CN112437811B - 一种重组nad合成酶及其基因和应用 - Google Patents

一种重组nad合成酶及其基因和应用 Download PDF

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Abstract

提供一种重组NAD合成酶及其基因和应用。该酶包含来源于流感嗜血杆菌的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶结构域以及来源于人类、酿酒酵母、大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌中的任意一种的烟酰胺核糖激酶结构域，能够应用于工业生产中以NR和ATP为原料规模化生产NAD。

Description

一种重组NAD合成酶及其基因和应用
技术领域
本发明涉及生物酶催化和基因工程技术领域，特别涉及一种通过基因工程技术手段人工获得的重组NAD合成酶、其基因以及用于规模化催化NR和ATP转化生产NAD的工业用途。
背景技术
NAD合成酶，是指烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide，缩写NAD)合成酶，也写作NADR或NadR，是一种催化底物转化成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的酶。
NAD是存在于包括人类细胞在内的几乎所有活细胞中的一种生理物质，对人体无毒副作用，这种物质是很多可催化氧化—还原反应的酶的辅助因子，其参与细胞物质代谢、能量合成、细胞DNA修复等多种生理活动，是线粒体中能量产生链中的控制标志物，被称为辅酶Ⅰ。
NAD的用途非常广泛，可以用于化工催化反应、原料药生产、保健品行业、化妆品行业等，市场需求量很大。目前，工业上生产NAD的方法一般包括两种，一种为化学法，另一种为生物催化法，生物催化法因相较于化学法具有反应条件温和、节能环保、无有机溶剂残留等优点而逐渐成为主流。
NAD的生物催化法生产具体是指，以烟酰胺单核苷酸(NMN)和三磷酸腺苷(ATP)为原料，在烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(NMNAT)的催化作用下，生产NAD。此种方法存在一个弊端，就是NMN的价格特别昂贵，从而导致NAD的生产成本极高，在市场上没有竞争优势。因此，工业上多采用以NMN的前体物质烟酰胺核糖(NR)替代NMN，同时加入用于催化NR转化成NMN的生物催化剂烟酰胺核糖激酶(NRK)的生物催化方法。此种方法的缺点在于，需要进行两步酶催化反应，导致反应时间延长，生产操作步骤增多。NAD合成酶的优势就在于能够以NR和ATP为原料，经一步催化合成NAD。
目前已在多种生物体内发现了自然存在的NAD合成酶，如，来源于鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)中的stNadR，来源于流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)中的hiNadR,，来源于大肠杆菌(Escherichia coli)中的ecNadR等。但是这些自然存在的NAD合成酶的活性存在明显的偏向性，如，hiNadR虽具有较高的将NMN转化为NAD的活性，但将NR转化为NMN的活性则相对弱一些，而stNadR、ecNadR的活性则刚好与之相反。因此，在采用这些自然存在的NAD合成酶催化NR和ATP转化生产NAD时存在转化率偏低的问题，导致生产NAD的产量低、成本高，从而无法满足在工业上应用的条件，限制了NAD合成酶在规模化工业生产中的应用。
发明内容
鉴于上述背景技术中提到的现有技术的不足，本发明的目的在于克服自然存在的NAD合成酶催化NR和ATP转化成NAD的转化率偏低的技术问题，开发一种适于规模化工业应用的重组NAD合成酶，从而解决现有NAD的工业化生产方法存在的生产成本高、操作繁琐的技术难题。
为实现上述目的，发明人对目前已知基因进行了大量的试验和筛选，并利用基因工程学技术手段对筛选到的已知目的基因片段进行融合从而获得一系列重组NAD合成酶，最终筛选出其中酶活性得到显著提高的融合产物。基于此，本发明提供了一种重组NAD合成酶，所述重组NAD合成酶包含来源于流感嗜血杆菌的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶结构域以及来源于人类、酿酒酵母、大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌中的任意一种的烟酰胺核糖激酶结构域。
本发明提供的上述重组NAD合成酶中，流感嗜血杆菌、酿酒酵母、大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌是指该名称菌种下的所有类型的菌株，即，来源于流感嗜血杆菌、酿酒酵母、大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌菌种下的所有类型的菌株的对应酶结构域都适用本发明。
优选地，本发明提供的上述重组NAD合成酶中，烟酰胺核糖激酶结构域融合在烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶结构域的C端。
更优选地，本发明提供的上述重组NAD合成酶中，烟酰胺核糖激酶结构域通过柔性连接肽段与烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶结构域进行融合，前述柔性连接肽段的序列为GSGSGSGS。该连接肽段是发明人针对融合的两个酶结构域的结构特征特别设计并经多次筛选和试验验证而确定的，相较于其他连接肽段，该肽段可起到增强蛋白表达的作用。
更优选地，本发明提供的上述重组NAD合成酶中，来源于流感嗜血杆菌的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶结构域的氨基酸序列为UniProt中登录号为P44308[52-224]的氨基酸序列，命名为hiNMNAT；来源于人类、酿酒酵母、大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的烟酰胺核糖激酶结构域的氨基酸序列依次为UniProt中登录号为Q9NWW6、Q9NPI5、P53915、P27278[230-410]和P24518[230-410]的氨基酸序列，对应的命名依次为hNRK1、hNRK2、yNRK1、ecNRK和stNRK。
更优选地，本发明提供的上述重组NAD合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：4至SEQID NO：8所示。
本发明同时还提供了一种基因序列，该基因序列编码本发明提供的上述重组NAD合成酶。
本发明同时还提供了一种生物材料，包括重组载体、重组细胞或者重组微生物，该生物材料含有本发明提供的上述基因序列。即，本发明提供的生物材料是含有本发明提供的上述基因序列的重组载体，或者是含有本发明提供的上述基因序列的重组细胞，又或者是含有本发明提供的上述基因序列的重组微生物。
另外，本发明还提供了上述重组NAD合成酶的用途，即应用于工业生产中以NR和ATP为原料规模化生产NAD。
有益效果
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、与自然界存在的NAD合成酶相比，本发明提供的重组NAD合成酶的酶活力显著提高，经试验检测，其酶活力是自然界存在的常用NAD合成酶的3.5-65倍，其催化NR和ATP转化生成NAD的产率增加了400％以上，从而能够适用于NAD的规模化工业大生产中。
2、与现有的生物催化生产NAD的方法相比，应用本发明提供的重组NAD合成酶生产NAD时，可实现以NR和ATP为原料一步催化生成NAD，其投料成本降低的同时，又能缩短反应时间，减少工业操作步骤，从而大大降低了生产成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释，本发明并不局限于以下实施例。若无特别说明，本发明实施例中所使用的原料及试剂皆为市售商品，实施例中未注明具体条件者，均按常规条件或制造商建议的条件进行。
1、NAD合成酶质粒的构建
(1)自然界存在的NAD合成酶质粒
设计如下引物对(SEQ ID NO：9至SEQ ID NO：14)
ecNadR-1-NdeⅠ-up：CCCATATGTCGTCATTTGATTACCTG
ecNadR-end-XhoⅠ-dn：CCCTCGAGTTATCTCTGCTCCCCCATCATCT
stNadR-1-NdeⅠ-up：CCCATATGTCATCGTTCGACTATCTCAA
stNadR-end-XhoⅠ-dn：CCCTCGAGTTATCCCTGCTCGCCCATCATC
hiNadR-52-NdeⅠ-up：CCCATATGTCAAAAACAAAAGAGAAAAA
hiNadR-end-NdeⅠ-up：CCCTCGAGTCATTGAGATGTCCCTTTTAT
利用PCR扩增技术分别对来源于大肠杆菌(Escherichia coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)中的NAD合成酶(ecNadR、stNadR和hiNadR)的基因序列进行扩增，然后利用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ将扩增产物连接到载体pET-28a上，分别得到质粒pET28a-ecNadR、pET28a-stNadR和pET28a-hiNadR，经测序确认其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3所示。
(2)本发明提供的重组NAD合成酶质粒
参考蛋白数据库公开的hiNMNAT、hNRK1、hNRK2、yNRK1、ecNRK和stNRK的氨基酸序列(UniProt登录号分别为：P44308[52-224]、Q9NWW6、Q9NPI5、P53915、P27278[230-410]和P24518[230-410])，结合序列比对和结构功能分析，设计带有柔性连接肽段GSGSGSGS序列的引物将hiNMNAT和hNRK1、hNRK2、yNRK1、ecNRK、stNRK的基因序列分别扩增出来，然后以扩增产物为模板，利用引物将hiNMNAT分别与hNRK1、hNRK2、yNRK1、ecNRK、stNRK进行融合PCR，即得到本发明提供的重组NAD合成酶hihNadR1、hihNadR2、hiyNadR、hiecNadR和histNadR的融合基因片段，其对应的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：8所示。再利用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ将融合基因片段连接到载体pET-22b上，分别得到质粒pET22b-hihNadR1、pET22b-hihNadR2、pET22b-hiyNadR、pET22b-hiecNadR和pET22b-histNadR。
2、NAD合成酶酶液的制备
将第1部分构建好的NAD合成酶质粒分别转化50μL BL21(DE3)感受态细胞，加入900μL Luria Broth(LB)培养基37℃活化1h，接入10-20mL LB培养基(含100mg/L氨苄青霉素或50mg/L卡那霉素)中37℃培养6h-16h，然后接入1-4L LB培养基(含100mg/L氨苄青霉素或50mg/L卡那霉素)中37℃培养至OD600＝0.8-1，调节温度至16-37℃，加入0.2-1mM IPTG诱导蛋白表达。4-20h后离心收集菌体，用20mL破菌液(20mM Tris-HCl pH7.5,100mM NaCl,10mM咪唑)重悬。然后用均质机破碎细胞，离心(4℃,12000g,25min)收集上清液。
上清液中加入30mL Buffer A(20mM Tris-HCl pH7.5,100mM NaCl)平衡后的重力柱(30mL柱体积含4mL Ni-NTA凝胶)，吸附半小时后收集含未结合蛋白流穿液，30mL BufferB(20mM Tris-HCl pH7.5,100mM NaCl,20mM咪唑)冲洗杂蛋白两遍后，10mL Buffer C(20mMTris-HCl pH7.5,100mM NaCl,500mM咪唑)孵育10min后收集含结合目的蛋白的洗脱液，SDS-PAGE蛋白电泳结果显示洗脱液为高纯度目的蛋白，即得NAD合成酶酶液。
3、NAD合成酶酶活力测定
第2部分制备得到的酶液经NanoDrop 2000测定蛋白浓度后稀释至1g/L，取100μL加入到400μL反应液(100mM pH7.2磷酸盐缓冲液、烟酰胺核糖10mM、ATP 20mM、MgCl2 10mM)中，37℃反应15min。反应结束后，通过高效液相色谱(HPLC)测定反应液中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的含量，测定结果如表1所示。一个酶活力单位(U)定义为上述条件下，每分钟转化一微摩尔烟酰胺核糖为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸所需酶量。
表1
酶液 序列来源 NAD生成量 酶活U/mg
ecNadR 大肠杆菌 0.2mM 0.05
stNadR 鼠伤寒沙门氏 0.2mM 0.06
hiNadR 流感嗜血杆菌 0.1mM 0.03
hihNadR1 本发明 0.8mM 0.21
hihNadR2 本发明 7.0mM 1.87
hiyNadR 本发明 1.6mM 0.43
hiecNadR 本发明 5.9mM 1.57
histNadR 本发明 7.4mM 1.97
                         序列表
<110>  邦泰合盛生物科技（深圳）有限公司、邦泰生物工程（深圳）有限公司
<120>  一种重组NAD合成酶及其基因和应用
<160>  14
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  410
<212>  PRT
<213>  大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>  1
Met Ser Ser Phe Asp Tyr Leu Lys Thr Ala Ile Lys Gln Gln Gly Cys
1               5                   10                  15
Thr Leu Gln Gln Val Ala Asp Ala Ser Gly Met Thr Lys Gly Tyr Leu
            20                  25                  30
Ser Gln Leu Leu Asn Ala Lys Ile Lys Ser Pro Ser Ala Gln Lys Leu
        35                  40                  45
Glu Ala Leu His Arg Phe Leu Gly Leu Glu Phe Pro Arg Gln Lys Lys
    50                  55                  60
Thr Ile Gly Val Val Phe Gly Lys Phe Tyr Pro Leu His Thr Gly His
65                  70                  75                  80
Ile Tyr Leu Ile Gln Arg Ala Cys Ser Gln Val Asp Glu Leu His Ile
                85                  90                  95
Ile Met Gly Phe Asp Asp Thr Arg Asp Arg Ala Leu Phe Glu Asp Ser
            100                 105                 110
Ala Met Ser Gln Gln Pro Thr Val Pro Asp Arg Leu Arg Trp Leu Leu
        115                 120                 125
Gln Thr Phe Lys Tyr Gln Lys Asn Ile Arg Ile His Ala Phe Asn Glu
    130                 135                 140
Glu Gly Met Glu Pro Tyr Pro His Gly Trp Asp Val Trp Ser Asn Gly
145                 150                 155                 160
Ile Lys Lys Phe Met Ala Glu Lys Gly Ile Gln Pro Asp Leu Ile Tyr
                165                 170                 175
Thr Ser Glu Glu Ala Asp Ala Pro Gln Tyr Met Glu His Leu Gly Ile
            180                 185                 190
Glu Thr Val Leu Val Asp Pro Lys Arg Thr Phe Met Ser Ile Ser Gly
        195                 200                 205
Ala Gln Ile Arg Glu Asn Pro Phe Arg Tyr Trp Glu Tyr Ile Pro Thr
    210                 215                 220
Glu Val Lys Pro Phe Phe Val Arg Thr Val Ala Ile Leu Gly Gly Glu
225                 230                 235                 240
Ser Ser Gly Lys Ser Thr Leu Val Asn Lys Leu Ala Asn Ile Phe Asn
                245                 250                 255
Thr Thr Ser Ala Trp Glu Tyr Gly Arg Asp Tyr Val Phe Ser His Leu
            260                 265                 270
Gly Gly Asp Glu Ile Ala Leu Gln Tyr Ser Asp Tyr Asp Lys Ile Ala
        275                 280                 285
Leu Gly His Ala Gln Tyr Ile Asp Phe Ala Val Lys Tyr Ala Asn Lys
    290                 295                 300
Val Ala Phe Ile Asp Thr Asp Phe Val Thr Thr Gln Ala Phe Cys Lys
305                 310                 315                 320
Lys Tyr Glu Gly Arg Glu His Pro Phe Val Gln Ala Leu Ile Asp Glu
                325                 330                 335
Tyr Arg Phe Asp Leu Val Ile Leu Leu Glu Asn Asn Thr Pro Trp Val
            340                 345                 350
Ala Asp Gly Leu Arg Ser Leu Gly Ser Ser Val Asp Arg Lys Glu Phe
        355                 360                 365
Gln Asn Leu Leu Val Glu Met Leu Glu Glu Asn Asn Ile Glu Phe Val
    370                 375                 380
Arg Val Glu Glu Glu Asp Tyr Asp Ser Arg Phe Leu Arg Cys Val Glu
385                 390                 395                 400
Leu Val Arg Glu Met Met Gly Glu Gln Arg
                405                 410
<210>  2
<211>  410
<212>  PRT
<213>  鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)
<400>  2
Met Ser Ser Phe Asp Tyr Leu Lys Thr Ala Ile Lys Gln Gln Gly Cys
1               5                   10                  15
Thr Leu Gln Gln Val Ala Asp Ala Ser Gly Met Thr Lys Gly Tyr Leu
            20                  25                  30
Ser Gln Leu Leu Asn Ala Lys Ile Lys Ser Pro Ser Ala Gln Lys Leu
        35                  40                  45
Glu Ala Leu His Arg Phe Leu Gly Leu Glu Phe Pro Arg Arg Gln Lys
    50                  55                  60
Asn Ile Gly Val Val Phe Gly Lys Phe Tyr Pro Leu His Thr Gly His
65                  70                  75                  80
Ile Tyr Leu Ile Gln Arg Ala Cys Ser Gln Val Asp Glu Leu His Ile
                85                  90                  95
Ile Met Gly Tyr Asp Asp Thr Arg Asp Arg Gly Leu Phe Glu Asp Ser
            100                 105                 110
Ala Met Ser Gln Gln Pro Thr Val Ser Asp Arg Leu Arg Trp Leu Leu
        115                 120                 125
Gln Thr Phe Lys Tyr Gln Lys Asn Ile Arg Ile His Ala Phe Asn Glu
    130                 135                 140
Glu Gly Met Glu Pro Tyr Pro His Gly Trp Asp Val Trp Ser Asn Gly
145                 150                 155                 160
Ile Lys Ala Phe Met Ala Glu Lys Gly Ile Gln Pro Ser Trp Ile Tyr
                165                 170                 175
Thr Ser Glu Glu Ala Asp Ala Pro Gln Tyr Leu Glu His Leu Gly Ile
            180                 185                 190
Glu Thr Val Leu Val Asp Pro Glu Arg Thr Phe Met Asn Ile Ser Gly
        195                 200                 205
Ala Gln Ile Arg Glu Asn Pro Phe Arg Tyr Trp Glu Tyr Ile Pro Thr
    210                 215                 220
Glu Val Lys Pro Phe Phe Val Arg Thr Val Ala Ile Leu Gly Gly Glu
225                 230                 235                 240
Ser Ser Gly Lys Ser Thr Leu Val Asn Lys Leu Ala Asn Ile Phe Asn
                245                 250                 255
Thr Thr Ser Ala Trp Glu Tyr Gly Arg Asp Tyr Val Phe Ser His Leu
            260                 265                 270
Gly Gly Asp Glu Met Ala Leu Gln Tyr Ser Asp Tyr Asp Lys Ile Ala
        275                 280                 285
Leu Gly His Ala Gln Tyr Ile Asp Phe Ala Val Lys Tyr Ala Asn Lys
    290                 295                 300
Val Ala Phe Ile Asp Thr Asp Phe Val Thr Thr Gln Ala Phe Cys Lys
305                 310                 315                 320
Lys Tyr Glu Gly Arg Glu His Pro Phe Val Gln Ala Leu Ile Asp Glu
                325                 330                 335
Tyr Arg Phe Asp Leu Val Ile Leu Leu Glu Asn Asn Thr Pro Trp Val
            340                 345                 350
Ala Asp Gly Leu Arg Ser Leu Gly Ser Ser Val Asp Arg Lys Ala Phe
        355                 360                 365
Gln Asn Leu Leu Val Glu Met Leu Lys Glu Asn Asn Ile Glu Phe Val
    370                 375                 380
His Val Lys Glu Ala Asp Tyr Asp Gly Arg Phe Leu Arg Cys Val Glu
385                 390                 395                 400
Leu Val Lys Glu Met Met Gly Glu Gln Gly
                405                 410
<210>  3
<211>  370
<212>  PRT
<213>  流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)
<400>  3
Met Ser Lys Thr Lys Glu Lys Lys Val Gly Val Ile Phe Gly Lys Phe
1               5                   10                  15
Tyr Pro Val His Thr Gly His Ile Asn Met Ile Tyr Glu Ala Phe Ser
            20                  25                  30
Lys Val Asp Glu Leu His Val Ile Val Cys Ser Asp Thr Val Arg Asp
        35                  40                  45
Leu Lys Leu Phe Tyr Asp Ser Lys Met Lys Arg Met Pro Thr Val Gln
    50                  55                  60
Asp Arg Leu Arg Trp Met Gln Gln Ile Phe Lys Tyr Gln Lys Asn Gln
65                  70                  75                  80
Ile Phe Ile His His Leu Val Glu Asp Gly Ile Pro Ser Tyr Pro Asn
                85                  90                  95
Gly Trp Gln Ser Trp Ser Glu Ala Val Lys Thr Leu Phe His Glu Lys
            100                 105                 110
His Phe Glu Pro Ser Ile Val Phe Ser Ser Glu Pro Gln Asp Lys Ala
        115                 120                 125
Pro Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Leu Glu Val Ser Leu Val Asp Pro Asp
    130                 135                 140
Arg Thr Phe Phe Asn Val Ser Ala Thr Lys Ile Arg Thr Thr Pro Phe
145                 150                 155                 160
Gln Tyr Trp Lys Phe Ile Pro Lys Glu Ala Arg Pro Phe Phe Ala Lys
                165                 170                 175
Thr Val Ala Ile Leu Gly Gly Glu Ser Ser Gly Lys Ser Val Leu Val
            180                 185                 190
Asn Lys Leu Ala Ala Val Phe Asn Thr Thr Ser Ala Trp Glu Tyr Gly
        195                 200                 205
Arg Glu Phe Val Phe Glu Lys Leu Gly Gly Asp Glu Gln Ala Met Gln
    210                 215                 220
Tyr Ser Asp Tyr Pro Gln Met Ala Leu Gly His Gln Arg Tyr Ile Asp
225                 230                 235                 240
Tyr Ala Val Arg His Ser His Lys Ile Ala Phe Ile Asp Thr Asp Phe
                245                 250                 255
Ile Thr Thr Gln Ala Phe Cys Ile Gln Tyr Glu Gly Lys Ala His Pro
            260                 265                 270
Phe Leu Asp Ser Met Ile Lys Glu Tyr Pro Phe Asp Val Thr Ile Leu
        275                 280                 285
Leu Lys Asn Asn Thr Glu Trp Val Asp Asp Gly Leu Arg Ser Leu Gly
    290                 295                 300
Ser Gln Lys Gln Arg Gln Gln Phe Gln Gln Leu Leu Lys Lys Leu Leu
305                 310                 315                 320
Asp Lys Tyr Lys Val Pro Tyr Ile Glu Ile Glu Ser Pro Ser Tyr Leu
                325                 330                 335
Asp Arg Tyr Asn Gln Val Lys Ala Val Ile Glu Lys Val Leu Asn Glu
            340                 345                 350
Glu Glu Ile Ser Glu Leu Gln Asn Thr Thr Phe Pro Ile Lys Gly Thr
        355                 360                 365
Ser Gln
    370
<210>  4
<211>  380
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  4
Met Ser Lys Thr Lys Glu Lys Lys Val Gly Val Ile Phe Gly Lys Phe
1               5                   10                  15
Tyr Pro Val His Thr Gly His Ile Asn Met Ile Tyr Glu Ala Phe Ser
            20                  25                  30
Lys Val Asp Glu Leu His Val Ile Val Cys Ser Asp Thr Val Arg Asp
        35                  40                  45
Leu Lys Leu Phe Tyr Asp Ser Lys Met Lys Arg Met Pro Thr Val Gln
    50                  55                  60
Asp Arg Leu Arg Trp Met Gln Gln Ile Phe Lys Tyr Gln Lys Asn Gln
65                  70                  75                  80
Ile Phe Ile His His Leu Val Glu Asp Gly Ile Pro Ser Tyr Pro Asn
                85                  90                  95
Gly Trp Gln Ser Trp Ser Glu Ala Val Lys Thr Leu Phe His Glu Lys
            100                 105                 110
His Phe Glu Pro Ser Ile Val Phe Ser Ser Glu Pro Gln Asp Lys Ala
        115                 120                 125
Pro Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Leu Glu Val Ser Leu Val Asp Pro Asp
    130                 135                 140
Arg Thr Phe Phe Asn Val Ser Ala Thr Lys Ile Arg Thr Thr Pro Phe
145                 150                 155                 160
Gln Tyr Trp Lys Phe Ile Pro Lys Glu Ala Arg Pro Phe Gly Ser Gly
                165                 170                 175
Ser Gly Ser Gly Ser Met Lys Thr Phe Ile Ile Gly Ile Ser Gly Val
            180                 185                 190
Thr Asn Ser Gly Lys Thr Thr Leu Ala Lys Asn Leu Gln Lys His Leu
        195                 200                 205
Pro Asn Cys Ser Val Ile Ser Gln Asp Asp Phe Phe Lys Pro Glu Ser
    210                 215                 220
Glu Ile Glu Thr Asp Lys Asn Gly Phe Leu Gln Tyr Asp Val Leu Glu
225                 230                 235                 240
Ala Leu Asn Met Glu Lys Met Met Ser Ala Ile Ser Cys Trp Met Glu
                245                 250                 255
Ser Ala Arg His Ser Val Val Ser Thr Asp Gln Glu Ser Ala Glu Glu
            260                 265                 270
Ile Pro Ile Leu Ile Ile Glu Gly Phe Leu Leu Phe Asn Tyr Lys Pro
        275                 280                 285
Leu Asp Thr Ile Trp Asn Arg Ser Tyr Phe Leu Thr Ile Pro Tyr Glu
    290                 295                 300
Glu Cys Lys Arg Arg Arg Ser Thr Arg Val Tyr Gln Pro Pro Asp Ser
305                 310                 315                 320
Pro Gly Tyr Phe Asp Gly His Val Trp Pro Met Tyr Leu Lys Tyr Arg
                325                 330                 335
Gln Glu Met Gln Asp Ile Thr Trp Glu Val Val Tyr Leu Asp Gly Thr
            340                 345                 350
Lys Ser Glu Glu Asp Leu Phe Leu Gln Val Tyr Glu Asp Leu Ile Gln
        355                 360                 365
Glu Leu Ala Lys Gln Lys Cys Leu Gln Val Thr Ala
    370                 375                 380
<210>  5
<211>  411
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  5
Met Ser Lys Thr Lys Glu Lys Lys Val Gly Val Ile Phe Gly Lys Phe
1               5                   10                  15
Tyr Pro Val His Thr Gly His Ile Asn Met Ile Tyr Glu Ala Phe Ser
            20                  25                  30
Lys Val Asp Glu Leu His Val Ile Val Cys Ser Asp Thr Val Arg Asp
        35                  40                  45
Leu Lys Leu Phe Tyr Asp Ser Lys Met Lys Arg Met Pro Thr Val Gln
    50                  55                  60
Asp Arg Leu Arg Trp Met Gln Gln Ile Phe Lys Tyr Gln Lys Asn Gln
65                  70                  75                  80
Ile Phe Ile His His Leu Val Glu Asp Gly Ile Pro Ser Tyr Pro Asn
                85                  90                  95
Gly Trp Gln Ser Trp Ser Glu Ala Val Lys Thr Leu Phe His Glu Lys
            100                 105                 110
His Phe Glu Pro Ser Ile Val Phe Ser Ser Glu Pro Gln Asp Lys Ala
        115                 120                 125
Pro Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Leu Glu Val Ser Leu Val Asp Pro Asp
    130                 135                 140
Arg Thr Phe Phe Asn Val Ser Ala Thr Lys Ile Arg Thr Thr Pro Phe
145                 150                 155                 160
Gln Tyr Trp Lys Phe Ile Pro Lys Glu Ala Arg Pro Phe Gly Ser Gly
                165                 170                 175
Ser Gly Ser Gly Ser Met Lys Leu Ile Val Gly Ile Gly Gly Met Thr
            180                 185                 190
Asn Gly Gly Lys Thr Thr Leu Thr Asn Ser Leu Leu Arg Ala Leu Pro
        195                 200                 205
Asn Cys Cys Val Ile His Gln Asp Asp Phe Phe Lys Pro Gln Asp Gln
    210                 215                 220
Ile Ala Val Gly Glu Asp Gly Phe Lys Gln Trp Asp Val Leu Glu Ser
225                 230                 235                 240
Leu Asp Met Glu Ala Met Leu Asp Thr Val Gln Ala Trp Leu Ser Ser
                245                 250                 255
Pro Gln Lys Phe Ala Arg Ala His Gly Val Ser Val Gln Pro Glu Ala
            260                 265                 270
Ser Asp Thr His Ile Leu Leu Leu Glu Gly Phe Leu Leu Tyr Ser Tyr
        275                 280                 285
Lys Pro Leu Val Asp Leu Tyr Ser Arg Arg Tyr Phe Leu Thr Val Pro
    290                 295                 300
Tyr Glu Glu Cys Lys Trp Arg Arg Ser Thr Arg Asn Tyr Thr Val Pro
305                 310                 315                 320
Asp Pro Pro Gly Leu Phe Asp Gly His Val Trp Pro Met Tyr Gln Lys
                325                 330                 335
Tyr Arg Gln Glu Met Glu Ala Asn Gly Val Glu Val Val Tyr Leu Asp
            340                 345                 350
Gly Met Lys Ser Arg Glu Glu Leu Phe Arg Glu Val Leu Glu Asp Ile
        355                 360                 365
Gln Asn Ser Leu Leu Asn Arg Ser Gln Glu Ser Ala Pro Ser Pro Ala
    370                 375                 380
Arg Pro Ala Arg Thr Gln Gly Pro Gly Arg Gly Cys Gly His Arg Thr
385                 390                 395                 400
Ala Arg Pro Ala Ala Ser Gln Gln Asp Ser Met
                405                 410
<210>  6
<211>  421
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  6
Met Ser Lys Thr Lys Glu Lys Lys Val Gly Val Ile Phe Gly Lys Phe
1               5                   10                  15
Tyr Pro Val His Thr Gly His Ile Asn Met Ile Tyr Glu Ala Phe Ser
            20                  25                  30
Lys Val Asp Glu Leu His Val Ile Val Cys Ser Asp Thr Val Arg Asp
        35                  40                  45
Leu Lys Leu Phe Tyr Asp Ser Lys Met Lys Arg Met Pro Thr Val Gln
    50                  55                  60
Asp Arg Leu Arg Trp Met Gln Gln Ile Phe Lys Tyr Gln Lys Asn Gln
65                  70                  75                  80
Ile Phe Ile His His Leu Val Glu Asp Gly Ile Pro Ser Tyr Pro Asn
                85                  90                  95
Gly Trp Gln Ser Trp Ser Glu Ala Val Lys Thr Leu Phe His Glu Lys
            100                 105                 110
His Phe Glu Pro Ser Ile Val Phe Ser Ser Glu Pro Gln Asp Lys Ala
        115                 120                 125
Pro Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Leu Glu Val Ser Leu Val Asp Pro Asp
    130                 135                 140
Arg Thr Phe Phe Asn Val Ser Ala Thr Lys Ile Arg Thr Thr Pro Phe
145                 150                 155                 160
Gln Tyr Trp Lys Phe Ile Pro Lys Glu Ala Arg Pro Phe Gly Ser Gly
                165                 170                 175
Ser Gly Ser Gly Ser Met Thr Ser Lys Lys Val Ile Leu Val Ala Leu
            180                 185                 190
Ser Gly Cys Ser Ser Ser Gly Lys Thr Thr Ile Ala Lys Leu Thr Ala
        195                 200                 205
Ser Leu Phe Thr Lys Ala Thr Leu Ile His Glu Asp Asp Phe Tyr Lys
    210                 215                 220
His Asp Asn Glu Val Pro Val Asp Ala Lys Tyr Asn Ile Gln Asn Trp
225                 230                 235                 240
Asp Ser Pro Glu Ala Leu Asp Phe Lys Leu Phe Gly Lys Glu Leu Asp
                245                 250                 255
Val Ile Lys Gln Thr Gly Lys Ile Ala Thr Lys Leu Ile His Asn Asn
            260                 265                 270
Asn Val Asp Asp Pro Phe Thr Lys Phe His Ile Asp Arg Gln Val Trp
        275                 280                 285
Asp Glu Leu Lys Ala Lys Tyr Asp Ser Ile Asn Asp Asp Lys Tyr Glu
    290                 295                 300
Val Val Ile Val Asp Gly Phe Met Ile Phe Asn Asn Thr Gly Ile Ser
305                 310                 315                 320
Lys Lys Phe Asp Leu Lys Ile Leu Val Arg Ala Pro Tyr Glu Val Leu
                325                 330                 335
Lys Lys Arg Arg Ala Ser Arg Lys Gly Tyr Gln Thr Leu Asp Ser Phe
            340                 345                 350
Trp Val Asp Pro Pro Tyr Tyr Phe Asp Glu Phe Val Tyr Glu Ser Tyr
        355                 360                 365
Arg Ala Asn His Ala Gln Leu Phe Val Asn Gly Asp Val Glu Gly Leu
    370                 375                 380
Leu Asp Pro Arg Lys Ser Lys Asn Ile Lys Glu Phe Ile Asn Asp Asp
385                 390                 395                 400
Asp Thr Pro Ile Ala Lys Pro Leu Ser Trp Val Cys Gln Glu Ile Leu
                405                 410                 415
Lys Leu Cys Lys Asp
            420
<210>  7
<211>  362
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  7
Met Ser Lys Thr Lys Glu Lys Lys Val Gly Val Ile Phe Gly Lys Phe
1               5                   10                  15
Tyr Pro Val His Thr Gly His Ile Asn Met Ile Tyr Glu Ala Phe Ser
            20                  25                  30
Lys Val Asp Glu Leu His Val Ile Val Cys Ser Asp Thr Val Arg Asp
        35                  40                  45
Leu Lys Leu Phe Tyr Asp Ser Lys Met Lys Arg Met Pro Thr Val Gln
    50                  55                  60
Asp Arg Leu Arg Trp Met Gln Gln Ile Phe Lys Tyr Gln Lys Asn Gln
65                  70                  75                  80
Ile Phe Ile His His Leu Val Glu Asp Gly Ile Pro Ser Tyr Pro Asn
                85                  90                  95
Gly Trp Gln Ser Trp Ser Glu Ala Val Lys Thr Leu Phe His Glu Lys
            100                 105                 110
His Phe Glu Pro Ser Ile Val Phe Ser Ser Glu Pro Gln Asp Lys Ala
        115                 120                 125
Pro Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Leu Glu Val Ser Leu Val Asp Pro Asp
    130                 135                 140
Arg Thr Phe Phe Asn Val Ser Ala Thr Lys Ile Arg Thr Thr Pro Phe
145                 150                 155                 160
Gln Tyr Trp Lys Phe Ile Pro Lys Glu Ala Arg Pro Phe Gly Ser Gly
                165                 170                 175
Ser Gly Ser Gly Ser Phe Val Arg Thr Val Ala Ile Leu Gly Gly Glu
            180                 185                 190
Ser Ser Gly Lys Ser Thr Leu Val Asn Lys Leu Ala Asn Ile Phe Asn
        195                 200                 205
Thr Thr Ser Ala Trp Glu Tyr Gly Arg Asp Tyr Val Phe Ser His Leu
    210                 215                 220
Gly Gly Asp Glu Ile Ala Leu Gln Tyr Ser Asp Tyr Asp Lys Ile Ala
225                 230                 235                 240
Leu Gly His Ala Gln Tyr Ile Asp Phe Ala Val Lys Tyr Ala Asn Lys
                245                 250                 255
Val Ala Phe Ile Asp Thr Asp Phe Val Thr Thr Gln Ala Phe Cys Lys
            260                 265                 270
Lys Tyr Glu Gly Arg Glu His Pro Phe Val Gln Ala Leu Ile Asp Glu
        275                 280                 285
Tyr Arg Phe Asp Leu Val Ile Leu Leu Glu Asn Asn Thr Pro Trp Val
    290                 295                 300
Ala Asp Gly Leu Arg Ser Leu Gly Ser Ser Val Asp Arg Lys Glu Phe
305                 310                 315                 320
Gln Asn Leu Leu Val Glu Met Leu Glu Glu Asn Asn Ile Glu Phe Val
                325                 330                 335
Arg Val Glu Glu Glu Asp Tyr Asp Ser Arg Phe Leu Arg Cys Val Glu
            340                 345                 350
Leu Val Arg Glu Met Met Gly Glu Gln Arg
        355                 360
<210>  8
<211>  362
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  8
Met Ser Lys Thr Lys Glu Lys Lys Val Gly Val Ile Phe Gly Lys Phe
1               5                   10                  15
Tyr Pro Val His Thr Gly His Ile Asn Met Ile Tyr Glu Ala Phe Ser
            20                  25                  30
Lys Val Asp Glu Leu His Val Ile Val Cys Ser Asp Thr Val Arg Asp
        35                  40                  45
Leu Lys Leu Phe Tyr Asp Ser Lys Met Lys Arg Met Pro Thr Val Gln
    50                  55                  60
Asp Arg Leu Arg Trp Met Gln Gln Ile Phe Lys Tyr Gln Lys Asn Gln
65                  70                  75                  80
Ile Phe Ile His His Leu Val Glu Asp Gly Ile Pro Ser Tyr Pro Asn
                85                  90                  95
Gly Trp Gln Ser Trp Ser Glu Ala Val Lys Thr Leu Phe His Glu Lys
            100                 105                 110
His Phe Glu Pro Ser Ile Val Phe Ser Ser Glu Pro Gln Asp Lys Ala
        115                 120                 125
Pro Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Leu Glu Val Ser Leu Val Asp Pro Asp
    130                 135                 140
Arg Thr Phe Phe Asn Val Ser Ala Thr Lys Ile Arg Thr Thr Pro Phe
145                 150                 155                 160
Gln Tyr Trp Lys Phe Ile Pro Lys Glu Ala Arg Pro Phe Gly Ser Gly
                165                 170                 175
Ser Gly Ser Gly Ser Phe Val Arg Thr Val Ala Ile Leu Gly Gly Glu
            180                 185                 190
Ser Ser Gly Lys Ser Thr Leu Val Asn Lys Leu Ala Asn Ile Phe Asn
        195                 200                 205
Thr Thr Ser Ala Trp Glu Tyr Gly Arg Asp Tyr Val Phe Ser His Leu
    210                 215                 220
Gly Gly Asp Glu Met Ala Leu Gln Tyr Ser Asp Tyr Asp Lys Ile Ala
225                 230                 235                 240
Leu Gly His Ala Gln Tyr Ile Asp Phe Ala Val Lys Tyr Ala Asn Lys
                245                 250                 255
Val Ala Phe Ile Asp Thr Asp Phe Val Thr Thr Gln Ala Phe Cys Lys
            260                 265                 270
Lys Tyr Glu Gly Arg Glu His Pro Phe Val Gln Ala Leu Ile Asp Glu
        275                 280                 285
Tyr Arg Phe Asp Leu Val Ile Leu Leu Glu Asn Asn Thr Pro Trp Val
    290                 295                 300
Ala Asp Gly Leu Arg Ser Leu Gly Ser Ser Val Asp Arg Lys Ala Phe
305                 310                 315                 320
Gln Asn Leu Leu Val Glu Met Leu Lys Glu Asn Asn Ile Glu Phe Val
                325                 330                 335
His Val Lys Glu Ala Asp Tyr Asp Gly Arg Phe Leu Arg Cys Val Glu
            340                 345                 350
Leu Val Lys Glu Met Met Gly Glu Gln Gly
        355                 360
<210>  9
<211>  26
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  9
cccatatgtc gtcatttgat tacctg                                       26
<210>  10
<211>  31
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  10
ccctcgagtt atctctgctc ccccatcatc t                                 31
<210>  11
<211>  28
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  11
cccatatgtc atcgttcgac tatctcaa                                     28
<210>  12
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  12
ccctcgagtt atccctgctc gcccatcatc                                   30
<210>  13
<211>  28
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  13
cccatatgtc aaaaacaaaa gagaaaaa                                     28
<210>  14
<211>  29
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  14
ccctcgagtc attgagatgt cccttttat                                    29

Claims (4)

1.一种重组NAD合成酶，其特征在于：所述重组NAD合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：8任一所示。
2.一种基因序列，其特征在于：所述基因序列编码权利要求1所述的重组NAD合成酶。
3.一种生物材料，包括重组载体、重组细胞或者重组微生物，其特征在于：所述生物材料含有权利要求2所述的基因序列。
4.权利要求1所述的重组NAD合成酶的用途，其特征在于：所述用途为将所述重组NAD合成酶应用于工业生产中以NR和ATP为原料规模化生产NAD。
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Ribosylnicotinamide kinase domain of NadR protein: identification and implications in NAD biosynthesis;Oleg V. Kurnasov et al.;《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》;第184卷(第24期);摘要，第6906页左栏第1段至第6916页右栏第2段，图1-图3 *
微生物NAD合成酶及其抑制剂的研究进展;毕继才 等;《微生物学报》;第51卷(第3期);第305-312页 *

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