JP2002529704A - 単一細胞の複数マーカー特徴付け - Google Patents
単一細胞の複数マーカー特徴付けInfo
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Abstract
(57)【要約】
方法は、異なる波長の蛍光化合物に結合体化された、複数の細胞プローブを同時使用し、密度勾配遠心を使用して体液から単離された単一の細胞を特徴付ける。特異的抗体、ペプチド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが、単一の細胞の同定および特徴付けの両方のためのプローブとして使用される。1つの実施形態において、本発明は、単一の循環癌細胞を特徴付ける方法であって、この方法は、蛍光プローブを使用してこの細胞上の複数の細胞マーカーを同時測定する工程を包含し、ここで、このプローブは、蛍光顕微鏡を使用して単一の細胞において発現される複数の細胞マーカーを区別するために、異なる波長の光を放出する。
Description
【0001】 (発明の技術分野) 本発明は、複数の蛍光プローブの同時使用による、単一の細胞上の複数の細胞
マーカーの特徴付けに関する。
マーカーの特徴付けに関する。
【0002】 (発明の背景) 単一の細胞環境、そしてより詳細には、異常細胞(例えば、外来細胞またはそ
の健常様式から改変された細胞(例えば、癌細胞またはウイルス感染細胞))の
特徴付けおよびモニタリングは、蛍光プローブを使用する単一の細胞上の複数の
マーカーの同時試験工程を包含する。
の健常様式から改変された細胞(例えば、癌細胞またはウイルス感染細胞))の
特徴付けおよびモニタリングは、蛍光プローブを使用する単一の細胞上の複数の
マーカーの同時試験工程を包含する。
【0003】 分子が、光を吸収する場合、その後、これらの分子は、種々の手段(その手段
の1つは、より長い波長の光の放出である)によって、それらのエネルギー増加
を受ける。分子が、可視光または紫外光で照射される場合、この分子は、電子遷
移を受け得、その間にこの分子は、ある量子のエネルギーを吸収し、そして電子
は、その電子が基底状態で占有する軌道から、より高いエネルギーの別の軌道へ
励起される。分子について記録される紫外スペクトルおよび可視スペクトルは、
吸収スペクトルである。最も励起された状態は、短命であり、そして紫外領域で
吸収されたエネルギーの主な運命は、リン光または蛍光としての光の再放出であ
る。この放出は、短い持続時間(例えば、励起された分子の基底状態への復帰に
ついて、10-8〜10-9秒)である場合、このプロセスは、蛍光と呼ばれる。分
子が、内部分子移動において光を吸収し、ここで、より長い波長で、光が再放出
される場合に、蛍光が生じる。抗体分子およびそれらに結合され得る他の有機色
素の蛍光特性は、多くの分析方法の基礎を提供する。これらの方法の1つが、免
疫蛍光法である(Bright,Analytical Chem.,60:1
031(1988);Guilbault(編):Practical Flu
orescence,第2版、Marcel Dekker(1990);Mc
Gowanら、J.Histochemistry & Cytochemis
try,36(7):757−762、(1988);Jonesら、Bioc
hemical & Biophysical Research Commu
nications,167(2):464−470(1990))。
の1つは、より長い波長の光の放出である)によって、それらのエネルギー増加
を受ける。分子が、可視光または紫外光で照射される場合、この分子は、電子遷
移を受け得、その間にこの分子は、ある量子のエネルギーを吸収し、そして電子
は、その電子が基底状態で占有する軌道から、より高いエネルギーの別の軌道へ
励起される。分子について記録される紫外スペクトルおよび可視スペクトルは、
吸収スペクトルである。最も励起された状態は、短命であり、そして紫外領域で
吸収されたエネルギーの主な運命は、リン光または蛍光としての光の再放出であ
る。この放出は、短い持続時間(例えば、励起された分子の基底状態への復帰に
ついて、10-8〜10-9秒)である場合、このプロセスは、蛍光と呼ばれる。分
子が、内部分子移動において光を吸収し、ここで、より長い波長で、光が再放出
される場合に、蛍光が生じる。抗体分子およびそれらに結合され得る他の有機色
素の蛍光特性は、多くの分析方法の基礎を提供する。これらの方法の1つが、免
疫蛍光法である(Bright,Analytical Chem.,60:1
031(1988);Guilbault(編):Practical Flu
orescence,第2版、Marcel Dekker(1990);Mc
Gowanら、J.Histochemistry & Cytochemis
try,36(7):757−762、(1988);Jonesら、Bioc
hemical & Biophysical Research Commu
nications,167(2):464−470(1990))。
【0004】 蛍光抗体技術は、種々の方法に関し、これらには、直接蛍光技術、間接蛍光技
術、混合抗グロブリン技術、およびサンドイッチ技術が挙げられる。直接蛍光染
色反応は、蛍光標識したプローブ(例えば、抗体)が、目的の分子(例えば、抗
原)に特異的である、プロセスに関する。別の直接的技術は、組織サンプルにお
いて抗原よりむしろ抗体を同定するために使用される、「サンドイッチ」反応に
関する。抗原は組織に添加されて、そして細胞中に存在する特異的抗体に結合さ
れる。抗原に対する特異的フルオレセイン標識抗体が添加され、そしてその抗原
と反応し、ここで、この抗原は、細胞中の抗体に固定化される。
術、混合抗グロブリン技術、およびサンドイッチ技術が挙げられる。直接蛍光染
色反応は、蛍光標識したプローブ(例えば、抗体)が、目的の分子(例えば、抗
原)に特異的である、プロセスに関する。別の直接的技術は、組織サンプルにお
いて抗原よりむしろ抗体を同定するために使用される、「サンドイッチ」反応に
関する。抗原は組織に添加されて、そして細胞中に存在する特異的抗体に結合さ
れる。抗原に対する特異的フルオレセイン標識抗体が添加され、そしてその抗原
と反応し、ここで、この抗原は、細胞中の抗体に固定化される。
【0005】 間接蛍光染色反応は、複数工程プロセスを含み得、ここで、単純な反応の工程
1は、抗原に特異的な非標識抗体(すなわち、一次抗体)に関し、そして他の工
程は、この非標識抗体に結合する、別の種の蛍光標識抗体(例えば、ヤギ抗ウサ
ギ免疫グロブリンのような、二次抗体または三次抗体)に関し得る。別の間接的
方法は、混合された抗グロブリン反応を含み、ここで、一次抗体上に存在する抗
原は、二次抗体上の結合部位に反応させるために使用される。免疫グロブリン抗
原が、この細胞上に存在し、そして抗免疫グロブリン抗体が、標識免疫グロブリ
ンをその細胞表面免疫グロブリンに結合させるために使用される。
1は、抗原に特異的な非標識抗体(すなわち、一次抗体)に関し、そして他の工
程は、この非標識抗体に結合する、別の種の蛍光標識抗体(例えば、ヤギ抗ウサ
ギ免疫グロブリンのような、二次抗体または三次抗体)に関し得る。別の間接的
方法は、混合された抗グロブリン反応を含み、ここで、一次抗体上に存在する抗
原は、二次抗体上の結合部位に反応させるために使用される。免疫グロブリン抗
原が、この細胞上に存在し、そして抗免疫グロブリン抗体が、標識免疫グロブリ
ンをその細胞表面免疫グロブリンに結合させるために使用される。
【0006】 間接蛍光技術は、その増大された感度について知られており、この感度は、第
1の抗体または一次抗体が、組織抗原によって提供されるより、より多くの二次
抗体に対する結合部位を提供することに起因する。増大された感度は、間接蛍光
法に関連するが、1細胞あたりで試験され得るマーカーの数が、制限される。1
つの理由は、二次抗体および三次抗体の数の増加が、特徴付けられる1抗原あた
りで、その細胞表面のより多くを占めることに起因する、空間的制限である。
1の抗体または一次抗体が、組織抗原によって提供されるより、より多くの二次
抗体に対する結合部位を提供することに起因する。増大された感度は、間接蛍光
法に関連するが、1細胞あたりで試験され得るマーカーの数が、制限される。1
つの理由は、二次抗体および三次抗体の数の増加が、特徴付けられる1抗原あた
りで、その細胞表面のより多くを占めることに起因する、空間的制限である。
【0007】 間接蛍光法の主要な欠点は、異なる種のモノクローナル抗体の利用能の制限で
ある。一般的に、モノクローナル抗体は、マウス、ラット、ヤギ、ウサギおよび
ヒツジにおいて生成される。このように、使用のための種の数が、限られている
。2つのプローブ間を区別することは、例えば、一次抗体がマウスにおいて惹起
される場合に、二次抗体(例えば、ヤギ抗マウス)が、両方のプローブを認識す
るので、困難である。従って、異なる種が、各々の一次抗体プローブに必要とさ
れるので、かなりの制限が生じる。
ある。一般的に、モノクローナル抗体は、マウス、ラット、ヤギ、ウサギおよび
ヒツジにおいて生成される。このように、使用のための種の数が、限られている
。2つのプローブ間を区別することは、例えば、一次抗体がマウスにおいて惹起
される場合に、二次抗体(例えば、ヤギ抗マウス)が、両方のプローブを認識す
るので、困難である。従って、異なる種が、各々の一次抗体プローブに必要とさ
れるので、かなりの制限が生じる。
【0008】 直接蛍光抗体技術と間接蛍光抗体技術との比較は、この間接的方法を使用する
場合の立体的障害によって引き起こされる空間的制限を示す。この直接蛍光技術
は、抗原に結合する特異的な蛍光標識抗体を直接的に扱い、そして最大数のマー
カーが試験されることを可能にする。一次抗体は、間接的方法における二次抗体
について、組織抗原によって提供されるよりも、より多くの結合部位を提供し、
そしてこの技術の感度を増加するが、重要な細胞表面空間がブロックされ、そし
て最適な数の免疫学的表面マーカーが試験されることを妨げる(Stewart
Sell,「Antigen−Antibody Reactions」、:
Basic Immunology,Elsevier Publisher,
New York,137頁、(1987))。
場合の立体的障害によって引き起こされる空間的制限を示す。この直接蛍光技術
は、抗原に結合する特異的な蛍光標識抗体を直接的に扱い、そして最大数のマー
カーが試験されることを可能にする。一次抗体は、間接的方法における二次抗体
について、組織抗原によって提供されるよりも、より多くの結合部位を提供し、
そしてこの技術の感度を増加するが、重要な細胞表面空間がブロックされ、そし
て最適な数の免疫学的表面マーカーが試験されることを妨げる(Stewart
Sell,「Antigen−Antibody Reactions」、:
Basic Immunology,Elsevier Publisher,
New York,137頁、(1987))。
【0009】 Kueblerは、循環癌細胞の段階付け(staging)を議論する(米
国特許第5,529,903号)。白血球搬出の白血球画分における循環癌細胞
の濃縮物を、PCRおよびその後の培養を使用してアッセイし、腫瘍形成マーカ
ーを同定する。Kueblerは、蛍光標識を結合した複数のプローブを同時に
使用することによる、単一の細胞の特徴付けには取り組んでいない。
国特許第5,529,903号)。白血球搬出の白血球画分における循環癌細胞
の濃縮物を、PCRおよびその後の培養を使用してアッセイし、腫瘍形成マーカ
ーを同定する。Kueblerは、蛍光標識を結合した複数のプローブを同時に
使用することによる、単一の細胞の特徴付けには取り組んでいない。
【0010】 フローサイトメトリーは、患者の血中の癌細胞の存在を検出するための別の方
法である。複数の免疫蛍光マーカーを用いるフローサイトメトリーを使用して、
血中の腫瘍細胞数、化学療法および臨床状態との間に、良好な相関が存在する(
Racilaら、Proc.Natl.Acad.Sci.,95:4589−
4594(1998))。この技術は、患者の血液(Racila、前出)、骨
髄(Grossら、Proc.Natl.Acad.Sci.,92:537−
541(1995))およびアフェレーシス産物(Simpsonら、Exp.
Hematol.,23:1062−1068(1995))における癌細胞に
ついての予後情報を提供した。
法である。複数の免疫蛍光マーカーを用いるフローサイトメトリーを使用して、
血中の腫瘍細胞数、化学療法および臨床状態との間に、良好な相関が存在する(
Racilaら、Proc.Natl.Acad.Sci.,95:4589−
4594(1998))。この技術は、患者の血液(Racila、前出)、骨
髄(Grossら、Proc.Natl.Acad.Sci.,92:537−
541(1995))およびアフェレーシス産物(Simpsonら、Exp.
Hematol.,23:1062−1068(1995))における癌細胞に
ついての予後情報を提供した。
【0011】 細胞(特に、免疫細胞、外来細胞または疾患細胞(例えば、癌細胞))を評価
するために利用可能である、細胞マーカーの広範なリストが存在する。最初の腫
瘍マーカーは、1847年に同定されたが、腫瘍マーカーのみの有用性は、胃腸
癌において1960年代に認識された。
するために利用可能である、細胞マーカーの広範なリストが存在する。最初の腫
瘍マーカーは、1847年に同定されたが、腫瘍マーカーのみの有用性は、胃腸
癌において1960年代に認識された。
【0012】 多くのグループが、乳癌細胞の上皮抗原に対する抗サイトケラチンモノクロー
ナル抗体を使用して、血液および/または骨髄から乳癌細胞を分離する方法を、
首尾よく開発してきた。上皮細胞は、癌の伝播由来でない限り、これらのサンプ
ルには通常存在しない(Martinら、Exp.Hematol.,26:2
52−264(1998);Berios、前出;Naumeら、J.Hema
tother.,6:103−114(1997))。Heatlyら、J.C
lin.Pathol.,48:26−32(1995)は、良性および悪性の
***上皮におけるサイトケラチン発現の研究を行い、サイトケラチンプロフィー
ルにおける変化を試験した。これらの研究における抗体、CAM5.2は、サイ
トケラチン特異的であり、そして大部分の腺癌、ならびに線維腺腫および線維性
嚢胞疾患に陽性であった。
ナル抗体を使用して、血液および/または骨髄から乳癌細胞を分離する方法を、
首尾よく開発してきた。上皮細胞は、癌の伝播由来でない限り、これらのサンプ
ルには通常存在しない(Martinら、Exp.Hematol.,26:2
52−264(1998);Berios、前出;Naumeら、J.Hema
tother.,6:103−114(1997))。Heatlyら、J.C
lin.Pathol.,48:26−32(1995)は、良性および悪性の
***上皮におけるサイトケラチン発現の研究を行い、サイトケラチンプロフィー
ルにおける変化を試験した。これらの研究における抗体、CAM5.2は、サイ
トケラチン特異的であり、そして大部分の腺癌、ならびに線維腺腫および線維性
嚢胞疾患に陽性であった。
【0013】 侵襲性の潜在性は、細胞増殖マーカーMiB1/Ki67および増殖細胞核抗
原(PCNA)と関連されている。これら2つの型の細胞増殖マーカーを使用し
て、Kirkegaard(Anat.Pathol.,109:69−74(
1997))は、星状細胞腫の増殖が、MiB1/Ki67およびPCNAの画
像サイトメトリーによって測定した場合に、組織学的分類および患者の生存に有
意に相関する。
原(PCNA)と関連されている。これら2つの型の細胞増殖マーカーを使用し
て、Kirkegaard(Anat.Pathol.,109:69−74(
1997))は、星状細胞腫の増殖が、MiB1/Ki67およびPCNAの画
像サイトメトリーによって測定した場合に、組織学的分類および患者の生存に有
意に相関する。
【0014】 MiB1/Ki67は、Gerdes(Int.J.Cancer,31:1
3−20(1983))によって紹介され、これは、組織病理学および細胞病理
学における、腫瘍の増殖画分の評価する直接的手段を提供する(Keyら、La
b Invest.,68:629−636,(1993))。Sasano(
Anticancer Res.,17:3685−3690(1997))は
、MiB1/Ki67発現によって標識される細胞増殖と腺管癌の発現との間に
、有意な相関を見出した。Vielh(Am.J.Clin.Pathol.,
94:681−686(1990))は、Ki67モノクローナル抗体を使用し
て、免疫組織学的染色(Ki67指数) 対 フローサイトメトリーの研究を行
った。増殖性指標は、フローサイトメトリーよりも免疫組織化学的技術を使用し
て、より良好であるとみなされた。
3−20(1983))によって紹介され、これは、組織病理学および細胞病理
学における、腫瘍の増殖画分の評価する直接的手段を提供する(Keyら、La
b Invest.,68:629−636,(1993))。Sasano(
Anticancer Res.,17:3685−3690(1997))は
、MiB1/Ki67発現によって標識される細胞増殖と腺管癌の発現との間に
、有意な相関を見出した。Vielh(Am.J.Clin.Pathol.,
94:681−686(1990))は、Ki67モノクローナル抗体を使用し
て、免疫組織学的染色(Ki67指数) 対 フローサイトメトリーの研究を行
った。増殖性指標は、フローサイトメトリーよりも免疫組織化学的技術を使用し
て、より良好であるとみなされた。
【0015】 PCNAはまた、細胞増殖の良好なマーカーであり、いくつかの新生物におけ
る調節解除された発現、および良性組織における時折の上方調節を示す(El−
Habashiら、Acta.Cytol.,41:636−648(1997
);Hallら、J.Pathol.,162:285−294(1990);
LeongおよびMilios,Appl.Immunohistochem.
,1:127−135(1993);Matthewsら、Nature,30
9:374−376(1984);Siitonenら、Am.J.Patho
l.,142:1081−1088(1993);GalandおよびDegr
aef、Cell Tissue Kinet.,22:383−392(19
89))。
る調節解除された発現、および良性組織における時折の上方調節を示す(El−
Habashiら、Acta.Cytol.,41:636−648(1997
);Hallら、J.Pathol.,162:285−294(1990);
LeongおよびMilios,Appl.Immunohistochem.
,1:127−135(1993);Matthewsら、Nature,30
9:374−376(1984);Siitonenら、Am.J.Patho
l.,142:1081−1088(1993);GalandおよびDegr
aef、Cell Tissue Kinet.,22:383−392(19
89))。
【0016】 細胞増殖、細胞増殖阻害、異数性またはホルモンレセプター状態のマーカーを
使用して、生検材料における癌の攻撃性の決定を含む、段階付けが可能である。
現在、「危険性」の患者における循環癌細胞における転移の潜在性を検出する必
要性が存在する。適切に段階付けされた癌は、この情報に基づく適切な治療介入
の選択を補助し、そして患者の状態(すなわち、予後、薬物処置、および任意の
可能な寛解または疾患進行)をモニターすることを可能にする。開示される発明
は、循環癌細胞に関する情報を検出、列挙および提供するための改善された方法
を提供し、そして癌の診断および処置を改革する可能性を有する。このような方
法は、患者の疾患状態の評価を提供するために、適切な処置介入を決定するため
に、およびこのような介入の有効性をモニターするために有用である。
使用して、生検材料における癌の攻撃性の決定を含む、段階付けが可能である。
現在、「危険性」の患者における循環癌細胞における転移の潜在性を検出する必
要性が存在する。適切に段階付けされた癌は、この情報に基づく適切な治療介入
の選択を補助し、そして患者の状態(すなわち、予後、薬物処置、および任意の
可能な寛解または疾患進行)をモニターすることを可能にする。開示される発明
は、循環癌細胞に関する情報を検出、列挙および提供するための改善された方法
を提供し、そして癌の診断および処置を改革する可能性を有する。このような方
法は、患者の疾患状態の評価を提供するために、適切な処置介入を決定するため
に、およびこのような介入の有効性をモニターするために有用である。
【0017】 生検材料における癌の段階付け(攻撃性の決定を含む)は、プローブ(例えば
、細胞増殖、細胞増殖阻害、異数性またはホルモンレセプター状態に対するプロ
ーブ)の混合物に依存してきた。生検研究に由来するこれらのデータは、患者の
結果の要因に対する良好な相関性を示した。しかし、単一の細胞(特に、癌細胞
および/または免疫細胞、そして最も特に、患者の血液サンプルから単離された
循環癌細胞)上、またはこれらの単一の細胞内の細胞マーカーに対する、複数の
プローブの同時測定の適用の調査は、なされていない。
、細胞増殖、細胞増殖阻害、異数性またはホルモンレセプター状態に対するプロ
ーブ)の混合物に依存してきた。生検研究に由来するこれらのデータは、患者の
結果の要因に対する良好な相関性を示した。しかし、単一の細胞(特に、癌細胞
および/または免疫細胞、そして最も特に、患者の血液サンプルから単離された
循環癌細胞)上、またはこれらの単一の細胞内の細胞マーカーに対する、複数の
プローブの同時測定の適用の調査は、なされていない。
【0018】 体液から単離された単一の循環細胞(例えば、癌細胞)の同時の複数の特徴付
けは、マーカーの選択に依存して、哺乳動物の健康評価および/または癌の特徴
付けプロフィールを提供する。特に、哺乳動物由来の体液サンプル中の少数の循
環癌細胞の単離および特徴付けは、各癌細胞型の数および性質を評価する機会を
提供する。同時の複数の特徴付けは、各サンプルから、わずか1または2種の循
環癌細胞だけが、単離される場合、試験のために、少量の血液が処理される場合
、またはドナーが非常に少量の循環癌細胞を有する場合に、特に重要である。従
って、この癌の性質を評価するために、複数のマーカーを同時に使用して、これ
らの少数の細胞(すなわち、1〜20)の単離された循環癌細胞を最大に特徴付
ける必要性が存在する。さらに、循環癌細胞は、通常、異種の細胞集団を含むの
で、哺乳動物の循環から単離された各々の型の癌細胞を特徴付ける必要性が存在
する。従って、本発明の範囲において各々のサンプルを特徴付けることは、試験
される各々の細胞についてのより多くの情報を提供する。哺乳動物の循環から単
離された各々の細胞についての複数の特徴の存在または非存在に基づいて、少数
の異種癌細胞を特徴付ける能力は、段階付けおよび処置選択肢の評価に有用な情
報を提供し得る。
けは、マーカーの選択に依存して、哺乳動物の健康評価および/または癌の特徴
付けプロフィールを提供する。特に、哺乳動物由来の体液サンプル中の少数の循
環癌細胞の単離および特徴付けは、各癌細胞型の数および性質を評価する機会を
提供する。同時の複数の特徴付けは、各サンプルから、わずか1または2種の循
環癌細胞だけが、単離される場合、試験のために、少量の血液が処理される場合
、またはドナーが非常に少量の循環癌細胞を有する場合に、特に重要である。従
って、この癌の性質を評価するために、複数のマーカーを同時に使用して、これ
らの少数の細胞(すなわち、1〜20)の単離された循環癌細胞を最大に特徴付
ける必要性が存在する。さらに、循環癌細胞は、通常、異種の細胞集団を含むの
で、哺乳動物の循環から単離された各々の型の癌細胞を特徴付ける必要性が存在
する。従って、本発明の範囲において各々のサンプルを特徴付けることは、試験
される各々の細胞についてのより多くの情報を提供する。哺乳動物の循環から単
離された各々の細胞についての複数の特徴の存在または非存在に基づいて、少数
の異種癌細胞を特徴付ける能力は、段階付けおよび処置選択肢の評価に有用な情
報を提供し得る。
【0019】 (発明の要旨) 本発明に従って、単一の細胞環境下で、複数の体細胞性および遺伝子発現の細
胞マーカーを含む単一の細胞を特徴付けるための方法であり、ここで、この細胞
マーカーに対するプローブは、蛍光を発する能力を有する。
胞マーカーを含む単一の細胞を特徴付けるための方法であり、ここで、この細胞
マーカーに対するプローブは、蛍光を発する能力を有する。
【0020】 本発明の目的は、単一の細胞環境を特徴付ける方法を包含する特徴付けプロフ
ィールを確立する方法であり、ここで、蛍光プローブを使用して複数の細胞マー
カーを同時に測定し、ここで、このプローブは、蛍光顕微鏡を使用して、単一の
細胞において発現される複数の細胞マーカーを区別するために、異なる波長の光
を放出する。好ましくは、特徴付けプロフィールを確立する方法は、種々の期間
にわたるデータを蓄積するために、被験体を繰り返して試験することを包含する
。
ィールを確立する方法であり、ここで、蛍光プローブを使用して複数の細胞マー
カーを同時に測定し、ここで、このプローブは、蛍光顕微鏡を使用して、単一の
細胞において発現される複数の細胞マーカーを区別するために、異なる波長の光
を放出する。好ましくは、特徴付けプロフィールを確立する方法は、種々の期間
にわたるデータを蓄積するために、被験体を繰り返して試験することを包含する
。
【0021】 本発明の目的は、単一の細胞調製物を特徴付ける方法に関し、この方法は、表
面上へ細胞調製物を接着させる工程、この細胞調製物を固定液で固定化する工程
、この固定化された細胞を含むこのような細胞調製物を、所望の細胞マーカーに
対する複数のプローブと共にインキュベートする工程であって、ここで、この複
数のプローブは、蛍光(これは、異なる波長で励起され得る)を発する能力を有
する、工程、および各々の選択された細胞マーカーについて陽性の細胞を同定す
るために、これらの細胞を蛍光顕微鏡によって試験する工程を包含する。本発明
の好ましい目的は、密度勾配遠心プロセス、そしてより好ましくは、二重密度勾
配遠心プロセスによる、陰性選択プロトコルを使用して単離された循環癌細胞を
特徴付けることである。
面上へ細胞調製物を接着させる工程、この細胞調製物を固定液で固定化する工程
、この固定化された細胞を含むこのような細胞調製物を、所望の細胞マーカーに
対する複数のプローブと共にインキュベートする工程であって、ここで、この複
数のプローブは、蛍光(これは、異なる波長で励起され得る)を発する能力を有
する、工程、および各々の選択された細胞マーカーについて陽性の細胞を同定す
るために、これらの細胞を蛍光顕微鏡によって試験する工程を包含する。本発明
の好ましい目的は、密度勾配遠心プロセス、そしてより好ましくは、二重密度勾
配遠心プロセスによる、陰性選択プロトコルを使用して単離された循環癌細胞を
特徴付けることである。
【0022】 本発明の別の目的は、この哺乳動物の複数のマーカーの特徴付けプロフィール
を確立するために哺乳動物由来の単一の細胞環境を特徴付ける方法である。本発
明の1つの好ましい目的は、疾患を有する個体、例えば、癌を有する個体または
癌を有する疑いのある個体由来の単一の細胞を特徴付けて、癌の複数の特徴付け
プロフィールを提供する方法である。
を確立するために哺乳動物由来の単一の細胞環境を特徴付ける方法である。本発
明の1つの好ましい目的は、疾患を有する個体、例えば、癌を有する個体または
癌を有する疑いのある個体由来の単一の細胞を特徴付けて、癌の複数の特徴付け
プロフィールを提供する方法である。
【0023】 本発明の別の目的は、蛍光化合物を結合体化したプローブを使用して、単一の
細胞環境の細胞マーカーを特徴付けることであり、ここで、蛍光色素または蛍光
化合物は、適切なスペクトルフィルターを備える蛍光顕微鏡を使用して、各蛍光
標識プローブによって放出されている重複波長の光を排除することによって、こ
れらのマーカー間を区別することを可能にするように選択され、ここで、各プロ
ーブは、大きな干渉を伴わずに画像化され得る。
細胞環境の細胞マーカーを特徴付けることであり、ここで、蛍光色素または蛍光
化合物は、適切なスペクトルフィルターを備える蛍光顕微鏡を使用して、各蛍光
標識プローブによって放出されている重複波長の光を排除することによって、こ
れらのマーカー間を区別することを可能にするように選択され、ここで、各プロ
ーブは、大きな干渉を伴わずに画像化され得る。
【0024】 (発明の詳細な説明) 本発明は、単一の細胞環境を特徴付ける方法に関し、この方法は、蛍光顕微鏡
によって観察されるような蛍光プローブ介して、種々の細胞マーカーを同時に検
出する工程を包含する。好ましくは、プローブ(これは、細胞マーカーに指向さ
れる)は、蛍光化合物に結合体化されてプローブ−蛍光団(fluoropho
re)結合体を形成し、この結合体は、適切な蛍光フィルター(単数または複数
)(例えば、光学フィルターセット)を備える顕微鏡によって選択的に検出され
得る。
によって観察されるような蛍光プローブ介して、種々の細胞マーカーを同時に検
出する工程を包含する。好ましくは、プローブ(これは、細胞マーカーに指向さ
れる)は、蛍光化合物に結合体化されてプローブ−蛍光団(fluoropho
re)結合体を形成し、この結合体は、適切な蛍光フィルター(単数または複数
)(例えば、光学フィルターセット)を備える顕微鏡によって選択的に検出され
得る。
【0025】 (複数のマーカーの特徴付け) 本発明は、細胞マーカーに結合する複数の蛍光プローブの使用、および特徴付
けのための目的のプローブに関し、ここで、このプローブの蛍光色素は、細胞マ
ーカーの特定の群の、あるマーカーとその次のマーカーとを区別する能力を干渉
しない。本発明の好ましい実施形態において、プローブは、タンパク質またはペ
プチド、そしてより好ましくは、抗体または分子プローブ(DNA分子またはR
NA分子であり得る)である、いずれかの生物学的プローブであり得る。好まし
くは、複数の細胞マーカーを試験するための蛍光プローブの選択は、励起された
場合に特定の波長の光を放出し得る、異なる蛍光化合物を結合体化したプローブ
を含む。単一の細胞環境における、複数のプローブ−蛍光団を介する細胞マーカ
ーの同時試験は、細胞または細胞群の特徴のプロフィールを提供する。本発明の
好ましい実施形態において、蛍光プローブは、400ナノメーター〜850ナノ
メーターの波長の光を放出する蛍光プローブの混合物からなる群より選択され、
そして、適切な広帯域および波長のフィルターを使用して、各々の蛍光標識され
たプローブによって放出されている、重複波長の光を排除することによって、こ
れらのマーカー間を区別し得る;このような光学フィルターセットは、各々のプ
ローブについての特定の放出スペクトルを検出し得る。より好ましくは、蛍光プ
ローブは、430ナノメーター〜510ナノメーター、482ナノメーター〜5
62ナノメーター、552ナノメーター〜582ナノメーター、577ナノメー
ター〜657ナノメーター、637ナノメーター〜697ナノメーター、679
ナノメーター〜763ナノメーター、および745ナノメーター〜845ナノメ
ーターの波長を有する光を放出する。そして最も好ましくは、蛍光プローブは、
約470ナノメーター、522ナノメーター、567ナノメーター、617ナノ
メーター、667ナノメーター、721ナノメーター、および795ナノメータ
ーのピーク波長を有する光を放出する。
けのための目的のプローブに関し、ここで、このプローブの蛍光色素は、細胞マ
ーカーの特定の群の、あるマーカーとその次のマーカーとを区別する能力を干渉
しない。本発明の好ましい実施形態において、プローブは、タンパク質またはペ
プチド、そしてより好ましくは、抗体または分子プローブ(DNA分子またはR
NA分子であり得る)である、いずれかの生物学的プローブであり得る。好まし
くは、複数の細胞マーカーを試験するための蛍光プローブの選択は、励起された
場合に特定の波長の光を放出し得る、異なる蛍光化合物を結合体化したプローブ
を含む。単一の細胞環境における、複数のプローブ−蛍光団を介する細胞マーカ
ーの同時試験は、細胞または細胞群の特徴のプロフィールを提供する。本発明の
好ましい実施形態において、蛍光プローブは、400ナノメーター〜850ナノ
メーターの波長の光を放出する蛍光プローブの混合物からなる群より選択され、
そして、適切な広帯域および波長のフィルターを使用して、各々の蛍光標識され
たプローブによって放出されている、重複波長の光を排除することによって、こ
れらのマーカー間を区別し得る;このような光学フィルターセットは、各々のプ
ローブについての特定の放出スペクトルを検出し得る。より好ましくは、蛍光プ
ローブは、430ナノメーター〜510ナノメーター、482ナノメーター〜5
62ナノメーター、552ナノメーター〜582ナノメーター、577ナノメー
ター〜657ナノメーター、637ナノメーター〜697ナノメーター、679
ナノメーター〜763ナノメーター、および745ナノメーター〜845ナノメ
ーターの波長を有する光を放出する。そして最も好ましくは、蛍光プローブは、
約470ナノメーター、522ナノメーター、567ナノメーター、617ナノ
メーター、667ナノメーター、721ナノメーター、および795ナノメータ
ーのピーク波長を有する光を放出する。
【0026】 「同時に」とは、単一の細胞環境についてのマーカーの存在または非存在を、
同時に試験されることを意味する。「単一の細胞環境」とは、1つの供給源(例
えば、哺乳動物(例えば、ヒト)由来の血液サンプルまたは培養細胞サンプル)
から単離された単一の細胞または細胞の群を意味する。このような単一の細胞の
群は、異種性であり得る。体液サンプルから単離された細胞数は、細胞の供給源
に依存して変化し得る。例えば、少量の血液(例えば、20mlの血液サンプル
)〜大量の血液(例えば、白血球搬出サンプル)から単離された細胞のバリエー
ションは、1〜250細胞まで変化し得る(しかし、いくつかのサンプルは、特
定のサンプルから単離された細胞が0であり得る)。しかし、大部分の20ml
血液サンプルは、特徴付けについてほんの少数の単離された細胞(一般的に、1
〜20細胞、そしてより一般的には、1〜5細胞)のみを有する。従って、単一
の細胞環境の特徴付けは、本発明の複数のマーカーの特徴付け方法を使用して、
限定された数の細胞上の種々の細胞マーカーを使用して最大化される。これは、
適切な時点で、目的の細胞について価値のある情報を生成し得る。
同時に試験されることを意味する。「単一の細胞環境」とは、1つの供給源(例
えば、哺乳動物(例えば、ヒト)由来の血液サンプルまたは培養細胞サンプル)
から単離された単一の細胞または細胞の群を意味する。このような単一の細胞の
群は、異種性であり得る。体液サンプルから単離された細胞数は、細胞の供給源
に依存して変化し得る。例えば、少量の血液(例えば、20mlの血液サンプル
)〜大量の血液(例えば、白血球搬出サンプル)から単離された細胞のバリエー
ションは、1〜250細胞まで変化し得る(しかし、いくつかのサンプルは、特
定のサンプルから単離された細胞が0であり得る)。しかし、大部分の20ml
血液サンプルは、特徴付けについてほんの少数の単離された細胞(一般的に、1
〜20細胞、そしてより一般的には、1〜5細胞)のみを有する。従って、単一
の細胞環境の特徴付けは、本発明の複数のマーカーの特徴付け方法を使用して、
限定された数の細胞上の種々の細胞マーカーを使用して最大化される。これは、
適切な時点で、目的の細胞について価値のある情報を生成し得る。
【0027】 「細胞マーカー」とは、検出可能および/または測定可能である、細胞の任意
の体細胞性マーカーまたは遺伝マーカーを意味する。細胞は、マーカーに結合す
る対応するプローブが存在する場合に、任意の選択された細胞マーカーに陽性ま
たは陰性であると決定され得る。さらに、目的の各マーカーの強度の定量および
/または測定が、本発明の好ましい実施形態である。生物学的および分子的特徴
付けは、例えば、増殖活性および運動活性を測定するために、抗原(例えば、レ
セプター、細胞内タンパク質および/またはペプチド)に対する抗体結合活性に
基づいて、単一の癌細胞を特徴付けることを含む。さらに、免疫学的プロフィー
リングは、転移の潜在性に関する細胞の結合能力および/または細胞の運動性に
関する情報を提供し得る。詳細には、癌細胞抗原は、単独または以下を含むが、
これらに限定されない分子マーカーと組み合わせての、いずれかで標的化され得
る:上皮増殖因子レセプター、上皮膜抗原、上皮特異的抗原、エストラジオール
、エストロゲンレセプター、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリー(例え
ば、腫瘍壊死因子(TNF)およびFas)、フェリチン、卵胞刺激ホルモン、
アクチン、ガストリン、B型肝炎コア抗原、B型肝炎表面抗原、熱ショックタン
パク質、Ki−67、ラクトフェリン、ラミン(lamin)B1、黄体化ホル
モン、チロシンキナーゼ、MAPキナーゼ、微小管結合タンパク質、c−Myc
、ミエリン塩基性タンパク質、ミオグロブリン、p16、サイクリン依存性キナ
ーゼ(例えば、P27、p21)、p53、増殖関連核抗原、膵臓ポリペプチド
、ウイルスタンパク質(例えば、パピローマウイルス、サイトメガロウイルス、
肝炎ウイルス)、増殖細胞核抗原、胎盤ラクトゲン、pneumocystis
carinii、プロゲステロンレセプター、プロラクチン、前立腺酸ホスフ
ァターゼ、前立腺特異的抗原、pS2、網膜芽細胞腫遺伝子産物、S−100タ
ンパク質、小細胞肺癌抗原、セロトニン、ソマトスタチン、サブスタンスP、シ
ナプトフィシン、オンコジーン、腫瘍関連プローブ(AFPを含む)、β2ミク
ログロブリン、CA19−9抗原、CA125抗原、CA15−3抗原、CEA
、カテプシン、カテプシンD、p300腫瘍関連抗原(例えば、M344モノク
ローナル抗体によって検出されるような)、コラーゲン、メラノーマ、前立腺特
異的抗原、HER−2/neu(例えば、p185(HER−2/neuオンコ
ジーンのタンパク質産物である))、ならびにアポトーシス性遺伝子および/ま
たはタンパク質(例えば、Bcl−2)。これらのプローブのいくつかは、ある
癌に対して他の癌よりも、より関連性があり得る。例えば、CA125の陽性同
定は、患者のより長い生存を示し得る(Scambiaら、Eur.J.Can
cer,32A(2):259−63)。同様に、CA15.3抗原は、頸部(
cervical)の患者の化学療法性応答の予測に関して、扁平上皮癌抗原(
SCC)よりも、より重要であり得る(Scambia、前出)。
の体細胞性マーカーまたは遺伝マーカーを意味する。細胞は、マーカーに結合す
る対応するプローブが存在する場合に、任意の選択された細胞マーカーに陽性ま
たは陰性であると決定され得る。さらに、目的の各マーカーの強度の定量および
/または測定が、本発明の好ましい実施形態である。生物学的および分子的特徴
付けは、例えば、増殖活性および運動活性を測定するために、抗原(例えば、レ
セプター、細胞内タンパク質および/またはペプチド)に対する抗体結合活性に
基づいて、単一の癌細胞を特徴付けることを含む。さらに、免疫学的プロフィー
リングは、転移の潜在性に関する細胞の結合能力および/または細胞の運動性に
関する情報を提供し得る。詳細には、癌細胞抗原は、単独または以下を含むが、
これらに限定されない分子マーカーと組み合わせての、いずれかで標的化され得
る:上皮増殖因子レセプター、上皮膜抗原、上皮特異的抗原、エストラジオール
、エストロゲンレセプター、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリー(例え
ば、腫瘍壊死因子(TNF)およびFas)、フェリチン、卵胞刺激ホルモン、
アクチン、ガストリン、B型肝炎コア抗原、B型肝炎表面抗原、熱ショックタン
パク質、Ki−67、ラクトフェリン、ラミン(lamin)B1、黄体化ホル
モン、チロシンキナーゼ、MAPキナーゼ、微小管結合タンパク質、c−Myc
、ミエリン塩基性タンパク質、ミオグロブリン、p16、サイクリン依存性キナ
ーゼ(例えば、P27、p21)、p53、増殖関連核抗原、膵臓ポリペプチド
、ウイルスタンパク質(例えば、パピローマウイルス、サイトメガロウイルス、
肝炎ウイルス)、増殖細胞核抗原、胎盤ラクトゲン、pneumocystis
carinii、プロゲステロンレセプター、プロラクチン、前立腺酸ホスフ
ァターゼ、前立腺特異的抗原、pS2、網膜芽細胞腫遺伝子産物、S−100タ
ンパク質、小細胞肺癌抗原、セロトニン、ソマトスタチン、サブスタンスP、シ
ナプトフィシン、オンコジーン、腫瘍関連プローブ(AFPを含む)、β2ミク
ログロブリン、CA19−9抗原、CA125抗原、CA15−3抗原、CEA
、カテプシン、カテプシンD、p300腫瘍関連抗原(例えば、M344モノク
ローナル抗体によって検出されるような)、コラーゲン、メラノーマ、前立腺特
異的抗原、HER−2/neu(例えば、p185(HER−2/neuオンコ
ジーンのタンパク質産物である))、ならびにアポトーシス性遺伝子および/ま
たはタンパク質(例えば、Bcl−2)。これらのプローブのいくつかは、ある
癌に対して他の癌よりも、より関連性があり得る。例えば、CA125の陽性同
定は、患者のより長い生存を示し得る(Scambiaら、Eur.J.Can
cer,32A(2):259−63)。同様に、CA15.3抗原は、頸部(
cervical)の患者の化学療法性応答の予測に関して、扁平上皮癌抗原(
SCC)よりも、より重要であり得る(Scambia、前出)。
【0028】 一般的に、本発明の特徴付け方法は、任意の選り抜きの抗体(例えば、選り抜
きの抗原(例えば、細胞マーカー)に反応するプローブ)を含む。例えば、特定
の細胞が、特定の細胞型(例えば、リンパ球(例えば、Tリンパ球、Bリンパ球
、およびナチュラルキラー細胞、マクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス細
胞など))に対する種々のプローブを使用して同定され得る。特定の細胞型に対
する任意の抗体は、本発明の範囲内で使用され得る。特に、CD2および/また
はCD3は、Tリンパ球の同定のために使用され得、CD14は、マクロファー
ジの同定のために使用され得、そしてCD19は、Bリンパ球の同定のために使
用され得る。使用され得る他の抗体は、文献において周知である。適切なリンパ
球抗体の例としては、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD
11a、CD11b、CD11c、CD14、CD15、CD16、CD19、
CD20、CD28、CD34、CD36、CD42a、CD43、CD44、
CD45、CD45R、CD45RA、CD45RB、CD45RO、CD57
、CD61などが挙げられる。ヒトCD45、CD3、CD19、CD14およ
びCD36に標的される抗体が、好ましい。例えば、CD45抗体は、CD45
リンパ球共通抗原(LCA)ファミリーを認識するために有用であり、これは、
膜糖タンパク質の少なくとも4つのアイソフォーム(220、205、190お
よび180kD)から構成される。特に、循環上皮細胞を富化するための陰性分
離の使用は、抗ヒト抗体(例えば、CD45、CD14およびCD3)の混合物
と共に精製され得る。抗体は、市販されている(Transduction L
aboratories Ltd.,UK;Southrern Biotec
hnology Associates,GAおよびPharMingen、C
A)。モノクローナル抗体に加えて、抗体は、ポリクローナル抗体、Fabフラ
グメント、および/またはペプチドを含み得る。DAPI、Hoechst、ヨ
ウ化プロピジウムは、細胞の核におけるDNAを染色するために有用な対比染色
剤であり、そしてアクリジンオレンジは、RNA染色に有用である。
きの抗原(例えば、細胞マーカー)に反応するプローブ)を含む。例えば、特定
の細胞が、特定の細胞型(例えば、リンパ球(例えば、Tリンパ球、Bリンパ球
、およびナチュラルキラー細胞、マクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス細
胞など))に対する種々のプローブを使用して同定され得る。特定の細胞型に対
する任意の抗体は、本発明の範囲内で使用され得る。特に、CD2および/また
はCD3は、Tリンパ球の同定のために使用され得、CD14は、マクロファー
ジの同定のために使用され得、そしてCD19は、Bリンパ球の同定のために使
用され得る。使用され得る他の抗体は、文献において周知である。適切なリンパ
球抗体の例としては、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD
11a、CD11b、CD11c、CD14、CD15、CD16、CD19、
CD20、CD28、CD34、CD36、CD42a、CD43、CD44、
CD45、CD45R、CD45RA、CD45RB、CD45RO、CD57
、CD61などが挙げられる。ヒトCD45、CD3、CD19、CD14およ
びCD36に標的される抗体が、好ましい。例えば、CD45抗体は、CD45
リンパ球共通抗原(LCA)ファミリーを認識するために有用であり、これは、
膜糖タンパク質の少なくとも4つのアイソフォーム(220、205、190お
よび180kD)から構成される。特に、循環上皮細胞を富化するための陰性分
離の使用は、抗ヒト抗体(例えば、CD45、CD14およびCD3)の混合物
と共に精製され得る。抗体は、市販されている(Transduction L
aboratories Ltd.,UK;Southrern Biotec
hnology Associates,GAおよびPharMingen、C
A)。モノクローナル抗体に加えて、抗体は、ポリクローナル抗体、Fabフラ
グメント、および/またはペプチドを含み得る。DAPI、Hoechst、ヨ
ウ化プロピジウムは、細胞の核におけるDNAを染色するために有用な対比染色
剤であり、そしてアクリジンオレンジは、RNA染色に有用である。
【0029】 本発明の1つの実施形態において、特徴付けプロトコルは、組み合わせ染色(
例えば、蛍光染色)および蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH
)(FISHのプロトコルおよびプローブは、例えば、Methods of
Molecular Biology,33:63−74(1994)の、Me
yneら、に見出され得る)を含み得る。例えば、特異的核酸配列が、癌細胞に
ついてのプローブとして適切である。特に、分子プローブ設計は、染色体動原体
プローブ(例えば、第18染色体について、5’−Cy3−TT−Cy3−TT
−Cy3−GAGATGTGTGTACTCACACTAAGAGAATTGA
ACCACCGTTTTGAAGGAGC−3’;第17染色体について、5’
−CY5−TT−CY5−TT−CY5−TGTTTCAAACGTGAACT
TTGAAAGGAAAGTTCAACTCGGGGATTTGAATG−3’
;第7染色体について、5’−CY5−TT−CY5−TT−CY5−GCTG
TGGCATTTTCAGGTGGAGATTTCAAGCGATTTGAGG
ACAATTGCAG−3’);およびmRNAプローブ設計(例えば、サイト
ケラチン14mRNAプローブ、5’−CY3−TT−CY3−TT−CY3−
GGATTTGGCGGCTGGAGGAGGTCACATCTCTGGATG
ACTGCGATCCAGAG−3’;サイトケラチン19mRNAプローブ、
5’−CY3−TT−CY3−TT−CY3−ATCTTGGCGAGATCG
GTGCCCGGAGCGGAATCCACCTCCACACTGACCTG−
3’;MUC I(EPISIALIN)mRNAプローブ、5’−FITC−
TT−FITC−TT−FITC−TTGAACTGTGTCTCCACGTC
GTGGACATTGATGGTACCTTCTCGGAAGGC−3’;およ
びエストロゲンmRNAプローブ、5’−CY5−TT−CY5−TT−CY5
−GTGCAGACCGTGTCCCCGCAGGGCAGAAGGCTGCT
CAGAAACCGGCGGGCCAC−3)を含み得るが、これらに限定され
ない。そして特に、以下の染色体の動原体領域についてのプローブ:第7染色体
(例えば、CGATTTGAGGACAATTGCAG)、染色体18(例えば
、GTACTCACACTAAGAGAATTGAACCACCGT)、第X染
色体(例えば、GACGATGGAGTTTAACTCAGG、TCGTTGG
AAACGGGAATAATTCCCATAACTAAACACAAACA、A
AGCCTTTTCCTTTATCTTCACAGAAAGA)が、標的化され
得る。約20〜約60ヌクレオチド長の配列が使用され得、好ましくは、約40
〜45ヌクレオチド長である。癌細胞はまた、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)
技術によって同定され得、これらの技術およびプローブは、当該分野で周知であ
る。
例えば、蛍光染色)および蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH
)(FISHのプロトコルおよびプローブは、例えば、Methods of
Molecular Biology,33:63−74(1994)の、Me
yneら、に見出され得る)を含み得る。例えば、特異的核酸配列が、癌細胞に
ついてのプローブとして適切である。特に、分子プローブ設計は、染色体動原体
プローブ(例えば、第18染色体について、5’−Cy3−TT−Cy3−TT
−Cy3−GAGATGTGTGTACTCACACTAAGAGAATTGA
ACCACCGTTTTGAAGGAGC−3’;第17染色体について、5’
−CY5−TT−CY5−TT−CY5−TGTTTCAAACGTGAACT
TTGAAAGGAAAGTTCAACTCGGGGATTTGAATG−3’
;第7染色体について、5’−CY5−TT−CY5−TT−CY5−GCTG
TGGCATTTTCAGGTGGAGATTTCAAGCGATTTGAGG
ACAATTGCAG−3’);およびmRNAプローブ設計(例えば、サイト
ケラチン14mRNAプローブ、5’−CY3−TT−CY3−TT−CY3−
GGATTTGGCGGCTGGAGGAGGTCACATCTCTGGATG
ACTGCGATCCAGAG−3’;サイトケラチン19mRNAプローブ、
5’−CY3−TT−CY3−TT−CY3−ATCTTGGCGAGATCG
GTGCCCGGAGCGGAATCCACCTCCACACTGACCTG−
3’;MUC I(EPISIALIN)mRNAプローブ、5’−FITC−
TT−FITC−TT−FITC−TTGAACTGTGTCTCCACGTC
GTGGACATTGATGGTACCTTCTCGGAAGGC−3’;およ
びエストロゲンmRNAプローブ、5’−CY5−TT−CY5−TT−CY5
−GTGCAGACCGTGTCCCCGCAGGGCAGAAGGCTGCT
CAGAAACCGGCGGGCCAC−3)を含み得るが、これらに限定され
ない。そして特に、以下の染色体の動原体領域についてのプローブ:第7染色体
(例えば、CGATTTGAGGACAATTGCAG)、染色体18(例えば
、GTACTCACACTAAGAGAATTGAACCACCGT)、第X染
色体(例えば、GACGATGGAGTTTAACTCAGG、TCGTTGG
AAACGGGAATAATTCCCATAACTAAACACAAACA、A
AGCCTTTTCCTTTATCTTCACAGAAAGA)が、標的化され
得る。約20〜約60ヌクレオチド長の配列が使用され得、好ましくは、約40
〜45ヌクレオチド長である。癌細胞はまた、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)
技術によって同定され得、これらの技術およびプローブは、当該分野で周知であ
る。
【0030】 細胞マーカーとは、検出可能および/または測定可能な、細胞の任意の体細胞
性マーカーまたは遺伝マーカーを意味する。細胞は、任意の選択された細胞マー
カーについて陽性または陰性であることが決定され得る。さらに、目的の各マー
カーの強度を定量および/または測定することが、本発明の好ましい実施形態で
ある。本発明の好ましい実施形態において、癌を有する、癌を有する疑いのある
、または癌を発症する危険性のある哺乳動物(例えば、ヒト)から単離された細
胞を単離および特徴付けることは、癌の存在または非存在を決定するため、およ
び癌の進行、再発または寛解を段階付けるために、各サンプルについてのカスタ
マイズ化された特徴付けプロフィールを確立する手段である。この実施形態の関
連性は、以下のシナリオにおいて獲得される。血液サンプル中の循環***起源細
胞の存在は、上皮細胞が、血液中に脱落されること、ならびに少量の増殖因子、
多量の増殖阻害因子、二倍体状態、正常DNA含量、およびエストロゲンレセプ
ター陽性を示す特徴付けプロフィールが、これらの細胞が癌性であることを示す
ことを、示し得る。しかし、これらの単離された上皮細胞は、例えば、異数体で
あるとして、および高度な増殖能力を有するとして特徴付けられる場合、患者の
評価は、非常に異なる。好ましくは、特徴付けられる各細胞は、特定の細胞型に
ついての関連マーカーを決定するために試験され得る。例えば、癌細胞を、特定
の細胞マーカーに対するプローブの混合物を使用して特徴付け、この細胞の起源
(例えば、前立腺)、細胞の特定の型(例えば、上皮)、非特異的分子マーカー
(例えば、p53)、および固有の、またはそれ以上の天然における細胞特異的
物質(例えば、エストロゲン、プロスタグランジン、アンドロゲンのようなホル
モン;Her−2/neu)を同定する。異数性とは、完全な複数の一倍体数の
染色体からの任意の偏差を意味し、そして本発明において、癌細胞の状況下で高
倍数体(例えば、三倍体、四倍体など)をいう。本発明の単一の循環癌細胞(そ
の新生物性進行へ継続的に進化し得る)の分子特徴付けは、癌の段階付けおよび
/または攻撃性に関する価値のある情報を提供し得る。上皮増殖因子(EGF)
は、乳癌および卵巣癌において過剰発現される。EGFレセプターの過剰活性は
、全ての上皮性の癌(例えば、***、膀胱、肺、腎、頭部および頸部、および前
立腺)の1/3に関連する。HER2/neuレセプターは、癌を有さない個体
と比較して、癌患者において上昇されるか、変異される。過剰量でHER−2タ
ンパク質を産生する乳癌患者は、予後不良である。HER−2レセプターに対す
る抗体を使用する臨床研究は、乳癌患者において進行中である。この目的は、抗
体を用いでHER−2オンコジーンレセプターをブロックすることである。
性マーカーまたは遺伝マーカーを意味する。細胞は、任意の選択された細胞マー
カーについて陽性または陰性であることが決定され得る。さらに、目的の各マー
カーの強度を定量および/または測定することが、本発明の好ましい実施形態で
ある。本発明の好ましい実施形態において、癌を有する、癌を有する疑いのある
、または癌を発症する危険性のある哺乳動物(例えば、ヒト)から単離された細
胞を単離および特徴付けることは、癌の存在または非存在を決定するため、およ
び癌の進行、再発または寛解を段階付けるために、各サンプルについてのカスタ
マイズ化された特徴付けプロフィールを確立する手段である。この実施形態の関
連性は、以下のシナリオにおいて獲得される。血液サンプル中の循環***起源細
胞の存在は、上皮細胞が、血液中に脱落されること、ならびに少量の増殖因子、
多量の増殖阻害因子、二倍体状態、正常DNA含量、およびエストロゲンレセプ
ター陽性を示す特徴付けプロフィールが、これらの細胞が癌性であることを示す
ことを、示し得る。しかし、これらの単離された上皮細胞は、例えば、異数体で
あるとして、および高度な増殖能力を有するとして特徴付けられる場合、患者の
評価は、非常に異なる。好ましくは、特徴付けられる各細胞は、特定の細胞型に
ついての関連マーカーを決定するために試験され得る。例えば、癌細胞を、特定
の細胞マーカーに対するプローブの混合物を使用して特徴付け、この細胞の起源
(例えば、前立腺)、細胞の特定の型(例えば、上皮)、非特異的分子マーカー
(例えば、p53)、および固有の、またはそれ以上の天然における細胞特異的
物質(例えば、エストロゲン、プロスタグランジン、アンドロゲンのようなホル
モン;Her−2/neu)を同定する。異数性とは、完全な複数の一倍体数の
染色体からの任意の偏差を意味し、そして本発明において、癌細胞の状況下で高
倍数体(例えば、三倍体、四倍体など)をいう。本発明の単一の循環癌細胞(そ
の新生物性進行へ継続的に進化し得る)の分子特徴付けは、癌の段階付けおよび
/または攻撃性に関する価値のある情報を提供し得る。上皮増殖因子(EGF)
は、乳癌および卵巣癌において過剰発現される。EGFレセプターの過剰活性は
、全ての上皮性の癌(例えば、***、膀胱、肺、腎、頭部および頸部、および前
立腺)の1/3に関連する。HER2/neuレセプターは、癌を有さない個体
と比較して、癌患者において上昇されるか、変異される。過剰量でHER−2タ
ンパク質を産生する乳癌患者は、予後不良である。HER−2レセプターに対す
る抗体を使用する臨床研究は、乳癌患者において進行中である。この目的は、抗
体を用いでHER−2オンコジーンレセプターをブロックすることである。
【0031】 用語「複数の(multiple)」とは、単一の細胞環境を特徴付けるため
の4以上の細胞マーカーおよび/またはプローブを意味する。本発明の好ましい
実施形態は、約5以上、約6以上、または7個のマーカーおよび/またはプロー
ブが、単一の細胞環境あたりで試験され得ることである。7個のプローブが、同
時に試験され得るが、ただし、各々の陽性マーカーは、細胞の特徴付けのために
使用される複数のプローブ−蛍光団結合体セットでの各々の選択された蛍光標識
プローブについて、異なる放出波長に対応する多数のフィルターセットを備える
顕微鏡を使用して、同定され得る。好ましくは、密度勾配遠心を使用して体液か
ら単離された細胞を含むスライドあたり、4以上の蛍光標識プローブが、同時に
試験され得るが、ただし、各々の陽性マーカーは、この細胞を含むスライドまた
は単離されたサンプルあたりで研究されるように、複数のプローブ−蛍光団結合
体セットでの各々の選択された蛍光標識プローブについて、同定され得る;そし
てより好ましくは、単一の細胞環境を含むスライドあたり、5、6、または7個
の蛍光標識プローブが、複数のマーカーの特徴付けについて使用され得る。水銀
ランプが、450〜725ナノメーターの範囲の波長内の光を放出する蛍光プロ
ーブについて使用されることが留意される。
の4以上の細胞マーカーおよび/またはプローブを意味する。本発明の好ましい
実施形態は、約5以上、約6以上、または7個のマーカーおよび/またはプロー
ブが、単一の細胞環境あたりで試験され得ることである。7個のプローブが、同
時に試験され得るが、ただし、各々の陽性マーカーは、細胞の特徴付けのために
使用される複数のプローブ−蛍光団結合体セットでの各々の選択された蛍光標識
プローブについて、異なる放出波長に対応する多数のフィルターセットを備える
顕微鏡を使用して、同定され得る。好ましくは、密度勾配遠心を使用して体液か
ら単離された細胞を含むスライドあたり、4以上の蛍光標識プローブが、同時に
試験され得るが、ただし、各々の陽性マーカーは、この細胞を含むスライドまた
は単離されたサンプルあたりで研究されるように、複数のプローブ−蛍光団結合
体セットでの各々の選択された蛍光標識プローブについて、同定され得る;そし
てより好ましくは、単一の細胞環境を含むスライドあたり、5、6、または7個
の蛍光標識プローブが、複数のマーカーの特徴付けについて使用され得る。水銀
ランプが、450〜725ナノメーターの範囲の波長内の光を放出する蛍光プロ
ーブについて使用されることが留意される。
【0032】 複数の細胞特徴付けのための細胞の供給源は、任意の細胞含有流体、好ましく
は、体液(例えば、天然の体液または富化された体液)、腫瘍サンプル、あるい
は体液または腫瘍から単離された培養細胞、そしてより好ましくは、癌細胞を含
む富化された細胞サンプル、そして最も好ましくは、密度勾配遠心によって得ら
れた血液、尿または骨髄における単離された循環癌細胞(米国特許第5,962
,237号)を含む。「富化された体液」は、白血球搬出画分またはアフェレー
シス画分などを含む。
は、体液(例えば、天然の体液または富化された体液)、腫瘍サンプル、あるい
は体液または腫瘍から単離された培養細胞、そしてより好ましくは、癌細胞を含
む富化された細胞サンプル、そして最も好ましくは、密度勾配遠心によって得ら
れた血液、尿または骨髄における単離された循環癌細胞(米国特許第5,962
,237号)を含む。「富化された体液」は、白血球搬出画分またはアフェレー
シス画分などを含む。
【0033】 特徴付けのための細胞は、哺乳動物に由来するまたはインビトロで培養される
任意の細胞、以下の正常な細胞型および異常な細胞型を含み得るがこれらに限定
されない:上皮細胞、内皮細胞、骨格細胞、骨細胞、骨髄細胞、体液または身体
組織に由来する循環細胞、神経および筋肉。異常な細胞型は、正常な態様の体細
胞発現および/または遺伝子発現から外れた細胞(例えば、癌細胞、ウイルス感
染細胞または移植片対宿主病に関与する細胞のような罹患細胞)を意味する。よ
り詳細には、細胞は、多くの異なる癌を含む循環癌細胞(前立腺、胸部、肝臓、
腎臓、結腸、直腸、胃、食道、膀胱、脳、卵巣、膵臓および肺のような上皮の癌
を含むがこれらに限定されない)である。肉腫(例えば、線維肉腫または横紋筋
肉腫)、リンパ系系列もしくは骨髄性系列の造血腫瘍、または別の腫瘍(黒色腫
、奇形癌、神経芽細胞腫または神経膠腫を含むがこれらに限定されない)の形態
の他の癌。ヒトのような哺乳動物から単離された循環癌細胞または循環癌細胞の
群の特徴の評価は、この細胞の供給源の健康の現行の評価を提供し得る。
任意の細胞、以下の正常な細胞型および異常な細胞型を含み得るがこれらに限定
されない:上皮細胞、内皮細胞、骨格細胞、骨細胞、骨髄細胞、体液または身体
組織に由来する循環細胞、神経および筋肉。異常な細胞型は、正常な態様の体細
胞発現および/または遺伝子発現から外れた細胞(例えば、癌細胞、ウイルス感
染細胞または移植片対宿主病に関与する細胞のような罹患細胞)を意味する。よ
り詳細には、細胞は、多くの異なる癌を含む循環癌細胞(前立腺、胸部、肝臓、
腎臓、結腸、直腸、胃、食道、膀胱、脳、卵巣、膵臓および肺のような上皮の癌
を含むがこれらに限定されない)である。肉腫(例えば、線維肉腫または横紋筋
肉腫)、リンパ系系列もしくは骨髄性系列の造血腫瘍、または別の腫瘍(黒色腫
、奇形癌、神経芽細胞腫または神経膠腫を含むがこれらに限定されない)の形態
の他の癌。ヒトのような哺乳動物から単離された循環癌細胞または循環癌細胞の
群の特徴の評価は、この細胞の供給源の健康の現行の評価を提供し得る。
【0034】 本発明の特徴付けプロフィールの開発は、正常な細胞および異常な細胞の数お
よび種類を臨床的にモニタリングするための有用な適用を有する。本発明の好ま
しい実施形態は、体液サンプルから単離された循環上皮癌細胞(例えば、存在す
る場合には、疾患の進行をモニタリングするために体液のサンプルから単離され
た、***、前立腺、腎臓など)の数および特徴を測定することを含む。より詳細
には、本発明は、特定の時点での哺乳動物の健康評価に関する。単離された循環
癌細胞の特徴的プロフィールの開発は、転移の可能性を決定するため、癌の再発
をモニタリングするため、および治療効力を評価するために貴重である。乳癌は
、複数特徴付けプロフィールを確立する重要性の一例として役立つ。約30%〜
50%の乳癌患者は、転移性乳癌を発症し、この転移性乳癌により患者が死亡す
る。転移性癌細胞(すなわち、例えば、高い増殖可能性および異数性を有する細
胞)に患者が気付くのが早ければ早いほど、より早期に薬物介入を受ける機会が
増え、そしてうまくいけば生存の機会が増えると期待される。現在のところ、診
断時から転移癌発症までの盲(blind)期間が存在し得る。この期間は、患
者ごとに変動し、そして全ての乳癌患者をモニタリングするために重要な期間と
なる。インタクトな循環癌細胞を特徴付けするための複数マーカーの同時測定は
価値がある。なぜなら、単離された細胞の数は、1サンプルあたり、1から25
0を超えて変動し得るからである。もちろん、循環癌細胞が存在しないことを立
証する患者サンプルを処理することは、価値ある情報である。試験を繰り返すこ
とは、いずれかの陰性の試験データを確認するために推奨される。患者のモニタ
リングは、癌が局所化され続けているか、後退しているか、または患者が治癒し
ているかを立証するために非常に推奨される。従って、循環細胞の存在または非
存在を決定することは、それ自体が、各患者について立証するために、そしてさ
らに各患者について反復して立証するために重要な工程である。一連の反復した
陰性試験には、循環癌細胞の陽性単離が続いて行われ得、この癌細胞は、本発明
の範囲内で特徴付けられ得る。この新たな情報は、癌が依然として体内に存在し
、そして循環において癌細胞を生じ得る癌の増殖を生じるに十分、身体において
定着している証拠を立証する。しばしば、身体における癌の実際の二次供給源は
未知である。
よび種類を臨床的にモニタリングするための有用な適用を有する。本発明の好ま
しい実施形態は、体液サンプルから単離された循環上皮癌細胞(例えば、存在す
る場合には、疾患の進行をモニタリングするために体液のサンプルから単離され
た、***、前立腺、腎臓など)の数および特徴を測定することを含む。より詳細
には、本発明は、特定の時点での哺乳動物の健康評価に関する。単離された循環
癌細胞の特徴的プロフィールの開発は、転移の可能性を決定するため、癌の再発
をモニタリングするため、および治療効力を評価するために貴重である。乳癌は
、複数特徴付けプロフィールを確立する重要性の一例として役立つ。約30%〜
50%の乳癌患者は、転移性乳癌を発症し、この転移性乳癌により患者が死亡す
る。転移性癌細胞(すなわち、例えば、高い増殖可能性および異数性を有する細
胞)に患者が気付くのが早ければ早いほど、より早期に薬物介入を受ける機会が
増え、そしてうまくいけば生存の機会が増えると期待される。現在のところ、診
断時から転移癌発症までの盲(blind)期間が存在し得る。この期間は、患
者ごとに変動し、そして全ての乳癌患者をモニタリングするために重要な期間と
なる。インタクトな循環癌細胞を特徴付けするための複数マーカーの同時測定は
価値がある。なぜなら、単離された細胞の数は、1サンプルあたり、1から25
0を超えて変動し得るからである。もちろん、循環癌細胞が存在しないことを立
証する患者サンプルを処理することは、価値ある情報である。試験を繰り返すこ
とは、いずれかの陰性の試験データを確認するために推奨される。患者のモニタ
リングは、癌が局所化され続けているか、後退しているか、または患者が治癒し
ているかを立証するために非常に推奨される。従って、循環細胞の存在または非
存在を決定することは、それ自体が、各患者について立証するために、そしてさ
らに各患者について反復して立証するために重要な工程である。一連の反復した
陰性試験には、循環癌細胞の陽性単離が続いて行われ得、この癌細胞は、本発明
の範囲内で特徴付けられ得る。この新たな情報は、癌が依然として体内に存在し
、そして循環において癌細胞を生じ得る癌の増殖を生じるに十分、身体において
定着している証拠を立証する。しばしば、身体における癌の実際の二次供給源は
未知である。
【0035】 予後検査または治療検査は、細胞の同定、増殖、増殖阻害(例えば、細胞休止
状態)、倍数性状態、およびホルモンレセプター評価を提供するプローブ(例え
ば、抗体、ペプチド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド)を含み得る。例
えば、CAM 5.2は抗体であり、これはサイトケラチンと反応し、そして上
皮癌細胞を同定するために有用である。抗P27は、細胞の休止状態または静止
状態を評価するためのプローブである。抗MiBl/Ki67およびPCNAは
、細胞の増殖能力を評価するための2つのプローブである。ホルモンレセプター
または遺伝子の状態は、治療剤または介入の組み合わせ(多薬物処置または薬物
治療と組み合わせた放射線を含む)の価値、または予後情報を決定するために有
用である。倍数性状態は、癌または遺伝性疾患の同定に関する予後情報に重要で
ある。例えば、第1染色体、第17染色体および/または第18染色体の評価は
、プローブ(そのうちのいくつかは、例えば上記に列挙される)を用いて決定さ
れ得る。
状態)、倍数性状態、およびホルモンレセプター評価を提供するプローブ(例え
ば、抗体、ペプチド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド)を含み得る。例
えば、CAM 5.2は抗体であり、これはサイトケラチンと反応し、そして上
皮癌細胞を同定するために有用である。抗P27は、細胞の休止状態または静止
状態を評価するためのプローブである。抗MiBl/Ki67およびPCNAは
、細胞の増殖能力を評価するための2つのプローブである。ホルモンレセプター
または遺伝子の状態は、治療剤または介入の組み合わせ(多薬物処置または薬物
治療と組み合わせた放射線を含む)の価値、または予後情報を決定するために有
用である。倍数性状態は、癌または遺伝性疾患の同定に関する予後情報に重要で
ある。例えば、第1染色体、第17染色体および/または第18染色体の評価は
、プローブ(そのうちのいくつかは、例えば上記に列挙される)を用いて決定さ
れ得る。
【0036】 種々の細胞マーカーの発現はおそらく、互いに相関し得る。例えば、PCNA
−MiBI/Ki67発現とP27発現との間に逆の関係が存在し得る。エスト
ロゲンレセプター陰性細胞は、最も攻撃性であり、MiB1/Ki67発現とP
CNA発現とを直接相関させ得、そしてP27発現と逆の相関を有し得る。倍数
性細胞は、攻撃性であると考えられ、高いMiB1/Ki67およびPCNA発
現を有し得、そしてP27発現は低くあり得る。本発明について予想される1つ
の特定のプローブ−発蛍光団結合体セットとしては、MiB1−CY3、PCN
A−CY3.5もしくはTEXAS REDTM、P27−CY5、サイトケラチ
ン−FITC、PSA−AMCA、または1サンプルもしくは1スライドあたり
でのDNA対比染色(DAPI)のような蛍光化合物で標識されたプローブ(例
えば、プローブ−蛍光色素)が挙げられる。
−MiBI/Ki67発現とP27発現との間に逆の関係が存在し得る。エスト
ロゲンレセプター陰性細胞は、最も攻撃性であり、MiB1/Ki67発現とP
CNA発現とを直接相関させ得、そしてP27発現と逆の相関を有し得る。倍数
性細胞は、攻撃性であると考えられ、高いMiB1/Ki67およびPCNA発
現を有し得、そしてP27発現は低くあり得る。本発明について予想される1つ
の特定のプローブ−発蛍光団結合体セットとしては、MiB1−CY3、PCN
A−CY3.5もしくはTEXAS REDTM、P27−CY5、サイトケラチ
ン−FITC、PSA−AMCA、または1サンプルもしくは1スライドあたり
でのDNA対比染色(DAPI)のような蛍光化合物で標識されたプローブ(例
えば、プローブ−蛍光色素)が挙げられる。
【0037】 この複数マーカー試験の好ましい実施形態は、以下を評価するための極めて貴
重なツールを提供するために当該分野の技術水準のコンピュータ化蛍光顕微鏡を
利用する:(1)血流中に循環癌細胞が存在するか否か、(2)これらの細胞が
血流中で***する可能性を有するか、または転移性二次腫瘍部位を係留および形
成するか。必要に応じて、試験の最適化は、特徴付けのために培養細胞株由来の
細胞を含むスライド上でマーカーのセットを同定することを含む。1セットのプ
ローブ−発蛍光団結合体に指向された1セットの細胞マーカーが適用され得、そ
してスライドが顕微鏡で読み取られ得、次いでカバーガラスが除去され得、そし
て別のセットのプローブ−発蛍光団結合体が適用され得る;多くのマーカーが単
一サンプルについて試験されることを可能にする。複数染色期間に起因して必要
とされる場合、顕微鏡のXY座標記録特徴が、目的の細胞を再度位置決定するた
めに用いられ得る。顕微鏡の複数焦点面Z軸の組み合わせ特徴は、染色体が細胞
内の異なる面上に位置する場合、染色体の可視化および染色体数の数え上げを可
能にする。多数の細胞株が試験されて、試験が再現性があることおよび全ての型
の癌細胞に感受性であることを確実にする。
重なツールを提供するために当該分野の技術水準のコンピュータ化蛍光顕微鏡を
利用する:(1)血流中に循環癌細胞が存在するか否か、(2)これらの細胞が
血流中で***する可能性を有するか、または転移性二次腫瘍部位を係留および形
成するか。必要に応じて、試験の最適化は、特徴付けのために培養細胞株由来の
細胞を含むスライド上でマーカーのセットを同定することを含む。1セットのプ
ローブ−発蛍光団結合体に指向された1セットの細胞マーカーが適用され得、そ
してスライドが顕微鏡で読み取られ得、次いでカバーガラスが除去され得、そし
て別のセットのプローブ−発蛍光団結合体が適用され得る;多くのマーカーが単
一サンプルについて試験されることを可能にする。複数染色期間に起因して必要
とされる場合、顕微鏡のXY座標記録特徴が、目的の細胞を再度位置決定するた
めに用いられ得る。顕微鏡の複数焦点面Z軸の組み合わせ特徴は、染色体が細胞
内の異なる面上に位置する場合、染色体の可視化および染色体数の数え上げを可
能にする。多数の細胞株が試験されて、試験が再現性があることおよび全ての型
の癌細胞に感受性であることを確実にする。
【0038】 これらのマーカーのいくつかは、患者の結果と相関する。転移性乳癌の危険性
がある患者の血液由来の単離された癌細胞と、サイトケラチン、P27、MiB
l/Ki67および/またはPCNAの発現、エストロゲンレセプターの存在、
ならびに第1染色体、第17染色体および第18染色体の倍数性についてのその
後の染色との組み合わせは、これらのマーカーと患者の予後因子との間の何らか
の統計的相関を提供するはずである。乳癌転移の危険性がある患者は、サイトケ
ラチン陽性乳癌細胞を血液循環中に有するようである。転移可能性を有する細胞
を血液中に有する患者において、高い増殖マーカー(MiB1/Ki67および
PCNA)、ならびに増殖阻害マーカーP27の低い発現を有することが予測さ
れる。患者が、タモキシフェンのようなエストロゲンレセプター薬物に対する応
答者である場合、時間をかけた処置の際に、血液から単離された循環癌細胞の数
が減少し、MiB1/Ki67またはPCNAの発現が減少し、そしてエストロ
ゲンレセプター陽性であり続けることが予想される。特に、これらの特異的技術
を用いて、おそらく微小転移を血液または二次部位に形成している乳癌細胞を見
出し得、同定し得、そして特徴付け得る。転移または異数性のような攻撃性につ
いてのマーカー、およびエストロゲンレセプター陰性は、細胞増殖のマーカー(
MiB1およびPCNA)に対して直接の相関を、そして細胞停止マーカー(P
27)に対して逆の相関を有することが予想される。長期の目的は、この情報が
患者に対して複数の方法で(例えば、初期検出およびリンパ節切開の排除、予後
情報、ならびにこの型の癌がホルモン治療に応答するか否かの指標、ならびに治
療の適切性についての指標、ならびに血液置換産物の試験についての指標)有用
であることである。
がある患者の血液由来の単離された癌細胞と、サイトケラチン、P27、MiB
l/Ki67および/またはPCNAの発現、エストロゲンレセプターの存在、
ならびに第1染色体、第17染色体および第18染色体の倍数性についてのその
後の染色との組み合わせは、これらのマーカーと患者の予後因子との間の何らか
の統計的相関を提供するはずである。乳癌転移の危険性がある患者は、サイトケ
ラチン陽性乳癌細胞を血液循環中に有するようである。転移可能性を有する細胞
を血液中に有する患者において、高い増殖マーカー(MiB1/Ki67および
PCNA)、ならびに増殖阻害マーカーP27の低い発現を有することが予測さ
れる。患者が、タモキシフェンのようなエストロゲンレセプター薬物に対する応
答者である場合、時間をかけた処置の際に、血液から単離された循環癌細胞の数
が減少し、MiB1/Ki67またはPCNAの発現が減少し、そしてエストロ
ゲンレセプター陽性であり続けることが予想される。特に、これらの特異的技術
を用いて、おそらく微小転移を血液または二次部位に形成している乳癌細胞を見
出し得、同定し得、そして特徴付け得る。転移または異数性のような攻撃性につ
いてのマーカー、およびエストロゲンレセプター陰性は、細胞増殖のマーカー(
MiB1およびPCNA)に対して直接の相関を、そして細胞停止マーカー(P
27)に対して逆の相関を有することが予想される。長期の目的は、この情報が
患者に対して複数の方法で(例えば、初期検出およびリンパ節切開の排除、予後
情報、ならびにこの型の癌がホルモン治療に応答するか否かの指標、ならびに治
療の適切性についての指標、ならびに血液置換産物の試験についての指標)有用
であることである。
【0039】 同じ癌細胞内で複数のマーカーを可視化して、個々の患者についての特徴付け
プロフィールを提供することは、循環細胞の攻撃能力の評価を含み得るがこれに
限定されない。循環細胞は、一次組織部位内での細胞死に起因して、単純に血流
中の無害な移動物であり得るか、または定着する場所を探す戦士のように循環攻
撃的殺傷性癌細胞であり得る。患者の医療に対するこの刷新的なアプローチは、
腫瘍が現行の走査方法によって検出される前に行われ得る。この技術をまた用い
て、治療の有効性をモニタリングし得、そして必要な場合、この技術を用いて治
療の経過を変化させ得る。
プロフィールを提供することは、循環細胞の攻撃能力の評価を含み得るがこれに
限定されない。循環細胞は、一次組織部位内での細胞死に起因して、単純に血流
中の無害な移動物であり得るか、または定着する場所を探す戦士のように循環攻
撃的殺傷性癌細胞であり得る。患者の医療に対するこの刷新的なアプローチは、
腫瘍が現行の走査方法によって検出される前に行われ得る。この技術をまた用い
て、治療の有効性をモニタリングし得、そして必要な場合、この技術を用いて治
療の経過を変化させ得る。
【0040】 複数のマーカーを同じ癌細胞内で可視化することは、その特徴付けを可能にし
、そして重要なことにその攻撃能力を初期段階で検出することを可能にする。本
発明についての理論的根拠は、患者の結果と相関するマーカーが利用可能である
ことである。例えば、患者が乳癌を有する場合、しばしば、血液中を循環する、
患者を脅かしても脅かさなくともよい、***の起源細胞が存在する。この調査の
刷新的な性質は、同じ細胞上または同じ細胞内の複数のマーカーを可視化して、
その結果、細胞が見出された場合に、うまくいけば初期の段階の攻撃能力につい
て個々の細胞を分析するための適用が開発されることである。
、そして重要なことにその攻撃能力を初期段階で検出することを可能にする。本
発明についての理論的根拠は、患者の結果と相関するマーカーが利用可能である
ことである。例えば、患者が乳癌を有する場合、しばしば、血液中を循環する、
患者を脅かしても脅かさなくともよい、***の起源細胞が存在する。この調査の
刷新的な性質は、同じ細胞上または同じ細胞内の複数のマーカーを可視化して、
その結果、細胞が見出された場合に、うまくいけば初期の段階の攻撃能力につい
て個々の細胞を分析するための適用が開発されることである。
【0041】 例えば、いずれか特定の理論には束縛されないが、1つの仮説は、循環***起
源細胞が循環中に見出される場合、これらの細胞は、周囲の組織から脱落した細
胞(非腫瘍細胞)であり得ることであり得る。循環上皮細胞が単離される場合、
低い増殖因子、高い増殖阻害因子、二倍体および/またはエストロゲンレセプタ
ー陽性を見出すことを予想し得る。患者の状態が悪化するにつれて、循環乳癌細
胞の数は増加し、そして攻撃性因子もまた増加すると予想される。患者のサンプ
ルの、培養された乳癌細胞と混合された全血サンプルもしくはアフェレーシス(
aphersis)白血球画分のサンプルは、患者の血液(例えば、脂肪血症血
液または化学療法薬物もしくはホルモン療法薬物を有する血液)中に存在し得る
可能な妨害について調べられ得る。
源細胞が循環中に見出される場合、これらの細胞は、周囲の組織から脱落した細
胞(非腫瘍細胞)であり得ることであり得る。循環上皮細胞が単離される場合、
低い増殖因子、高い増殖阻害因子、二倍体および/またはエストロゲンレセプタ
ー陽性を見出すことを予想し得る。患者の状態が悪化するにつれて、循環乳癌細
胞の数は増加し、そして攻撃性因子もまた増加すると予想される。患者のサンプ
ルの、培養された乳癌細胞と混合された全血サンプルもしくはアフェレーシス(
aphersis)白血球画分のサンプルは、患者の血液(例えば、脂肪血症血
液または化学療法薬物もしくはホルモン療法薬物を有する血液)中に存在し得る
可能な妨害について調べられ得る。
【0042】 循環細胞に対するプローブ−発蛍光団結合体の適用は悪性を示し得、そしてマ
ーカーの相関において見られたような予後または治療的成功に関する初期警告を
提供し得る。その後の予後予測とともに増殖能力(特に非係留増殖能力もしくは
血流内で***する能力)または治療評価のいずれかについて予後値を提供し得る
、マーカーを選択することへの合理的かつ体系的なアプローチが分析されている
。
ーカーの相関において見られたような予後または治療的成功に関する初期警告を
提供し得る。その後の予後予測とともに増殖能力(特に非係留増殖能力もしくは
血流内で***する能力)または治療評価のいずれかについて予後値を提供し得る
、マーカーを選択することへの合理的かつ体系的なアプローチが分析されている
。
【0043】 近年の文献(および単一細胞環境内の複数のマーカーについての本発明者らの
経験)は、予後値または治療値を提供し得るマーカーの選択が、サイトケラチン
、P27(細胞休止状態)、MiBl/Ki67(細胞増殖)またはPCNA(
細胞増殖)、エストロゲンレセプター(治療値または予後情報)、ならびに倍数
性状態(予後情報)または第1染色体、第17染色体および/または第18染色
体を含むことを示唆する。マーカーは、互いに相関することが見出され得る。
経験)は、予後値または治療値を提供し得るマーカーの選択が、サイトケラチン
、P27(細胞休止状態)、MiBl/Ki67(細胞増殖)またはPCNA(
細胞増殖)、エストロゲンレセプター(治療値または予後情報)、ならびに倍数
性状態(予後情報)または第1染色体、第17染色体および/または第18染色
体を含むことを示唆する。マーカーは、互いに相関することが見出され得る。
【0044】 P27/Kipタンパク質は、サイクリン依存性キナーゼインヒビターと呼ば
れる、近年同定されたタンパク質ファミリーに属する。これらのタンパク質は、
細胞周期の進行の間に、細胞依存性キナーゼ活性の負のレギュレーターとして重
要な役割を果たす。Tsihliasら,Cancer Res.,58:54
2−548,(1998)は、前立腺癌において、P27染色の増加が、全ての
腫瘍切片において両性の前立腺上皮成分と相関することを見出した。Harva
tら(Oncogene,14:2111−2122,(1997))は、培養
された乳癌細胞におけるP27の外因性発現が増殖阻止を誘導することを報告し
た。節陰性患者における予後マーカーとしてのP27の評価は、アジュバント治
療から利益を得える、小さな、侵襲性の乳癌腫を有する患者を同定する際に有用
であることが見出されている(Tanら,Cancer Res.,57:12
59−1263,(1997);Katayoseら,Cancer Res.
,57:5441−5445,(1997))。ヒトP27を発現する組換えア
デノウイルスでの乳癌細胞の感染は、この細胞におけるP27の高発現、ならび
にS期の細胞またはアポトーシス細胞の比率の著しい減少を引き起こすことが報
告されている(Craigら,Oncogene,14:2283−2289,
(1997))。癌細胞のP27レベルと足場非依存性増殖との間に逆の相関が
存在する。足場非依存性増殖は、癌細胞が血液中で転移する能力において重要で
あり得る(Kawadaら,J.Cancer Res.,89:110−11
5,(1998))。
れる、近年同定されたタンパク質ファミリーに属する。これらのタンパク質は、
細胞周期の進行の間に、細胞依存性キナーゼ活性の負のレギュレーターとして重
要な役割を果たす。Tsihliasら,Cancer Res.,58:54
2−548,(1998)は、前立腺癌において、P27染色の増加が、全ての
腫瘍切片において両性の前立腺上皮成分と相関することを見出した。Harva
tら(Oncogene,14:2111−2122,(1997))は、培養
された乳癌細胞におけるP27の外因性発現が増殖阻止を誘導することを報告し
た。節陰性患者における予後マーカーとしてのP27の評価は、アジュバント治
療から利益を得える、小さな、侵襲性の乳癌腫を有する患者を同定する際に有用
であることが見出されている(Tanら,Cancer Res.,57:12
59−1263,(1997);Katayoseら,Cancer Res.
,57:5441−5445,(1997))。ヒトP27を発現する組換えア
デノウイルスでの乳癌細胞の感染は、この細胞におけるP27の高発現、ならび
にS期の細胞またはアポトーシス細胞の比率の著しい減少を引き起こすことが報
告されている(Craigら,Oncogene,14:2283−2289,
(1997))。癌細胞のP27レベルと足場非依存性増殖との間に逆の相関が
存在する。足場非依存性増殖は、癌細胞が血液中で転移する能力において重要で
あり得る(Kawadaら,J.Cancer Res.,89:110−11
5,(1998))。
【0045】 乳癌患者における染色体異数性と、臨床適用における侵襲性に対する関係とが
相関付けられている(Wingrenら,Br.J.Cancer,69:54
6−549,(1994))。蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FI
SH)は、倍数性全体を決定するためだけでなく、間期の細胞における特定の染
色体の過剰提示または過少提示を評価するためにも用いられ得る。Shackn
eyら(Cytometry,22:282−291,(1995))は、複数
コピーの第1染色体、第3染色体および第17染色体が、試験した他の染色体よ
りも頻繁に個々の腫瘍の細胞に選択的に蓄積したことを見出した。Affiyお
よびMark(Cancer Genet.Cytogenet.,97:10
1−105,(1997))は、***の第I段階および第II段階の浸潤性腺管
癌と相関した第8染色体のトリソミー、ならびに攻撃的な生物学的挙動を予測す
る他のマーカーを見出した。
相関付けられている(Wingrenら,Br.J.Cancer,69:54
6−549,(1994))。蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FI
SH)は、倍数性全体を決定するためだけでなく、間期の細胞における特定の染
色体の過剰提示または過少提示を評価するためにも用いられ得る。Shackn
eyら(Cytometry,22:282−291,(1995))は、複数
コピーの第1染色体、第3染色体および第17染色体が、試験した他の染色体よ
りも頻繁に個々の腫瘍の細胞に選択的に蓄積したことを見出した。Affiyお
よびMark(Cancer Genet.Cytogenet.,97:10
1−105,(1997))は、***の第I段階および第II段階の浸潤性腺管
癌と相関した第8染色体のトリソミー、ならびに攻撃的な生物学的挙動を予測す
る他のマーカーを見出した。
【0046】 乳癌は、腫瘍のエストロゲンレセプターレベルに従って2つの型に分けられ得
る(Zhuら,Med.Hypotheses,49:69−75,(1997
))。エストロゲンレセプター陽性は、抗ホルモン治療に対する70%応答率と
関連する。対照的に、腫瘍がエストロゲンレセプター陰性である患者の間では、
この応答率は10%未満である。腫瘍がエストロゲンレセプター陽性である患者
は一般に、疾患のない優れた生存を達成する(Rayter,BR.J.Sur
g.,78:528−535,(1991))。
る(Zhuら,Med.Hypotheses,49:69−75,(1997
))。エストロゲンレセプター陽性は、抗ホルモン治療に対する70%応答率と
関連する。対照的に、腫瘍がエストロゲンレセプター陰性である患者の間では、
この応答率は10%未満である。腫瘍がエストロゲンレセプター陽性である患者
は一般に、疾患のない優れた生存を達成する(Rayter,BR.J.Sur
g.,78:528−535,(1991))。
【0047】 増殖因子、インヒビター、エストロゲンレセプターおよび異数性の相関は、多
くの研究において行われているが、血液循環内に見出される癌細胞においては行
われていない。フローサイトメトリーを用いて、Leeら(Mod.Patho
l.,5:61−67,(1992))は、異数性が、エストロゲンレセプター
の損失、高い組織学的等級、高い核の等級および有糸***率と有意に関連したこ
とを見出した。抗Ki67モノクローナル抗体を用いた染色による、増殖の免疫
組織化学的評価は、有糸***率と強く相関した。異数性および四倍体の腫瘍は、
二倍体腫瘍よりも高いKi67スコアを実証した。異数性と低レベルのエストロ
ゲンレセプターとの間で相関が実証された(Fernandesら,Can.J
.Surg.,34:349−355,(1991))。循環している細胞にお
ける増殖マーカー、エストロゲンレセプターおよび薬物治療の相関は、増殖マー
カーにおける最初の減少が、タモキシフェン治療に対するその後の臨床応答に関
連することが示された「1回目の」研究において、Makrisら(Breas
t Cancer Res.Treat.,48:11−20,(1998))
によって生検材料を用いて行われた。応答者は、低いKi67を伴って、エスト
ロゲンレセプター(ER)陽性である可能性がより高かった。彼らは、その後の
応答に関連した、14日間の処置後のKi67およびERにおける減少を観察し
た。
くの研究において行われているが、血液循環内に見出される癌細胞においては行
われていない。フローサイトメトリーを用いて、Leeら(Mod.Patho
l.,5:61−67,(1992))は、異数性が、エストロゲンレセプター
の損失、高い組織学的等級、高い核の等級および有糸***率と有意に関連したこ
とを見出した。抗Ki67モノクローナル抗体を用いた染色による、増殖の免疫
組織化学的評価は、有糸***率と強く相関した。異数性および四倍体の腫瘍は、
二倍体腫瘍よりも高いKi67スコアを実証した。異数性と低レベルのエストロ
ゲンレセプターとの間で相関が実証された(Fernandesら,Can.J
.Surg.,34:349−355,(1991))。循環している細胞にお
ける増殖マーカー、エストロゲンレセプターおよび薬物治療の相関は、増殖マー
カーにおける最初の減少が、タモキシフェン治療に対するその後の臨床応答に関
連することが示された「1回目の」研究において、Makrisら(Breas
t Cancer Res.Treat.,48:11−20,(1998))
によって生検材料を用いて行われた。応答者は、低いKi67を伴って、エスト
ロゲンレセプター(ER)陽性である可能性がより高かった。彼らは、その後の
応答に関連した、14日間の処置後のKi67およびERにおける減少を観察し
た。
【0048】 以下を含むがこれらに限定されない、種々のホルモンが試験され得る:エスト
ロゲン、プロゲステロン、アンドロゲン、ジヒドロテストステロンおよびテスト
ステロン。例えば、アンドロゲンレセプターおよびアンドロゲンレセプター遺伝
子のコピー数は、前立腺癌患者から単離された癌細胞において検出され得る。循
環前立腺癌細胞の同定および特徴付けは、特に目的のものである。アンドロゲン
は、110kDのリガンドによって活性化された核レセプターであるアンドロゲ
ンレセプターを通じて多数の多様な応答を媒介する。種々の組織において見出さ
れるアンドロゲンレセプター発現は、発生、加齢および悪性トランスフォーメー
ションプロセスを通して変化する。アンドロゲンレセプターは、アンドロゲンレ
セプターに異なる親和性で結合する、テストステロンおよびジヒドロテストステ
ロンという2つのリガンドによって活性化され得る。この結合親和性の相違は、
この2つのリガンドによるアンドロゲンレセプターの異なるレベルの活性化をも
たらす。アンドロゲンレセプターは、アンドロゲン応答エレメントに結合するこ
とによって、種々の遺伝子の転写モディファイアとして作用する。アンドロゲン
応答エレメントによってアンドロゲン特異的作用を付与する能力は、他の細胞特
異的転写因子およびシス作用性DNAエレメントに依存し得る。テストステロン
およびジヒドロテストステロンは、同一の核レセプターに作用するようである。
しかし、特定の例では、これらは、異なる生理学的応答を媒介する。例えば、ジ
ヒドロテストステロンは、雄性外性器の完全な性発達を媒介し得るが、テストス
テロンは媒介し得ない。いくつかの場合には、アンドロゲンレセプターは、その
位置に依存して、逆の生理学的応答を類似の組織型において誘導し得る。例えば
、雄性型禿頭症では、活性化されたアンドロゲンレセプターは、ストロマ上皮作
用を開始することによって独特な毛包集団の増殖を抑制し得、一方、他の毛包は
増殖し続ける。他の場合では、その変異または変化した発現に起因する変化した
アンドロゲンレセプター活性は、アンドロゲン欠乏下での腫瘍細胞増殖を可能に
するアンドロゲン非依存性の発達に起因して、前立腺癌の再発のような病状をも
たらし得る。
ロゲン、プロゲステロン、アンドロゲン、ジヒドロテストステロンおよびテスト
ステロン。例えば、アンドロゲンレセプターおよびアンドロゲンレセプター遺伝
子のコピー数は、前立腺癌患者から単離された癌細胞において検出され得る。循
環前立腺癌細胞の同定および特徴付けは、特に目的のものである。アンドロゲン
は、110kDのリガンドによって活性化された核レセプターであるアンドロゲ
ンレセプターを通じて多数の多様な応答を媒介する。種々の組織において見出さ
れるアンドロゲンレセプター発現は、発生、加齢および悪性トランスフォーメー
ションプロセスを通して変化する。アンドロゲンレセプターは、アンドロゲンレ
セプターに異なる親和性で結合する、テストステロンおよびジヒドロテストステ
ロンという2つのリガンドによって活性化され得る。この結合親和性の相違は、
この2つのリガンドによるアンドロゲンレセプターの異なるレベルの活性化をも
たらす。アンドロゲンレセプターは、アンドロゲン応答エレメントに結合するこ
とによって、種々の遺伝子の転写モディファイアとして作用する。アンドロゲン
応答エレメントによってアンドロゲン特異的作用を付与する能力は、他の細胞特
異的転写因子およびシス作用性DNAエレメントに依存し得る。テストステロン
およびジヒドロテストステロンは、同一の核レセプターに作用するようである。
しかし、特定の例では、これらは、異なる生理学的応答を媒介する。例えば、ジ
ヒドロテストステロンは、雄性外性器の完全な性発達を媒介し得るが、テストス
テロンは媒介し得ない。いくつかの場合には、アンドロゲンレセプターは、その
位置に依存して、逆の生理学的応答を類似の組織型において誘導し得る。例えば
、雄性型禿頭症では、活性化されたアンドロゲンレセプターは、ストロマ上皮作
用を開始することによって独特な毛包集団の増殖を抑制し得、一方、他の毛包は
増殖し続ける。他の場合では、その変異または変化した発現に起因する変化した
アンドロゲンレセプター活性は、アンドロゲン欠乏下での腫瘍細胞増殖を可能に
するアンドロゲン非依存性の発達に起因して、前立腺癌の再発のような病状をも
たらし得る。
【0049】 タンパク質およびmRNAのレベルを用いて、ホルモンレセプター発現(例え
ば、アンドロゲンおよびエストロゲン)および癌遺伝子発現(例えば、p53、
HER2およびp21)を試験し得る。ホルモンレセプター遺伝子コピー数およ
び癌遺伝子数を特徴付ける試験は、変異または単一塩基変異を検出する。
ば、アンドロゲンおよびエストロゲン)および癌遺伝子発現(例えば、p53、
HER2およびp21)を試験し得る。ホルモンレセプター遺伝子コピー数およ
び癌遺伝子数を特徴付ける試験は、変異または単一塩基変異を検出する。
【0050】 増幅された遺伝子の過剰発現はしばしば、インビトロでの癌治療剤への耐性の
獲得と関連する。ヒト前立腺癌におけるインビボでのホルモン処置不全について
の類似の分子機構は、アンドロゲンレセプター(AR)遺伝子の増幅を含む。比
較ゲノムハイブリダイゼーションは、Xq1 1−q13領域(位置)の増幅は
、アンドロゲン剥奪治療の間に再発する腫瘍において通常であることを示す。高
レベルのアンドロゲンレセプター増幅は、30%の再発腫瘍において観察される
。アンドロゲンレセプター増幅は、減少したアンドロゲン濃度の間に現れる(V
isakorpiら,Nature Genetics,9:401−406,
(1995))。
獲得と関連する。ヒト前立腺癌におけるインビボでのホルモン処置不全について
の類似の分子機構は、アンドロゲンレセプター(AR)遺伝子の増幅を含む。比
較ゲノムハイブリダイゼーションは、Xq1 1−q13領域(位置)の増幅は
、アンドロゲン剥奪治療の間に再発する腫瘍において通常であることを示す。高
レベルのアンドロゲンレセプター増幅は、30%の再発腫瘍において観察される
。アンドロゲンレセプター増幅は、減少したアンドロゲン濃度の間に現れる(V
isakorpiら,Nature Genetics,9:401−406,
(1995))。
【0051】 薬物処置レジメンに対する応答を決定することは、細胞の数を定量し、そして
疾患の進行について細胞を特徴付けすることによって、薬物が有効であるか否か
と取り組む、価値ある別のツールである。本発明の好ましい実施形態では、基準
線の特徴付けプロフィールが確立され(すなわち、第1のプロフィールの確立)
、そしてその後の特徴付けプロフィールが基準線に対して比較される。本発明の
別の適用は、患者に入る前に骨髄または白血球細胞移植産物をモニタリングする
ことである。
疾患の進行について細胞を特徴付けすることによって、薬物が有効であるか否か
と取り組む、価値ある別のツールである。本発明の好ましい実施形態では、基準
線の特徴付けプロフィールが確立され(すなわち、第1のプロフィールの確立)
、そしてその後の特徴付けプロフィールが基準線に対して比較される。本発明の
別の適用は、患者に入る前に骨髄または白血球細胞移植産物をモニタリングする
ことである。
【0052】 (循環血球の単離) 本発明は、種々の蛍光化合物に結合体化された種々の細胞プローブを評価する
工程を含む、任意の被験体の単一細胞環境を特徴付けする方法に関し、ここで、
このような化合物は、励起した場合に、異なる波長の光を放出し得るように選択
される。好ましくは、天然のおよび富化された体液から単離された細胞が特徴付
けられる。より好ましくは、密度勾配遠心を用いて血液または血液画分から単離
された循環癌細胞は、米国特許第5,962,237号に記載される方法を用い
て特徴付けられる。循環から単離された、実質的に純粋な癌細胞(例えば、20
−80%の純度)の選択は、このような細胞を用いる(例えば、癌を段階付ける
(staging)、薬物感受性を決定する、転移細胞の存在を決定する、およ
び/または癌ワクチンを開発する)ための特定の方法の、より決定的な特徴付け
および利用を可能にし得る。詳細には、本発明はさらに、密度勾配遠心に供し、
そして陰性選択または陽性選択に供して全てまたは大部分の白血球および/また
は赤血球を除去した、天然および富化した体液中の循環癌細胞を単離するための
方法を提供する。一般に、天然の体液において単離された循環癌細胞は、陰性選
択に供されて、できる限り多くの白血球および/または赤血球が取り出され、そ
して富化された体液において単離された癌細胞(すなわち、白血球搬出)が陽性
選択に供される。本発明の範囲内では、陰性選択は、非癌細胞を、例えば、抗体
へと結合させ、そして結合した非癌細胞が癌細胞から分離される従来のプロセス
を意味する。陰性選択プロセスは、「直接的」および「間接的」の両方のプロト
コルを含む。例えば、直接的陰性選択プロセスは、支持体(例えば、マイクロビ
ーズ)に結合した抗体を用いることを含み、ここでこの抗体は非癌細胞へと結合
する。間接的陰性選択は、非癌細胞へと結合させるために「一次」抗体を、そし
て一次抗体へと結合させるために、支持体に結合した「二次」抗体を用いること
を含む。非濃縮体液から単離された循環癌細胞には、白血球が混入する。白血球
に結合する任意の結合因子(例えば、抗体)(例えば、抗CD45抗体または抗
CD3抗体)を用いて、これらの細胞を癌細胞から低減または除去し得る。本発
明の範囲において、陽性選択は、抗体のような結合因子によって癌細胞を結合し
、そして結合した癌細胞が非癌細胞から分離される、従来のプロセスを意味する
。
工程を含む、任意の被験体の単一細胞環境を特徴付けする方法に関し、ここで、
このような化合物は、励起した場合に、異なる波長の光を放出し得るように選択
される。好ましくは、天然のおよび富化された体液から単離された細胞が特徴付
けられる。より好ましくは、密度勾配遠心を用いて血液または血液画分から単離
された循環癌細胞は、米国特許第5,962,237号に記載される方法を用い
て特徴付けられる。循環から単離された、実質的に純粋な癌細胞(例えば、20
−80%の純度)の選択は、このような細胞を用いる(例えば、癌を段階付ける
(staging)、薬物感受性を決定する、転移細胞の存在を決定する、およ
び/または癌ワクチンを開発する)ための特定の方法の、より決定的な特徴付け
および利用を可能にし得る。詳細には、本発明はさらに、密度勾配遠心に供し、
そして陰性選択または陽性選択に供して全てまたは大部分の白血球および/また
は赤血球を除去した、天然および富化した体液中の循環癌細胞を単離するための
方法を提供する。一般に、天然の体液において単離された循環癌細胞は、陰性選
択に供されて、できる限り多くの白血球および/または赤血球が取り出され、そ
して富化された体液において単離された癌細胞(すなわち、白血球搬出)が陽性
選択に供される。本発明の範囲内では、陰性選択は、非癌細胞を、例えば、抗体
へと結合させ、そして結合した非癌細胞が癌細胞から分離される従来のプロセス
を意味する。陰性選択プロセスは、「直接的」および「間接的」の両方のプロト
コルを含む。例えば、直接的陰性選択プロセスは、支持体(例えば、マイクロビ
ーズ)に結合した抗体を用いることを含み、ここでこの抗体は非癌細胞へと結合
する。間接的陰性選択は、非癌細胞へと結合させるために「一次」抗体を、そし
て一次抗体へと結合させるために、支持体に結合した「二次」抗体を用いること
を含む。非濃縮体液から単離された循環癌細胞には、白血球が混入する。白血球
に結合する任意の結合因子(例えば、抗体)(例えば、抗CD45抗体または抗
CD3抗体)を用いて、これらの細胞を癌細胞から低減または除去し得る。本発
明の範囲において、陽性選択は、抗体のような結合因子によって癌細胞を結合し
、そして結合した癌細胞が非癌細胞から分離される、従来のプロセスを意味する
。
【0053】 天然の体液としては、血液、富化した血液画分、唾液、リンパ、髄液、***、
羊水、腔液および組織抽出物のような流体が挙げられるがこれらに限定されない
。種々の容量の天然の体液が用いられ得る。一般に、有用な容量の天然の体液は
、約5ml〜75mlの血液が、試験されるべき患者から抽出されることを意味
する。好ましくは、例えば、約15〜25mlの静脈血が試験され、そして最も
好ましくは約20mlが試験される。20ミリリットルの血液は、1:300〜
1:350の比の総血液容量を構成する。
羊水、腔液および組織抽出物のような流体が挙げられるがこれらに限定されない
。種々の容量の天然の体液が用いられ得る。一般に、有用な容量の天然の体液は
、約5ml〜75mlの血液が、試験されるべき患者から抽出されることを意味
する。好ましくは、例えば、約15〜25mlの静脈血が試験され、そして最も
好ましくは約20mlが試験される。20ミリリットルの血液は、1:300〜
1:350の比の総血液容量を構成する。
【0054】 天然に富化されるかまたは濃縮される体液の供給源は、白血球および循環癌細
胞(存在する場合)を含む体液を濃縮する任意の方法を含む。好ましくは、濃縮
された体液の例としては、白血球搬出、バフィコート、アフェレーシスなど(米
国特許第5,529,903号)が挙げられる。濃縮された体液サンプルまたは
画分(例えば、アフェレーシスまたは白血球搬出)は、広範に利用可能なプロト
コルによって収集される(Technical Manual of the
American Association of Blood Banks,
Washington,D.C.,17−337頁,1981)。一般に、3リ
ットルの血液において白血球および循環癌細胞(存在する場合)を含む、濃縮さ
れた細胞画分を収集するために3時間の期間が割り当てられる。3リットルの血
液は、循環癌細胞を含み得る、富化した細胞画分について処理するために有意な
容量の血液である。なぜなら、平均的なヒト被験体は、6〜7リットルの血液を
含むからである。これらの富化した細胞画分を捕獲するプロセスは、赤血球およ
び血清が患者へと再度輸液されることを可能にする。白血球搬出(米国特許第5
,112,298号および米国特許第5,147,290号)およびアフェレー
シス(米国特許第5,529,903号)手順は、白血球(WBC)画分内の癌
細胞を捕獲および濃縮する。従って、分子的および免疫学的プロファイリングを
標準化し、そして癌細胞を個々の患者から培養するという長期の目的のために、
白血球搬出サンプルの使用が、天然の体液から収集されたデータを支持するため
に好適であり得る。なぜなら、より多数の細胞が、患者から単離され得るからで
ある。
胞(存在する場合)を含む体液を濃縮する任意の方法を含む。好ましくは、濃縮
された体液の例としては、白血球搬出、バフィコート、アフェレーシスなど(米
国特許第5,529,903号)が挙げられる。濃縮された体液サンプルまたは
画分(例えば、アフェレーシスまたは白血球搬出)は、広範に利用可能なプロト
コルによって収集される(Technical Manual of the
American Association of Blood Banks,
Washington,D.C.,17−337頁,1981)。一般に、3リ
ットルの血液において白血球および循環癌細胞(存在する場合)を含む、濃縮さ
れた細胞画分を収集するために3時間の期間が割り当てられる。3リットルの血
液は、循環癌細胞を含み得る、富化した細胞画分について処理するために有意な
容量の血液である。なぜなら、平均的なヒト被験体は、6〜7リットルの血液を
含むからである。これらの富化した細胞画分を捕獲するプロセスは、赤血球およ
び血清が患者へと再度輸液されることを可能にする。白血球搬出(米国特許第5
,112,298号および米国特許第5,147,290号)およびアフェレー
シス(米国特許第5,529,903号)手順は、白血球(WBC)画分内の癌
細胞を捕獲および濃縮する。従って、分子的および免疫学的プロファイリングを
標準化し、そして癌細胞を個々の患者から培養するという長期の目的のために、
白血球搬出サンプルの使用が、天然の体液から収集されたデータを支持するため
に好適であり得る。なぜなら、より多数の細胞が、患者から単離され得るからで
ある。
【0055】 天然の体液(例えば、血液)の20mlサンプルとは対照的に、3リットルの
濃縮体液中の循環癌を単離する可能性は、100〜150倍以上高くに上昇され
る。次いで、より多くの細胞が評価のために単離されるので、特徴付けのデータ
は、より決定的になり得る。誘導された特徴付けプロフィールに基づいて、治療
処置の変化に影響する重要かつ有益な決定が、白血球搬出サンプルを提供する個
々の患者についてなされ得る。
濃縮体液中の循環癌を単離する可能性は、100〜150倍以上高くに上昇され
る。次いで、より多くの細胞が評価のために単離されるので、特徴付けのデータ
は、より決定的になり得る。誘導された特徴付けプロフィールに基づいて、治療
処置の変化に影響する重要かつ有益な決定が、白血球搬出サンプルを提供する個
々の患者についてなされ得る。
【0056】 (モノクローナル抗体に対する蛍光団(Fluorophore)の結合) 前立腺癌細胞の同定および特徴付けの両方に本発明者らが用いている抗体は、
全てマウスモノクローナル抗体であるので、間接的免疫蛍光による2つより多い
抗体を用いる分析は、煩雑でかつ面倒である。この問題を取り扱うための最善の
方法は、異なる蛍光団を用いて各抗体を直接標識することである。Davis,
W.C.編、Monoclonal antibody protocols(
Towata(NJ):Humana Press;1995.215〜221
(1995))において、タンパク質結合体調製のための手順および試薬の広範
囲にわたる調査が提供される。蛍光団のスクシンイミジルエステル誘導体を用い
る以下の抗体結合体を調製した:抗サイトケラチン−CY3、抗Ki67(Mi
Bl)−FITC、抗−Kip1/P27−Texas Red(登録商標)、
WDZ3(抗前立腺特異的膜抗原)(これは、WDZ1(ATCC#HB−11
430)およびWDZ2(ATCC#HB−10494)−Texas Red
の混合物である)、抗P27−CY5、抗アンドロゲンレセプター−CY3、抗
前立腺特異的抗原(PSA)−AMCAおよび前立腺特異的抗原ホスファターゼ
−Texas Red(登録商標)、ならびにペプシノーゲン−Texas R
ed。この抗体および蛍光誘導体は、市販されている(例えば、Organon
Teknika、Durham、NC)。
全てマウスモノクローナル抗体であるので、間接的免疫蛍光による2つより多い
抗体を用いる分析は、煩雑でかつ面倒である。この問題を取り扱うための最善の
方法は、異なる蛍光団を用いて各抗体を直接標識することである。Davis,
W.C.編、Monoclonal antibody protocols(
Towata(NJ):Humana Press;1995.215〜221
(1995))において、タンパク質結合体調製のための手順および試薬の広範
囲にわたる調査が提供される。蛍光団のスクシンイミジルエステル誘導体を用い
る以下の抗体結合体を調製した:抗サイトケラチン−CY3、抗Ki67(Mi
Bl)−FITC、抗−Kip1/P27−Texas Red(登録商標)、
WDZ3(抗前立腺特異的膜抗原)(これは、WDZ1(ATCC#HB−11
430)およびWDZ2(ATCC#HB−10494)−Texas Red
の混合物である)、抗P27−CY5、抗アンドロゲンレセプター−CY3、抗
前立腺特異的抗原(PSA)−AMCAおよび前立腺特異的抗原ホスファターゼ
−Texas Red(登録商標)、ならびにペプシノーゲン−Texas R
ed。この抗体および蛍光誘導体は、市販されている(例えば、Organon
Teknika、Durham、NC)。
【0057】 (標識したモノクローナル抗体を用いる細胞の特徴付け) サイトスピン(cytospin)遠心分離(1000rpm、10分間)を
用いて、前立腺癌細胞をスライド上にのばす。少なくとも2時間の風乾後、この
細胞を固定し、そして3%パラホルムアルデヒド/1%トリトン/PBS中に4
℃で4分間または2%パラホルムアルデヒド中に4℃で10分間、透過化処理す
る。次いで、この細胞を加湿チャンバ内のカバーガラス下で、4または5の標識
した抗体を用いて、3%BSA/PBSまたは1%BSA/0.1%Sapon
inとともにインキュベートする。最後に、このスライドを室温でPBS中で2
〜3回、各5分間洗浄し、次いで蛍光顕微鏡による検査のためにDAPIを含む
消光培地(anti−fade medium)中に入れる。4〜7以上、好ま
しくは5〜6、より好ましくは6〜7の異なる蛍光標識抗体を識別し得る、冷却
CCDカメラおよび蛍光フィルタキューブを備えた最新式マイクロスコープ(L
eica、Germany)を用いて画像を得る。前立腺細胞が前立腺特異的抗
原AMCAおよびサイトケラチン−FITCについて陽性に染色する場合、この
画像を融合して、前立腺細胞を示す着色合成写真を生成し得る。前立腺細胞が増
殖性能力を有する場合、それは、Ki67−CY3について陽性に染色(赤)す
るはずであり、そして増殖性細胞核抗原(PCNA)−Texas Redにつ
いて陽性であるはずである(もし、それが細胞周期のS期であれば)。周期化し
ていない静止期の前立腺細胞は、P27−Cy5について陽性に染色するはずで
ある。適切な色が、CY5およびTexas Redに割当てられ得る。現在の
報告(van Oijenら、Am.J.Clin.Pathol.110:2
4〜31、1998)は、Ki67抗原(MiB1)を含む細胞の全てが活性に
増殖する細胞ではないことを示す。この報告は、同期化インヒビターで処理した
細胞ならびにP53およびP21を過剰発現する細胞を扱っている。この現在の
報告により、細胞周期のS期で増殖する細胞を同定するために、抗−PCNA抗
体を、アッセイ中に含む。癌患者の血中で活発に***するこれらの細胞を同定す
ることは、患者の診断および処置への多段階のアプローチにおいて補助となるは
ずである。
用いて、前立腺癌細胞をスライド上にのばす。少なくとも2時間の風乾後、この
細胞を固定し、そして3%パラホルムアルデヒド/1%トリトン/PBS中に4
℃で4分間または2%パラホルムアルデヒド中に4℃で10分間、透過化処理す
る。次いで、この細胞を加湿チャンバ内のカバーガラス下で、4または5の標識
した抗体を用いて、3%BSA/PBSまたは1%BSA/0.1%Sapon
inとともにインキュベートする。最後に、このスライドを室温でPBS中で2
〜3回、各5分間洗浄し、次いで蛍光顕微鏡による検査のためにDAPIを含む
消光培地(anti−fade medium)中に入れる。4〜7以上、好ま
しくは5〜6、より好ましくは6〜7の異なる蛍光標識抗体を識別し得る、冷却
CCDカメラおよび蛍光フィルタキューブを備えた最新式マイクロスコープ(L
eica、Germany)を用いて画像を得る。前立腺細胞が前立腺特異的抗
原AMCAおよびサイトケラチン−FITCについて陽性に染色する場合、この
画像を融合して、前立腺細胞を示す着色合成写真を生成し得る。前立腺細胞が増
殖性能力を有する場合、それは、Ki67−CY3について陽性に染色(赤)す
るはずであり、そして増殖性細胞核抗原(PCNA)−Texas Redにつ
いて陽性であるはずである(もし、それが細胞周期のS期であれば)。周期化し
ていない静止期の前立腺細胞は、P27−Cy5について陽性に染色するはずで
ある。適切な色が、CY5およびTexas Redに割当てられ得る。現在の
報告(van Oijenら、Am.J.Clin.Pathol.110:2
4〜31、1998)は、Ki67抗原(MiB1)を含む細胞の全てが活性に
増殖する細胞ではないことを示す。この報告は、同期化インヒビターで処理した
細胞ならびにP53およびP21を過剰発現する細胞を扱っている。この現在の
報告により、細胞周期のS期で増殖する細胞を同定するために、抗−PCNA抗
体を、アッセイ中に含む。癌患者の血中で活発に***するこれらの細胞を同定す
ることは、患者の診断および処置への多段階のアプローチにおいて補助となるは
ずである。
【0058】 (細胞(癌細胞)の免疫検出) 固定化工程の終了後、液体をスライドの表面から吸い取り(例えば、真空吸引
)、次いで、標識したプローブを、100mlの1×PBS、0.5%BSA、
0.1%サポニン、および0.05%NaN3から構成される溶媒中で、スライ
ド上のサンプルに添加する。カバーガラスをサンプル領域上に置く。このスライ
ドを湿潤ボックス内で、室温で60分間インキュベートする。このスライドを、
室温で10分間、1×PBSとともにCoplinジャーに入れる。プローブ標
識結合体の例としては、蛍光化合物で標識したタンパク質またはDNAの任意の
混合物が挙げられる。例えば、サイトケラチンおよびWDZ−3抗体染色は、7
0〜150ng/μl、そして好ましくは約100ng/μlの濃度で、抗サイ
トケラチン抗体ーFITC(Becton Dickinsonから市販のCA
M 5.2)およびWDZ−3抗体−TEXAS RED(登録商標)(Cel
l−Woeks)を含有する混合物(30μl)の調製物を含む。WDZ−3/
TEXAS RED(登録商標)結合体は、約2の色素/タンパク質比を有する
。
)、次いで、標識したプローブを、100mlの1×PBS、0.5%BSA、
0.1%サポニン、および0.05%NaN3から構成される溶媒中で、スライ
ド上のサンプルに添加する。カバーガラスをサンプル領域上に置く。このスライ
ドを湿潤ボックス内で、室温で60分間インキュベートする。このスライドを、
室温で10分間、1×PBSとともにCoplinジャーに入れる。プローブ標
識結合体の例としては、蛍光化合物で標識したタンパク質またはDNAの任意の
混合物が挙げられる。例えば、サイトケラチンおよびWDZ−3抗体染色は、7
0〜150ng/μl、そして好ましくは約100ng/μlの濃度で、抗サイ
トケラチン抗体ーFITC(Becton Dickinsonから市販のCA
M 5.2)およびWDZ−3抗体−TEXAS RED(登録商標)(Cel
l−Woeks)を含有する混合物(30μl)の調製物を含む。WDZ−3/
TEXAS RED(登録商標)結合体は、約2の色素/タンパク質比を有する
。
【0059】 (蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)) FISHは、倍数性全体を決定するためだけでなく、間期細胞における特定の
染色体の過剰提示または過少提示を評価するためにも用いられ得る。他のプロー
ブが、特定の蛍光化合物に標識される第18染色体を含む混合物に添加され得る
。例えば、第18染色体の異数性は、循環血液から単離されたLNCaP前立腺
癌細胞上のCY3標識第18染色体を用いて試験され得る。CY3に結合体化さ
れる第18染色体は、色素/タンパク質の比が2である。第18染色体−CY3
の最終濃度は、約70〜150ng/μl、最も好ましくは、約125ng/μ
lである。
染色体の過剰提示または過少提示を評価するためにも用いられ得る。他のプロー
ブが、特定の蛍光化合物に標識される第18染色体を含む混合物に添加され得る
。例えば、第18染色体の異数性は、循環血液から単離されたLNCaP前立腺
癌細胞上のCY3標識第18染色体を用いて試験され得る。CY3に結合体化さ
れる第18染色体は、色素/タンパク質の比が2である。第18染色体−CY3
の最終濃度は、約70〜150ng/μl、最も好ましくは、約125ng/μ
lである。
【0060】
【化1】 FISHカクテル(容量/スライド):19.5μl FISH緩衝液;0.
5μl CY3−染色体動原体プローブ18(200ng/μl)。FISH染
色:スライド上のサンプル領域上にFishカクテルを添加する;サンプル領域
上にカバーガラスを置く;ゴムセメントでカバーガラスを密封する;ホットプレ
ート上でサンプルを5分間85℃で変性する;湿潤ボックス中で4時間オーブン
中で42℃でサンプルをハイブリダイズする;非常に注意深く、ゴムセメントお
よびカバーガラスをサンプルスライドから取り除く;2×Standard S
aline Citrate(SSC)/0.1%NP−40(USB;Cat
:19628)を用いてCoplin Jar中でスライドを52℃(前加熱)
で2分間洗浄する;このスライドを室温で風乾する;封入剤(1.0μg/ml
;Vector Lab;Cat.H−12000)中の14μl/スライドの
DAPIを用いて、このサンプルをDAPI対比染色する;サンプル上にカバー
ガラスを置く;FLO−TEXX封入剤(Lerner Lab;Cat.M7
70−3)を用いてカバーガラスを密封する;このスライドを暗所に室温で少な
くとも10分間静置する。
5μl CY3−染色体動原体プローブ18(200ng/μl)。FISH染
色:スライド上のサンプル領域上にFishカクテルを添加する;サンプル領域
上にカバーガラスを置く;ゴムセメントでカバーガラスを密封する;ホットプレ
ート上でサンプルを5分間85℃で変性する;湿潤ボックス中で4時間オーブン
中で42℃でサンプルをハイブリダイズする;非常に注意深く、ゴムセメントお
よびカバーガラスをサンプルスライドから取り除く;2×Standard S
aline Citrate(SSC)/0.1%NP−40(USB;Cat
:19628)を用いてCoplin Jar中でスライドを52℃(前加熱)
で2分間洗浄する;このスライドを室温で風乾する;封入剤(1.0μg/ml
;Vector Lab;Cat.H−12000)中の14μl/スライドの
DAPIを用いて、このサンプルをDAPI対比染色する;サンプル上にカバー
ガラスを置く;FLO−TEXX封入剤(Lerner Lab;Cat.M7
70−3)を用いてカバーガラスを密封する;このスライドを暗所に室温で少な
くとも10分間静置する。
【0061】 (実施例1) 実施例1は、蛍光化合物で標識したモノクローナル抗体を用いた癌細胞の特徴
付けを示す。
付けを示す。
【0062】 サイトスピン調製物を作製し、LNCaP細胞(前立腺癌細胞株)および白血
球を試験した。サイトスピン調製物を調製するためには任意のスライドが用いら
れ得る。好ましくは、荷電したスライド(VWR Scientific)をS
handon Megafunnels/Slide Assemblyととも
に用いる。サイトスピン調製物は、約5×105細胞/2.5mlを含む。この
スライドを、メガファネル(megafunnel)を用いてアセンブルし、そ
してShandon Cytopsin−3中に配置する。サンプルを、室温で
、高加速度で1,000rpm、10分間遠心分離する。メガファネルチャンバ
を開放しスライドから離す。スライドを、少なくとも2時間室温で風乾し、次い
で染色までスライドボックスに保管し得る。好ましくは、スライドを一晩風乾し
、次いで4℃で、2%パラホルムアルデヒド中で5分間、または3%パラホルム
アルデヒド/1% TritonX100中で4分間、固定する。例えば、Co
plinジャーを固定液で満たし(約4℃で)、スライドを10〜15分間、固
定溶液中に置き、次いでスライドをリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で1回リ
ンスし、そしてPBS中で10分間インキュベートする。この細胞を、PBS中
の1.0%ウシ血清アルブミン(BSA)−0.1%サポニンを用いた室温で1
5分間のインキュベーションにより透過化し、次いで同じ溶液中で1つ以上のモ
ノクローナル抗体とともに、室温で1時間かまたは4℃で一晩(好ましくは、4
℃で一晩)インキュベートした。翌日細胞を室温で2回(各5分)洗浄し、未結
合の抗体を除去した。DAPI(Vectashield、Vector La
boratories)を含有する消光培地へのマウンティング後、細胞を顕微
鏡(Leica、Germany)を用いる蛍光顕微鏡により試験した。冷却C
CDカメラおよび適切な蛍光フィルターキューブを用いて画像を得た。
球を試験した。サイトスピン調製物を調製するためには任意のスライドが用いら
れ得る。好ましくは、荷電したスライド(VWR Scientific)をS
handon Megafunnels/Slide Assemblyととも
に用いる。サイトスピン調製物は、約5×105細胞/2.5mlを含む。この
スライドを、メガファネル(megafunnel)を用いてアセンブルし、そ
してShandon Cytopsin−3中に配置する。サンプルを、室温で
、高加速度で1,000rpm、10分間遠心分離する。メガファネルチャンバ
を開放しスライドから離す。スライドを、少なくとも2時間室温で風乾し、次い
で染色までスライドボックスに保管し得る。好ましくは、スライドを一晩風乾し
、次いで4℃で、2%パラホルムアルデヒド中で5分間、または3%パラホルム
アルデヒド/1% TritonX100中で4分間、固定する。例えば、Co
plinジャーを固定液で満たし(約4℃で)、スライドを10〜15分間、固
定溶液中に置き、次いでスライドをリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で1回リ
ンスし、そしてPBS中で10分間インキュベートする。この細胞を、PBS中
の1.0%ウシ血清アルブミン(BSA)−0.1%サポニンを用いた室温で1
5分間のインキュベーションにより透過化し、次いで同じ溶液中で1つ以上のモ
ノクローナル抗体とともに、室温で1時間かまたは4℃で一晩(好ましくは、4
℃で一晩)インキュベートした。翌日細胞を室温で2回(各5分)洗浄し、未結
合の抗体を除去した。DAPI(Vectashield、Vector La
boratories)を含有する消光培地へのマウンティング後、細胞を顕微
鏡(Leica、Germany)を用いる蛍光顕微鏡により試験した。冷却C
CDカメラおよび適切な蛍光フィルターキューブを用いて画像を得た。
【0063】 細胞型(例えば、サイトケラチン)、組織特異型(例えば、前立腺特異的マー
カー抗原(PSMA)、増殖期(PCNAおよびMiBl/Ki67)および細
胞増殖阻害(P27)を同定するための複数のマーカーを同じ細胞内で同時に用
い得、そして首尾良い染色を示す画像を1に示す。DAPI画像を用い、異数性
の測定のためにDNA含量を決定した。抗サイトケラチン−FITCでのLNC
aP細胞の染色により、上皮細胞を同定し、そしてKi67−CY3(核の全て
ではないが、いくつかにおいて見られ得る)は、増殖する細胞を示す。
カー抗原(PSMA)、増殖期(PCNAおよびMiBl/Ki67)および細
胞増殖阻害(P27)を同定するための複数のマーカーを同じ細胞内で同時に用
い得、そして首尾良い染色を示す画像を1に示す。DAPI画像を用い、異数性
の測定のためにDNA含量を決定した。抗サイトケラチン−FITCでのLNC
aP細胞の染色により、上皮細胞を同定し、そしてKi67−CY3(核の全て
ではないが、いくつかにおいて見られ得る)は、増殖する細胞を示す。
【0064】 図1は、DAPI、FITC、CY3、Texas Red、およびCY5を
選択的に識別し得る5つの異なるフィルターキューブを用いて得られたLNCa
P細胞の同じ同一箇所の5つの白黒画像を示す。この細胞は、上記の蛍光団の1
つにそれぞれ結合体化する、4つのモノクローナル抗体と同時にインキュベート
され、次いで、DAPIで対比染色された。図1A)360/40nmのエキサ
イター、400nmの2色性のエミッターおよび470/40nmのエミッター
を有するフィルターキューブを用いて得た、DNAに特異的な色素であるDAP
Iで染色した細胞核の画像。図1B)モノクローナル抗体−FITC結合体で染
色した、そして470/40nmのエキサイター、497nmの2色性のエミッ
ターおよび522/40nmのエミッターを有するフィルターキューブを用いて
得た、細胞サイトケラチンを示す画像。図1C)モノクローナル抗体−CY3結
合体で染色した、そして546/11nmのエキサイター、557nmの2色性
のエミッターおよび567/15nmのエミッターを有するフィルターキューブ
を用いて得た、核抗原Ki67を示す画像。図1D)モノクローナル抗体−Te
xas Red結合体で染色した、そして581/10nmのエキサイター、5
93nmの2色性のエミッターおよび617/40nmのエミッターを有するフ
ィルターを用いて得た、前立腺組織マーカーである前立腺特異的膜抗原を示す画
像。図1E)モノクローナル抗体−CY5結合体で染色した、そして630/2
0nmのエキサイター、649nmの2色性のエミッターおよび667/30n
mのエミッターを有するフィルターキューブを用いて得た、核抗原P27を示す
画像。
選択的に識別し得る5つの異なるフィルターキューブを用いて得られたLNCa
P細胞の同じ同一箇所の5つの白黒画像を示す。この細胞は、上記の蛍光団の1
つにそれぞれ結合体化する、4つのモノクローナル抗体と同時にインキュベート
され、次いで、DAPIで対比染色された。図1A)360/40nmのエキサ
イター、400nmの2色性のエミッターおよび470/40nmのエミッター
を有するフィルターキューブを用いて得た、DNAに特異的な色素であるDAP
Iで染色した細胞核の画像。図1B)モノクローナル抗体−FITC結合体で染
色した、そして470/40nmのエキサイター、497nmの2色性のエミッ
ターおよび522/40nmのエミッターを有するフィルターキューブを用いて
得た、細胞サイトケラチンを示す画像。図1C)モノクローナル抗体−CY3結
合体で染色した、そして546/11nmのエキサイター、557nmの2色性
のエミッターおよび567/15nmのエミッターを有するフィルターキューブ
を用いて得た、核抗原Ki67を示す画像。図1D)モノクローナル抗体−Te
xas Red結合体で染色した、そして581/10nmのエキサイター、5
93nmの2色性のエミッターおよび617/40nmのエミッターを有するフ
ィルターを用いて得た、前立腺組織マーカーである前立腺特異的膜抗原を示す画
像。図1E)モノクローナル抗体−CY5結合体で染色した、そして630/2
0nmのエキサイター、649nmの2色性のエミッターおよび667/30n
mのエミッターを有するフィルターキューブを用いて得た、核抗原P27を示す
画像。
【0065】 5つの白黒画像(図1由来)の擬似カラー合成写真が利用可能であるが、以下
を含まない:A)DAPIで染色した細胞核(青)、FITCで染色したサイト
ケラチン(緑)、およびCY3で染色したKi67核抗原(赤)を示す合成画像
。B)DAPIで染色した細胞核(青)、およびTexas Redで染色した
前立腺特異的膜抗原(赤)を示す合成画像。C)FITCで染色したサイトケラ
チン(緑)、およびCY5で染色したP27核抗原(赤)を示す合成画像。
を含まない:A)DAPIで染色した細胞核(青)、FITCで染色したサイト
ケラチン(緑)、およびCY3で染色したKi67核抗原(赤)を示す合成画像
。B)DAPIで染色した細胞核(青)、およびTexas Redで染色した
前立腺特異的膜抗原(赤)を示す合成画像。C)FITCで染色したサイトケラ
チン(緑)、およびCY5で染色したP27核抗原(赤)を示す合成画像。
【0066】 (実施例2) 実施例2は、増殖マーカーおよび増殖インヒビターについての核抗原染色を示
す。表1は、いくつかの実験の結果を示し、そして以下のとおりに要約され得る
:コンフルエントなIRM90細胞では、核の50%がP27で標識され、そし
て約16%がMiB1で標識される;指数関数的なIRM90細胞では、核の約
50%がMiB1で標識され、そしてP27で標識されるものはない。LNCa
P細胞を用いる場合、核の約10%がPCNAで標識され(S期)、50%がM
1Blで標識され、そしてP27では標識されない。従って、1つのアッセイに
おいて、増殖しているかまたは静止期にある細胞を同定し得、そしてこれらの同
じ細胞が新生物であればそれもまた決定し得る。
す。表1は、いくつかの実験の結果を示し、そして以下のとおりに要約され得る
:コンフルエントなIRM90細胞では、核の50%がP27で標識され、そし
て約16%がMiB1で標識される;指数関数的なIRM90細胞では、核の約
50%がMiB1で標識され、そしてP27で標識されるものはない。LNCa
P細胞を用いる場合、核の約10%がPCNAで標識され(S期)、50%がM
1Blで標識され、そしてP27では標識されない。従って、1つのアッセイに
おいて、増殖しているかまたは静止期にある細胞を同定し得、そしてこれらの同
じ細胞が新生物であればそれもまた決定し得る。
【0067】
【表1】 (実施例3) 本実施例は、DNA定量含量(Quantification Conten
t)の測定を示す。単一の癌細胞における核DNA含量の、白血球と比較した定
量は、異数性の指標として用いられ得る。蛍光色素である4’,6−ジアミジノ
−2−フェニルインドール(DAPI)は、高い特異性でDNAに結合し、そし
て複合体は強い蛍光を示す。これは、核およびウイルス粒子(Rao,JYら、
Cancer Epidemiology,Biomarkers&Preve
ntion,7:1027〜1033(1998))、および乳癌細胞(Col
eman、AWら、J.Histochem&Cytochem.29:959
〜968(1981))におけるDNAの測定を可能にした。定量的蛍光画像ア
ッセイについての基礎は、同じスライド上での、患者由来の白血球(WBC)な
どの参照細胞と、問い合わせ中の循環している上皮細胞(CEC)とのDNA含
量の比較である。細胞周期のG0期にある循環しているWBCは、2コピー(2
c)のDNA(=2N)含量を有する。G0期〜G1期の正常な上皮細胞はまた、
2c DNAを有し、そしてG2−M期では4c DNAを有する。従って、C
EC DNA含量に対する参照WBC DNA含量の比は、異数性の比の測定値
よりも実質的に大きい。なぜなら、3cまたは4cのDNAを有する***細胞は
、G2−M期には6c〜8cのDNA含量を有するからである。このアッセイは
、内部で完全に制御されている。なぜなら、WBCおよび癌細胞の核DAPI蛍
光は、同じスライド上でのみ比較され、そしてそのスライド上の非常に近傍で測
定されるからである。これは、染色により生じ得るいかなる問題(例えば、イン
キュベーション時間またはDAPI濃度)、または画像獲得もしくは画像処理に
由来するいかなる問題も排除する。なぜなら、参照細胞および試験細胞は、常に
正確に同様に処理されるからである。2つの前立腺癌細胞株(LNCaPおよび
TSU)ならびに正常前立腺細胞(NPC)を血中にスパイクし、そしてこのサ
ンプルを細胞単離および細胞染色(米国特許第5,962,237号)のための
標準的プロトコールを用いて処理した。より多数のLNCaPおよびTSU、な
らびに第3の前立腺癌細胞株(PC3)を単離したWBC中にスパイクし、そし
て上記のように染色した。封入剤は、正常ストック1:3での希釈により0.5
μg/mlのDAPI(XHM003)を含んだ。0.5〜3秒の曝露時間を用
いて、DAPI染色核の蛍光画像を得た。DAPI封入剤を含むが細胞を含まな
いスライドを用いて、バックグラウンド画像を得た。標識の存在を示す陽性サイ
トケラチン染色により、前立腺細胞を同定した。
t)の測定を示す。単一の癌細胞における核DNA含量の、白血球と比較した定
量は、異数性の指標として用いられ得る。蛍光色素である4’,6−ジアミジノ
−2−フェニルインドール(DAPI)は、高い特異性でDNAに結合し、そし
て複合体は強い蛍光を示す。これは、核およびウイルス粒子(Rao,JYら、
Cancer Epidemiology,Biomarkers&Preve
ntion,7:1027〜1033(1998))、および乳癌細胞(Col
eman、AWら、J.Histochem&Cytochem.29:959
〜968(1981))におけるDNAの測定を可能にした。定量的蛍光画像ア
ッセイについての基礎は、同じスライド上での、患者由来の白血球(WBC)な
どの参照細胞と、問い合わせ中の循環している上皮細胞(CEC)とのDNA含
量の比較である。細胞周期のG0期にある循環しているWBCは、2コピー(2
c)のDNA(=2N)含量を有する。G0期〜G1期の正常な上皮細胞はまた、
2c DNAを有し、そしてG2−M期では4c DNAを有する。従って、C
EC DNA含量に対する参照WBC DNA含量の比は、異数性の比の測定値
よりも実質的に大きい。なぜなら、3cまたは4cのDNAを有する***細胞は
、G2−M期には6c〜8cのDNA含量を有するからである。このアッセイは
、内部で完全に制御されている。なぜなら、WBCおよび癌細胞の核DAPI蛍
光は、同じスライド上でのみ比較され、そしてそのスライド上の非常に近傍で測
定されるからである。これは、染色により生じ得るいかなる問題(例えば、イン
キュベーション時間またはDAPI濃度)、または画像獲得もしくは画像処理に
由来するいかなる問題も排除する。なぜなら、参照細胞および試験細胞は、常に
正確に同様に処理されるからである。2つの前立腺癌細胞株(LNCaPおよび
TSU)ならびに正常前立腺細胞(NPC)を血中にスパイクし、そしてこのサ
ンプルを細胞単離および細胞染色(米国特許第5,962,237号)のための
標準的プロトコールを用いて処理した。より多数のLNCaPおよびTSU、な
らびに第3の前立腺癌細胞株(PC3)を単離したWBC中にスパイクし、そし
て上記のように染色した。封入剤は、正常ストック1:3での希釈により0.5
μg/mlのDAPI(XHM003)を含んだ。0.5〜3秒の曝露時間を用
いて、DAPI染色核の蛍光画像を得た。DAPI封入剤を含むが細胞を含まな
いスライドを用いて、バックグラウンド画像を得た。標識の存在を示す陽性サイ
トケラチン染色により、前立腺細胞を同定した。
【0068】 WBCのDAPI蛍光は、0.5〜3秒の曝露時間(画像獲得のため)および
DAPI濃度(0.5〜1.5μg/ml)に関して直線であった。1画素あた
りの蛍光は、直線性を保証するには1画素あたり2000単位未満であるべきで
ある。血液スパイクしたサンプルについて、LNCaP核DAPI蛍光対WBC
DAPI蛍光の比は、1.9〜4.4にわたり(16細胞)、このことは、こ
の癌細胞株中のこの細胞が本質的に全ての異数性(2N DNAより多い)であ
ったことを示す。TSU細胞については、この比は、1.6〜3.4にわたり(
13細胞)、このことは、ほとんどの細胞(13のうち10)が2N DNAよ
り多く有し、したがって異数性であったことを示す。これらの結果は、これらの
2つの前立腺癌細胞株が第18染色体に関して異数性であることを示した以前の
FISHデータにより支持される。有糸***促進剤の存在下で培養したNPCに
ついては、DAPIに関するNPC/WBCの核蛍光の比は、1.0〜1.5に
わたった。抗Ki67処理細胞からのデータは、FBSの存在下で増殖したNP
Cの80%より多くが細胞周期の増殖期にあり、そして1より大きいNPC/W
BC比を有するはずであることを示す。より多数の癌細胞が単離された(スライ
ド上にサイトスピンした)WBC中にスパイクされ、次いで核結合DAPIの統
合した蛍光強度を得るために分析された場合、このデータは以下の通りである:
LNCaP、128 WBCおよび56癌細胞を分析した場合、95%が2Nよ
り多いDNAの含量を有した;TSU、89 WBCおよび125癌細胞を分析
した場合、90%が2Nより多いDNAの含量を有した;PC3、95 WBC
および90癌細胞を分析した場合、94%が2Nより多いDNAの含量を有した
。
DAPI濃度(0.5〜1.5μg/ml)に関して直線であった。1画素あた
りの蛍光は、直線性を保証するには1画素あたり2000単位未満であるべきで
ある。血液スパイクしたサンプルについて、LNCaP核DAPI蛍光対WBC
DAPI蛍光の比は、1.9〜4.4にわたり(16細胞)、このことは、こ
の癌細胞株中のこの細胞が本質的に全ての異数性(2N DNAより多い)であ
ったことを示す。TSU細胞については、この比は、1.6〜3.4にわたり(
13細胞)、このことは、ほとんどの細胞(13のうち10)が2N DNAよ
り多く有し、したがって異数性であったことを示す。これらの結果は、これらの
2つの前立腺癌細胞株が第18染色体に関して異数性であることを示した以前の
FISHデータにより支持される。有糸***促進剤の存在下で培養したNPCに
ついては、DAPIに関するNPC/WBCの核蛍光の比は、1.0〜1.5に
わたった。抗Ki67処理細胞からのデータは、FBSの存在下で増殖したNP
Cの80%より多くが細胞周期の増殖期にあり、そして1より大きいNPC/W
BC比を有するはずであることを示す。より多数の癌細胞が単離された(スライ
ド上にサイトスピンした)WBC中にスパイクされ、次いで核結合DAPIの統
合した蛍光強度を得るために分析された場合、このデータは以下の通りである:
LNCaP、128 WBCおよび56癌細胞を分析した場合、95%が2Nよ
り多いDNAの含量を有した;TSU、89 WBCおよび125癌細胞を分析
した場合、90%が2Nより多いDNAの含量を有した;PC3、95 WBC
および90癌細胞を分析した場合、94%が2Nより多いDNAの含量を有した
。
【0069】 ヒト核型は非常に堅固であり、従って、異数性は、癌細胞を同定するための優
れたマーカーである。CEC/WBC核DAPI蛍光比が2より大きい(4Nよ
り多いDNA含量)任意のCECは、新生物とみなされるべきである(LNCa
Pモデルを参照のこと)。正常な分化した前立腺組織中の細胞の95%より多く
が細胞周期のG0/G1期(=2N DNA)にあるはずである。従って、末梢血
中の前立腺起源の任意のCECの出現(WDZについて染色する陽性染色)が、
特にこの細胞が1.3以上のCEC/WBC核DAPI蛍光比を有する場合、疑
われるはずである。このような細胞は、異数性であり得る。なぜなら、正常な前
立腺細胞のほとんどが2N含量より多いDNAを有さない(すなわち、約1のC
EC/WBC比)からである。
れたマーカーである。CEC/WBC核DAPI蛍光比が2より大きい(4Nよ
り多いDNA含量)任意のCECは、新生物とみなされるべきである(LNCa
Pモデルを参照のこと)。正常な分化した前立腺組織中の細胞の95%より多く
が細胞周期のG0/G1期(=2N DNA)にあるはずである。従って、末梢血
中の前立腺起源の任意のCECの出現(WDZについて染色する陽性染色)が、
特にこの細胞が1.3以上のCEC/WBC核DAPI蛍光比を有する場合、疑
われるはずである。このような細胞は、異数性であり得る。なぜなら、正常な前
立腺細胞のほとんどが2N含量より多いDNAを有さない(すなわち、約1のC
EC/WBC比)からである。
【0070】
【表2】 (実施例4) 本実施例は、アンドロゲンレセプター検出についての細胞の染色を示す。
【0071】 癌患者由来の循環癌細胞におけるアンドロゲンレセプターの免疫組織化学染色
の方法を、以下に概説する:前立腺癌と診断された癌患者から約20mlの血液
を得た;血液を2重勾配遠心分離システムにより処理し、そして界面を新しいチ
ューブに収集した;界面懸濁物におけるリンパ球を磁気細胞ソートシステムによ
り枯渇した;磁気細胞ソートシステムからの細胞をサイトスピンによりスライド
上にスピンした;このスライドを2%パラホルムアルデヒド中で固定した;スラ
イドをPBS中で2分間3回洗浄し、そしてブロック血清とともにPBS−ゼラ
チン中で20分間インキュベートした;アンドロゲンレセプター抗体:1)ヒト
アンドロゲンレセプターa.a.1−21に対するマウスIgG(Chicag
oのUniversity of IllinoisのGail Prins博
士の寄贈)、2)ヒトアンドロゲンレセプターa.a.33−485に対するマ
ウスIgG(Pharm Mingen)、3)ヒトアンドロゲンレセプター4
86〜651に対するマウスIgG(PharmMingen)。アンドロゲン
レセプター抗体色素結合体:1)直接色素結合化:TEXAS RED(登録商
標)、CY3、TRITCおよびFITC。
の方法を、以下に概説する:前立腺癌と診断された癌患者から約20mlの血液
を得た;血液を2重勾配遠心分離システムにより処理し、そして界面を新しいチ
ューブに収集した;界面懸濁物におけるリンパ球を磁気細胞ソートシステムによ
り枯渇した;磁気細胞ソートシステムからの細胞をサイトスピンによりスライド
上にスピンした;このスライドを2%パラホルムアルデヒド中で固定した;スラ
イドをPBS中で2分間3回洗浄し、そしてブロック血清とともにPBS−ゼラ
チン中で20分間インキュベートした;アンドロゲンレセプター抗体:1)ヒト
アンドロゲンレセプターa.a.1−21に対するマウスIgG(Chicag
oのUniversity of IllinoisのGail Prins博
士の寄贈)、2)ヒトアンドロゲンレセプターa.a.33−485に対するマ
ウスIgG(Pharm Mingen)、3)ヒトアンドロゲンレセプター4
86〜651に対するマウスIgG(PharmMingen)。アンドロゲン
レセプター抗体色素結合体:1)直接色素結合化:TEXAS RED(登録商
標)、CY3、TRITCおよびFITC。
【0072】 間接免疫組織化学染色:異なる色素結合体化抗マウスIgG抗体(例えば、二
次抗体:ローダミン標識ヤギ抗マウスIgM、フルオレセイン標識ヤギ抗マウス
IgG(H+L)、抗マウスIgG(H+L)、F(ab’)2−FITC(ヤ
ギ)、TEXAS RED(登録商標)−Xヤギ抗マウスIgG(H+L)。
次抗体:ローダミン標識ヤギ抗マウスIgM、フルオレセイン標識ヤギ抗マウス
IgG(H+L)、抗マウスIgG(H+L)、F(ab’)2−FITC(ヤ
ギ)、TEXAS RED(登録商標)−Xヤギ抗マウスIgG(H+L)。
【0073】 免疫組織化学染色:このスライドを一次抗体とともに室温で60分間インキュ
ベートした。このスライドを二次抗体−色素とともに室温で60分間インキュベ
ートした。10分間、DAPI対比染色した。顕微鏡下で試験した。
ベートした。このスライドを二次抗体−色素とともに室温で60分間インキュベ
ートした。10分間、DAPI対比染色した。顕微鏡下で試験した。
【0074】 アンドロゲンレセプター遺伝子コピー数の検出を以下に考察する。
【0075】 遺伝子特異的プローブおよび遺伝子座特異的プローブを用いる蛍光インサイチ
ュハイブリダイゼーション(FISH)は、個々の間期の核中の特定配列のコピ
ー数を評価するための迅速手段を提供する。現在の技術改良は、研究および診断
的実験室において、新鮮な組織標品および保存中の組織標品の両方の分析に適用
可能なFISHを作製した。FISHは、同時に1つまたは2〜3の遺伝子座の
分析に限定され、これにより、ゲノム−ワイド調査を非現実的にする。この技術
の用途は、循環癌細胞中の遺伝子変化の分析において示される。インサイチュハ
イブリダイゼーションのために用いたプローブは、Xq12(Vysis In
c.)の遺伝子座からのLSIアンドロゲンレセプターゲノムDNA、またはテ
ンプレートとしてゲノムDNAを用いて特定のアンドロゲンレセプター遺伝子プ
ライマーにより生成され、Spectrum Orange dUTPを含有す
るニックトランスレーションキット(Vysis Inc.)により標識される
、PCR産物のいずれかである。
ュハイブリダイゼーション(FISH)は、個々の間期の核中の特定配列のコピ
ー数を評価するための迅速手段を提供する。現在の技術改良は、研究および診断
的実験室において、新鮮な組織標品および保存中の組織標品の両方の分析に適用
可能なFISHを作製した。FISHは、同時に1つまたは2〜3の遺伝子座の
分析に限定され、これにより、ゲノム−ワイド調査を非現実的にする。この技術
の用途は、循環癌細胞中の遺伝子変化の分析において示される。インサイチュハ
イブリダイゼーションのために用いたプローブは、Xq12(Vysis In
c.)の遺伝子座からのLSIアンドロゲンレセプターゲノムDNA、またはテ
ンプレートとしてゲノムDNAを用いて特定のアンドロゲンレセプター遺伝子プ
ライマーにより生成され、Spectrum Orange dUTPを含有す
るニックトランスレーションキット(Vysis Inc.)により標識される
、PCR産物のいずれかである。
【0076】 蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH):FISHカクテル(
Vol/スライド):17.0μl FISH緩衝液;1.0μlXq12プロ
ーブ−Spectrum Orange(Vysis;Lot#13156);
2.0μl H2O。FISH染色:スライド上のサンプル領域上にFISHカ
クテルを添加する;サンプル領域上にカバーガラスをおく;ゴムセメントでカバ
ーガラスを密閉する;ホットプレート上で、5分間85℃でサンプルを変性する
;湿潤ボックス中で、4時間42℃オーブン中で、サンプルをハイブリダイズす
る;非常に注意深く、ゴムセメントおよびカバーガラスをサンプルから取り除く
;2×SSC/0.1%NP−40(USB;Cat:19628)を用いてC
oplin Jar中でスライドを52℃(前加熱)で2分間洗浄する;このス
ライドを室温で風乾する;封入剤(1.0μg/ml;Vector Lab;
Cat.H−1200)中の14μl/スライドのDAPIを用いて、このサン
プルを対比染色する;サンプル上にカバーガラスを置く;FLO−TEXX封入
剤(Lerner Lab;Cat.M770−3)を用いてカバーガラスを密
封する;このスライドを暗所に室温で少なくとも10分間静置する;そして蛍光
顕微鏡下で染色したスライドを分析する。
Vol/スライド):17.0μl FISH緩衝液;1.0μlXq12プロ
ーブ−Spectrum Orange(Vysis;Lot#13156);
2.0μl H2O。FISH染色:スライド上のサンプル領域上にFISHカ
クテルを添加する;サンプル領域上にカバーガラスをおく;ゴムセメントでカバ
ーガラスを密閉する;ホットプレート上で、5分間85℃でサンプルを変性する
;湿潤ボックス中で、4時間42℃オーブン中で、サンプルをハイブリダイズす
る;非常に注意深く、ゴムセメントおよびカバーガラスをサンプルから取り除く
;2×SSC/0.1%NP−40(USB;Cat:19628)を用いてC
oplin Jar中でスライドを52℃(前加熱)で2分間洗浄する;このス
ライドを室温で風乾する;封入剤(1.0μg/ml;Vector Lab;
Cat.H−1200)中の14μl/スライドのDAPIを用いて、このサン
プルを対比染色する;サンプル上にカバーガラスを置く;FLO−TEXX封入
剤(Lerner Lab;Cat.M770−3)を用いてカバーガラスを密
封する;このスライドを暗所に室温で少なくとも10分間静置する;そして蛍光
顕微鏡下で染色したスライドを分析する。
【0077】
【表3】
【0078】
【表4】 本明細書において引用される全ての参考文献(特許および特許出願を含む)は
、その全体が参考として本明細書において援用される。
、その全体が参考として本明細書において援用される。
【0079】 本発明は、特定の好ましい実施形態および手順と組み合わせて本明細書におい
て記載および開示されているが、これらの特定の実施形態により本発明を限定す
ることは意図されない。むしろ、すべてのこのような代替期的実施形態および改
変は、本発明の精神および範囲内におさまることが意図される。
て記載および開示されているが、これらの特定の実施形態により本発明を限定す
ることは意図されない。むしろ、すべてのこのような代替期的実施形態および改
変は、本発明の精神および範囲内におさまることが意図される。
【図1】 図1は、蛍光プローブを使用する、種々のマーカーの同時測定を示す。
【手続補正書】特許協力条約第34条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成12年5月24日(2000.5.24)
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0063
【補正方法】変更
【補正内容】
【0063】 細胞型(例えば、サイトケラチン)、組織特異型(例えば、前立腺特異的マー
カー抗原(PSMA)、増殖期(PCNAおよびMiBl/Ki67)および細
胞増殖阻害(P27)を同定するための複数のマーカーを同じ細胞内で同時に用
い得、そして首尾良い染色を示す画像を図1A〜5Aに示す。DAPI画像を用
い、異数性の測定のためにDNA含量を決定した。抗サイトケラチン−FITC
でのLNCaP細胞の染色により、上皮細胞を同定し、そしてKi67−CY3
(核の全てではないが、いくつかにおいて見られ得る)は、増殖する細胞を示す
。
カー抗原(PSMA)、増殖期(PCNAおよびMiBl/Ki67)および細
胞増殖阻害(P27)を同定するための複数のマーカーを同じ細胞内で同時に用
い得、そして首尾良い染色を示す画像を図1A〜5Aに示す。DAPI画像を用
い、異数性の測定のためにDNA含量を決定した。抗サイトケラチン−FITC
でのLNCaP細胞の染色により、上皮細胞を同定し、そしてKi67−CY3
(核の全てではないが、いくつかにおいて見られ得る)は、増殖する細胞を示す
。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0064
【補正方法】変更
【補正内容】
【0064】 図1A〜5Aは、DAPI、FITC、CY3、Texas Red、および
CY5を選択的に識別し得る5つの異なるフィルターキューブを用いて得られた
LNCaP細胞の同じ同一箇所の5つの白黒画像を示す。この細胞は、上記のフ
ルオロフォアの1つにそれぞれ結合体化する、4つのモノクローナル抗体と同時
にインキュベートされ、次いで、DAPIで対比染色された。図1A)360/
40nmのエキサイター、400nmの2色性のエミッターおよび470/40
nmのエミッターを有するフィルターキューブを用いて得た、DNAに特異的な
色素であるDAPIで染色した細胞核の画像。図2A)モノクローナル抗体−F
ITC結合体で染色した、そして470/40nmのエキサイター、497nm
の2色性のエミッターおよび522/40nmのエミッターを有するフィルター
キューブを用いて得た、細胞サイトケラチンを示す画像。図3A)モノクローナ
ル抗体−CY3結合体で染色した、そして546/11nmのエキサイター、5
57nmの2色性のエミッターおよび567/15nmのエミッターを有するフ
ィルターキューブを用いて得た、核抗原Ki67を示す画像。図4A)モノクロ
ーナル抗体−Texas Red結合体で染色した、そして581/10nmの
エキサイター、593nmの2色性のエミッターおよび617/40nmのエミ
ッターを有するフィルターを用いて得た、前立腺組織マーカーである前立腺特異
的膜抗原を示す画像。図5A)モノクローナル抗体−CY5結合体で染色した、
そして630/20nmのエキサイター、649nmの2色性のエミッターおよ
び667/30nmのエミッターを有するフィルターキューブを用いて得た、核
抗原P27を示す画像。
CY5を選択的に識別し得る5つの異なるフィルターキューブを用いて得られた
LNCaP細胞の同じ同一箇所の5つの白黒画像を示す。この細胞は、上記のフ
ルオロフォアの1つにそれぞれ結合体化する、4つのモノクローナル抗体と同時
にインキュベートされ、次いで、DAPIで対比染色された。図1A)360/
40nmのエキサイター、400nmの2色性のエミッターおよび470/40
nmのエミッターを有するフィルターキューブを用いて得た、DNAに特異的な
色素であるDAPIで染色した細胞核の画像。図2A)モノクローナル抗体−F
ITC結合体で染色した、そして470/40nmのエキサイター、497nm
の2色性のエミッターおよび522/40nmのエミッターを有するフィルター
キューブを用いて得た、細胞サイトケラチンを示す画像。図3A)モノクローナ
ル抗体−CY3結合体で染色した、そして546/11nmのエキサイター、5
57nmの2色性のエミッターおよび567/15nmのエミッターを有するフ
ィルターキューブを用いて得た、核抗原Ki67を示す画像。図4A)モノクロ
ーナル抗体−Texas Red結合体で染色した、そして581/10nmの
エキサイター、593nmの2色性のエミッターおよび617/40nmのエミ
ッターを有するフィルターを用いて得た、前立腺組織マーカーである前立腺特異
的膜抗原を示す画像。図5A)モノクローナル抗体−CY5結合体で染色した、
そして630/20nmのエキサイター、649nmの2色性のエミッターおよ
び667/30nmのエミッターを有するフィルターキューブを用いて得た、核
抗原P27を示す画像。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0065
【補正方法】変更
【補正内容】
【0065】 5つの白黒画像(図1A〜5A由来)の擬似カラー合成写真が利用可能である
が、以下を含まない:A)DAPIで染色した細胞核(青)、FITCで染色し
たサイトケラチン(緑)、およびCY3で染色したKi67核抗原(赤)を示す
合成画像。B)DAPIで染色した細胞核(青)、およびTexas Redで
染色した前立腺特異的膜抗原(赤)を示す合成画像。C)FITCで染色したサ
イトケラチン(緑)、およびCY5で染色したP27核抗原(赤)を示す合成画
像。
が、以下を含まない:A)DAPIで染色した細胞核(青)、FITCで染色し
たサイトケラチン(緑)、およびCY3で染色したKi67核抗原(赤)を示す
合成画像。B)DAPIで染色した細胞核(青)、およびTexas Redで
染色した前立腺特異的膜抗原(赤)を示す合成画像。C)FITCで染色したサ
イトケラチン(緑)、およびCY5で染色したP27核抗原(赤)を示す合成画
像。
【手続補正4】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1A〜図5Aは、DAPI、FITC、CY3、Texas Redおよび
CY5を選択的に区別し得る、5つの異なるフィルターキューブを用いて得られ
た、LNCaP細胞の同じ同定領域の5つの単色画像を示す。
CY5を選択的に区別し得る、5つの異なるフィルターキューブを用いて得られ
た、LNCaP細胞の同じ同定領域の5つの単色画像を示す。
【図2】 図1A〜図5Aは、DAPI、FITC、CY3、Texas Redおよび
CY5を選択的に区別し得る、5つの異なるフィルターキューブを用いて得られ
た、LNCaP細胞の同じ同定領域の5つの単色画像を示す。
CY5を選択的に区別し得る、5つの異なるフィルターキューブを用いて得られ
た、LNCaP細胞の同じ同定領域の5つの単色画像を示す。
【図3】 図1A〜図5Aは、DAPI、FITC、CY3、Texas Redおよび
CY5を選択的に区別し得る、5つの異なるフィルターキューブを用いて得られ
た、LNCaP細胞の同じ同定領域の5つの単色画像を示す。
CY5を選択的に区別し得る、5つの異なるフィルターキューブを用いて得られ
た、LNCaP細胞の同じ同定領域の5つの単色画像を示す。
【図4】 図1A〜図5Aは、DAPI、FITC、CY3、Texas Redおよび
CY5を選択的に区別し得る、5つの異なるフィルターキューブを用いて得られ
た、LNCaP細胞の同じ同定領域の5つの単色画像を示す。
CY5を選択的に区別し得る、5つの異なるフィルターキューブを用いて得られ
た、LNCaP細胞の同じ同定領域の5つの単色画像を示す。
【図5】 図1A〜図5Aは、DAPI、FITC、CY3、Texas Redおよび
CY5を選択的に区別し得る、5つの異なるフィルターキューブを用いて得られ
た、LNCaP細胞の同じ同定領域の5つの単色画像を示す。
CY5を選択的に区別し得る、5つの異なるフィルターキューブを用いて得られ
た、LNCaP細胞の同じ同定領域の5つの単色画像を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) G01N 33/566 C12N 15/00 A (81)指定国 AE,AL,AM,AT,AU, AZ,BA,BB,BG,BR,BY,CA,CH,C N,CU,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,GB ,GD,GE,GH,GM,HR,HU,ID,IL, IN,IS,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,L C,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MD,MG ,MK,MN,MW,MX,NO,NZ,PL,PT, RO,RU,SD,SE,SG,SI,SK,SL,T J,TM,TR,TT,UA,UG,US,UZ,VN ,YU,ZA,ZW (72)発明者 ティーエス’オー, ポール オー., ピー. アメリカ合衆国 メリーランド 21042, エリコット シティ, フロー アベニ ュー 9039 (72)発明者 ワン, ゼン−ピン アメリカ合衆国 メリーランド 21042, エリコット シティ, セント ジョン ズ レーン 3610 Fターム(参考) 2G054 AA08 AB04 AB05 CA21 CA22 CA23 CE02 EA03 EB01 EB02 FA21 GA04 GB02 GB10 4B024 AA11 AA12 AA14 CA01 CA11 HA12 HA13 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ02 QQ03 QQ42 QQ79 QQ96 QR32 QR48 QR56 QR66 QS03 QS13 QS33 QS36 QX02
Claims (56)
- 【請求項1】 単一の循環癌細胞を特徴付ける方法であって、該方法は、蛍
光プローブを使用して該細胞上の複数の細胞マーカーを同時測定する工程を包含
し、ここで、該プローブは、蛍光顕微鏡を使用して単一の細胞において発現され
る複数の細胞マーカーを区別するために、異なる波長の光を放出する、方法。 - 【請求項2】 請求項1に記載の方法であって、ここで、前記単一の細胞は
、循環癌細胞を含むサンプルから密度勾配遠心によって単離され、該単離された
細胞は、表面上に接着され、そして固定液で固定化され、そして特徴付けのため
の細胞を含む該表面を、前記プローブと共にインキュベートし、ここで、各プロ
ーブは、該単一の細胞のマーカーと反応し、そしてマーカーと結合する任意のプ
ローブを、各特異的マーカーの同定について設定された光学フィルターを備える
顕微鏡によって試験する、方法。 - 【請求項3】 前記細胞が、体液から単離される、請求項1に記載の方法。
- 【請求項4】 前記細胞が、密度勾配遠心を使用して体液から単離される、
請求項3に記載の方法。 - 【請求項5】 前記体液が、血液、骨髄、唾液、脳脊髄液、尿、体腔液およ
び***からなる群より選択される、請求項3に記載の方法。 - 【請求項6】 前記細胞が、上皮癌細胞である、請求項1に記載の方法。
- 【請求項7】 前記細胞が、前立腺、***、肝臓、腎臓、結腸、直腸、胃、
食道、膀胱、脳、卵巣、膵臓または肺の細胞である、請求項6に記載の方法。 - 【請求項8】 前記細胞が、前立腺癌細胞である、請求項6に記載の方法。
- 【請求項9】 前記細胞接着のための表面が、顕微鏡スライドである、請求
項2に記載の方法。 - 【請求項10】 前記固定液が、パラホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド
、アルコールおよびアセトンからなる群より選択される、請求項2に記載の方法
。 - 【請求項11】 前記プローブが、細胞マーカーに結合する蛍光プローブを
作製するために、ある波長の光を放出する蛍光化合物に共有結合される、請求項
1に記載の方法。 - 【請求項12】 前記蛍光プローブが、前記単一の細胞の特徴付けにおける
同時使用のために、最小の重複放出スペクトルを有する他のプローブから選択さ
れる、請求項11に記載の方法。 - 【請求項13】 請求項1に記載の方法であって、前記蛍光プローブは、4
00ナノメーター〜850ナノメーターの波長の光を放出する蛍光プローブの混
合物からなる群より選択され、ここで、前記放出スペクトルは、各選択されたプ
ローブによって放出されている蛍光の、大部分の重複波長の排除を可能にするス
ペクトルフィルターを備える顕微鏡を使用して、互いに区別され得る、方法。 - 【請求項14】 前記蛍光プローブの1つが、430ナノメーター〜510
ナノメーターの波長を有する光を放出する、請求項1に記載の方法。 - 【請求項15】 前記蛍光プローブが、約470ナノメーターのピーク波長
を有する光を放出する、請求項14に記載の方法。 - 【請求項16】 前記蛍光プローブの1つが、482ナノメーター〜562
ナノメーターの波長を有する光を放出する、請求項1に記載の方法。 - 【請求項17】 前記蛍光プローブが、約552ナノメーターのピーク波長
を有する光を放出する、請求項16に記載の方法。 - 【請求項18】 前記蛍光プローブの1つが、552ナノメーター〜582
ナノメーターの波長を有する光を放出する、請求項1に記載の方法。 - 【請求項19】 前記蛍光プローブが、約567ナノメーターのピーク波長
を有する光を放出する、請求項18に記載の方法。 - 【請求項20】 前記蛍光プローブの1つが、577ナノメーター〜657
ナノメーターの波長を有する光を放出する、請求項1に記載の方法。 - 【請求項21】 前記蛍光プローブが、約617ナノメーターのピーク波長
を有する光を放出する、請求項20に記載の方法。 - 【請求項22】 前記蛍光プローブの1つが、637ナノメーター〜697
ナノメーターの波長を有する光を放出する、請求項1に記載の方法。 - 【請求項23】 前記蛍光プローブが、約667ナノメーターのピーク波長
を有する光を放出する、請求項22に記載の方法。 - 【請求項24】 前記蛍光プローブの1つが、679ナノメーター〜763
ナノメーターの波長を有する光を放出する、請求項1に記載の方法。 - 【請求項25】 前記蛍光プローブが、およそCy5.5から放出されるピ
ーク波長を有する光を放出する、請求項24に記載の方法。 - 【請求項26】 前記蛍光プローブの1つが、745ナノメーター〜845
ナノメーターの波長を有する光を放出する、請求項1に記載の方法。 - 【請求項27】 前記蛍光プローブが、フルオレセインイソチオシアネート
;CY3;CY3.5;Cy5;CY5.5;AMCA;テトラメチルローダミ
ンイソチオシアネート;TEXAS REDTM;R−フィコエリトリン;および
スペクトルレッドからなる群より選択される蛍光化合物を含む、請求項13に記
載の方法。 - 【請求項28】 前記プローブが、4つの蛍光プローブを含む、請求項1に
記載の方法。 - 【請求項29】 前記プローブが、5つの蛍光プローブを含む、請求項1に
記載の方法。 - 【請求項30】 前記プローブが、6つの蛍光プローブを含む、請求項1に
記載の方法。 - 【請求項31】 前記プローブが、7つの蛍光プローブを含む、請求項1に
記載の方法。 - 【請求項32】 請求項1に記載の方法であって、ここで、前記プローブは
、異なる波長の光を放出する複数の蛍光プローブを含み、該複数の蛍光プローブ
は、1つマーカーを別のマーカーと同時に試験した場合に区別されることを可能
にする、適切なフィルターセットの組み合わせを使用する場合に、放出される光
の波長間で最小の干渉を有する、方法。 - 【請求項33】 前記プローブが、生物学的プローブを含む、請求項1に記
載の方法。 - 【請求項34】 前記生物学的プローブが、タンパク質またはペプチドを含
む、請求項33に記載の方法。 - 【請求項35】 前記タンパク質が、抗体である、請求項34に記載の方法
。 - 【請求項36】 前記プローブが、分子プローブを含む、請求項1に記載の
方法。 - 【請求項37】 前記分子プローブが、DNAまたはそのDNA配列を含む
、請求項36に記載の方法。 - 【請求項38】 前記分子プローブが、RNAまたはそのRNA配列を含む
、請求項36に記載の方法。 - 【請求項39】 前記プローブが、生物学的プローブ、分子プローブ、また
は生物学的プローブおよび分子プローブの組み合わせを含む、請求項1に記載の
方法。 - 【請求項40】 前記生物学的プローブが、同定プローブ、増殖プローブ、
細胞周期停止プローブ、オンコジーン、ウイルス、細菌およびホルモンのプロー
ブからなる群より選択される、請求項39に記載の方法。 - 【請求項41】 前記分子プローブが、同定プローブ、増殖プローブ、細胞
周期停止プローブ、オンコジーン、ウイルス、細菌およびホルモンのプローブか
らなる群より選択される、請求項39に記載の方法。 - 【請求項42】 前記プローブが、上皮細胞特異的プローブを含む、請求項
39に記載の方法。 - 【請求項43】 前記プローブが、組織特異的プローブを含む、請求項39
に記載の方法。 - 【請求項44】 前記細胞が、哺乳動物から得られる、請求項1に記載の方
法。 - 【請求項45】 前記哺乳動物が、ヒトである、請求項44に記載の方法。
- 【請求項46】 前記生物学的プローブおよび分子プローブが、コピー数の
計数のために、ホルモンレセプターまたはホルモンレセプター遺伝子を検出する
ために使用される、請求項39に記載の方法。 - 【請求項47】 前記ホルモンが、アンドロゲンである、請求項46に記載
の方法。 - 【請求項48】 前記ホルモンが、エストロゲンである、請求項46に記載
の方法。 - 【請求項49】 前記ホルモンが、プロゲステロンである、請求項46に記
載の方法。 - 【請求項50】 前記細胞マーカーが、抗原である、請求項1に記載の方法
。 - 【請求項51】 前記細胞マーカーが、レセプターである、請求項1に記載
の方法。 - 【請求項52】 単一の細胞調製物を特徴付ける方法であって、該方法は、
特徴付けられるべき癌細胞調製物を表面上に接着させる工程、該細胞調製物を固
定液で固定化する工程、固定化された細胞を含むこのような細胞表面と、所望の
細胞マーカーに対する複数のプローブとをインキュベートする工程であって、こ
こで、該複数のプローブは、異なる波長で励起される場合に蛍光を発する能力を
有する、工程、および各選択された細胞マーカーについて陽性細胞を同定するた
めに、該細胞を蛍光顕微鏡によって試験する工程を包含し、ここで、該癌細胞調
製物は、陰性選択プロセスを使用して、体液サンプルから単離される、方法。 - 【請求項53】 循環癌細胞の特徴付けプロフィールを確立する方法であっ
て、該方法は、蛍光プローブを使用する複数の細胞マーカーの同時測定によって
、単一の循環癌細胞環境を特徴付ける方法を包含し、ここで、該プローブは、蛍
光顕微鏡を使用して単一の細胞において発現される複数の細胞マーカーを区別す
るために、異なる波長の光を放出する、方法。 - 【請求項54】 請求項52に記載の方法であって、ここで、前記単一の細
胞は、循環癌細胞を含むサンプルから密度勾配遠心によって単離され、該単離さ
れた細胞は、表面上に接着され、そして固定液で固定化され、そして特徴付けの
ための細胞を含む該表面を、前記プローブと共にインキュベートし、ここで、各
プローブは、該単一の細胞のマーカーと反応し、そしてマーカーと結合する任意
のプローブを、各個々のマーカーの同定について設定された光学フィルターを備
える顕微鏡によって試験する、方法。 - 【請求項55】 細胞が、陰性選択プロセスによってさらに単離される、請
求項53に記載の方法。 - 【請求項56】 請求項53に記載の方法であって、ここで、前記細胞が、
陽性選択プロセスによってさらに単離され、ここで、特異的細胞型が、該細胞に
選択的に結合する抗体によって、細胞の異種混合物から選択される、方法。
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