JP6173577B1 - 細胞増殖法を用いた循環腫瘍細胞の検出・分離取得方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)生体循環体液からの試料を前処理し、単核球相を得る第1のステップ、
(2)ウェルプレートに、CTC及び/又はCTSC増殖用無血清培地からなる培養液を注入したウェルプレートを用意し、第1のステップで得た単核球を播種し、インキュベートする第2のステップ、
(3)第2のステップでインキュベーションして得たプレートウェルから、培養液を除去する第3のステップ、
(4)第3のステップの後、プレートウェルに付着した付着性腫瘍細胞を検出するか、或いは、分離取得する第4のステップ。
[1]以下の(1)〜(4)の処理ステップを含む、生体循環体液中の循環腫瘍細胞及び/又は循環腫瘍幹細胞の検出・分離取得方法:
(1)生体循環体液からの試料を前処理し、単核球相を得る第1のステップ、
(2)ウェルプレートに、循環腫瘍細胞及び/又は循環腫瘍幹細胞増殖用無血清培地からなる培養液を注入したウェルプレートを用意し、第1のステップで得た単核球を播種し、インキュベートする第2のステップ、
(3)第2のステップでインキュベーションして得たプレートウェルから、培養液を除去する第3のステップ、
(4)第3のステップの後、プレートウェルに付着した付着性腫瘍細胞を検出するか、或いは、分離取得する第4のステップ。
[2]第2のステップで、第1のステップで得た単核球を播種し、インキュベートするための循環腫瘍細胞及び/又は循環腫瘍幹細胞増殖用無血清培地からなる培養液が、AIM−V培養液を基本とする培養液であることを特徴とする前記[1]に記載の生体循環体液中の循環腫瘍細胞及び/又は循環腫瘍幹細胞の検出・分離取得方法。
[3]第2のステップで、第1のステップで得た単核球を播種し、インキュベートするためのAIM−V培養液を基本とする培養液が、AIM−V培養液、或いは、AIM−V培養液に、被験者の自己血清、健常人由来のAB血清及びパルミチン酸又はその塩から選択される1又は2以上を添加した培養液であることを特徴とする前記[1]又は[2]に記載の生体循環体液中の循環腫瘍細胞及び/又は循環腫瘍幹細胞の検出・分離取得方法。
[4]生体循環体液からの試料が、末梢血からの血液試料であることを特徴とする、前記[1]〜[3]のいずれかに記載の生体循環体液中の循環腫瘍細胞及び/又は循環腫瘍幹細胞の検出・分離取得方法。
[5]第1のステップの生体循環体液からの試料の前処理が、生体循環体液に含まれる液体成分及び非細胞成分の除去であることを特徴とする前記[1]〜[3]のいずれかに記載の生体循環体液中の循環腫瘍細胞及び/又は循環腫瘍幹細胞の検出・分離取得方法。
[6]第2のステップにおけるインキュベートが、37℃、3〜7日間を増殖温度及び増殖期間の基準条件として行われることを特徴とする前記[1]〜[5]のいずれかに記載の生体循環体液中の循環腫瘍細胞及び/又は循環腫瘍幹細胞の検出・分離取得方法。
[7]第2のステップにおけるインキュベートが、5%CO2に調整されたインキュベーター内で行われることを特徴とする前記[6]に記載の生体循環体液中の循環腫瘍細胞及び/又は循環腫瘍幹細胞の検出・分離取得方法。
(1)生体循環体液からの試料を前処理し、単核球相を得る第1のステップ、
(2)ウェルプレートに、CTC及び/又はCTSC増殖用無血清培地からなる培養液を注入したウェルプレートを用意し、第1のステップで得た単核球を播種し、インキュベートする第2のステップ、
(3)第2のステップでインキュベーションして得たプレートウェルから、培養液を除去する第3のステップ、
(4)第3のステップの後、プレートウェルに付着した付着性腫瘍細胞を検出するか、或いは、分離取得する第4のステップ。
(1)接触阻止現象が見られないこと。
(2)軟寒天内コロニー形成能を示すこと(当該方法は、浮遊性細胞に適用する方法である。)
(3)顕微鏡下で細胞の体積に比し異常な染色体の形態と容積が見られること。
(4)継代培養下***回数がヒト正常細胞では限界とされるヘイフリック限界の約50回以上の***能を示すこと、すなわち仮に一週間に2〜3回***するとして約半年間以上の間、継代培養し、永久増殖能・不死化を示すこと。
(遺伝学的、血清学的には)
(5)すでに判明しているがん幹細胞CTSCの細胞表面マーカーであるCD44、CD45、CD47、CKII、EpCAM等、抗原を単独或いは複数有すること。
(6)当該細胞の培養液中に、頭径部・食道扁平上皮がんではSCC、肺がんではCA125、乳がんではCA15−3、肺がんではAFP、CEA、すい臓がんではCEA、CA19−9、大腸がんではCA19−9など、一般的に腫瘍マーカーとされる24種類のマーカーのうち、少なくとも一つ以上が対照群に比べて陽性反応を示すこと。
(7)当該細胞から、TotalRNAを精製し、遺伝子解析にかけ、がん関連遺伝子及びがん幹細胞遺伝子の発現が優位に認められること。
(取得細胞の造腫瘍性を観察するために)
(8)分離・取得したがん細胞のDNAを精製し、NIH3T3細胞に導入するとNIH3T3細胞の接触阻止現象が消失し、形態学的にがん細胞形質を発現することが観察されること。
(9)免疫不全ヌードマウス又はスキッドマウスに当該細胞を移植した時、移植細胞が造腫瘍性を示すこと。更に増殖した組織を再培養するとその組織細胞が増殖すること。
本発明の実施例においては、以下の実験方法にしたがった。すなわち、実験試料(血液提供した各種がん患者からの末梢血)を以下の手順で、すべて無菌的に処理した。なお、あらかじめ、各協力施設からの情報で、HBV、HCVなどの各種ウイルス感染のある場合は、その処理は非感染群とは別個に試験し、医療廃棄物処理専門業者による適正な医療廃棄物処理を実施した。
1.適量の抗凝固剤ヘパリンナトリウム(0.05ml)入りのディスポーザブル30ml採血用注射器を用意し、また、ヘパリンナトリウムの入っていない血清入手用の同30ml採血注射器を用意した。これをL型180°三方活栓の各挿入口に、18、21、24、ゲージ翼状針の適当なものを血管側に結合、採血の準備をした。血液は各々30ml採血し、以下の分離操作を実施した。
2.血清採取は、採血注射筒に針を装着の上、37℃、5%CO2インキュベータ内で、1時間静置処理し、その後4℃、3,000回転(800G)、30分間遠心分離を実施した。上静を自己血清(AS)とし、4℃で冷所保存した。
3.一方、末梢血単核球(PBMCs)分離を目指すヘパリン採血管は、採血後よく採血管をローリングさせ、十分に混和した。その後、同量の(−)PBSを入れ混和、血液粘度を低下させた後、予め用意したファイコール・アイソパーク(F/I)密度勾配遠心分離剤を5ml注入した15mlチューブに各5mlずつF/Iに混和しないように、ゆっくりとF/I上面に注ぎ、静置した。これを、4℃、3,000回転(1710G)で、30分遠心分離し、F/Iと血漿との境界に単核球層を得た。これからPBMCsを吸引採取し、(−)PBSを加えたのち、4℃、1200回転(270G)、15分間遠心分離を実施した。これを二度繰り返し、上静を除去後、予定した実験条件に適合する培養液(RPMI−1640、AIM−V)を加え、以下の実験に使用した。
4.得られたPBMCsを、I×104/100μlとなるように調整し、96穴プレート(BDFalcon社製、96 Well, Clear, Tissue Culture Treated Plate, Flat Bottom)、又は、384穴プレート(BD Falcon社製、384 Well, Clear, Tissue Culture Treated Plate, Flat Bottom)の各ウェルに実験計画に基き実験条件の1グループ3ウェルとし、1×104/100μl(/well / 96 well plate or 1x104/25μl/well/384 well plate )ずつ注入し、細胞の播種を終えた。培養液単独の場合は、そのウェルに更に100μlの当該培養液を注入し、5%ASのグループ、又は各種添加薬剤(LPS、IL−1α、IL−1β、パルミチン酸(Palmitic Acid))の使用グループに関しては、計画に従って濃度の配分が行われるように、100μlの溶液をそれぞれ用意し、注入した。全培養液量を200μl/ウェルとして、37℃、5%CO2条件下のインキュベーターに、所定時間、静置培養し、実験を開始した。
5.培養開始1週間後、各ウェルから培養液を吸引除去し、そこに(−)PBSを100μlずつ注入し、よくウェル内を洗浄した後、廃棄し、この操作を二度繰り返した。その後、再度(−)PBSを100μl注入し、顕微鏡にて各ウェル中の付着性細胞をその形態学的特徴(大きさ、形状、細胞内顆粒の存在様式など)から正常PBMCsを分別し、算出した。
1グループ3ウェルの細胞数を算出後、その平均値と標準誤差(Average± SE)を算出した。[これらの実験は、約2年間にわたり、同一患者等において複数回実施し、病期(Stage I〜IV)や病状(悪化、改善傾向)の変化にもかかわらず、がんが存在している限り、それらデータで、取得CTCs数の減少がみられるものの、常に全体として、薬剤に対する反応としては再現性を持ち、同一傾向を示すことを確認し、正式データとして採用した。(各種データ参照)もちろん、がんが治癒したとみなされる段階の患者においては、この処理による付着性がん細胞の検出は、1個以下になることも判明した。また、健常人と考えられるものからは、該付着性細胞は検出されなかった。]
6.あらかじめ当該処理により得られた付着細胞をCTC(CTSC)の表面抗源とされるCD44、CD45、CD47、CKII、EpCAMなどの特異抗体で結合させ、その後FITC結合合二次抗体で染色し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、当該処理で取得した付着性細胞が、CTC(CTSC)であることを実証した(染色像参照)。
7.各種培養条件を設定し、使用薬剤のCTC(CTSC)誘導効果について検討した。使用した各種薬剤濃度などに関しては、結果の表(Table)の中に記載した。
培養液については、CTCの分離取得について、末梢血単核球の標準的培養液であるRPMI−1640培養液(以下、RPMI−1640と記載)を基準に無血清培地AIM−V培養液(以下AIM−Vと記載)と比較した。すなわち、これら培養液にそれぞれ5%の児牛血清(FBS)又は末梢血提供者の自己血清(Autologous Serum:AS)又はAB型血清を添加培養し、それら各培養液間のCTC分離、取得の有無及び効果を検討した。その結果として、CTCの分取にはAIM−Vが有用で、また、AS添加がその効果を増強すること、AB型血清はAS血清より若干効果が減弱することなどを実証した。
更に、上記培養液の結果を基礎に、自己血清採取による患者負担の増加を回避し、尚かつ被験者の病状毎の血清成分の変動の影響を排除し、真に担癌患者血清でないのか否かが判然としないなど、AB型血清の持つ本質的不安定性を除去するため、新たなCTC分離取得因子としてパルミチン酸(Palmitic Acid)を含む各種添加成分(LPS、ConA、PHA、IL−1α、IL−1β)の候補を検討し、最も安全かつ効率の良い因子の探索を実施した。この検討経過で、LPSにもCTC誘導効果は若干観察されることもあったが、LPSは極めて強い毒性を持つ物質であるから、CTC分離後の各種研究、臨床応用の技術開発という目的から鑑みれば、試薬としては安全上不適切であると判断し以後の実験では、除外することにした。結果として、CTCの安定した分取には、AIM−V培養液とパルミチン酸(Palmitic Acid)添加が、最良の結果を得ることを確認した。
8.本発明の実験において、供試試料は、病院から提供された、舌癌、下顎悪性腫瘍、悪性リンパ腫、乳がん、肺がん、胃がん、前立腺がん、子宮肉腫などの末期がん患者から提供された試料を、供試試料として用いた。
供試培養液として、以下の培養液を用意し、用いた。
(1)RPMI−1640+5%FBS
(2)RPMI−1640+5%Auto Serum(自己血清)
(3)AIM−V(無血清培地単独)
(4)AIM−V+5%FBS
(5)AIM−V+5%Auto Serum(自己血清)
上記培養液を用い、実施例1に記載の実験方法に従って、各培養液におけるがん細胞(CTC)取得効率(がん細胞検出精度)について試験した。
培養液として、RPMI−1640を用い、これを共通の培養液として、該培養液を子牛血清(FBS)添加群と、自己血清(Auto Serum)添加群とに分け、がん患者6名より採取した試料につき、そのCTC誘導能の有無を検討した。
結果を、表1に示す。表に示されるように、RPMI−1640培養液では、自己血清添加群とFBS添加群間でのがん細胞取得効率に顕著な差は見られず、いずれも取得効率は低かった。
培養液として、RPMI−1640にパルミチン酸(Plmitic Acid)を添加したものを使用し、これを共通の培養液として、該培養液を子牛血清(FBS)添加群と、自己血清(Auto Serum)添加群とに分け、がん患者6名より採取した試料につき、そのCTC誘導能の有無を検討した。
結果を、表2に示す。表に示されるように、RPMI−1640培養液にパルミチン酸(Plmitic Acid)を添加したものでは、自己血清添加群とFBS添加群との間で、(*)を除き、がん細胞取得効率に顕著な差は見られず、両方とも取得効率は低かった。
RPMI−1640培養液と、AIM−V培養液との間でのCTC誘導能の有無を比較検討した。RPMI−1640については、子牛血清(FBS)添加群と、自己血清(Auto Serum)添加群との2群に分けて、がん患者6名より採取した試料につき、そのCTC誘導能の有無を検討した。
結果を、表3に示す。表に示されるように、AIM−V培養液は、血清なしの単味で、子牛血清(FBS) 又は自己血清(Auto Serum)を添加したRPMI−1640培養液のいずれの培養液に比較して、高いがん細胞取得効率を示した。
AIM−V培養液に子牛血清(FBS)を添加した条件でのCTC誘導能の有無を検討した。
結果を、表4に示す。表に示されるように、AIM−V培養液に子牛血清(FBS)を添加した群では、高いがん細胞取得効率を示したが、患者ソース間で、がん細胞取得効率に大きな違いが認められた。
AIM−V培養液に子牛血清(FBS)を添加した培養液を共通とし、該培養液にパルミチン酸(Plmitic Acid)添加群を作成し、パルミチン酸(Plmitic Acid)非添加群との間で、CTC誘導能を比較検討した。
結果を、表5に示す。表に示されるように、パルミチン酸(Plmitic Acid)非添加群では、試験4の場合と同様、患者間で、CTC取得効率の相違がみられたが、パルミチン酸(Plmitic Acid)非添加群で、CTC取得効率の悪かった患者ソースにおいても、パルミチン酸(Plmitic Acid)添加により(群)、CTC取得効率の改善、増強が認められた。
AIM−V培養液単独の群と、AIM−Vに患者の自己血清(Auto Serum)を添加した群を用意し、両培養液間のCTC誘導能の比較検討を行った。
結果を、表6に示す。表に示されるように、AIM−Vに患者の自己血清(Auto Serum)を添加した群では、(*)の場合を除き、大部分の患者ソースにおいて、CTC取得効率は向上した。いずれの場合も高いCTC取得効率が認められた。
AIM−V培養液に患者自己血清(Auto Serum)を添加した培養液を共通培養液とし、該培養液にパルミチン酸(Plmitic Acid)添加群を作成し、パルミチン酸(Plmitic Acid)非添加群との間で、CTC誘導能を比較検討した。
結果を、表7に示す。表に示されるように、AIM−V培養液に患者自己血清(Auto Serum)を添加した培養液の群に、パルミチン酸(Plmitic Acid)を添加した群と添加しなかった非添加群との間で、CTC取得効率において、対照的な二つの傾向が示された。すなわち、パルミチン酸非添加でCTC取得効率の高かった患者ソースでは、パルミチン酸(Plmitic Acid)添加で低下傾向を示した。一方、パルミチン酸非添加でCTC取得効率の低かった患者ソースでは、パルミチン酸(Plmitic Acid)添加でCTC取得効率の上昇が認められた。
上記試験1及び試験2で検討した、AIM−V培養液及びRPMI−1640培養液を用いたCTC取得試験で得られたものを蛍光顕微鏡で観察した結果(写真)を、図1に示す。図(1−a)は、AIM−V培養液を用いたCTC取得の結果を、図(1−b)は、RPMI−1640培養液を用いた場合のCTC取得の結果を示す。AIM−V培養液を用いた場合には、多数のCTC細胞が認められ、CTC誘導能が示されたが、RPMI−1640培養液を用いた場合には、CTC細胞は、認められなかった。
以上の試験結果から、以下の結論が得られた。
(i)RPMI−1640単独、及びRPMI−1640+5%Auto Serum(自己血清)添加の両グループでは、播種した末梢血由来単核球(PBMC)数(I×104/Well)の0.1%以上の単位で、CTCの誘導・分離・取得はできなかった。
(ii)AIM−V単独では、播種した末梢血由来単核球(PBMC)の0.1〜0.2%の範囲で、CTCの誘導・分離・取得ができた。
(iii)AIM−V+5%Auto Serum(自己血清)添加グループでは、CTC取得率が、2.2〜2.7%へと、AIM−V単独の場合の14倍から20倍へと増加した。
(iv)AIM−Vに50%の割合で、RPMI−1640を加えると、CTC取得率が、RPMI−1640+5%Auto Serum(自己血清)添加のグループと同一%へと低下した。
(v)上記(iv)の傾向は、RPMI−1640の25%添加、RPMI−1640の12.5%添加でも同様で、CTCの取得効果上昇は観察されなかった。
この試験結果から、CTCの誘導・分離・取得に用いる培養液として、AIM−Vが有用であり、該培養液にAuto Serum(AS)を添加することにより、CTC取得効果を高めることができることが確認された。
供試培養液として、以下の培養液を用意し、用いた。
(1)AIM−V(無血清培地)
(2)AS(Auto Serum:自己血清)
(3)LPS(Lipopolysaccharide)
(4)IL−1α(Interleukin 1 α)
(5)IL−1β(Interleukin 1 β)
(6)Palmitic Acid
上記培養液を用い、実施例1に記載の実験方法に従って、用意したがん患者末梢血単核球(PBMCs)を各ウェルに播種し、各培養液におけるがん細胞(CTC)取得効率(がん細胞検出精度)における、添加物の影響について試験した。
AIM−V培養液(AIM−V:Group A)を基本とし、そこにAS(自己血清)を添加したグループ(AIM−V+AS:Group B)、更に、これらのグループにLPS(Lipopolysaccharide)を基本濃度を1conc. (Group E, F)とし、0.1conc.〜100conc.の濃度をそれぞれ添加した各グループ(Group GH, GD)を作成した。そして、それらのグループ間でのCTC分取効果を検討した。
結果を、表8に示す。表に示されるように、AIM−V培養液にLPSを添加したグループでは、LPSの添加量が少ないグループで、AIM−V単独より効果はみられたが、AIM−V+ASグループのLPS添加群では、どのLPS濃度添加グループでも、CTC分取効率は激減した。
AIM−V培養液(AIM−V:Group A)を基本とし、そこにAS(自己血清)を添加したグループ(AIM−V+AS:Group B)、更に、これらのグループにIL−1α(Interleukin 1α)を基本濃度を1conc. (Group E, F)とし、0.1conc.〜100conc.の濃度をそれぞれ添加した各グループ(Group GH, GD)を作成した。そして、それらのグループ間でのCTC分取効果を検討した。
結果を、表9に示す。表に示されるように、AIM−V培養液にIL−1αを添加したグループでは、IL−1αの添加量の多賓に無関係にAIM−V単独と同等か、それ以下の効果しか認められなかった(Group C, E, G)。AIM−V+ASグループのIL−1α添加群では、どのIL−1α濃度添加グループでも、非添加群よりCTC取得効率は減少した。
AIM−V培養液(AIM−V:Group A)を基本とし、そこにAS(自己血清)を添加したグループ(AIM−V+AS:Group B)、更に、これらのグループにIL−1β(Interleukin 1β)を基本濃度を1conc. (Group E, F)とし、0.1conc.〜100conc.の濃度をそれぞれ添加した各グループ(Group GH, GD)を作成した。そして、それらのグループ間でのCTC分取効果を検討した。
結果を、表10に示す。表に示されるように、AIM−V培養液にIL−1βを添加したグループでは、IL−1βの添加量に応じて、AIM−V単独と同等か、わずかに上回る程度の効果しか認められなかった(Group C, E, G)。AIM−V+ASグループのIL−1β添加群では、どのIL−1β濃度添加グループでも、非添加群と同等程度のCTC取得効率しか認められなかった。
AIM−V培養液(AIM−V:Group A)を基本とし、そこにAS(自己血清)を添加したグループ(AIM−V+AS:Group B)、更に、これらのグループにPalmitic Acid を基本濃度を1conc. (Group G, H)とし、0.25conc.〜4conc.の濃度をそれぞれ添加した各グループ(Group KL, IJ, GH, EF, CD)を作成した。そして、それらのグループ間でのCTC分取効果を検討した。
結果を、表11に示す。表に示されるように、AIM−V培養液にPalmitic Acid を添加したグループでは、Palmitic Acid の添加量にほぼ無関係に、非添加群に比し2〜3倍のCTC取得効率の上昇が確認された(Group C, E, G, I, K)。AIM−V+ASグループのPalmitic Acid添加群では、どのPalmitic Acid濃度添加グループでも、濃度依存性は見られず、非添加群と同程度かそれ以下のCTC取得効率しか認められなかった。
以上の試験結果から、次の結論が得られた:AIM−V培養液に添加成分を添加することにより、CTC取得効果を高めることを検討し、新たなCTC分離取得因子としてパルミチン酸(Palmitic Acid)を含む各種添加成分(LPS、ConA、PHA、IL−1α、IL−1β)の候補を検討し、最も安全かつ効率の良い因子の探索を実施した結果、結果として、CTCの安定した分取には、AIM−V培養液にパルミチン酸(Palmitic Acid)を添加することが、最良の結果を得ることを確認した。なお、この検討経過で、LPSにもCTC誘導効果は若干観察されることもあったが、LPSは極めて強い毒性を持つ物質であるから、CTC分離後の各種研究、臨床応用の技術開発という目的から鑑みれば、試薬としては安全上不適切であると判断し、以後の実験では、除外することにした。
実施例1の試験方法により、実施例2でCTC増殖用培養液を用いて取得されたがん細胞(CTC)の形態変化について、顕微鏡画像により検証した。顕微鏡写真を図2〜7に示す。各図中、(図−a)、(図−b)は、CTC細胞増殖実験における培養条件、すなわち、増殖用培養液と血清、又はパルミチン酸等の因子の有無や濃度などによる培養条件によるCTCの形態的な特徴を、異なる患者のCTCについて検討した結果(異なる患者からのがん細胞(CTC)の顕微鏡写真)を示す。該実験は、各増殖条件の違いによるCTC細胞の形態的相違発現の有無を検討することを目的とし、(a)、(b)は、異なる患者由来について、異なる患者由来であっても、同一培養条件では、同一の細胞形態を示すことを検証するためのものである。
AIM−V培養液単独で培養・取得したCTCの蛍光顕微鏡画像を図2(2−a;2−b)に示す。AIM−V培養液単独で培養・取得したCTCの細胞形態において、細胞質内の核や顆粒成分に特に大きさの異常や濃染した部分は見当たらない。
AIM−V培養液+Palmitic Acid(×1濃度)を添加培養し、取得したCTCの蛍光顕微鏡画像を図3(3−a;3−b)に示す。AIM−V培養液+Palmitic Acid(×1濃度)を添加培養・取得したCTCの細胞形態において、細胞質内の核や顆粒成分に、Palmitic Acid非添加群の場合に比べて、やや核成分の増加がみられるものの、特に大きさの拡大や濃染した部分は見られなかった。
AIM−V培養液+Palmitic Acid(×4濃度)を添加培養し、取得したCTCの蛍光顕微鏡画像を図4(4−a;4−b)に示す。AIM−V培養液+Palmitic Acid(×4濃度)を添加培養・取得したCTCの細胞形態において、細胞の大きさの拡大、融合傾向がみられ(図4−b)、細胞質内の核や顆粒成分に、Palmitic Acid非添加群(図2−a;2−b)や、(×1濃度)添加群(図3−a;3−b)の場合に比べて、核成分や細胞質内の核や顆粒成分の顕著な増加や濃染が観察される。
AIM−V+5%Auto Serum培養液にて培養し、取得したCTCの蛍光顕微鏡画像を図5(5−a;5−b)に示す。AIM−V+5%Auto Serum培養液にて培養し、取得したCTCの細胞形態において、細胞、細胞質内の核や顆粒成分に特に大きさの異常や濃染した部分は見られない。
AIM−V+5%Auto Serum+Palmitic Acid(×1濃度)培養液にて培養し、取得したCTCの蛍光顕微鏡画像を図6(6−a;6−b)に示す。AIM−V+5%Auto Serum+Palmitic Acid(×1濃度)培養液にて培養し、取得したCTCの細胞形態において、細胞、細胞質内の核や顆粒成分に特に大きさの異常や濃染した部分は見られない。
AIM−V+5%Auto Serum+Palmitic Acid(×4濃度)培養液にて培養し、取得したCTCの蛍光顕微鏡画像を図7(7−a;7−b)に示す。AIM−V+5%Auto Serum+Palmitic Acid(×4濃度)培養液にて培養し、取得したCTCの細胞形態において、細胞の大きさの拡大、融合傾向がみられ(図7−a)、細胞質内の核や顆粒成分にPalmitic Acid非添加群(図5−a;5−b)や、×1濃度添加群(図6−a;6−b)に比べて、核成分や細胞質内顆粒成分の顕著な増加や濃染が観察される。該形態変化は、Palmitic Acid(×4濃度)培養液の条件下で、CTC細胞の増殖・活性化により、核の異常増殖と細胞内小器官、エネルギー産生の主役であるミトコンドリア等を増加させると考えられ、その結果、顕微鏡像では、核酸や細胞内顆粒が増加し、核や細胞質が光の透過性を一層妨げ、濃染した状態が観察されると考えられる。
以上のCTC(CTSC)の形態変化の試験結果から、次の結論が得られた:AIM−V培養液或いは、該培養液にAuto Serum及び/又はPalmitic Acidのような添加成分を添加した、CTC増殖培養液を用いて、CTCを増殖取得することによりCTCを確実かつ効果的に取得することができ、その際に、CTCの細胞形態には形態変化を起こさずに、増殖取得することが可能であることが確認された。すなわち、CTC(CTSC)を増殖、取得する場合には、取得した細胞の形態には人工的変化を誘導しないことが、CTCの性質や特性を確認するために重要となり、したがって、CTCの形態や性状に特段の変化を誘導しない条件で、かつ、安定的にCTCを増殖、取得できる方法であることが求められる。上記実験結果からは、該条件を満たしつつ、確実にCTC(CTSC)を増殖、取得することができる方法であることが確認された。
以下の実施例に示されるとおり、各患者末梢血から分離取得したCTCについて、膜表面のCD44、CD45、CD47、CKII、EpCAMの各抗原を用いて、蛍光抗体染色法により、確認及び同定を行った。各試験における結果の各図の写真において、各(図−a)は、CTCの顕微鏡による写真の像を、各(図−b)は、膜表面抗原を用いて染色した蛍光顕微鏡による写真像を示す。
抗原染色の方法は、FITC(fluorescein isothiocyanate) labelによる、以下の手順に従って、試料を調製し、染色、検鏡、観察・写真撮影した。
(1)付着細胞の酵素処理。(非付着細胞は(4)から開始する。)
(2)Trypsin EDTA処理。
(3)シングル細胞群に、5%FBS添加RPMI medium添加、酵素反応停止、吸引。
(4)遠心分離(1200〜1500回転、4℃、7分)。
(5)4℃保冷下(−)PBSで洗浄・ボルテックス、遠心×2回。
(6)細胞数の計測・分注:1×106/100μl/TUBE。
(7)細胞の各チューブの周囲を遮光のためにアルミホイールで覆い、4℃保冷下に30分放置し、細胞の代謝活動を低下させる(表面抗原の細胞膜内外への運動・移動の阻止)。
(8)抗体の添加:1μg/2μl/1×106spin down cells(medium除去細胞群)4℃保冷下・遮光下で1時間染色。
(9)4℃保冷下、(−)PBSで洗浄・ボルテックス、遠心×2回:遠心分離(1200〜1500回転、4℃、7分)。
(10)適量の(−)PBSを細胞に加え、スライドグラス又はプレートに添加し、検鏡する。
(11)蛍光顕微鏡にて観察・写真撮影。
(1)付着細胞の酵素処理。(非付着細胞は(4)から開始する。)
(2)Trypsin EDTA処理。
(3)シングル細胞群に、5%FBS添加RPMI medium添加、酵素反応停止、吸引。
(4)遠心分離(1200〜1500回転、4℃、7分)。
(5)4℃保冷下(−)PBSで洗浄・ボルテックス、遠心×2回。
(6)細胞数の計測・分注:1×106/100μl/TUBE。
(7)細胞の各チューブの周囲を遮光のためにアルミホイールで覆い、4℃保冷下に30分放置し、細胞の代謝活動を低下させる(表面抗原の細胞膜内外への運動・移動の阻止)。
(8)一次抗体の添加:1μg/2μl/1×106spin down cells(medium除去細胞群)4℃保冷下・遮光下で1時間染色。
(9)4℃保冷下、(−)PBSで洗浄・ボルテックス、遠心×2回:遠心分離(1200〜1500回転、4℃、7分)。
(10)二次抗体の添加:1μg/2μl/1×106spin down cells(medium除去細胞群)4℃保冷下・遮光下で1時間染色。
(11)4℃保冷下、(−)PBSで洗浄・ボルテックス、遠心×2回:遠心分離(1200〜1500回転、4℃、7分)。
(12)適量の(−)PBSを細胞に加え、スライドグラス又はプレートに添加し、検鏡する。
(13)蛍光顕微鏡にて観察・写真撮影。
実施例1の方法により、各患者の末梢血から取得したCTCについて、膜抗原CD44を用いて、該CTCの確認及び同定を行った。
3人の患者:(1)K.H.(Gastric Ca. :胃がん:liver meta.肝転移)、(2)T.K.(Tongue Ca. 舌がん)、(3)K.H.(Gastric Ca. :胃がん:liver meta.肝転移)の末梢血から取得した、CTCの顕微鏡写真の像と、膜抗原CD44を用いた蛍光抗体顕微鏡の写真を図8〜10に示す。(図8−a〜10−a)は顕微鏡写真の像を、(図8−b〜10−b)は、蛍光抗体顕微鏡の写真を示す。写真に示されるように、上記(1)〜(3)の患者から取得されたCTCは、CD44による染色は示されなかった。
3人の患者:(1)T.K.(Tongue Ca. 舌がん)、(2)S.K.(Kerato-cystic Ca. 角化嚢胞がん)(3)S.O.(Lung Ca. 肺がん)の末梢血から取得した、CTCの顕微鏡写真の像と、膜抗原CD44を用いた蛍光抗体顕微鏡の写真を図11〜13に示す。(図12−a〜13−a)は顕微鏡写真の像を、(図12−b〜13−b)は、蛍光抗体顕微鏡の写真を示す。写真(図12〜13)に示されるように、上記(2)〜(3)の患者から取得されたCTCは、CD44による染色が示され、顕微鏡写真の像と、蛍光抗体顕微鏡の写真とが、一致し、取得したCTCが上記がんのCTCであることが確認された。
2人の患者:(1)H.Y.(Breast Ca. 乳がん)、(2)Y.H.(Lung Ca. 肺がん)の末梢血から取得した、CTCの顕微鏡写真の像と、膜抗原CD44を用いた蛍光抗体顕微鏡の写真を図14〜15に示す。(図14−a〜15−a)は顕微鏡写真の像を、(図14−b〜15−b)は、蛍光抗体顕微鏡の写真を示す。写真(図14〜15)に示されるように、上記(1)〜(2)の患者から取得されたCTCは、CD44による染色が示され、顕微鏡写真の像と、蛍光抗体顕微鏡の写真とが、一致し、取得したCTCが上記がんのCTCであることが確認された。
実施例1の方法により、各患者の末梢血から取得したCTCについて、膜抗原CD45を用いて、該CTCの確認及び同定を行った。
実施例1の方法により、各患者の末梢血から取得したCTCについて、膜抗原CD47を用いて、該CTCの確認及び同定を行った。
実施例1の方法により、各患者の末梢血から取得したCTCについて、膜抗原CKIIを用いて、該CTCの確認及び同定を行った。
実施例1の方法により、各患者の末梢血から取得したCTCについて、膜抗原EpCAMを用いて、該CTCの確認及び同定を行った。
実施例1の方法により、患者の末梢血から取得したCTCが、CTC細胞機能を保持するか否かを検討するために、該取得したCTCの造腫瘍性又は長期生存の確認を行った。
患者H.Y.(Breast Ca. 乳がん)からの試料から分離したCTC:CTC−HY−1(HY−1)と、患者K.H.(Gastric Ca. :胃がん:liver meta.肝転移) から分離したCTC:CTC−KH−1(KH−1)、を「実験群A」と、「実験群B」の二つの実験群に分け、以下のとおり、患者から増殖分離採取したCTCを移植した。
(実験群A):2匹のヌードマウス(Nude1-1;Nude1-2)に対して、「Nude1-1」には、CTC(HY−1)を、「Nude1-2」には、CTC(KH−1)をヌードマウスの背部皮下に1×106移植し、全観察期間三か月間造腫瘍性有無を検討した。期間後、当該ヌードマウスの末梢血と脾臓を採取し、CTCの分離、培養を実施した。増殖しているCTC移植群に残存している細胞につき、生残存が移植したCTCであることを、非蛍光発光増(Control)及び膜表面CD45抗原を用いた蛍光抗体法にて、染色検討し、CTC の残存を確認した。
(実験群B):2匹のヌードマウス(Nude2-1;Nude2-2)に対して、「Nude2-1」には、CTC(HY−1)を、「Nude2-2」には、CTC(KH−1)をヌードマウスの背部皮下に1×106移植し、同量の細胞を腹腔内にも移植した。実験群Aの場合と同様に、増殖しているCTC移植群に残存している細胞につき、生残存が移植したCTCであることを確認した。
CTC移植群に残存している細胞の顕微鏡写真(非蛍光発光像)の像と、膜抗原CD45を用いた蛍光抗体顕微鏡(蛍光発光像)の写真を図27〜30に示す。図中、(27−a)、(27−b)は、CTC(HY−1)を「Nude1-1」に移植した場合のCTC移植群に残存している細胞の顕微鏡写真(Control)、及び、蛍光抗体顕微鏡(蛍光発光像)の写真を、(28−a)、(28−b)は、CTC(KH−1)を「Nude1-2」に移植した場合のCTC移植群に残存している細胞の顕微鏡写真(Control)、及び、蛍光抗体顕微鏡(蛍光発光像)の写真を示す。図中、(29−a)、(29−b)は、CTC(HY−1)を「Nude2-1」に移植した場合のCTC移植群に残存している細胞の顕微鏡写真(Control)、及び、蛍光抗体顕微鏡(蛍光発光像)の写真を、(30−a)、(30−b)は、CTC(KH−1)を「Nude2-2」に移植した場合のCTC移植群に残存している細胞の顕微鏡写真(Control)、及び、蛍光抗体顕微鏡(蛍光発光像)の写真を示す。写真(図27〜30)に示されるように、CTC移植群に残存している細胞は、膜抗原CD45による染色が示され、顕微鏡写真の像と一致し、CTC移植群に残存している細胞が上記がんのCTCであることが確認された。参考として、正常小腸組織細胞の顕微鏡写真の像(31−a)と、該細胞のCD45染色による蛍光顕微鏡による写真の像(31−b)を示す。図31のとおり、正常小腸組織細胞においては、CD45による染色は全く示されなかった。
既存の樹立がん細胞株(UTC−8:独立行政法人産業技術総合研究所、特許性物寄託センター寄託番号:FERM BP−08611)を用い、該樹立がん細胞株におけるCD47陽性細胞(CTSC)の検出について試験した。
樹立がん細胞株(UTC−8)を試料として用い、実施例1の方法により、CTC細胞を増殖取得後、細胞膜上のCD47抗原により、該抗原陽性細胞の検出を行った。結果を非蛍光色素染色の顕微鏡像、及び、蛍光色素染色法によるCD47陽性細胞像で表示した。
実施例12の場合と同様に、既存の樹立がん細胞株(UTC−8:FERM BP−08611)を用い、該樹立がん細胞株におけるCD47陽性細胞(CTSC)の検出について再度試験した。
実施例12の場合と同様に、樹立がん細胞株(UTC−8)を試料として用い、実施例1の方法により、CTC細胞を増殖取得後、細胞膜上のCD47抗原により、該抗原陽性細胞の検出を行った。結果を非蛍光色素染色の顕微鏡像、及び、蛍光色素染色法によるCD47陽性細胞像で表示した。
Claims (7)
- 以下の(1)〜(4)の処理ステップを含む、生体循環体液中の循環腫瘍細胞及び/又は循環腫瘍幹細胞の検出・分離取得方法:
(1)生体循環体液からの試料を前処理し、単核球相を得る第1のステップ、
(2)ウェルプレートに、循環腫瘍細胞及び/又は循環腫瘍幹細胞増殖用無血清培地からなる培養液を注入したウェルプレートを用意し、第1のステップで得た単核球を播種し、インキュベートする第2のステップ、
(3)第2のステップでインキュベーションして得たプレートウェルから、培養液を除去する第3のステップ、
(4)第3のステップの後、プレートウェルに付着した付着性腫瘍細胞を検出するか、或いは、分離取得する第4のステップ。 - 第2のステップで、第1のステップで得た単核球を播種し、インキュベートするための循環腫瘍細胞及び/又は循環腫瘍幹細胞増殖用無血清培地からなる培養液が、AIM−V培養液を基本とする培養液であることを特徴とする請求項1に記載の生体循環体液中の循環腫瘍細胞及び/又は循環腫瘍幹細胞の検出・分離取得方法。
- 第2のステップで、第1のステップで得た単核球を播種し、インキュベートするためのAIM−V培養液を基本とする培養液が、AIM−V培養液、或いは、AIM−V培養液に、被験者の自己血清、健常人由来のAB血清及びパルミチン酸又はその塩から選択される1又は2以上を添加した培養液であることを特徴とする請求項1又は2に記載の生体循環体液中の循環腫瘍細胞及び/又は循環腫瘍幹細胞の検出・分離取得方法。
- 生体循環体液からの試料が、末梢血からの血液試料であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の生体循環体液中の循環腫瘍細胞及び/又は循環腫瘍幹細胞の検出・分離取得方法。
- 第1のステップの生体循環体液からの試料の前処理が、生体循環体液に含まれる液体成分及び非細胞成分の除去であることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の生体循環体液中の循環腫瘍細胞及び/又は循環腫瘍幹細胞の検出・分離取得方法。
- 第2のステップにおけるインキュベートが、37℃、3〜7日間を増殖温度及び増殖期間の基準条件として行われることを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の生体循環体液中の循環腫瘍細胞及び/又は循環腫瘍幹細胞の検出・分離取得方法。
- 第2のステップにおけるインキュベートが、5%CO2に調整されたインキュベーター内で行われることを特徴とする請求項6に記載の生体循環体液中の循環腫瘍細胞及び/又は循環腫瘍幹細胞の検出・分離取得方法。
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