6.2 摇瓶发酵
从种子摇瓶取5ml种子培养基到发酵摇瓶中(30ml/500ml单挡板摇瓶)，37℃，220rpm震荡培养约24h(如果2h内发酵液颜色不再变化，可提前结束发酵)。发酵过程中需用20％(v/v)氨水调控pH(注意要边加边震荡，发酵液开始变红时停加氨水)。发酵液高速离心，取上清，稀释5倍，HPLC检测L-组氨酸产量。
6.3 高效液相色谱HPLC测定组氨酸含量
使用OPA柱前衍生氨基酸分析法来测定发酵液中L-组氨酸含量。一级氨基酸在巯基试剂存在下与邻苯二醛(OPA)反应生成OPA-氨基酸，生成的氨基酸衍生物经反相高效液相色谱分离后用紫外或荧光检测，在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。
衍生剂和流动相配制：
硼酸缓冲液：0.4M硼酸缓冲液，准确称取6.183g硼酸，溶于超纯水中，用10N NaOH溶液调至pH 10.2，定容至250ml容量瓶中。
衍生剂：准确称取500mg邻苯二甲醛(OPA)固体，加5ml无水乙醇，加500μl巯基丙酸，用0.4M，pH 10.2的硼酸缓冲液定容至50ml。
流动相A：40mM NaH2PO4溶液，准确称取5.5g NaH2PO4·H2O，溶于超纯水，用10NNaOH溶液调至pH 7.8，定容至1L，0.22μm滤膜过滤后备用。
流动相B：甲醇，试剂纯度为HPLC级。
高效液相色谱测定条件：
色谱柱：伊利特Hypersil BDS C18 4.6x 250mm，5μm；流速：1.0ml/min；停止时间：20min；柱温：40度；DAD设置：UV 334nm，10nm(带宽)，参比390nm，20nm(带宽)。
洗脱程序如表3所示。
表3、HPLC洗脱程序
Figure GDA0003434861340000101
Figure GDA0003434861340000111
自动进样器分别取0.5μl样品，2.5μl硼酸缓冲液，0.5μl衍生剂，32μl超纯水，混合衍生后进样。
4.3菌株发酵的L-组氨酸产量：
根据上述发酵方案测定方法，比较各菌株的L-组氨酸发酵产量，每个菌株做3个平行实验，结果如表4所示。
表4、菌株发酵的L-组氨酸水平比较
Figure GDA0003434861340000112
由表4可见，基因工程菌株W3110::PtrcHisGK136E,S226Ter的L-组氨酸产量比W3110::PtrcHisG提高了约3.75倍。因此验证了通过定向进化组合高通量筛选获得的hisGK136E ,S226Ter突变体可有效解除组氨酸或其合成中间代谢物对ATP磷酸核糖基转移酶的抑制，提高了L-组氨酸的产量，为后续菌株的基因工程改造奠定了基础，值得进一步开发利用。
序列表
<110> 浙江华睿生物技术有限公司
<120> 一种提高L-组氨酸产生菌生产能力的方法
<130> SHPI2010425
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
gtggctgctg gccaaccagc cgaggtaaga cagcgcccct agttcaaggc ttg 53
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
agtgccaagc ttgcatgcct gcaggtcgac tctagagcac gagacggtcc tcaaccatg 59
<210> 3
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
tcctaggtat aatactagtt tttattgcgc ggttgataag ttttagagct agaaatagc 59
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
actagtatta tacctaggac tg 22
<210> 5
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
tcctaggtat aatactagtg ctgctaattg atcctcggtt ttagagctag aaatagc 57
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
cagattagtt tcactcaatg atg 23
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
ccccgaggat caattagcag ctaaaccact ttcacgttag aaagc 45
<210> 8
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
gctgctaatt gatcctcggg gtcgccatga gctttaacac aatca 45
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
gatctcatcg gcaatcggcg gcg 23
<210> 10
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
gagccggatg attaattgtc aataaaccac tttcacgtta gaaag 45
<210> 11
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
ctttctaacg tgaaagtggt ttattgacaa ttaatcatcc ggctc 45
<210> 12
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
gtgttaaagc tcatggcgat cactccatca tcttctcaat c 41
<210> 13
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
gattgagaag atgatggagt gatcgccatg agctttaaca c 41
<210> 14
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
gataacaatt tcacacagga aacagaccat gacagacaac actcgtttac 50
<210> 15
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
gcctgcaggt cgactctaga ggatcctcac tccatcatct tctcaatc 48
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 16
cgctattttt ggtgccatca g 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 17
gctgtattcc cgcagggcct c 21
<210> 18
<211> 299
<212> PRT
<213> Escherichia coli W3110
<400> 18
Met Thr Asp Asn Thr Arg Leu Arg Ile Ala Met Gln Lys Ser Gly Arg
1 5 10 15
Leu Ser Asp Asp Ser Arg Glu Leu Leu Ala Arg Cys Gly Ile Lys Ile
20 25 30
Asn Leu His Thr Gln Arg Leu Ile Ala Met Ala Glu Asn Met Pro Ile
35 40 45
Asp Ile Leu Arg Val Arg Asp Asp Asp Ile Pro Gly Leu Val Met Asp
50 55 60
Gly Val Val Asp Leu Gly Ile Ile Gly Glu Asn Val Leu Glu Glu Glu
65 70 75 80
Leu Leu Asn Arg Arg Ala Gln Gly Glu Asp Pro Arg Tyr Phe Thr Leu
85 90 95
Arg Arg Leu Asp Phe Gly Gly Cys Arg Leu Ser Leu Ala Thr Pro Val
100 105 110
Asp Glu Ala Trp Asp Gly Pro Leu Ser Leu Asn Gly Lys Arg Ile Ala
115 120 125
Thr Ser Tyr Pro His Leu Leu Lys Arg Tyr Leu Asp Gln Lys Gly Ile
130 135 140
Ser Phe Lys Ser Cys Leu Leu Asn Gly Ser Val Glu Val Ala Pro Arg
145 150 155 160
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Ile Cys Asp Leu Val Ser Thr Gly Ala Thr
165 170 175
Leu Glu Ala Asn Gly Leu Arg Glu Val Glu Val Ile Tyr Arg Ser Lys
180 185 190
Ala Cys Leu Ile Gln Arg Asp Gly Glu Met Glu Glu Ser Lys Gln Gln
195 200 205
Leu Ile Asp Lys Leu Leu Thr Arg Ile Gln Gly Val Ile Gln Ala Arg
210 215 220
Glu Ser Lys Tyr Ile Met Met His Ala Pro Thr Glu Arg Leu Asp Glu
225 230 235 240
Val Ile Ala Leu Leu Pro Gly Ala Glu Arg Pro Thr Ile Leu Pro Leu
245 250 255
Ala Gly Asp Gln Gln Arg Val Ala Met His Met Val Ser Ser Glu Thr
260 265 270
Leu Phe Trp Glu Thr Met Glu Lys Leu Lys Ala Leu Gly Ala Ser Ser
275 280 285
Ile Leu Val Leu Pro Ile Glu Lys Met Met Glu
290 295
<210> 19
<211> 900
<212> DNA
<213> Escherichia coli W3110
<400> 19
atgacagaca acactcgttt acgcatagct atgcagaaat ccggccgttt aagtgatgac 60
tcacgcgaat tgctggcgcg ctgtggcatt aaaattaatc ttcacaccca gcgcctgatc 120
gcgatggcag aaaacatgcc gattgatatt ctgcgcgtgc gtgacgacga cattcccggt 180
ctggtaatgg atggcgtggt agaccttggg attatcggcg aaaacgtgct ggaagaagag 240
ctgcttaacc gccgcgccca gggtgaagat ccacgctact ttaccctgcg tcgtctggat 300
ttcggcggct gtcgtctttc gctggcaacg ccggttgatg aagcctggga cggtccgctc 360
tccttaaacg gtaaacgtat cgccacctct tatcctcacc tgctcaagcg ttatctcgac 420
cagaaaggca tctcttttaa atcctgctta ctgaacggtt ctgttgaagt cgccccgcgt 480
gccggactgg cggatgcgat ttgcgatctg gtttccaccg gtgccacgct ggaagctaac 540
ggcctgcgcg aagtcgaagt tatctatcgc tcgaaagcct gcctgattca acgcgatggc 600
gaaatggaag aatccaaaca gcaactgatc gacaaactgc tgacccgtat tcagggtgtg 660
atccaggcgc gcgaatcaaa atacatcatg atgcacgcac cgaccgaacg tctggatgaa 720
gtcatcgccc tgctgccagg tgccgaacgc ccaactattc tgccgctggc gggtgaccaa 780
cagcgcgtag cgatgcacat ggtcagcagc gaaaccctgt tctgggaaac catggaaaaa 840
ctgaaagcgc tgggtgccag ttcaattctg gtcctgccga ttgagaagat gatggagtga 900
<210> 20
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 20
Met Thr Asp Asn Thr Arg Leu Arg Ile Ala Met Gln Lys Ser Gly Arg
1 5 10 15
Leu Ser Asp Asp Ser Arg Glu Leu Leu Ala Arg Cys Gly Ile Lys Ile
20 25 30
Asn Leu His Thr Gln Arg Leu Ile Ala Met Ala Glu Asn Met Pro Ile
35 40 45
Asp Ile Leu Arg Val Arg Asp Asp Asp Ile Pro Gly Leu Val Met Asp
50 55 60
Gly Val Val Asp Leu Gly Ile Ile Gly Glu Asn Val Leu Glu Glu Glu
65 70 75 80
Leu Leu Asn Arg Arg Ala Gln Gly Glu Asp Pro Arg Tyr Phe Thr Leu
85 90 95
Arg Arg Leu Asp Phe Gly Gly Cys Arg Leu Ser Leu Ala Thr Pro Val
100 105 110
Asp Glu Ala Trp Asp Gly Pro Leu Ser Leu Asn Gly Lys Arg Ile Ala
115 120 125
Thr Ser Tyr Pro His Leu Leu Glu Arg Tyr Leu Asp Gln Lys Gly Ile
130 135 140
Ser Phe Lys Ser Cys Leu Leu Asn Gly Ser Val Glu Val Ala Pro Arg
145 150 155 160
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Ile Cys Asp Leu Val Ser Thr Gly Ala Thr
165 170 175
Leu Glu Ala Asn Gly Leu Arg Glu Val Glu Val Ile Tyr Arg Ser Lys
180 185 190
Ala Cys Leu Ile Gln Arg Asp Gly Glu Met Glu Glu Ser Lys Gln Gln
195 200 205
Leu Ile Asp Lys Leu Leu Thr Arg Ile Gln Gly Val Ile Gln Ala Arg
210 215 220
Glu
225
<210> 21
<211> 900
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 21
atgacagaca acactcgttt acgcatagct atgcagaaat ccggccgttt aagtgatgac 60
tcacgcgaat tgctggcgcg ctgtggcatt aaaattaatc ttcacaccca gcgcctgatc 120
gcgatggcag aaaacatgcc gattgatatt ctgcgcgtgc gtgacgacga cattcccggt 180
ctggtaatgg atggcgtggt agaccttggg attatcggcg aaaacgtgct ggaagaagag 240
ctgcttaacc gccgcgccca gggtgaagat ccacgctact ttaccctgcg tcgtctggat 300
ttcggcggct gtcgtctttc gctggcaacg ccggttgatg aagcctggga cggtccgctc 360
tccttaaacg gtaaacgtat cgccacctct tatcctcacc tgctcgagcg ttatctcgac 420
cagaaaggca tctcttttaa atcctgctta ctgaacggtt ctgttgaagt cgccccgcgt 480
gccggactgg cggatgcgat ttgcgatctg gtttccaccg gtgccacgct ggaagctaac 540
ggcctgcgcg aagtcgaagt tatctatcgc tcgaaagcct gcctgattca acgcgatggc 600
gaaatggaag aatccaaaca gcaactgatc gacaaactgc tgacccgtat tcagggtgtg 660
atccaggcgc gcgaatgaaa atacatcatg atgcacgcac cgaccgaacg tctggatgaa 720
gtcatcgccc tgctgccagg tgccgaacgc ccaactattc tgccgctggc gggtgaccaa 780
cagcgcgtag cgatgcacat ggtcagcagc gaaaccctgt tctgggaaac catggaaaaa 840
ctgaaagcgc tgggtgccag ttcaattctg gtcctgccga ttgagaagat gatggagtga 900

Claims (7)

1.一种提高L-组氨酸产生菌生产能力的方法，包括以下步骤：
A. 对于大肠杆菌W3110来源的ATP磷酸核糖基转移酶进行突变，获得酶活力提高的突变体，其中所述ATP磷酸核糖基转移酶的氨基酸序列为SEQ ID NO: 18，所述突变体是SEQID NO: 18的K136E、S226Ter突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO: 20，其中Ter为终止子；
B. 设计编码步骤A中所得ATP磷酸核糖基转移酶突变体的基因；
C. 将步骤B中所述基因整合入大肠杆菌的基因组中、或者替换大肠杆菌基因组中原始的ATP磷酸核糖基转移酶编码基因，获得基因工程菌。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述突变体的编码基因是SEQ ID NO: 21。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤C通过基因编辑技术实现。
4.一种基因工程菌，其特征在于，按照如权利要求1-3中任一项所述的方法构建得到。
5.如权利要求4所述基因工程菌用于生产L-组氨酸的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，通过所述基因工程菌的发酵来生产L-组氨酸。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，种子培养基组成为：20 g/L葡萄糖，4 g/L酵母提取物，3 g/L蛋白胨，1.2 g/L磷酸二氢钾，0.5 g/L硫酸镁·7H2O，10 mg/L硫酸亚铁·7H2O，10 mg/L一水合硫酸锰，1 mg/L VB1，1 mg/L VB3，1 mg/L VB5，1 mg/L VB12，1 mg/LVH，氢氧化钠调节至pH7.0-7.2。
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