CN109239030A - 一种检测循环肿瘤细胞her2不同位点和er、pr的试剂盒及应用 - Google Patents

一种检测循环肿瘤细胞her2不同位点和er、pr的试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测循环肿瘤细胞HER2不同位点和ER、PR的试剂盒及应用，本发明所述方法，检测原理如下：首先富集循环肿瘤细胞和其他稀有细胞，然后根据抗原抗体反应原理，采用免疫荧光检测方法，检测富集的细胞中目的蛋白在细胞中的表达。本试剂盒通过对靶标细胞和白细胞共同抗原CD45进行荧光标记，通过筛选目的蛋白阳性、CD45阴性的细胞，从而对血液中特定蛋白阳性的循环肿瘤细胞进行判读和计数。

Description

一种检测循环肿瘤细胞HER2不同位点和ER、PR的试剂盒及 应用
技术领域：
本发明涉及一种医用检测方法，特别涉及血液中循环肿瘤细胞的检测，具体涉及人表皮生长因子受体2(HER2)不同位点、***受体(ER)、孕激素受体(PR)蛋白免疫荧光检测试剂盒，适用于不同体液样本HER2、ER、PR抗原的检测，还涉及该试剂盒在检测HER2、ER、PR中的用途。
背景技术：
目前癌症发病率较高，严重威胁人类健康。有些癌症较难早期发现，诊断时多为晚期，如肺癌，结直肠癌，卵巢癌，胰腺癌等。相应的，晚期癌症的5年存活率显著低于早期患者，早发现早诊断精准治疗可显著延长患者的存活时间。
人表皮生长因子受体2(Human epidermal growth factor receptor 2，HER2)、***受体(Estrogen receptor，ER)、孕激素受体(Progesterone receptor，PR)是重要的免疫组化标志物之一。在包括乳腺癌、胃癌、肠癌、肺癌、子宫内膜癌等的其他多种恶性肿瘤中可检测到HER2蛋白的过表达。在包括乳腺癌、子宫内膜癌中也常有ER、PR的高表达。临床常根据HER2、ER、PR的表达状态为患者的临床治疗提供参考。以乳腺癌为例，乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，年发病数占全球癌症新发病例数23％，死亡人数占14％，位居女性肿瘤发生首位。临床实践表明：当ER、PR表达均为阳性时，内分泌治疗药物三苯氧胺(Tamoxiefen，TAM)治疗有效率为60％～75％，而两者之一为阳性时(ER+PR-或ER-PR+)有效率下降至35％～50％，表明ER、PR表达与内分泌治疗疗效密切相关，其检测结果将直接决定治疗方案的选择。在20％～30％的乳腺癌患者中存在HER2基因的扩增及其编码蛋白的过表达(SlamonDJ，et al.Science，1989)，对这些患者来说，内分泌治疗和标准化疗的治疗效果并不理想，抗HER2抗体药物可改善这部分癌症患者的预后。目前被FDA批准的HER2类药物针对HER2的不同位点，具有不同的作用机制。同样的在子宫内膜癌中，HER2、ER、PR的表达显示类似的结果。可选择类似的治疗方案对患者进行治疗。
目前肿瘤诊断主要依赖于病理学、影像学和血清学三种方法。病理学是肿瘤诊断的金标准，但是组织取样具有一定的创伤性，且受限于取材部位，同时由于肿瘤组织的异质性，单点组织取样不足以反应整体肿瘤状态，且难以重复取样动态监测。影像学方法在诊断肿瘤中作用较广泛，但是影像学一般存在辐射伤害。而且，影像学通常只反应肿瘤大小等信息，难以判断肿瘤的恶性程度。更重要的一点，影像学通常只能检测2mm以上的肿瘤组织，对于较小的肿瘤组织诊断敏感性较差，存在滞后性。血清学目前通常用于辅助判断癌症治疗疗效等信息，取样较为方便，但是灵敏度和特异性较差，且与病理生理相关性差。同样的，在治疗方面，目前临床上也存在一定的局限性。对于肿瘤患者，特别是发生转移的患者，目前通常只依据原发灶的信息来判断治疗方案，忽略了对转移灶甚至微转移灶的检测与治疗。治疗过程中，目前主要通过影像学或血清学来判断治疗疗效，在疗效判断的精准性等方面存在一定的局限。
以循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell，CTC)为主的体液肿瘤细胞的检测可为上述局限性提供一些解决方案。CTC是指在肿瘤形成或进展过程中从原发灶或转移灶脱落进入血液循环的肿瘤细胞，CTC的检出提示体内原发灶或转移灶的存在，或癌前病变细胞的存在，是转移病灶形成的“种子”细胞，是肿瘤发生发展的直接证据。近年来不断有证据显示：在肿瘤发生发展的早期，甚至是影像学可见病灶形成之前肿瘤就播散入血了，这种播散可能存在于肿瘤发展的整个过程中。所以，对CTC进行检测有利于早期发现肿瘤、辅助诊断或为选择治疗方案提供参考。同时，对CTC进行动态检测可了解患者对治疗药物的敏感性，及早发现耐药信号。
HER2、ER、PR表达的检测主要是通过免疫组织化学方法，由于存在肿瘤异质性和微小转移灶不可见的原因，原位癌组织中HER2、ER、PR检测并不能直接反映血液及转移灶中相关指标的表达水平。研究显示，HER2在乳腺癌组织和CTC中的状态并不一致，符合率约48％～97％(Lee JS，et al.Breast Cancer Res Treat，2016)；约有21％的乳腺癌患者，其转移灶中ER/PR的表达发生了变化(MacFarlane R，et al.J ClinOncol，2008)。另外，组织中HER2、ER、PR的检测在组织切片上进行，单张片子并不能反映患者整体的HER2、ER、PR表达水平且缺乏多种蛋白同时检测的结果，并缺乏HER2不同位点同时检测的结果。基于CTC对患者HER2、ER、PR表达水平进行检测，用于预测患者对特定药物治疗的作用，为疾病治疗方案的选择提供参考，更好的指导临床应用。
发明目的：
临床实践发现，抗HER2抗体有原发耐药和继发耐药，耐药机制如HER2受体分子结构的变化、持续激活的p95HER2变异本(HER2胞外段缺失)、HER2蛋白下游信号通路的改变等，这时候就需要应用不同作用机制的药物。抗HER2抗体曲妥珠和帕妥珠抗体通过结合于HER2胞外区发挥作用。而抑制酪氨酸激酶活性的小分子药物拉帕替尼和阿法替尼作用于HER2的胞内结构域。由此，可以通过检测HER2表达部位进行精准分型从而采取不同的辅助治疗方案。乳腺癌、子宫内膜癌常有ER、PR的高表达。当其高表达时，内分泌治疗有效率高。因此，及时检测ER、PR，可根据结果合理地选择内分泌治疗并判断患者的预后。本发明中的试剂盒可检测乳腺癌、子宫内膜癌等肿瘤患者CTC中HER2不同位点(胞外和/或胞内区域)、ER、PR的表达水平来对患者的用药提供参考性的意见。
目前肿瘤患者的HER2、ER、PR检测，主要是在组织上进行免疫组织化学检测，由于某些转移灶在很小的时候不易发现，加上肿瘤异质性的影响，其存在有创、不能反复取样本进行检测、不能动态监测、单个组织样本不足以反映整个肿瘤负荷的缺点。本发明中通过免疫荧光技术对患者的CTC中HER2、ER、PR的蛋白表达水平进行检测，可以更精准的反映患者的疾病负荷。并且可以反复取材，动态监测病情，从而为采取治疗方案提供更多的依据。
目前的免疫组化组织化学染色检测，不同的蛋白只能在不同的片子上进行染色。本发明中通过不同抗体和荧光标记实现多标免疫荧光检测，可以在同一张片子上对HER2、ER、PR进行检测，可反映同一细胞多种分子的阳性细胞数、蛋白表达量和蛋白定位，结果更加准确。Maurizio Scaltriti等(Scaltriti M，et al.J Natl Cancer Inst，2007)采用转染全长HER2和HER2胞内段的乳腺癌细胞系，对细胞增殖、受体激活和体外移植瘤进行检测，研究HER2胞内段和胞外段对HER2不同特异性单抗类药物的有效性。采用特异性靶向HER2胞内段的单抗类药物lapatinib能够显著性抑制过表达HER2胞内段蛋白的细胞的增殖和体外移植瘤的生长，相反采用特异性针对HER2胞外段的单抗类药物Trastuzumab，没有任何效果。进一步对46例转移性乳腺癌患者的石蜡包埋组织中的HER2全长和胞内段进行检测，对比患者的用药效果。结果发现对于HER2胞外段表达缺失的患者，Trastuzumab的有效性只有11.1％；而HER2全长表达的患者，Trastuzumab有效性达到51.4％。该研究检测患者组织中全长HER2和HER2胞内段的表达，不能判断胞外段缺失情况，而且需要分别采用两张组织切片，只能够对可以观察并取到肿瘤组织的患者进行检测，无法进行动态检测。Aktas B等(Aktas B.BMC Cancer，2016)等检测了96例乳腺癌患者CTC的EpCAM、HER2、ER、PR等分子的表达，发现原发灶与CTC中HER2、ER、PR表达的一致率为59％(p＝0.262)、39％(p＝0.51)和44％(p＝0.62)，转移灶与CTC中HER2、ER、PR表达的一致率为67％(p＝0.04)，43％(p＝0.16)和46％(p＝0.6)。该研究用反转录PCR对HER2、ER、PR进行检测，RNA容易降解，而且无法识别单细胞中HER2不同位点及ER、PR的表达状态。
发明内容：
针对现有技术的不足，本发明提供一种检测HER2不同位点和ER、PR抗原的方法及其试剂盒。
现有技术尚无采用免疫荧光方法同时检测CTC中HER2不同位点及ER、PR表达的报道。
本发明所述方法，检测原理如下：首先采用已知的方法富集循环肿瘤细胞，其中所述富集方法可以采用中国专利200810097889.4、201310057307.0、2015104411229中描述的方法。然后根据抗原抗体反应原理，采用已知的免疫荧光检测方法，检测富集的细胞中目的蛋白的表达。本试剂盒通过对靶标细胞和白细胞共同抗原CD45进行荧光标记，通过筛选目的蛋白阳性、CD45阴性的细胞，从而对血液中特定蛋白阳性的CTC进行判读和计数。在此基础上，将靶蛋白阳性、CD45阴性的候选CTC按照目的蛋白荧光强度将其表达按照高、中、低表达进行分类。
但将免疫荧光检测方法用于检测CTC中HER2、ER、PR表达在实践中遇到诸多困难，包括：细胞容易从玻片脱落、荧光较弱、非特异染色、基质背景高等。
本发明经过多次筛选研究，最终得到一种适合的方法，解决了上述困难，同时在实践过程中，意外的发现，本发明的检测结果和现有技术相比检测精度和准确率大大提高。
本发明的检测方法，步骤如下：
1)CTC的富集
取血液和其他体液样品，对其中的CTC可进行富集，其中所述富集，方法可选用任何一种CTC的分离富集方法，选自：红细胞去除、阴性富集、阳性富集、密度梯度分离法、膜过滤法、微流控法、流式细胞技术等；也可以不经富集将血标本涂于多张载玻片。
其中所述CTC(循环肿瘤细胞)是指在肿瘤形成或进展过程中从原发灶或转移灶脱落进入血液循环的肿瘤细胞，通常使用流式细胞仪分选、磁珠阳性分选方法富集得到，优选的使用阴性富集方法得到，本发明最佳方法如下：
使用去除血浆、红细胞、白细胞的阴性富集方法获得各种亚型的异常细胞；使用室温或室温20％恒湿条件使玻片自然干燥；使用固定剂固定细胞及抗原。
富集后的样本采用固定液固定，所述固定液选自：乙醇、甲醇、***、丙酮、冰醋酸、甲醛、多聚甲醛、戊二醛、丙烯醛、苦味酸、PLP液(过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液)、ECD-G液(碳二亚酰胺-戊二醛)等。在后续检测步骤中也可以采用这些试剂进行后固定。
2)将富集的CTC进行免疫荧光检测，免疫荧光检测方法步骤如下：2.1CYP1洗载玻片3min×3次，每次100～150μL，确保覆盖满整个标本区；
2.2吸去载玻片上多余液体，加入CYPP作用5min。用CYP1同上洗片3min×1次；吸去多余液体，加200μ1冰丙酮：甲醇(7∶3)作用5min，CYP1洗片3min×3次，吸去多余水分；
2.3加100～150μl封闭液室温封闭20～30min。吸去多余封闭液，加100～150μl稀释好的ER抗体、PR抗体和CD45抗体，室温湿盒内避光孵育1～2h；(直接标记抗体也可在2.5加入)。
2.4避光，取CYP2100～150μL/片洗片3min×3次，吸去多余水分；2.5加100～150μL稀释好的荧光二抗，湿盒内避光孵育(37℃，25～30min或室温30～60min)。CYP2洗3min×4次，吸去多余水分。2.6复染：取10μL DAPI染液，加至标本区。
2.7盖上盖玻片，并吸去周边液体。镜下观察或置于2～8℃或-20℃环境下避光保存。
3)对样本进行镜检观察
将样本置于荧光显微镜下，扫描整个标本区。若发现片状或者圈状信号时，切换至高倍镜下进一步鉴定。记录每个阳性细胞的坐标，并且40×物镜分别在不同通道下拍照。必要时可使用油镜观察。
4)结果判断
阳性细胞：目的蛋白荧光信号阳性且无血源性白细胞表面抗原荧光信号的有核细胞，记为一个阳性细胞。
阴性细胞：细胞有血源性白细胞表面抗原荧光信号，不论目的蛋白是否有荧光均记为阴性。
以上步骤中，需要使用到荧光素，其可以直接标记在抗体上或者通过荧光标记的第二抗体进行检测；标记抗体的荧光素具有不同的发射光谱，优选绿色荧光(如AlexaFluor 488)、橘色荧光(如Alexa Fluor 555)、红色(如Alexa Fluor 594)、深红色荧光(如Alexa Fluor 647)、浅色荧光(如Alexa Fluor 700)的组合；标记抗体的荧光素不限于Alexa Fluor系列荧光素，同样可以采用Dylight、华青染料、异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocynate，FITC)、生物素(biotin)、量子点、Texas Red、藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(APC)、罗丹明(rhodamine)等系列的荧光素标记抗体，或者不同系列的荧光素标记抗体联用。
CD45抗体是针对白细胞通用抗原的抗体，用于排除血源性细胞，也可以选自以下细胞表面抗原的抗体：CD3、CD11b、CD14、CD16、CD19、CD34、CD35、CD36、CD38、CD41、CD58、CD61、CD66b、CD235a；在组织或者细胞系上进行免疫荧光检测可以省略CD45抗体。
本发明的检测方法包含手工和自动化设备的操作。
本发明的检测方法可以与荧光原位杂交(FISH)技术联用，步骤为以下任一种：(i)：先进行免疫荧光检测再进行荧光原位杂交；(ii)：先进行荧光原位杂交再进行免疫荧光检测；(iii)：同时进行免疫荧光检测和荧光原位杂交。
本检测过程使用的缓冲液CYP1、CYP2、CYPP中含有表面活性剂和蛋白保护剂，这些表面活性剂可以采用0～10％的Triton X-100、saponin、Tween、NP-40、SDS、聚乙二醇；蛋白保护剂可采用0～10％的BSA、海藻糖(Trehalose)、蔗糖。
作为本领域技术人员公知的，本检测过程使用的封闭液也可以选用：动物血清、0.5％～10％BSA、Fc受体抗体。
作为本领域技术人员公知的，本检测过程可使用修复方法对样品进行处理，包含酶消化修复、EDTA修复、高压修复、微波修复等。
本检测过程使用的核染料不限于DAPI，同样可以采用Hoechst、碘化丙啶等。
作为本领域技术人员公知的，免疫荧光检测中特异抗体与细胞的孵育过程可分为液体染色和固体染色。液体染色是将细胞制备成细胞悬液，在悬液中进行细胞透化、抗体孵育等操作，然后将细胞转移至载玻片固定、封片；而固体染色是先将细胞转移至载玻片固定，再进行细胞透化、抗体孵育等操作。
本发明为进行上述免疫荧光检测，设计了一种便于操作的试剂盒，所述试剂盒中包括了上述免疫荧光检测步骤中的主要试剂，如以下试剂：
缓冲液CYP1、CYP2、CYPP、封闭液，检测HER2胞内胞外不同位点及ER、PR的特异性抗体至少一种以及相应的荧光二抗，荧光标记的CD45抗体，抗体稀释液，细胞核染色液，操作过程中所涉及的对照细胞可以包含或者不包含在试剂盒中。
本发明所述试剂盒优选以下组分：
以下对本发明试剂进行名称术语的解释：
本试剂盒中HER2抗体-1和HER2抗体-2分别识别HER2蛋白的不同序列，其中HER2蛋白序列属于已知序列，公开在Yamamoto T，et al.Similarity of protein encoded bythe human c-erb-B-2 gene to epidermal growth factor receptor.Nature，1986,319(6050)：230-4.文献中名称为c-erb-B-2。HER2抗体-1识别HER2蛋白第23-652位氨基酸序列，HER2抗体-2识别HER2蛋白第676-1255位氨基酸序列。
本试剂盒中ER抗体针对的ER序列属于已知序列，公布在Green S，et al.Humanoestrogen receptor cDNA：sequence，expression and homology to v-erb-A.Nature，1986，320(6058)：134-9.文献中名称为oestrogen receptor(ER)
本试剂盒中PR抗体针对的PR序列属于已知序列，公布在Kastner P，et al.Twodistinct estrogen-regulated promoters generate transcripts encoding the twofunctionally different human progesterone receptor forms A and B.EMBO J，1990,9(5)：1603-14.文献中名称为human progesterone receptor(hPR)。
本发明的核心技术在于步骤2)将富集的CTC进行免疫荧光检测，其中的涂片方法是本发明人经过多次实验和数据筛选获得的，有关条件的筛选过程如下：
步骤2.2中，吸去载玻片上多余液体，加入CYPP作用5min，加100～150μl封闭液室温封闭20～30min；
筛选过程如下：测试不同类型和不同浓度梯度的穿透试剂，不同的后固定试剂、封闭时间最终筛选到适合的反应条件。
步骤2.3中，加100～150μl稀释好的HER2-1、HER2-2、ER、PR抗体和CD45抗体，室温湿盒内避光孵育1～2h；
筛选过程如下：测试不同抗体浓度、孵育温度、孵育时间、洗片液，最终筛选到适合的反应条件。
步骤2.5中加100～150μL稀释好的荧光二抗，湿盒内避光孵育(37℃，25～30min或室温30～60min)。
筛选过程如下：测试不同抗体浓度、孵育温度、孵育时间、洗片液，最终筛选到适合的反应条件。
经过上述筛选，得到本发明的涂片条件和方法，所得结果检测精度和准确率大大提高。
本发明的试剂盒主要用于检测血液中的CTC，也可用于检测胸/腹腔积液、灌洗液、心包积液、脑脊液、尿液、细胞系、引流液、痰液等中的肿瘤细胞。也可应用于细胞片如涂片/爬片、组织的免疫荧光检测等。
本发明的试剂盒，可以适用于多种癌症细胞。癌症可包括以下至少一种：乳腺癌、食管癌、胃癌、结肠癌、肺癌、子宫内膜癌、***癌、睾丸癌、脑癌、皮肤癌、直肠癌、肉瘤、气管癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、卵巢癌、淋巴癌、***、外阴癌、黑素瘤、间皮瘤、肾癌、膀胱癌、甲状腺癌、骨癌、癌、肉瘤和软组织癌。
以下通过实验数据进一步说明本发明的有益效果：
本发明的有益效果：
1.与现有技术根据肿瘤组织中蛋白表达情况来指导用药相比，本发明的检测结果可以对用药进行实时指导。CTC检测不仅能够反映整体肿瘤(包括原位癌和可能存在的不可见的微小转移灶)负荷，同样可以反映体液中易发生转移的肿瘤细胞中HER2、ER、PR的表达情况。同时，HER2阳性者，可根据HER2的表达部位，为治疗药物的精准选择提供参考。
2.与现有技术对肿瘤组织中HER2进行免疫组化检测相比，对CTC中HER2、ER、PR细胞进行计数和表达量的区分，能够更精准的反映HER2、ER、PR与临床参数的相关性和指导用药。同时可在同一细胞上对HER2、ER、PR的表达水平进行检测，有利于患者治疗方案的选择。
3.与现有技术相比较，本研究所采用的样本是各种体液来源的细胞，在取材上比基于肿瘤组织的检测技术更加方便。
附图说明：
图1为同一样品的荧光显示图，分别为靶蛋白HER2胞内段、HER2胞外段、ER、PR、白细胞通用抗原CD45、细胞核染料DAPI、合图。
具体实施方式：
实施例1
材料：阴性富集的血液样本涂片、对照细胞可用BT-474细胞涂片。
实验步骤：
1.抽取3.5ml外周血于ACD(柠檬酸钠)抗凝管中。用的人外周血白细胞去除试剂盒阴性富集肿瘤细胞，并固定于载玻片；
2.CYP1洗载玻片3min×3次，每次100～150μL，确保覆盖满整个标本区；
3.吸去载玻片上多余液体，加入CYPP作用5min，CYP1同上洗片3min×1次；吸去多余液体，加200μl冰丙酮：甲醇(7∶3)作用5min，CYP1洗片3min×3次，吸去多余水分；
4.加100～150μl封闭液室温封闭25～30min。吸去多余封闭液，加100μl稀释好的HER2抗体-1、HER2抗体-2、ER抗体、PR抗体和CD45抗体，室温湿盒内避光孵育1.5～2h；
5.避光，取CYP2100-150μL/片洗片3min×3次，吸去多余水分；
6.加100μl稀释好的二抗，湿盒内避光孵育(37℃，25～30min)。CYP2洗3min×4次，吸去多余水分。
7.复染：将DAPI管瞬时离心后，液面处取10μL DAPI染液，加至标本区。
8.盖片：盖上盖玻片，镜下观察。将HER2、ER、PR部分或全部表达阳性、CD45抗体阴性的细胞视为阳性细胞(图1，本次实验ER用Alexa532标记的荧光二抗，未用试剂盒Alexa594标记的二抗)，并记录阳性细胞的数量。结果说明：
实施例2
材料：适量抗凝血液1管，采用膜过滤方法富集后对其进行蛋白检测
实验步骤：
1.抽取适量外周血放入含有抗凝剂采血管中，轻微震荡混匀。
2.将混悬液加入膜过滤分离肿瘤细胞技术装置中，缓慢通过滤器和滤膜。
3.待过滤完毕后，继续在膜过滤装置中加入50ml 0.01M PBS，将管壁周围附着的细胞混悬液冲入膜过滤装置内，让其通过滤器和滤膜；
4.固定滤膜上的细胞；
5.同实施例1操作检测蛋白。
实施例3
材料：适量抗凝血液1管，采用微流控方法富集后对其进行蛋白检测
实验步骤：
1.抽取的适量血液采用各种原理的微流控芯片进行富集。
2.富集后样本进行蛋白免疫荧光检测。
实施例4
材料：冰冻组织切片
实验步骤：
1.由冰冻切片机中取出载有切片的载玻片，放入湿盒中。
2.待载玻片达到室温且未干时，加CYP1于切片上洗载玻片3-5次；
3.吸去多余液体，加CYPP孵育，CYP1洗片；
4.吸去多余液体，加封闭液室温封闭；
5.吸去多余封闭液，加稀释好的HER2抗体-1、HER2抗体-2、ER抗体、PR抗体，室温避光孵育适当时间；
6.避光，CYP2洗片，吸去多余水分；
7.加稀释好的二抗，避光孵育适当时间。
8.CYP2洗片，吸去多余水分。
9.加10μlDAPI，封片镜检。根据细胞形态和HER2、ER、PR表达判断是否为阳性细胞。

Claims (10)

1.一种检测循环肿瘤细胞中HER2不同位点和ER、PR表达的方法，所述方法，步骤如下：
1)循环肿瘤细胞的富集
取血液和其他体液样品，对其中的循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell，CTC)进行富集，其中所述富集，方法可选用任何一种稀有有核细胞的分离富集方法，选自：红细胞去除、阴性富集、阳性富集、密度梯度分离法、膜过滤法、微流控法、流式细胞技术等；也可以不经富集将血标本涂于多张载玻片，
富集后的样本采用固定液固定，所述固定液选自：乙醇、甲醇、***、丙酮、冰醋酸、甲醛、多聚甲醛、戊二醛、丙烯醛、苦味酸、PLP液、ECD-G液，
2)将富集的CTC进行免疫荧光检测，免疫荧光检测方法步骤如下：
2.1)CYP1洗载玻片3min×3次，每次100～150μL，确保覆盖满整个标本区；
2.2)吸去载玻片上多余液体，加入CYPP作用5min，用CYP1同上洗片3min×1次；吸去多余液体，加200μl冰丙酮：甲醇(7:3)作用5min，CYP1洗片3min×3次，吸去多余水分；
2.3)加100～150μl封闭液室温封闭20～30min，吸去多余封闭液，加100～150μl稀释好的ER抗体、PR抗体和CD45抗体，室温湿盒内避光孵育1～2h；
2.4)避光，取CYP2 100～150μL/片洗片3min×3次，吸去多余水分；
2.5)加100～150μL稀释好的荧光二抗，湿盒内避光孵育，CYP2洗3min×4次，吸去多余水分，
2.6)复染：取10μL DAPI染液，加至标本区，
2.7)盖上盖玻片，并吸去周边液体，镜下观察或置于2～8℃或-20℃环境下避光保存，
3)对样本进行镜检观察
将样本置于荧光显微镜下，扫描整个标本区，若发现片状或者圈状信号时，切换至高倍镜下进一步鉴定，记录每个阳性细胞的坐标，并且40×物镜分别在不同通道下拍照，必要时可使用油镜观察，
4)结果判断
阳性细胞：目的蛋白荧光信号阳性且无血源性白细胞表面抗原荧光信号的有核细胞，记为一个阳性细胞，
阴性细胞：细胞有血源性白细胞表面抗原荧光信号，不论目的蛋白是否有荧光均记为阴性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测过程中需要使用到荧光素，所述荧光素优先使用绿色荧光、橘色荧光、红色荧光、深红色、浅色荧光的组合，选自：Alexa Fluor、Dylight、华青染料、异硫氰酸荧光素、生物素、量子点、Texas Red、藻红蛋白、藻蓝蛋白、罗丹明。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测过程中使用的CD45抗体是针对白细胞通用抗原的抗体，用于排除血源性细胞，也可以选自以下抗体：CD3、CD11b、CD14、CD16、CD19、CD34、CD35、CD36、CD38、CD41、CD58、CD61、CD66b、CD235a。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法可以与荧光原位杂交(FISH)技术联用，步骤为以下任一种：(i)：先用免疫荧光检测再进行荧光原位杂交；(ii)：先用荧光原位杂交再进行免疫荧光检测；(iii)：同时进行免疫荧光检测和荧光原位杂交。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测过程使用的缓冲液CYP1、CYP2、CYPP中含有表面活性剂和蛋白保护剂，表面活性剂选自：0～10％的Triton X-100、saponin、Tween、NP-40、SDS、聚乙二醇；蛋白保护剂选自：0～10％的BSA、海藻糖、蔗糖。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测过程使用的封闭液选自：动物血清、0.5％～10％BSA、Fc受体抗体。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测过程使用的修复方法选自：酶消化修复、EDTA修复、高压修复、微波修复。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测过程使用的核染料选自DAPI，Hoechst、碘化丙啶。
9.一种试剂盒，所述试剂盒中包括了权利要求1检测方法步骤中的主要试剂：缓冲液CYP1、CYP2、CYPP、封闭液，检测HER2胞内胞外不同位点及ER、PR的特异性抗体至少一种以及相应的荧光二抗，荧光标记的CD45抗体，抗体稀释液，细胞核染色液，任选的所涉及的对照细胞包含或者不包含在试剂盒中。
10.根据权利要求9的试剂盒，含有以下组分：
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