CN113801799B - 酵母菌sll12及其在制备控制枣果实采后病害的生物防治剂中的应用 - Google Patents

酵母菌sll12及其在制备控制枣果实采后病害的生物防治剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了保藏编号为CGMCC No.21854的酵母菌(Debaryomyces nepalensis)SLL12及其在制备控制枣果实采后病害的生物防治剂中的应用，不仅丰富了酵母菌菌种资源库，拓宽了酵母菌在果实采后保鲜领域的应用范围，更为枣果实采后病害的防控提供了新的解决方案。

Description

酵母菌SLL12及其在制备控制枣果实采后病害的生物防治剂中的应用
技术领域
本发明属于酵母菌及果实采后病害生物防治技术领域，涉及一种酵母菌，还涉及该酵母菌在制备控制枣果实采后病害的生物防治剂中的应用。
背景技术
枣果实富含氨基酸、蛋白质、膳食纤维、矿物质、抗坏血酸等营养物质，深受广大消费者的喜爱。然而枣果实在采后贮藏期间极易发生微生物潜伏侵染性病害，黑斑病是其主要的采后病害之一。目前常用的防治枣果实采后病害的方法为化学杀菌剂包括代森锰锌，多菌灵等等。但是化学杀菌剂存在安全、环境污染等问题。因此，减少化学杀菌剂的使用，积极探讨开发有效的生物防治技术，是防治枣果实采后病害的研究热点。
研究表明，拮抗微生物能够有效防治果实采后病害的发生，其中拮抗酵母菌因能够迅速适应果实表面低氧高糖等微环境且能够在发酵罐中大量生产而成为果实采后生物防治的重点研究对象。拮抗酵母菌防治果实采后病害的机制主要包括营养与空间的竞争，分泌抑菌性物质和诱导宿主抗性等。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种酵母菌；目的之二在于提供该酵母菌在制备控制枣果实采后病害的生物防治剂中的应用，效果明确、显著。
经研究，本发明提供如下技术方案：
1.酵母菌(Debaryomyces nepalensis)SLL12，保藏编号为CGMCC No.21854。
2.所述酵母菌SLL12在制备控制枣果实采后病害的生物防治剂中的应用。
进一步，所述枣果实采后病害为黑斑病。
进一步，所述酵母菌SLL12通过诱导枣果实产生抗病性、以及营养与空间的竞争来防治枣果实的采后黑斑病。
酵母菌SLL12是从枣园叶片中分离得到，于2021年3月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.21854，分类命名为Debaryomyces nepalensis。
本发明的研究结果表明，酵母菌SLL12在体外并不能抑制枣果实黑斑病病原菌——链格孢菌(Alternaria alternate)的生长，说明酵母菌对链格孢菌不产生相应的抑菌物质或者说产生的抑菌物质的量极低，但酵母菌SLL12在果实上却能够有效地防治枣果实采后黑斑病的发生与进展，诱导宿主产生抗病性、营养与空间的竞争是其防治枣果实采后黑斑病的主要机制。
本发明的有益效果在于：本发明提供了保藏编号为CGMCC No.21854的酵母菌SLL12及其在制备控制枣果实采后病害的生物防治剂中的应用，不仅丰富了酵母菌菌种资源库，拓宽了酵母菌在果实采后保鲜领域的应用范围，更为枣果实采后病害的防控提供了新的解决方案。
附图说明
图1为筛选出的部分酵母菌在YEPD平板上对的形态。
图2为筛选出的部分酵母菌对链格孢菌的离体抑菌效果。
图3为筛选出的部分酵母菌对枣果实采后黑斑病的控制效果，其中DI表示发病率，LD表示病斑直径。
图4为酵母菌SLL12异孔接种对枣果实采后黑斑病的控制效果，其中DI表示发病率，LD表示病斑直径。
图5为酵母菌SLL12在枣果实伤口处的生长动态。
图6为扫描电镜下枣果实伤口处酵母菌SLL12和链格孢菌的生长动态，其中A1和A2为枣果实伤口处组织；B1和B2为酵母菌SLL12在枣果实伤口处的生长状态；C1和C2为链格孢菌在枣果实伤口处的生长状态；D1和D2为酵母菌SLL12和链格孢菌在枣果实伤口处的生长动态；A1～D1为放大1000倍；A2～D2为放大5000倍。
上述图3和图4中，Control表示对照；柱和竖线分别代表生物学重复的均值和标准偏差，同一时间点不同字母表示差异显著(P<0.05)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。
一.实验方法
1.酵母菌的筛选
从山西省临汾市、山西省晋中市以及重庆市北碚区的枣园中，采用五点取样法，收集不同枣园的根际土、叶片及幼果。每个枣园的根际土样品为5个取样点的根际土壤混合，每份根际土样品重约1kg。取2.0g根际土样品，置于20-30mL无菌水中，于28℃、200rmp下震荡1h使其充分混匀，取1ml进行梯度稀释(10-1，10-2，10-3)后涂布于培养基上。将叶片样品及幼果样品全部浸入无菌水中，于28℃、200rmp下震荡1h，取1ml进行梯度稀释(10-1，10-2)后涂布于培养基上。挑取具有典型酵母形态特征的单菌落进行划线纯化，甘油保种。纯化后的菌种放置于-80℃冰箱保存。
2.酵母菌对链格孢菌的离体抑菌效果
为了测试酵母菌在离体条件下对链格孢菌的抑制效果，用接种环挑取酵母菌单菌落在PDA平板中心划线，25℃培养48h后，打取培养5d的链格孢菌菌饼接种于距离酵母菌2.5cm的位置，以只接种链格孢菌的平板作为对照，7d记录链格孢菌孢子及菌丝径向生长的情况。实验重复3次。
3.酵母菌对枣果实采后黑斑病的控制效果
为了测试酵母菌对枣果实采后黑斑病的控制效果，对枣果实进行清洗消毒后，用无菌打孔器在果实赤道部位等距离打2个孔(直径3mm，深度3mm)，在果实伤口处加入1×108cells/mL酵母菌悬液20μL，以等量的无菌水作为对照，接种4h后接入链格孢菌孢子悬浮液(1×105spore/mL)，待菌液吸收后，单果包装，分别于25℃和4℃(RH90％～95％)条件下贮藏，测定果实发病率和病斑直径。每组处理10个果实。实验重复3次。
4.酵母菌的分子生物学鉴定
将酵母菌菌株通过16S rDNA序列分析进行鉴定。将培养好的酵母菌采用基因组DNA提取试剂盒提取菌体DNA，采用通用引物进行16s rDNA PCR扩增。正向引物为5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’(SEQ ID No.1)，反向引物为5’-TCCTCCGCTTATTGAT-ATGC-3’(SEQID No.2)。反应体系包括：12.5μL 2×Taq MasterMix(Dye),1μL各引物和1μL DNA模板。PCR反应过程如下：预变性，94℃，2min；然后30个循环：变性，94℃，30s；退火，55℃，30s；延伸72℃，30s；终延伸72℃，2min；最后4℃保存。PCR扩增产物使用1％琼脂糖进行凝胶电泳，随后在UV灯下观察条带。将PCR扩增产物委托上海生工生物股份有限公司进行测序，并利用NCBI中BLAST数据库进行对比。
5.酵母菌异孔接种对枣果实采后黑斑病的控制效果
为了确定酵母菌诱导果实产生抗病性的能力，采用酵母菌异孔接种方式。对枣果实进行清洗消毒后，用无菌打孔器在果实赤道部位等距离打2个孔(直径3mm、深2mm)，在果实伤口处加入1×108cells/mL酵母菌悬液20μL，以等量的无菌水作为对照，放置24h后，在之前打的孔右边1cm左右距离处再打1个同样大小的新孔，在新孔中接入链格孢菌孢子悬浮液(1×106spores/mL)10μL，室温干燥后，单果包装，放置于25℃，测定果实发病率和病斑直径。每组处理10个果实。实验重复3次。
6.酵母菌在枣果实伤口处的生长动态
通过细胞计数评估酵母菌在枣果实伤口处利用果实营养进行生长增殖的能力以及其在果实上进行营养和空间竞争的能力。对枣果实进行清洗消毒后，用无菌打孔器在果实赤道部位等距离打2个孔(直径3mm，深度3mm)，在果实伤口处加入1×108cells/mL酵母菌悬液20μL，以等量的无菌水作为对照，待菌液吸收后，单果包装，分别于25℃和4℃(RH90％～95％)下贮藏。以接种后1h测定的酵母菌数为起始值。取样时，用无菌打孔器取伤口处直径为10mm的果肉组织3份，放入含10mL无菌水的无菌研钵内研磨至匀浆，用稀释平板法于25℃培养48h后，使用全自动菌落计数仪计数，结果以每个伤口处的酵母数量来表示，单位为Log10 cells/wound。每组处理10个果实，实验重复3次。
7.酵母菌及链格孢菌在枣果实伤口处的生长状态
采用扫描电镜观察酵母菌与链格孢菌在枣果实伤口处的生长状态。对枣果实进行清洗消毒后，用无菌打孔器在果实赤道部位等距离打2个孔(直径3mm，深度3mm)，在果实伤口处加入1×108cells/mL酵母菌悬液20μL，以等量的无菌水作为对照，接种4h后接入链格孢菌孢子悬浮液(1×108spore/mL)10μL，果实在室温下自然晾干后用PE膜单果包装，置于20℃、相对湿度85％～90％的环境下贮藏，并用PE膜覆盖进行保湿处理，2d后采用扫描电镜观察酵母菌与链格孢菌在果实伤口处的生长状态。每组处理15个果实，实验重复3次。
二.实验结果
1.酵母菌的筛选
从山西省临汾市、山西省晋中市和重庆市北碚区的枣园中，共分离得到酵母菌疑似菌株135株。部分酵母菌疑似菌株在YEPD平板上对的形态如图1所示。
2.酵母菌对枣黑斑病菌的离体抑菌效果
对筛选出的135株酵母菌疑似菌株进行了离体抑菌实验。结果表明，135株菌株均在体外对链格孢菌没有抑制效果，部分菌株对链格孢菌的离体抑菌效果如图2所示。上述结果说明酵母菌对链格孢菌不产生相应的抑菌物质或者说产生的抑菌物质的量极低。
3.酵母菌对枣果实采后黑斑病的控制效果
随机选取在体外生长速度较快、活性较强的8株酵母菌疑似菌株，考察其对枣果实采后黑斑病的控制效果。结果如图3所示，8株菌株均能够在一定程度上降低枣果实采后黑斑病的发病率并延缓病斑生长，其中菌株SLL12的效果最好。
4.酵母菌的分子生物学鉴定
菌株SLL12的16S rDNA扩增产物的测得序列如SEQ ID No.3所示，使用NCBI中的BLAST程序对测得序列进行同源性比对分析，结果显示，菌株SLL12与酵母菌(Debaryomycesnepalensis)的同源性为100％。
5.酵母菌异孔接种对枣果实采后黑斑病的控制效果
如图4所示，酵母菌SLL12异孔接种能够有效地降低枣果实采后黑斑病的发病率并延缓病斑生长，说明其具有诱导枣果实产生抗病性的能力，能够通过诱导枣果实的抗病性来防治枣果实的采后黑斑病。
6.酵母菌在枣果实伤口处的生长动态
酵母菌SLL12在枣果实伤口处的生长动态如图5所示，可见酵母菌SLL12能够在枣果实伤口处有效定殖且迅速定殖，说明营养与空间的竞争是酵母菌SLL12防治枣果实采后病害的机制之一。
7.酵母菌及链格孢菌在枣果实伤口处的生长状态
扫描电镜下枣果实伤口处酵母菌SLL12和链格孢菌的生长动态如图6所示，可见酵母菌SLL12经过多次洗涤后依然能紧紧地附着在枣果实伤口表面，并能观察到有包裹酵母的胞外基质的形成。从图6D1-D2还可以观察到少数的链格孢菌菌丝被酵母菌SLL12细胞紧紧地包围，不能有效地接触枣果实伤口表面。上述结果显示了酵母菌SLL12快速地增殖及在果实伤口处的定殖能力，从而对链格孢菌形成强大的营养和空间竞争优势，抑制链格孢菌进一步对枣果实的侵染。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 西南大学
<120> 酵母菌SLL12及其在制备控制枣果实采后病害的生物防治剂中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 3
<211> 612
<212> DNA
<213> 酵母菌SLL12(Debaryomyces nepalensis SLL12)
<400> 3
gaatagcttc tttttgcagc gcttattgcg cggcgaaaaa ccttacacac agtgtttttt 60
gttattacaa gaactcttgc tttggtctgg actagaaata gtttgggcca gaggtttact 120
aaactaaact tcaatattta tattgaattg ttatttattt taattgtcaa tttgttgatt 180
aaattcaaaa aatcttcaaa actttcaaca acggatctct tggttctcgc atcgatgaag 240
aacgcagcga aatgcgataa gtaatatgaa ttgcagattt tcgtgaatca tcgaatcttt 300
gaacgcacat tgcgcccttt ggtattccaa agggcatgcc tgtttgagcg tcatttctct 360
ctcaaacctt cgggtttggt attgagtgat actcttagtc gaactaggcg tttgcttgaa 420
atgtattggc atgagtggta ctggatagtg ctatatgact ttcaatgtat taggtttatc 480
caactcgttg aatagtttaa tggtatattt ctcggtattc taggctcggc cttacaatat 540
aacaaacaag tttgacctca aatcaggtag gactacccgc tgaacttaag catatcaata 600
agcggaggaa aa 612

Claims (3)

1.酵母菌（Debaryomyces nepalensis）SLL12，保藏编号为CGMCC No. 21854。
2.权利要求1所述酵母菌SLL12在制备控制枣果实采后病害的生物防治剂中的应用，所述枣果实采后病害为黑斑病。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述酵母菌SLL12通过诱导枣果实产生抗病性、以及营养与空间的竞争来防治枣果实的采后黑斑病。
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