CN117264854B - 一种植物乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物乳杆菌及其应用，命名为植物乳杆菌L3 Lactiplantibacillus plantarum L3，该菌株在中国典型培养物保藏中心登记保藏；保藏号为CCTCC M 2023863。所述菌株能够高产苯乳酸，对霉菌、金黄色葡萄球菌等病原微生物具有很强的抑菌效果。本发明提供的植物乳杆菌L3 Lactiplantibacillus plantarum L3在发酵乳及苹果的贮藏保鲜中，可显著抑制有害微生物的生长，保证产品的质量及延长产品的贮藏期，可为食品贮藏保鲜方法的开发提供理论依据。此外，该菌株还具有高产共轭亚油酸、生物膜等益生功能因子的能力。
Description
技术领域
本发明涉及乳酸菌菌种领域，尤其涉及一种植物乳杆菌及其应用。
背景技术
食品安全是一个世界性的挑战，目前细菌污染、病毒污染、真菌污染等微生物污染是主要的食品安全问题。目前，针对微生物污染主要使用的是化学防腐剂，如丙酸钙、双乙酸钠、山梨酸钾等，然而频繁或过量地使用化学防腐剂会导致微生物耐药、化学防腐剂残留、食品品质改变等问题，不能满足消费者对高品质食品的要求。有研究报道指出，乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是公认的安全级菌株，在代谢过程中可以产生苯乳酸等物质来抑制有害微生物。
苯乳酸（phenyllactic acid，PLA），即2-羟基-3-苯基丙酸，是蜂蜜和发酵食品中天然存在的有机酸。分子式为C9H10O3，分子量166 g/moL，熔化温度约为98℃，通常被认为是安全的，对动物和人类细胞无细胞毒性，且无任何令人讨厌的气味。PLA具有治疗冠心病、抗心肌缺氧、抗HIV、提高免疫力、改善肉品质及抑菌等生理功能。在这些功能中目前关注最多的是抑菌作用，与Nisin（乳酸链球菌素）等天然抑菌物质相比，PLA在水中的溶解性较好，并能保持良好的热稳定性（120℃，20 min）和酸适应性，正因为这些优良特性，PLA在食品中相较于Nisin等抑菌物质更容易扩散。PLA的抑菌谱较广，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌等具有抑制作用。因此乳酸菌苯乳酸在食品中的开发利用具有巨大的前景。研究开发一种具有产抑菌物质特性的发酵剂，替代添加化学防腐剂具有重要的意义。
发明内容
本发明旨在提供一种高产苯乳酸的乳酸菌及其应用。本发明从采自云南大理喜洲粑粑发酵面团中分离出一株植物乳杆菌，该菌株高产苯乳酸、共轭亚油酸和生物膜，显著抑制病原微生物的生长，延长食品的保质期。
本发明第一方面，提供一种植物乳杆菌，所述植物乳杆菌命名为植物乳杆菌 L3Lactiplantibacillus plantarum L3，保藏编号为CCTCC M 2023863，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏日期：2023-05-30。
进一步地，所述植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillus plantarum L3分离自云南大理喜洲粑粑发酵面团。
所述植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillus plantarum L3肉眼观察菌落形态为：圆形，半透明，凸起，边缘整齐，表面湿润的乳白色菌落；光学显微镜下菌株细胞呈杆状，不产芽孢，革兰氏染色阳性。
进一步地，所述植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillus plantarum L3的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明第二方面，提供一种微生物菌剂，所述菌剂包含所述的植物乳杆菌。
本发明第三方面，提供所述植物乳杆菌或所述微生物菌剂在制备苯乳酸、共轭亚油酸或生物膜中的应用。
本发明第四方面，提供所述植物乳杆菌或所述微生物菌剂在食物保鲜或抑制腐败与致病微生物中的应用。所述腐败与致病微生物为霉菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌等。
本发明第五方面，提供所述植物乳杆菌或所述微生物菌剂在发酵食品中的应用。
作为优选， 所述发酵食品为面制品或者发酵乳。
作为优选，所述植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillus plantarum L3制备的发酵乳活菌数不低于1×106CFU/mL。
本发明提供的菌株能够高产苯乳酸，苯乳酸含量能达到250mg/L以上，还高产共轭亚油酸和生物膜，培养24h可以产生330ug/mL以上的共轭亚油酸。
在发酵乳的贮藏保鲜中，将保加利亚乳杆菌：嗜热链球菌：植物乳杆菌 L3Lactiplantibacillus plantarum L3接种于牛奶中，发酵制得发酵乳（试验组），以不接种植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillus plantarum L3为对照组。结果表明，在21d储存期间，对照组发酵乳中的霉菌数基本不变；试验组发酵乳中的霉菌数量减少。植物乳杆菌 L3Lactiplantibacillus plantarum L3有效地抑制了发酵乳贮藏中霉菌的生长，为开发一种具有产抑菌物质特性的发酵剂，替代添加化学防腐剂具有重要的意义。
在以苹果为例的食物保鲜实验中，植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillusplantarum L3 表现出很强的抑菌能力，能有效地控制苹果中霉菌的生长，并抑制病变区的扩大；能延长苹果贮藏期。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明从云南大理喜洲粑粑发酵面团样品中分离筛选得到一株高产苯乳酸的乳酸菌。通过形态学鉴定、16S rDNA基因测序以及全基因组测序对该乳酸菌进行鉴定，在分类上属Lactiplantibacillus plantarum，为植物乳杆菌，并将其命名为植物乳杆菌 L3Lactiplantibacillus plantarum L3。
（2）本发明提供的植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillus plantarum L3产苯乳酸、共轭亚油酸和生物膜，苯乳酸能够抑菌，共轭亚油酸具有抗癌、降脂、抗氧化等众多生理功能，生物膜用于抵抗不良环境，保持菌株活性。
（3）本发明提供的植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillus plantarum L3能显著的抑制霉菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌等病原微生物的生长，在食品贮藏过程中可以抑制病原微生物的生长，说明菌株可作为一种防腐微生物菌剂，延长食品保质期，有利于维持食品的质量及品质。
附图说明
图1植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillus plantarum L3的菌落形态；
图2 植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillus plantarum L3的基因圈图；
图3 植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillus plantarum L3的生长曲线；
图4 植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillus plantarum L3抑菌能力，A为霉菌抑菌能力测定，B为金黄色葡萄球菌抑菌能力测定，C为副溶血性弧菌抑菌能力测定；
图5 植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillus plantarum L3产苯乳酸的能力；
图6 植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillus plantarum L3在发酵乳中的应用；
图7 植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillus plantarum L3在苹果保鲜中的应用，A为植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillus plantarum L3在苹果上对霉菌的影响，B为苹果的病变直径；
图8 植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillus plantarum L3产生物膜的能力。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，本部分的描述仅是示范性和解释性，不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。本发明用到的霉菌从变质的酸奶中分离得到，经18s rDNA测序后，测序结果与GenBank数据库比对,结果显示与娄地青霉的同源性为100％，确定其为娄地青霉菌。金黄色葡萄球菌从乳饼分离得到，经生化检验及全基因组测序，测序结果与GenBank数据库比对，结果显示与金黄色葡萄球菌同源性为100％，确定其为金黄色葡萄球菌；副溶血性弧菌从淡水鱼中分离得到，经生化检验及全基因组进行测序，测序结果与GenBank数据库比对，结果显示与副溶血性弧菌同源性为100％，确定其为副溶血性弧菌。植物乳杆菌 L2分离于豆瓣酱，发酵乳杆菌A1分离于五味子泡酒，发酵乳杆菌A3分离于泡蒜，发酵乳杆菌A5分离于牦牛干巴，发酵乳杆菌A10分离于奶渣，植物乳杆菌C67分离于山羊奶，植物乳杆菌C6分离于乳饼，植物乳杆菌E8分离于奶渣，植物乳杆菌E64分离于甜白酒，以上9株乳酸菌分离后均通过16s rDNA测序，测序结果与GenBank数据库比对，结果鉴定为相应的乳酸菌品种。
实施例1菌种的分离纯化
取采自云南大理的喜洲粑粑发酵面团样品1g，接种于灭菌的生理盐水中，依次进行10倍梯度稀释。分别取10-4、10-5、10-6稀释液用平板涂布法涂布在含有0.5%CaCO3的MRS固体培养基上，放入恒温培养箱，37°C静置培养48h。观察并记录菌落特征，挑取菌落形态不同且含有溶钙圈的菌落，进一步进行划线分离纯化3 ~4次，使最终平板上为同一形态菌落为止。挑取单菌落接菌于MRS液体培养基中37℃培养24h，以备保藏和鉴定使用。
菌种的鉴定
（1）菌种的形态学特征
如图1所示，乳酸菌L3在MRS琼脂培养基培养48h后，菌落形态呈乳白色，半透明，较湿润，光滑，边缘整齐，有明显的凸起。乳酸菌L3光学显微镜下菌株细胞呈杆状，不产芽孢，革兰氏染色阳性。
（2）菌种的分子遗传学鉴定
①16S rDNA基因测序
使用TSINGKE的DNA提取试剂盒（通用型）提取细菌基因组，以提取到的菌株的基因组为模板，采用细菌通用引物：27F (5 '-AGTTTGATCMTGGCTCAG -3 ')和1492R (5 '-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行16S rDNA的PCR实验。将PCR产物送至北京擎科生物科技有限公司进行测序。16S rDNA的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，并将测序结果在NCBI数据库（www.ncbi.nlm.gov/blast/）中应用BLAST工具与GenBank数据库已有序列进行比对分析，分析待测菌株与已知菌株相应序列的同源性。GenBank数据库的比对结果显示与植物乳杆菌的同源性为100％，确定筛选的乳酸菌L3为植物乳杆菌。
②全基因测序
取2.5μg乳酸菌L3质检合格的DNA样本，加入磁珠纯化，取1μL样本Qubit定量。用机械打断的方法（超声波）将DNA片段化，然后对片段化的DNA进行片段纯化、末端修复、3端加A、连接测序接头，再用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，进行PCR 扩增形成测序文库（NEBNext®Ultra™DNA Library Prep Kit for Illumina®），建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用IlluminaNovaSeq进行测序。 如图2结果显示乳酸菌L3基因总长度是3167484 bp，平均G+C含量44.65 %。
最终，通过形态学、16S rDNA测序以及全基因组测序确定筛选的菌株为植物乳杆菌，并将其命名为植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillus plantarum L3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2023863。
实施例2菌株的抑菌能力
（1）植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillus plantarum L3的生长曲线
将在MRS液体液体培养基中活化三代的植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillusplantarum L3种子液按1%的接种量（V/V）接种于MRS液体培养基中，取种子液200μL置于96孔板中，测定其在600nm处的吸光值，每隔2 h测一次，共测定24 h，每个时间点重复3次，取平均值以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制生长曲线。
如图3所示，随着发酵时间的延长，植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillusplantarum L3的OD600 nm值呈上升趋势，生长符合S形曲线。0~2h处于生长的延滞期，菌株的生长速率较为缓慢；2~14 h处于生长对数期，菌株的生长速率急剧上升；14~18 h处于生长的稳定期，菌株的OD600nm值基本趋于稳定；18~24 h处于生长的衰亡期，菌OD600nm值微弱的降低。
(2)植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillus plantarum L3的抑菌能力测定
将灭菌后的牛津杯置于平板上，将霉菌（娄地青霉）悬液以3 %（v/v）体积分数接种至未凝固的麦芽汁琼脂培养基中，混匀后倒入平板。平板置于超净工作台中 30 min 后，用镊子拔出牛津杯（10 mm深，8 mm宽），孔内加200μL植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillusplantarum L3发酵上清液（CFS），植物乳杆菌 L2Lactiplantibacillus plantarumL2发酵上清液（CFS），对照组加入200μL灭菌后的无菌MRS肉汤，将麦芽汁琼脂平板置于28℃条件下培养3 d，观察并测量抑菌圈的大小，做三次重复。
将金黄色葡萄球菌悬液以3%（v/v）体积分数接种至未凝固的LB琼脂培养基中，混匀后倒入平板。平板置于超净工作台中 30 min 后，用镊子拔出牛津杯（10 mm深，8 mm宽），孔内加200μL植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillus plantarum L3发酵上清液（CFS），植物乳杆菌 L2Lactiplantibacillus plantarumL2发酵上清液（CFS），对照组加入200μL灭菌后的无菌MRS肉汤及无菌水，将LB琼脂平板置于37℃条件下培养24h，观察并测量抑菌圈的大小，做三次重复。
将副溶血性弧菌悬液以3%（v/v）体积分数接种至3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上，并用涂布棒涂布均匀，将灭菌后的牛津杯置于平板上，孔内加200μL植物乳杆菌 L3Lactiplantibacillus plantarum L3发酵上清液（CFS），植物乳杆菌L2Lactiplantibacillus plantarumL2发酵上清液（CFS），对照组加入200μL灭菌后的无菌MRS肉汤及无菌水。将3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板置于37 ℃条件下培养24h，观察并测量抑菌圈的大小，做三次重复。
如图4中ABC所示，A为霉菌抑菌能力测定，B为金黄色葡萄球菌抑菌能力测定，C为副溶血性弧菌抑菌能力测定；与对照组相比，植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillusplantarum L3 CFS在霉菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌平板上出现了明显的抑菌圈，抑菌圈直径分别达21.8±1.1 mm，20.3±1.6 mm，13.7±0.9 mm表明植物乳杆菌 L3Lactiplantibacillus plantarum L3具有较高的抑菌能力，可以抑制霉菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌生长。
实施例3菌种产苯乳酸能力测定
将在MRS液体培养基中活化三代的植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillusplantarum L3种子液按1%的接种量（V/V）接种于含0，0.2，0.4，0.6，0.8，1 g/L苯丙氨酸的MRS液体培养基中，于37℃培养24 h后在8000 rpm，4 ℃下离心5 min，用无菌0.22 μm的过滤器过滤，获得无细胞上清液，并使用配备安捷伦Zorbax SB-C18柱（150 mm × 4.6 mm，5μm）的反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行分析，A相为0.05 %三氟乙酸乙腈，B相为0.05 %三氟乙酸水溶液，在210 nm处进行测定。
如图5所示，随着苯丙氨酸添加量的增加（0-1g/L），PLA（苯乳酸）的含量呈先增加，后减小的趋势。苯丙氨酸添加量为0.6 g/L时PLA含量最高，可以达到258.1±1.39mg/L。
实施例4植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillus plantarum L3在食品中的应用
（1）植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillus plantarum L3在发酵乳中的应用
活化后的菌种以1%的接种量接入MRS肉汤中培养（37℃，24h）至第三代，将保加利亚乳杆菌：嗜热链球菌：植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillus plantarum L3按照1:1:1的比例在无菌环境下接种至牛奶后在36℃的条件下进行培养得到发酵乳。植物乳杆菌 L3Lactiplantibacillus plantarum L3的接种量为0.5-2%(v/v)。
发酵乳抑菌效果
将备用的霉菌悬液用PBS洗涤，在新鲜巴氏杀菌牛奶中重悬至约103CFU/mL，按照1:1:1的比例将保加利亚乳杆菌：嗜热链球菌：植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillusplantarum L3接种于牛奶中。分别在0 d、4 d、8 d、12 d、16 d、21 d使用伊红美蓝平板检测霉菌数。将相同比例的保加利亚乳杆菌：嗜热链球菌的牛奶作为对照组。
如图6所示，在21 d（天）储存期间，未处理发酵乳中的霉菌数基本不变（7.30~7.29log CFU/mL）；加入植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillus plantarum L3发酵乳中的霉菌数量减少，由最初的7.31 log CFU/mL变为5.83 log CFU/mL。显然，植物乳杆菌 L3Lactiplantibacillus plantarum L3处理有效地抑制了发酵乳在储存过程中霉菌的生长。说明植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillus plantarum L3可以做为具有防腐作用的发酵剂应用发酵乳的生产中，从而解决发酵乳中霉菌超标的问题，减少经济损失。
（2）植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillus plantarum L3在食品保鲜中的应用
选择了相同大小的新鲜苹果（每个苹果重约200 g）。苹果在2%次氯酸钠溶液（v/v）中浸泡2分钟，用自来水冲洗，并在室温下干燥。每个苹果表面用70%乙醇消毒。用无菌牛津杯在每个苹果上做了一个伤口（10mm深，7.8mm宽）。然后，将霉菌悬液注入每个伤口10μL。使其在1小时内充分吸收霉菌悬液，之后再接种20μL的植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillusplantarum L3 CFS，以无菌MRS肉汤为对照，于30 ℃培养并观察霉菌生长及苹果腐烂情况。
如图7中A所示，在早期阶段（0-2d），植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillusplantarum L3 CFS处理组与对照组无明显的差别；但是在第4 d时可以观察到植物乳杆菌L3 Lactiplantibacillus plantarum L3 CFS表现出很强的抗菌能力，能有效地控制苹果中霉菌的生长，并抑制病变区的扩大；在末期阶段（7-9d），与植物乳杆菌 L3Lactiplantibacillus plantarum L3 CFS处理组相比，无菌MRS肉汤处理组可以明显的观察到霉菌及苹果发生腐烂，同时由图7中B可知，对照组苹果上的病变区显著高于植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillus plantarum L3 CFS处理组（P<0.001）。表明植物乳杆 L3Lactiplantibacillus plantarum L3在控制水果和蔬菜腐败中是有效的，可以延长食品的贮藏期。
实施例5植物乳杆菌 L3Lactiplantibacillus plantarumL3产其它益生功能因子
（1）植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillus plantarum L3产共轭亚油酸（CLA）能力的测定
将实验保藏的10株乳酸菌在MRS液体液体培养基中将活化三代的乳酸菌于37℃下培养24 h。结束后离心（8000r，5min，4℃）得到发酵上清液，取结束后取 10mL发酵上清液于分液漏斗中，并加入30mL 正己烷，振荡5min后静置20min，然后再添加 20 mL正己烷；整个过程重复三次后弃去下层液体，将上层有机相收集在干净的烧杯中，并加入无水硫酸钠吸收水分，然后使用 0.22 m 的过滤器过滤杂质和细菌。将过滤后的液体稀释10倍后，将其储存在-4℃条件下备检。使用紫外分光光度计于 232m下测定备检液的吸光度，然后根据公式计算备检液的 CLA 含量，所得数据即为发酵液中的CLA 含量。发酵液中的共亚油酸计算公式:y=0.0781x-0.0508 ( R2=0.9993)，x为吸光度。
如表1所示，在10株乳酸菌中植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillus plantarumL3的CLA含量334.22±1.26ug/mL远高于其它菌株。表明菌株处苯乳酸外还能产生其它的益生功能因子，对人体健康有益。
表1
（2）植物乳杆菌 L3 Lactiplantibacillus plantarum L3产生物膜能力的测定
将实验保藏的5株乳酸菌在MRS液体培养基中将活化三代的乳酸菌于37℃下培养24 h。培养结束后，去除每根试管的内容物，每根试管用5 mL无菌PBS（pH 7.2）洗涤2次，以去除不粘附的细菌。将剩余附着的细菌用5 mL 95%甲醇混合15 min，将液体去除，在60℃的烘箱中干燥。然后，每根试管用5 mL0.1%（v/v）结晶紫染色15 min。然后用无菌PBS（pH7.2）清洗，去除所有未结合的染料。试管在60 ℃的烘箱中干燥后，用5 mL 33%冰醋酸溶解结合结晶紫，用紫外分光光度计在490 nm波长下测定样品的吸光度。
生物膜的形成可以抵抗高温、不适当的pH值、渗透压、金属离子、抗生素等条件，增强细菌的存活率。此外生物膜还可以促进乳酸菌在肠道中的粘附，有利于乳酸菌的定植。结晶紫染色是大家比较公认的测定生物膜的一种方法，通过结晶紫可以将生物膜进行染色，生物膜越多，结晶紫颜色就越高，在OD490nm测定出的值就越高。
如图8所示，植物乳杆菌L3所产生的生物膜的量高于其它乳酸菌，说明在不良环境及胃肠道中的存活率更高，利用益生功能的发挥。
应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性说明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。
Claims (7)
1.一种植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum），其特征在于，所述植物乳杆菌命名为植物乳杆菌L3，保藏编号为CCTCC M 2023863，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，包含权利要求1所述的植物乳杆菌。
3.权利要求1所述的植物乳杆菌或权利要求2所述的微生物菌剂在制备苯乳酸、共轭亚油酸或生物膜中的应用。
4.权利要求1的植物乳杆菌或权利要求2所述的微生物菌剂在食物保鲜或抑制腐败与致病微生物中的应用，所述的应用不以治疗疾病为目的。
5.权利要求1的植物乳杆菌或权利要求2所述的微生物菌剂在发酵食品中的应用。
6.根据权利要求5所述的植物乳杆菌或权利要求2所述的微生物菌剂在发酵食品中的应用，其特征在于，所述发酵食品为面制品或者发酵乳。
7.根据权利要求5所述的植物乳杆菌在发酵食品中的应用，其特征在于，所述植物乳杆菌L3制备的发酵乳活菌数不低于1×106 CFU/mL。
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