CN109468287B

CN109468287B - 一种羟化酶突变体

Info

Publication number: CN109468287B
Application number: CN201811396041.1A
Authority: CN
Inventors: 范文超; 高书良; 王金刚; 梁岩; 袁圣伦; 任亮
Original assignee: Zhejiang Huarui Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Huarui Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-11-22
Filing date: 2018-11-22
Publication date: 2020-10-16
Anticipated expiration: 2038-11-22
Also published as: CN109468287A

Abstract

本发明通过定向进化的方法获得了酶活力提高的羟化酶突变体SEQ ID NOs:3‑4，这些突变体或者其表达微生物能高效催化达玛烯二醇通过羟基化反应来制备原人参二醇，具有工业化开发和应用前景。

Description

一种羟化酶突变体

技术领域

本发明属于生物催化领域，涉及一种羟化酶突变体，具体地说，涉及一种达玛烯二醇羟化酶突变体及其在合成原人参二醇中的用途。

背景技术

人参皂苷是从人参及其同属植物(如三七、西洋参等)中分离到的皂苷的总称，属于三萜类皂苷，是人参中的主要有效成份。目前，已经从人参中分离出了至少60种皂苷，其中一些人参皂苷被证实具有广泛的生理功能和药用价值：包括抗肿瘤、免疫调节、抗疲劳、护心、护肝等功能。根据苷元配基的形式，人参皂苷通常被分为三类，齐墩果烷型，原人参二醇型(PPD型)和原人参三醇型(PPT型)。原人参二醇(protopanaxadiol，PPD)是合成人参皂苷化合物的重要前体，其一般通过达玛烯二醇(dammarenediol-II，DMD)经羟化酶催化合成。反应式如下：

目前人参Panax Ginseng中催化该步反应的羟化酶已被克隆鉴定(Han,J.-Y.,H.-S.Hwang,S.-W.Choi,H.-J.Kim and Y.E.Choi.Cytochrome P450 CYP716A53v2Catalyzesthe Formation of Protopanaxatriol from Protopanaxadiol During GinsenosideBiosynthesis in Panax Ginseng.Plant Cell Physiol.2012,53(9):1535–1545.)。人参Panax Ginseng来源的CYP716A47蛋白，又称原人参二醇合酶(protopanaxadiol synthase，PPDS)，或称达玛烯二醇羟化酶(dammarenediol-II hydroxylase，DMD羟化酶)，可以选择性地催化DMD底物，在C-12位发生羟基化，生成PPD。但该DMD羟化酶催化效率较低，如果对其进行改造，大幅度提高酶活力，将会为工业化应用提供可行性。

发明内容

为了开发催化效率高的达玛烯二醇羟化酶(本文中简称羟化酶)，本发明以人参PanaxGinseng来源的达玛烯二醇羟化酶(Genebank:AEY75213.1，即SEQ ID NO:1，在此命名为DMDH)为基础，通过易错PCR的方法建立羟化酶基因突变库，再通过筛选基因突变库获得酶活力明显提高的羟化酶突变体。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种羟化酶，其氨基酸序列为：

SEQ ID NO:3，其为SEQ ID NO:1第186位的M替换为L、第321位的K替换为A的突变体，即：

MVLFFSLSLLLLPLLLLFAYFSYTKRIPQKENDSKAPLPPGQTGWPLIGETLNYLSCVKSGVSENFVKYRKEKYSPKVFRTSLLGEPMAILCGPEGNKFLYSTEKKLVQVWFPSSVEKMFPRSHGESNADNFSKVRGKMMFLLKVDGMKKYVGLMDRVMKQFLETDWNRQQQINVHNTVKKYTVTLSCRVFMSIDDEEQVTRLGSSIQNIEAGLLAVPINIPGTAMNRAIKTVKLLTREVEAVIKQRKVDLLENKQASQPQDLLSHLLLTANQDGQFLSESDIASHLIGLMQGGYTTLNGTITFVLNYLAEFPDVYNQVLAEQVEIANSKHPKELLNWEDLRKMKYSWNVAQEVLRIIPPGVGTFREAITDFTYAGYLIPKGWKMHLIPHDTHKNPTYFPSPEKFDPTRFEGNGPAPYTFTPFGGGPRMCPGIEYARLVILIFMHNVVTNFRWEKLIPNEKILTDPIPRFAHGLPIHLHPHN(SEQ ID NO:3)；或者

SEQ ID NO:4，其为SEQ ID NO:1第120位的F替换为A、第186位的M替换为L、第279位的S替换为A的突变体，即：

MVLFFSLSLLLLPLLLLFAYFSYTKRIPQKENDSKAPLPPGQTGWPLIGETLNYLSCVKSGVSENFVKYRKEKYSPKVFRTSLLGEPMAILCGPEGNKFLYSTEKKLVQVWFPSSVEKMAPRSHGESNADNFSKVRGKMMFLLKVDGMKKYVGLMDRVMKQFLETDWNRQQQINVHNTVKKYTVTLSCRVFMSIDDEEQVTRLGSSIQNIEAGLLAVPINIPGTAMNRAIKTVKLLTREVEAVIKQRKVDLLENKQASQPQDLLSHLLLTANQDGQFLAESDIASHLIGLMQGGYTTLNGTITFVLNYLAEFPDVYNQVLKEQVEIANSKHPKELLNWEDLRKMKYSWNVAQEVLRIIPPGVGTFREAITDFTYAGYLIPKGWKMHLIPHDTHKNPTYFPSPEKFDPTRFEGNGPAPYTFTPFGGGPRMCPGIEYARLVILIFMHNVVTNFRWEKLIPNEKILTDPIPRFAHGLPIHLHPHN(SEQ ID NO:4)。

优选上述羟化酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

本发明的第二个目的在于提供编码上述羟化酶的基因。

本发明的第三个目的在于提供包含上述基因的质粒。

考虑到于DMD羟化酶属于细胞色素P450单加氧酶，在进行催化反应时，需要P450还原酶作为辅助蛋白存在才能发挥正常功能，所以在表达DMD羟化酶的同时，需要共表达辅助酶P450还原酶。P450还原酶例如包括、但不限于拟南芥Arabidopsis thaliana来源的CPR2酶(Genebank:NP_849472.2)，即SEQ ID NO:5。

因此，在一种优选的实施方式中，包含上述基因的质粒还包含P450还原酶SEQIDNO:5的编码基因SEQ ID NO:6，用于共表达羟化酶和P450还原酶。

优选地，该共表达质粒的骨架是pYES2.1载体。

本发明的第四个目的在于提供转化了上述共表达羟化酶和P450还原酶的质粒的微生物。

作为另一种可选的实施方式，羟化酶和P450还原酶可以分别位于不同的质粒上，这两个质粒共转化微生物后获得的转化子也可以表达P450还原酶SEQ ID NO:5和羟化酶。

当，羟化酶和P450还原酶可以分别位于不同的质粒上时，两种质粒的骨架可以都是pUC57载体。

优选地，上述微生物选自酿酒酵母或者解脂耶氏酵母。更优选酿酒酵母BY4742(EUROSCARF)。

本发明的第五个目的在于提供上述羟化酶、或者微生物在合成原人参二醇中的用途。

在一种实施方式中，上述用途是以达玛烯二醇为底物原料，在羟化酶和P450还原酶催化下通过羟基化反应来制备原人参二醇。

优选地，上述的酶催化反应在pH7.4，温度30℃进行。

本发明构建的羟化酶突变体SEQ ID NOs:3-4明显提高了羟基化反应的催化活力，可高效率地催化底物达玛烯二醇生成原人参二醇，该酶催化反应条件温和，具备工业化开发和应用前景。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

本文的实施例中，如果对于反应温度或操作温度没有做出具体说明，则该温度通常指室温(15-30℃)。

为简要起见，本文中的氨基酸缩写既可以使用英文三字母、也可以采用英文单字母，这是本领域技术人员熟知的，这些缩写列于下表中：

表1氨基酸中英文对照及缩写

丙氨酸	Alanine	A或Ala	脂肪族类
				精氨酸	Arginine	R或Arg	碱性氨基酸类
天冬酰胺	Asparagine	N或Asn	酰胺类
				天冬氨酸	Aspartic acid	D或Asp	酸性氨基酸类
半胱氨酸	Cysteine	C或Cys	含硫类
				谷氨酰胺	Glutamine	Q或Gln	酰胺类
谷氨酸	Glutamic acid	E或Glu	酸性氨基酸类
				甘氨酸	Glycine	G或Gly	脂肪族类
组氨酸	Histidine	H或His	碱性氨基酸类
				异亮氨酸	Isoleucine	I或Ile	脂肪族类
亮氨酸	Leucine	L或Leu	脂肪族类
				赖氨酸	Lysine	K或Lys	碱性氨基酸类
蛋氨酸	Methionine	M或Met	含硫类
				苯丙氨酸	Phenylalanine	F或Phe	芳香族类
脯氨酸	Proline	P或Pro	亚氨基酸
				丝氨酸	Serine	S或Ser	羟基类
苏氨酸	Threonine	T或Thr	羟基类
				色氨酸	Tryptophan	W或Trp	芳香族类
酪氨酸	Tyrosine	Y或Tyr	芳香族类
				缬氨酸	Valine	V或Val	脂肪族类

作为构建羟化酶突变体的基础模板，来源于人参Panax Ginseng的达玛烯二醇羟化酶(Genebank:AEY75213.1，本文中命名为DMDH)的氨基酸序列为SEQ ID NO:1：

MVLFFSLSLLLLPLLLLFAYFSYTKRIPQKENDSKAPLPPGQTGWPLIGETLNYLSCVKSGVSENFVKYRKEKYSPKVFRTSLLGEPMAILCGPEGNKFLYSTEKKLVQVWFPSSVEKMFPRSHGESNADNFSKVRGKMMFLLKVDGMKKYVGLMDRVMKQFLETDWNRQQQINVHNTVKKYTVTMSCRVFMSIDDEEQVTRLGSSIQNIEAGLLAVPINIPGTAMNRAIKTVKLLTREVEAVIKQRKVDLLENKQASQPQDLLSHLLLTANQDGQFLSESDIASHLIGLMQGGYTTLNGTITFVLNYLAEFPDVYNQVLKEQVEIANSKHPKELLNWEDLRKMKYSWNVAQEVLRIIPPGVGTFREAITDFTYAGYLIPKGWKMHLIPHDTHKNPTYFPSPEKFDPTRFEGNGPAPYTFTPFGGGPRMCPGIEYARLVILIFMHNVVTNFRWEKLIPNEKILTDPIPRFAHGLPIHLHPHN(SEQ ID NO:1)。

DMDH的编码基因序列为SEQ ID NO:2：

atggttttgttcttttctttgtctttgttgttgttgccattgttattattgtttgcttatttttcttacactaaacgtattcctcaaaaggaaaacgactctaaggctccattgccacccggtcaaactggatggccattgattggtgaaactttaaattacttgtcttgtgttaagtctggtgtttctgaaaacttcgttaagtatagaaaggaaaaatattctccaaaggttttcagaacttctttattgggtgaaccaatggctattttgtgcggtccagaaggtaataagttcttgtattcaactgaaaagaagttggtccaagtttggttcccttcttcagttgaaaaaatgttccctcgttctcacggagagtcaaacgcagataacttttctaaagttagaggtaaaatgatgttcttattaaaagttgatggtatgaaaaaatatgttggtttgatggatagagttatgaaacaattcttggagactgattggaatagacaacaacaaattaatgttcataacactgttaaaaagtacacagttactatgtcttgtagagttttcatgtcaattgacgacgaagagcaagttacaagattgggttcttcaatacaaaatattgaagctggtttgttggctgttccaattaatattcccggtactgcaatgaatagagctattaaaacagttaaattgttaactagagaagttgaagctgttataaaacaaagaaaagttgatttattggaaaacaagcaagcttcacaaccacaagatttgttatctcatttgttgttgactgctaatcaagatggtcaatttttgtcagaatcagatattgcatctcatttgattggattgatgcaaggtggttacacaacattaaacggtacaataacatttgttttaaattatttggctgaatttccagatgtttataatcaagttttgaaagaacaagttgaaattgctaattcaaaacatccaaaagaattgttaaattgggaagacttgagaaagatgaagtattcttggaacgtcgctcaagaagtcttgaggattattccacccggtgttggtactttcagagaagctataactgattttacatacgctggttacttgattccaaaaggttggaaaatgcatttgattccacatgatactcataaaaatccaacttatttcccatctccagaaaaatttgacccaactagattcgaaggtaacggaccagctccatacactttcactccattcggtggtggacctaggatgtgccccggtattgagtatgctaggttagttatattgatatttatgcataatgttgttacaaattttagatgggaaaaattgataccaaatgaaaagattttgactgacccaattccaagattcgctcacggtttgccaatacatttacatccacataattag

(SEQ ID NO:2)。

为了获得酶活性更高的羟化酶突变体，本发明对DMDH的基因序列SEQ ID NO:2进行点突变。通过易错PCR技术获得一个或多个氨基酸位点取代的突变体氨基酸序列，筛选出几个可提高酶活力的位点，然后以定点组合突变的方式，获得2株酶活力明显提高的突变体。

在本文中，术语“羟化酶”、“DMD羟化酶”、“原人参二醇合酶”、“PPDS”、“达玛烯二醇羟化酶”表示相同的意义。氨基酸序列为SEQ ID NO:1的羟化酶简称为“DMDH”，其为人参Panax Ginseng来源的CYP716A47蛋白。DMD羟化酶属于细胞色素P450单加氧酶，在催化时需要P450还原酶比如拟南芥Arabidopsis thaliana来源的CPR2酶(Genebank:NP_849472.2)作为辅助蛋白酶。

在一种实施方式中，上述CPR2酶(Genebank:NP_849472.2)的氨基酸序列为SEQ IDNO:5：

MSSSSSSSTSMIDLMAAIIKGEPVIVSDPANASAYESVAAELSSMLIENRQFAMIVTTSIAVLIGCIVMLVWRRSGSGNSKRVEPLKPLVIKPREEEIDDGRKKVTIFFGTQTGTAEGFAKALGEEAKARYEKTRFKIVDLDDYAADDDEYEEKLKKEDVAFFFLATYGDGEPTDNAARFYKWFTEGNDRGEWLKNLKYGVFGLGNRQYEHFNKVAKVVDDILVEQGAQRLVQVGLGDDDQCIEDDFTAWREALWPELDTILREEGDTAVATPYTAAVLEYRVSIHDSEDAKFNDINMANGNGYTVFDAQHPYKANVAVKRELHTPESDRSCIHLEFDIAGSGLTYETGDHVGVLCDNLSETVDEALRLLDMSPDTYFSLHAEKEDGTPISSSLPPPFPPCNLRTALTRYACLLSSPKKSALVALAAHASDPTEAERLKHLASPAGKVDEYSKWVVESQRSLLEVMAEFPSAKPPLGVFFAGVAPRLQPRFYSISSSPKIAETRIHVTCALVYEKMPTGRIHKGVCSTWMKNAVPYEKSENCSSAPIFVRQSNFKLPSDSKVPIIMIGPGTGLAPFRGFLQERLALVESGVELGPSVLFFGCRNRRMDFIYEEELQRFVESGALAELSVAFSREGPTKEYVQHKMMDKASDIWNMISQGAYLYVCGDAKGMARDVHRSLHTIAQEQGSMDSTKAEGFVKNLQTSGRYLRDVW(SEQ ID NO:5)。

其编码基因序列为SEQ ID NO:6：

atgtcttcttcttcatcatcttcaacttctatgattgacttgatggcagcaattattaagggagaaccagtcattgtctctgatccagctaacgcttctgcatatgagtctgtcgcagctgagttgtcttctatgttaattgaaaatagacagtttgctatgattgttactacatcaattgcagtcttgattggttgtattgttatgttggtttggaggaggtctggatctggtaattcaaagagagttgaacctttaaaacctttagttattaaaccaagagaagaagaaattgacgatggtcgtaaaaaagttactatcttttttggaactcagactggtactgctgagggtttcgctaaagctttgggtgaggaggctaaggctagatatgaaaaaactagattcaagattgttgatttggatgattacgctgcagacgacgacgaatacgaggaaaaattgaaaaaagaagatgtcgctttcttctttttagctacatatggtgacggtgaaccaacagacaatgctgcaagattttacaagtggttcacagaaggaaatgatcgtggtgagtggttgaaaaatttgaaatatggtgtttttggtttgggaaacagacaatacgagcatttcaataaagttgcaaaagtcgttgatgatattttagtcgaacaaggtgctcagagattggtccaagtcggtttgggtgacgatgatcaatgtatagaggatgacttcacagcttggagggaggctttgtggccagaattggatactattttgagagaggaaggtgatacagctgtcgctacaccatacactgctgcagtcttggagtacagagtttcaattcatgattctgaagatgcaaaatttaacgatattaacatggctaatggtaatggttatactgttttcgatgctcaacatccatacaaggcaaacgtcgcagtcaagagggagttgcacacaccagaatcagatagatcatgcattcatttagagtttgacatagctggttctggtttgacatacgaaactggtgaccacgttggtgtcttgtgcgacaacttgtcagagacagtcgatgaagctttgagattattagacatgtctccagacacttatttctctttgcatgctgagaaagaagatggtactccaatttcatcttcattgcctcctccattcccaccttgcaacttaagaactgctttgactagatacgcttgtttgttgtcttctcctaagaaatctgctttggtcgctttggctgcacatgcttctgatccaacagaggcagagaggttaaagcacttggcatcaccagctggaaaggttgatgagtactctaagtgggtcgtcgagtcacagcgttctttgttagaagttatggcagagttcccttcagctaagccaccattgggtgtcttcttcgctggagttgcaccaaggttgcaaccaagattttattctatttcttcttctccaaagattgcagaaactaggattcatgttacttgtgctttggtttacgaaaaaatgccaactggtcgtattcataaaggtgtctgttctacatggatgaagaacgctgttccttatgaaaaatctgaaaactgttcatcagctcctatattcgtcagacaatctaacttcaagttaccttcagattcaaaggttccaattattatgattggtcccggtactggattggcaccttttcgtggtttcttgcaagaaaggttggctttggttgagtctggtgtcgaattgggaccatcagtcttgtttttcggttgtaggaacagaagaatggatttcatttatgaggaggaattgcaaaggtttgttgagtctggtgctttggcagagttgtctgtcgctttctctagggagggtcctacaaaggaatacgttcaacataaaatgatggataaagcatctgatatatggaatatgatttcacaaggagcttatttgtatgtctgcggtgatgcaaagggtatggctagggacgtccatcgttctttacatactattgctcaagaacaaggttctatggattcaacaaaggctgaaggatttgttaagaacttgcaaacttctggaagatatttgagagatgtctggtag(SEQ ID NO:6)。

在本文中，术语“野生(型)”、“野生酶”、“野生型酶”和“WT”表示相同的意义，都是指未经基因工程改造的羟化酶DMDH(SEQ ID NO:1)。

本发明筛选出的2个羟化酶突变体SEQ ID NOs:3-4具有共同的特点，即相对于SEQID NO:1，都有一个位点的正向突变M186L，预示着至少第186位氨基酸的定点突变可能会引起酶活性的变化。

本发明的羟化酶突变体(SEQ ID NOs:3-4)由于氨基酸序列明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。

上述转化体宿主可以是任何适合表达羟化酶突变体SEQ ID NOs:3-4和P450还原酶的微生物，括细菌和真菌。优选微生物是酿酒酵母或者解脂耶氏酵母，更优选酿酒酵母BY4742。

当作为生物催化剂用于生产原人参二醇时，本发明的羟化酶和P450还原酶可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等；所述菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体。

本发明的羟化酶和P450还原酶的分离纯化、包括固定化酶制备技术也是本领域技术人员所熟知的。

实施例

材料和方法

本文中的全基因合成由苏州金唯智生物科技有限公司完成；表达载体由浙江华睿生物技术有限公司亚克隆制备。引物合成及测序皆由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

本文中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。

1.DMD和PPD含量的高效液相色谱(HPLC)测定

Shimadzu LC-20A液相色谱仪，Shodex C18-120-5 4E column(5μm,4.6mm×250mm)色谱柱，柱温35℃，流动相A水，流动相B乙腈，梯度洗脱：0min(35％B),55min(90％B),50-55min(90％B),55-65min(35％B)。流速：0.8ml/min，波长203nm。

DMD和PPD均购自武汉ChemFaces生物技术有限公司。

2.羟化酶酶活力测定

对发酵菌体进行蛋白微小体制备，用于酶活测定反应。500μl反应体系包括：100mM磷酸钾，pH7.4，含有1mM的NADPH，50微摩尔底物DMD和1mg蛋白微小体。反应体系在30℃孵育2h，用正己烷进行抽提两次。样品真空干燥后，用500μl甲醇重溶，送液相分析。

酶活定义：在pH7.4、温度30℃条件下，每分钟催化DMD产生1微摩尔(mol)PPD所需要的酶量定义为1个单位(U)。

3.培养基

YPD培养基：10g/L酵母提取物，20g/L胰蛋白胨，20g/L葡萄糖。(固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

实施例1野生型DMDH和CPR2基因共表达质粒的构建

1.所用DMDH基因SEQ ID NO:2(或称PgPPDS)和CPR2基因SEQ ID NO:6(或称AtCPR2)，由苏州金维智生物科技公司进行合成，将目的基因装载在pUC57载体上，分别获得pUC57-DMDH和pUC57-CPR2质粒，用于后续的PCR扩增模板。

2.野生型DMDH和CPR2基因共表达质粒的构建包括下述步骤：

2.1以Invitrogen的载体pYES2.1/V5-his-TOPO为模板，使用如下引物对(5’-3’)，扩增载体片段。

pYES2.1-vector-F:AAGCTGCGGCCCTGCATTAA，

pYES2.1-vector-R:ACGCGCCCTGTAGCGCCCCA。

2.2使用如下引物对(5’-3’)，以酿酒酵母BY4742基因组DNA为模板扩增启动子TDH3p。

TDH3p-F:ctgttccagagaacccccatg gtttaaacaccctggtcgacCAGTTCGAGTTTATCATTATC，

TDH3p-cpr2-R：GATGATGAAGAAGAAGACATTTTGTTTGTTTATGTGTGTT。

2.3使用如下引物对，以合成的AtCPR2基因为模板，扩增基因AtCPR2。

CPR2-tdh3-F:acacacataaacaaacaaaATGTCTTCTTCTTCATCATC，

CPR2-tpi1t-R:AATTATATTAATCCTACCAGACATCTCTCAAAT。

2.4使用如下引物对，以酿酒酵母BY4742基因组DNA为模板扩增终止子TPI1t。

TPI1t-cpr2-F:gatatttgagagatgtctggtagGATTAATATAATTATATAAAAA，

TPI1t-tef1p-R:GTAAGGATTCGCGGTCCTCG GCTCTTCTATATAACAGTTG。

2.5对上述三个片段进行overlapPCR，获得表达框TDH3p-AtCPR2-TPI1t。

2.6使用如下引物对，以酿酒酵母BY4742基因组DNA为模板扩增启动子TEF1p。

TEF1p-tpi1t-F:ctgttatatagaagagcCGAGGACCGCGAATCCTTAC，

TEF1p-DMDH-R:GAAAAGAACAAAACCATTTTGTAATTAAAACTTAGATTAGA。

2.7使用如下引物对，以合成的PgPPDS基因为模板扩增基因PgPPDs。

DMDH-tef1p-F:ctaagttttaattacaaaATGGTTTTGTTCTTTTCTTT

DMDH-cyc1t-R:GGAAAAGGGGCCTGTCTAATTATGTGGATGTAAATGT

2.8使用如下引物对，以酿酒酵母BY4742基因组DNA为模板扩增终止子CYC1t。

CYC1t-DMDH-F:catttacatccacataattagACAGGCCCCTTTTCCTTTGT，

CYC1t-R:GAGGTTTTCACCGTCATCACCGGTTACATGCGTACACGCGTT。

2.9对上述三个片段进行overlap PCR，获得表达框TEF1p-DMDH-CYC1t。

2.10使用Gibson方法，对上述得到的载体片段、TDH3p-CPR2-TPI1t和TEF1p-DMDH-CYC1t进行组装连接，完成质粒构建，获得DMDH和CPR2共表达质粒，命名为pYES2.1-DMDH-CPR2。

实施例2易错PCR法构建羟化酶随机突变体库

以实施例1中获得的质粒pYES2.1-DMDH-CPR2为模板，应用易错PCR技术构建随机突变体库，采用的引物对如下：

正向引物Errorpcr-F:ATGGTTTTGTTCTTTTCTTT，

反向引物Errorpcr-R:AATTATGTGGATGTAAATGT。

50μL易错PCR反应体系包括：50ng质粒模板pYES2.1-DMDH-CPR2，30pmol一对引物Errorpcr-F和Errorpcr-R，1X Taq buffer，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mMdTTP，7mM MgCl₂，(0mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM)MnCl₂，2.5个单位的Taq酶(Fermentas)。PCR反应条件为：95℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 2min/kbp；30个循环；72℃ 10min。胶回收1.5kb随机突变片段作为大引物，用KOD-plus DNA聚合酶做MegaPrimer PCR：94℃5min，；98℃ 10s，60℃ 30s，68℃ 2min/kbp，25个循环；68℃ 10min。DpnI消化质粒模板，转化酿酒酵母BY4742(EUROSCARF)，得到超过10⁴个克隆的随机突变库。

实施例3羟化酶的表达和制备

表达宿主选用酿酒酵母BY4742MATa his3Δ1leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0菌株。转化、表达及酶液制备方法参考文献(Han,J.-Y.,H.-S.Hwang,S.-W.Choi,H.-J.Kim andY.E.Choi.Cytochrome P450 CYP716A53v2Catalyzes the Formation ofProtopanaxatriol from Protopanaxadiol During Ginsenoside Biosynthesis inPanax Ginseng.Plant Cell Physiol.2012,53(9):1535–1545.)，具体方法如下：

将宿主菌BY4742菌种在YPD固体培养基上划线，30℃培养2天，挑单菌落转接装有4ml YPD液体培养基的试管。30℃，220rpm过夜培养，转接装有25ml YPD液体培养基的250ml摇瓶，30℃，220rpm培养4～6h，培养至OD₆₀₀为0.8～1.0，菌液用于制备酿酒酵母的转化感受态。感受态的制作和转化，使用Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit进行，严格参考其使用说明书。转化产物涂布SC-leu(葡萄糖20g/l，YNB基本氮源1.7g/l，组氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸各50mg/l)，30℃培养4天。挑取突变库转化子，接种YPD培养基，培养菌体。培养结束后，2000g 10min离心收集菌体，使用50ml TEK缓冲液(100mM KCl,50mM Tris-HCl,1mMEDTA)重悬菌体，6100g 3min离心，使用2ml提取缓冲液(20mMβ-巯基乙醇，1％BSA，0.6M山梨糖醇，50mM TrisHCl，1mM EDTA)重悬菌体，加入玻璃珠，进行震荡破碎。提取缓冲液6100g15min离心，上清过滤，加入终浓度为50mM的MgCl₂，继续冰浴1h，12500g离心5min，颗粒物使用1ml的TEG(30％甘油，50mM Tris-HCl，1mM EDTA)溶解，并用聚四氟乙烯进行匀质化，完成蛋白微小体溶液。

实施例4羟化酶突变体的筛选

逐个挑取突变库转化子，进行蛋白微小体制备，用于酶活测定反应。羟化酶突变体的酶活测定方法参见前述的“羟化酶酶活力测定”部分。

在随机突变库中，通过对约2000个突变体克隆筛选，筛选的优秀突变体如表1中所示。对这两株突变体克隆做进一步验证，进行质粒抽提后，送苏州金维智生物技术公司进行测序确认，对氨基酸突变位点进行鉴定。

表1、突变体相对酶活力

由表1的实验结果可以看出，相比野生型羟化酶DMDH，突变体SEQ ID NOs:3-4都明显提高了酶活力，其中SEQ ID NO:3的酶活力提高了4倍多，可高效率地催化底物达玛烯二醇DMD生成原人参二醇PPD，具备工业化开发潜力。

序列表

<110> 浙江华睿生物技术有限公司

<120> 一种羟化酶突变体

<130> SHPI1812133

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 482

<212> PRT

<213> Panax Ginseng

<400> 1

Met Val Leu Phe Phe Ser Leu Ser Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Phe Ala Tyr Phe Ser Tyr Thr Lys Arg Ile Pro Gln Lys Glu Asn

20 25 30

Asp Ser Lys Ala Pro Leu Pro Pro Gly Gln Thr Gly Trp Pro Leu Ile

35 40 45

Gly Glu Thr Leu Asn Tyr Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Val Ser Glu

50 55 60

Asn Phe Val Lys Tyr Arg Lys Glu Lys Tyr Ser Pro Lys Val Phe Arg

65 70 75 80

Thr Ser Leu Leu Gly Glu Pro Met Ala Ile Leu Cys Gly Pro Glu Gly

85 90 95

Asn Lys Phe Leu Tyr Ser Thr Glu Lys Lys Leu Val Gln Val Trp Phe

100 105 110

Pro Ser Ser Val Glu Lys Met Phe Pro Arg Ser His Gly Glu Ser Asn

115 120 125

Ala Asp Asn Phe Ser Lys Val Arg Gly Lys Met Met Phe Leu Leu Lys

130 135 140

Val Asp Gly Met Lys Lys Tyr Val Gly Leu Met Asp Arg Val Met Lys

145 150 155 160

Gln Phe Leu Glu Thr Asp Trp Asn Arg Gln Gln Gln Ile Asn Val His

165 170 175

Asn Thr Val Lys Lys Tyr Thr Val Thr Met Ser Cys Arg Val Phe Met

180 185 190

Ser Ile Asp Asp Glu Glu Gln Val Thr Arg Leu Gly Ser Ser Ile Gln

195 200 205

Asn Ile Glu Ala Gly Leu Leu Ala Val Pro Ile Asn Ile Pro Gly Thr

210 215 220

Ala Met Asn Arg Ala Ile Lys Thr Val Lys Leu Leu Thr Arg Glu Val

225 230 235 240

Glu Ala Val Ile Lys Gln Arg Lys Val Asp Leu Leu Glu Asn Lys Gln

245 250 255

Ala Ser Gln Pro Gln Asp Leu Leu Ser His Leu Leu Leu Thr Ala Asn

260 265 270

Gln Asp Gly Gln Phe Leu Ser Glu Ser Asp Ile Ala Ser His Leu Ile

275 280 285

Gly Leu Met Gln Gly Gly Tyr Thr Thr Leu Asn Gly Thr Ile Thr Phe

290 295 300

Val Leu Asn Tyr Leu Ala Glu Phe Pro Asp Val Tyr Asn Gln Val Leu

305 310 315 320

Lys Glu Gln Val Glu Ile Ala Asn Ser Lys His Pro Lys Glu Leu Leu

325 330 335

Asn Trp Glu Asp Leu Arg Lys Met Lys Tyr Ser Trp Asn Val Ala Gln

340 345 350

Glu Val Leu Arg Ile Ile Pro Pro Gly Val Gly Thr Phe Arg Glu Ala

355 360 365

Ile Thr Asp Phe Thr Tyr Ala Gly Tyr Leu Ile Pro Lys Gly Trp Lys

370 375 380

Met His Leu Ile Pro His Asp Thr His Lys Asn Pro Thr Tyr Phe Pro

385 390 395 400

Ser Pro Glu Lys Phe Asp Pro Thr Arg Phe Glu Gly Asn Gly Pro Ala

405 410 415

Pro Tyr Thr Phe Thr Pro Phe Gly Gly Gly Pro Arg Met Cys Pro Gly

420 425 430

Ile Glu Tyr Ala Arg Leu Val Ile Leu Ile Phe Met His Asn Val Val

435 440 445

Thr Asn Phe Arg Trp Glu Lys Leu Ile Pro Asn Glu Lys Ile Leu Thr

450 455 460

Asp Pro Ile Pro Arg Phe Ala His Gly Leu Pro Ile His Leu His Pro

465 470 475 480

His Asn

<210> 2

<211> 1449

<212> DNA

<213> Panax Ginseng

<400> 2

atggttttgt tcttttcttt gtctttgttg ttgttgccat tgttattatt gtttgcttat 60

ttttcttaca ctaaacgtat tcctcaaaag gaaaacgact ctaaggctcc attgccaccc 120

ggtcaaactg gatggccatt gattggtgaa actttaaatt acttgtcttg tgttaagtct 180

ggtgtttctg aaaacttcgt taagtataga aaggaaaaat attctccaaa ggttttcaga 240

acttctttat tgggtgaacc aatggctatt ttgtgcggtc cagaaggtaa taagttcttg 300

tattcaactg aaaagaagtt ggtccaagtt tggttccctt cttcagttga aaaaatgttc 360

cctcgttctc acggagagtc aaacgcagat aacttttcta aagttagagg taaaatgatg 420

ttcttattaa aagttgatgg tatgaaaaaa tatgttggtt tgatggatag agttatgaaa 480

caattcttgg agactgattg gaatagacaa caacaaatta atgttcataa cactgttaaa 540

aagtacacag ttactatgtc ttgtagagtt ttcatgtcaa ttgacgacga agagcaagtt 600

acaagattgg gttcttcaat acaaaatatt gaagctggtt tgttggctgt tccaattaat 660

attcccggta ctgcaatgaa tagagctatt aaaacagtta aattgttaac tagagaagtt 720

gaagctgtta taaaacaaag aaaagttgat ttattggaaa acaagcaagc ttcacaacca 780

caagatttgt tatctcattt gttgttgact gctaatcaag atggtcaatt tttgtcagaa 840

tcagatattg catctcattt gattggattg atgcaaggtg gttacacaac attaaacggt 900

acaataacat ttgttttaaa ttatttggct gaatttccag atgtttataa tcaagttttg 960

aaagaacaag ttgaaattgc taattcaaaa catccaaaag aattgttaaa ttgggaagac 1020

ttgagaaaga tgaagtattc ttggaacgtc gctcaagaag tcttgaggat tattccaccc 1080

ggtgttggta ctttcagaga agctataact gattttacat acgctggtta cttgattcca 1140

aaaggttgga aaatgcattt gattccacat gatactcata aaaatccaac ttatttccca 1200

tctccagaaa aatttgaccc aactagattc gaaggtaacg gaccagctcc atacactttc 1260

actccattcg gtggtggacc taggatgtgc cccggtattg agtatgctag gttagttata 1320

ttgatattta tgcataatgt tgttacaaat tttagatggg aaaaattgat accaaatgaa 1380

aagattttga ctgacccaat tccaagattc gctcacggtt tgccaataca tttacatcca 1440

cataattag 1449

<210> 3

<211> 482

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 3

Met Val Leu Phe Phe Ser Leu Ser Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Phe Ala Tyr Phe Ser Tyr Thr Lys Arg Ile Pro Gln Lys Glu Asn

20 25 30

Asp Ser Lys Ala Pro Leu Pro Pro Gly Gln Thr Gly Trp Pro Leu Ile

35 40 45

Gly Glu Thr Leu Asn Tyr Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Val Ser Glu

50 55 60

Asn Phe Val Lys Tyr Arg Lys Glu Lys Tyr Ser Pro Lys Val Phe Arg

65 70 75 80

Thr Ser Leu Leu Gly Glu Pro Met Ala Ile Leu Cys Gly Pro Glu Gly

85 90 95

Asn Lys Phe Leu Tyr Ser Thr Glu Lys Lys Leu Val Gln Val Trp Phe

100 105 110

Pro Ser Ser Val Glu Lys Met Phe Pro Arg Ser His Gly Glu Ser Asn

115 120 125

Ala Asp Asn Phe Ser Lys Val Arg Gly Lys Met Met Phe Leu Leu Lys

130 135 140

Val Asp Gly Met Lys Lys Tyr Val Gly Leu Met Asp Arg Val Met Lys

145 150 155 160

Gln Phe Leu Glu Thr Asp Trp Asn Arg Gln Gln Gln Ile Asn Val His

165 170 175

Asn Thr Val Lys Lys Tyr Thr Val Thr Leu Ser Cys Arg Val Phe Met

180 185 190

Ser Ile Asp Asp Glu Glu Gln Val Thr Arg Leu Gly Ser Ser Ile Gln

195 200 205

Asn Ile Glu Ala Gly Leu Leu Ala Val Pro Ile Asn Ile Pro Gly Thr

210 215 220

Ala Met Asn Arg Ala Ile Lys Thr Val Lys Leu Leu Thr Arg Glu Val

225 230 235 240

Glu Ala Val Ile Lys Gln Arg Lys Val Asp Leu Leu Glu Asn Lys Gln

245 250 255

Ala Ser Gln Pro Gln Asp Leu Leu Ser His Leu Leu Leu Thr Ala Asn

260 265 270

Gln Asp Gly Gln Phe Leu Ser Glu Ser Asp Ile Ala Ser His Leu Ile

275 280 285

Gly Leu Met Gln Gly Gly Tyr Thr Thr Leu Asn Gly Thr Ile Thr Phe

290 295 300

Val Leu Asn Tyr Leu Ala Glu Phe Pro Asp Val Tyr Asn Gln Val Leu

305 310 315 320

Ala Glu Gln Val Glu Ile Ala Asn Ser Lys His Pro Lys Glu Leu Leu

325 330 335

Asn Trp Glu Asp Leu Arg Lys Met Lys Tyr Ser Trp Asn Val Ala Gln

340 345 350

Glu Val Leu Arg Ile Ile Pro Pro Gly Val Gly Thr Phe Arg Glu Ala

355 360 365

Ile Thr Asp Phe Thr Tyr Ala Gly Tyr Leu Ile Pro Lys Gly Trp Lys

370 375 380

Met His Leu Ile Pro His Asp Thr His Lys Asn Pro Thr Tyr Phe Pro

385 390 395 400

Ser Pro Glu Lys Phe Asp Pro Thr Arg Phe Glu Gly Asn Gly Pro Ala

405 410 415

Pro Tyr Thr Phe Thr Pro Phe Gly Gly Gly Pro Arg Met Cys Pro Gly

420 425 430

Ile Glu Tyr Ala Arg Leu Val Ile Leu Ile Phe Met His Asn Val Val

435 440 445

Thr Asn Phe Arg Trp Glu Lys Leu Ile Pro Asn Glu Lys Ile Leu Thr

450 455 460

Asp Pro Ile Pro Arg Phe Ala His Gly Leu Pro Ile His Leu His Pro

465 470 475 480

His Asn

<210> 4

<211> 482

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 4

Met Val Leu Phe Phe Ser Leu Ser Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Phe Ala Tyr Phe Ser Tyr Thr Lys Arg Ile Pro Gln Lys Glu Asn

20 25 30

Asp Ser Lys Ala Pro Leu Pro Pro Gly Gln Thr Gly Trp Pro Leu Ile

35 40 45

Gly Glu Thr Leu Asn Tyr Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Val Ser Glu

50 55 60

Asn Phe Val Lys Tyr Arg Lys Glu Lys Tyr Ser Pro Lys Val Phe Arg

65 70 75 80

Thr Ser Leu Leu Gly Glu Pro Met Ala Ile Leu Cys Gly Pro Glu Gly

85 90 95

Asn Lys Phe Leu Tyr Ser Thr Glu Lys Lys Leu Val Gln Val Trp Phe

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Pro Ser Ser Val Glu Lys Met Ala Pro Arg Ser His Gly Glu Ser Asn

115 120 125

Ala Asp Asn Phe Ser Lys Val Arg Gly Lys Met Met Phe Leu Leu Lys

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Val Asp Gly Met Lys Lys Tyr Val Gly Leu Met Asp Arg Val Met Lys

145 150 155 160

Gln Phe Leu Glu Thr Asp Trp Asn Arg Gln Gln Gln Ile Asn Val His

165 170 175

Asn Thr Val Lys Lys Tyr Thr Val Thr Leu Ser Cys Arg Val Phe Met

180 185 190

Ser Ile Asp Asp Glu Glu Gln Val Thr Arg Leu Gly Ser Ser Ile Gln

195 200 205

Asn Ile Glu Ala Gly Leu Leu Ala Val Pro Ile Asn Ile Pro Gly Thr

210 215 220

Ala Met Asn Arg Ala Ile Lys Thr Val Lys Leu Leu Thr Arg Glu Val

225 230 235 240

Glu Ala Val Ile Lys Gln Arg Lys Val Asp Leu Leu Glu Asn Lys Gln

245 250 255

Ala Ser Gln Pro Gln Asp Leu Leu Ser His Leu Leu Leu Thr Ala Asn

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Gln Asp Gly Gln Phe Leu Ala Glu Ser Asp Ile Ala Ser His Leu Ile

275 280 285

Gly Leu Met Gln Gly Gly Tyr Thr Thr Leu Asn Gly Thr Ile Thr Phe

290 295 300

Val Leu Asn Tyr Leu Ala Glu Phe Pro Asp Val Tyr Asn Gln Val Leu

305 310 315 320

Lys Glu Gln Val Glu Ile Ala Asn Ser Lys His Pro Lys Glu Leu Leu

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Asn Trp Glu Asp Leu Arg Lys Met Lys Tyr Ser Trp Asn Val Ala Gln

340 345 350

Glu Val Leu Arg Ile Ile Pro Pro Gly Val Gly Thr Phe Arg Glu Ala

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Ile Thr Asp Phe Thr Tyr Ala Gly Tyr Leu Ile Pro Lys Gly Trp Lys

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Met His Leu Ile Pro His Asp Thr His Lys Asn Pro Thr Tyr Phe Pro

385 390 395 400

Ser Pro Glu Lys Phe Asp Pro Thr Arg Phe Glu Gly Asn Gly Pro Ala

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Pro Tyr Thr Phe Thr Pro Phe Gly Gly Gly Pro Arg Met Cys Pro Gly

420 425 430

Ile Glu Tyr Ala Arg Leu Val Ile Leu Ile Phe Met His Asn Val Val

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Thr Asn Phe Arg Trp Glu Lys Leu Ile Pro Asn Glu Lys Ile Leu Thr

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Asp Pro Ile Pro Arg Phe Ala His Gly Leu Pro Ile His Leu His Pro

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His Asn

<210> 5

<211> 712

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 5

Met Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ser Met Ile Asp Leu Met Ala

1 5 10 15

Ala Ile Ile Lys Gly Glu Pro Val Ile Val Ser Asp Pro Ala Asn Ala

20 25 30

Ser Ala Tyr Glu Ser Val Ala Ala Glu Leu Ser Ser Met Leu Ile Glu

35 40 45

Asn Arg Gln Phe Ala Met Ile Val Thr Thr Ser Ile Ala Val Leu Ile

50 55 60

Gly Cys Ile Val Met Leu Val Trp Arg Arg Ser Gly Ser Gly Asn Ser

65 70 75 80

Lys Arg Val Glu Pro Leu Lys Pro Leu Val Ile Lys Pro Arg Glu Glu

85 90 95

Glu Ile Asp Asp Gly Arg Lys Lys Val Thr Ile Phe Phe Gly Thr Gln

100 105 110

Thr Gly Thr Ala Glu Gly Phe Ala Lys Ala Leu Gly Glu Glu Ala Lys

115 120 125

Ala Arg Tyr Glu Lys Thr Arg Phe Lys Ile Val Asp Leu Asp Asp Tyr

130 135 140

Ala Ala Asp Asp Asp Glu Tyr Glu Glu Lys Leu Lys Lys Glu Asp Val

145 150 155 160

Ala Phe Phe Phe Leu Ala Thr Tyr Gly Asp Gly Glu Pro Thr Asp Asn

165 170 175

Ala Ala Arg Phe Tyr Lys Trp Phe Thr Glu Gly Asn Asp Arg Gly Glu

180 185 190

Trp Leu Lys Asn Leu Lys Tyr Gly Val Phe Gly Leu Gly Asn Arg Gln

195 200 205

Tyr Glu His Phe Asn Lys Val Ala Lys Val Val Asp Asp Ile Leu Val

210 215 220

Glu Gln Gly Ala Gln Arg Leu Val Gln Val Gly Leu Gly Asp Asp Asp

225 230 235 240

Gln Cys Ile Glu Asp Asp Phe Thr Ala Trp Arg Glu Ala Leu Trp Pro

245 250 255

Glu Leu Asp Thr Ile Leu Arg Glu Glu Gly Asp Thr Ala Val Ala Thr

260 265 270

Pro Tyr Thr Ala Ala Val Leu Glu Tyr Arg Val Ser Ile His Asp Ser

275 280 285

Glu Asp Ala Lys Phe Asn Asp Ile Asn Met Ala Asn Gly Asn Gly Tyr

290 295 300

Thr Val Phe Asp Ala Gln His Pro Tyr Lys Ala Asn Val Ala Val Lys

305 310 315 320

Arg Glu Leu His Thr Pro Glu Ser Asp Arg Ser Cys Ile His Leu Glu

325 330 335

Phe Asp Ile Ala Gly Ser Gly Leu Thr Tyr Glu Thr Gly Asp His Val

340 345 350

Gly Val Leu Cys Asp Asn Leu Ser Glu Thr Val Asp Glu Ala Leu Arg

355 360 365

Leu Leu Asp Met Ser Pro Asp Thr Tyr Phe Ser Leu His Ala Glu Lys

370 375 380

Glu Asp Gly Thr Pro Ile Ser Ser Ser Leu Pro Pro Pro Phe Pro Pro

385 390 395 400

Cys Asn Leu Arg Thr Ala Leu Thr Arg Tyr Ala Cys Leu Leu Ser Ser

405 410 415

Pro Lys Lys Ser Ala Leu Val Ala Leu Ala Ala His Ala Ser Asp Pro

420 425 430

Thr Glu Ala Glu Arg Leu Lys His Leu Ala Ser Pro Ala Gly Lys Val

435 440 445

Asp Glu Tyr Ser Lys Trp Val Val Glu Ser Gln Arg Ser Leu Leu Glu

450 455 460

Val Met Ala Glu Phe Pro Ser Ala Lys Pro Pro Leu Gly Val Phe Phe

465 470 475 480

Ala Gly Val Ala Pro Arg Leu Gln Pro Arg Phe Tyr Ser Ile Ser Ser

485 490 495

Ser Pro Lys Ile Ala Glu Thr Arg Ile His Val Thr Cys Ala Leu Val

500 505 510

Tyr Glu Lys Met Pro Thr Gly Arg Ile His Lys Gly Val Cys Ser Thr

515 520 525

Trp Met Lys Asn Ala Val Pro Tyr Glu Lys Ser Glu Asn Cys Ser Ser

530 535 540

Ala Pro Ile Phe Val Arg Gln Ser Asn Phe Lys Leu Pro Ser Asp Ser

545 550 555 560

Lys Val Pro Ile Ile Met Ile Gly Pro Gly Thr Gly Leu Ala Pro Phe

565 570 575

Arg Gly Phe Leu Gln Glu Arg Leu Ala Leu Val Glu Ser Gly Val Glu

580 585 590

Leu Gly Pro Ser Val Leu Phe Phe Gly Cys Arg Asn Arg Arg Met Asp

595 600 605

Phe Ile Tyr Glu Glu Glu Leu Gln Arg Phe Val Glu Ser Gly Ala Leu

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Ala Glu Leu Ser Val Ala Phe Ser Arg Glu Gly Pro Thr Lys Glu Tyr

625 630 635 640

Val Gln His Lys Met Met Asp Lys Ala Ser Asp Ile Trp Asn Met Ile

645 650 655

Ser Gln Gly Ala Tyr Leu Tyr Val Cys Gly Asp Ala Lys Gly Met Ala

660 665 670

Arg Asp Val His Arg Ser Leu His Thr Ile Ala Gln Glu Gln Gly Ser

675 680 685

Met Asp Ser Thr Lys Ala Glu Gly Phe Val Lys Asn Leu Gln Thr Ser

690 695 700

Gly Arg Tyr Leu Arg Asp Val Trp

705 710

<210> 6

<211> 2139

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 6

atgtcttctt cttcatcatc ttcaacttct atgattgact tgatggcagc aattattaag 60

ggagaaccag tcattgtctc tgatccagct aacgcttctg catatgagtc tgtcgcagct 120

gagttgtctt ctatgttaat tgaaaataga cagtttgcta tgattgttac tacatcaatt 180

gcagtcttga ttggttgtat tgttatgttg gtttggagga ggtctggatc tggtaattca 240

aagagagttg aacctttaaa acctttagtt attaaaccaa gagaagaaga aattgacgat 300

ggtcgtaaaa aagttactat cttttttgga actcagactg gtactgctga gggtttcgct 360

aaagctttgg gtgaggaggc taaggctaga tatgaaaaaa ctagattcaa gattgttgat 420

ttggatgatt acgctgcaga cgacgacgaa tacgaggaaa aattgaaaaa agaagatgtc 480

gctttcttct ttttagctac atatggtgac ggtgaaccaa cagacaatgc tgcaagattt 540

tacaagtggt tcacagaagg aaatgatcgt ggtgagtggt tgaaaaattt gaaatatggt 600

gtttttggtt tgggaaacag acaatacgag catttcaata aagttgcaaa agtcgttgat 660

gatattttag tcgaacaagg tgctcagaga ttggtccaag tcggtttggg tgacgatgat 720

caatgtatag aggatgactt cacagcttgg agggaggctt tgtggccaga attggatact 780

attttgagag aggaaggtga tacagctgtc gctacaccat acactgctgc agtcttggag 840

tacagagttt caattcatga ttctgaagat gcaaaattta acgatattaa catggctaat 900

ggtaatggtt atactgtttt cgatgctcaa catccataca aggcaaacgt cgcagtcaag 960

agggagttgc acacaccaga atcagataga tcatgcattc atttagagtt tgacatagct 1020

ggttctggtt tgacatacga aactggtgac cacgttggtg tcttgtgcga caacttgtca 1080

gagacagtcg atgaagcttt gagattatta gacatgtctc cagacactta tttctctttg 1140

catgctgaga aagaagatgg tactccaatt tcatcttcat tgcctcctcc attcccacct 1200

tgcaacttaa gaactgcttt gactagatac gcttgtttgt tgtcttctcc taagaaatct 1260

gctttggtcg ctttggctgc acatgcttct gatccaacag aggcagagag gttaaagcac 1320

ttggcatcac cagctggaaa ggttgatgag tactctaagt gggtcgtcga gtcacagcgt 1380

tctttgttag aagttatggc agagttccct tcagctaagc caccattggg tgtcttcttc 1440

gctggagttg caccaaggtt gcaaccaaga ttttattcta tttcttcttc tccaaagatt 1500

gcagaaacta ggattcatgt tacttgtgct ttggtttacg aaaaaatgcc aactggtcgt 1560

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aactgttcat cagctcctat attcgtcaga caatctaact tcaagttacc ttcagattca 1680

aaggttccaa ttattatgat tggtcccggt actggattgg caccttttcg tggtttcttg 1740

caagaaaggt tggctttggt tgagtctggt gtcgaattgg gaccatcagt cttgtttttc 1800

ggttgtagga acagaagaat ggatttcatt tatgaggagg aattgcaaag gtttgttgag 1860

tctggtgctt tggcagagtt gtctgtcgct ttctctaggg agggtcctac aaaggaatac 1920

gttcaacata aaatgatgga taaagcatct gatatatgga atatgatttc acaaggagct 1980

tatttgtatg tctgcggtga tgcaaagggt atggctaggg acgtccatcg ttctttacat 2040

actattgctc aagaacaagg ttctatggat tcaacaaagg ctgaaggatt tgttaagaac 2100

ttgcaaactt ctggaagata tttgagagat gtctggtag 2139

Claims

1.一种羟化酶，其氨基酸序列为：

SEQ ID NO:3，其为SEQ ID NO:1第186位的M替换为L、第321位的K替换为A的突变体；或者

SEQ ID NO:4，其为SEQ ID NO:1第120位的F替换为A、第186位的M替换为L、第279位的S替换为A的突变体。

2.编码如权利要求1所述羟化酶的基因。

3.包含如权利要求2所述基因的质粒。

4.如权利要求3所述的质粒，其特征在于，其还包含P450还原酶编码基因SEQ ID NO:6，用于共表达羟化酶和P450还原酶SEQ ID NO:5。

5.转化了如权利要求3所述质粒、并且共转化了用于表达P450还原酶SEQ ID NO:5的质粒的微生物。

6.转化了如权利要求4所述质粒的微生物。

7.如权利要求5或6所述的微生物，所述微生物选自酿酒酵母或者解脂耶氏酵母。

8.如权利要求7所述的微生物，其特征在于，为酿酒酵母BY4742。

9.如权利要求1所述羟化酶、或者如权利要求5或6所述微生物在合成原人参二醇中的用途。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，以达玛烯二醇为底物原料，在羟化酶和P450还原酶催化下通过羟基化反应来制备原人参二醇。