CN1092172A - 用于血液分析的预处理方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于血液分析的预处理方法,包括通过用至
少含有一种表面活性剂的水溶液和一种标记物处理
血样选择性标记白细胞,该表面活性剂从由阳离子表
面活性剂和两性表面活性剂组成的组中选取;使表面
活性剂的水溶液在不会破坏白细胞的整个细胞膜却
足以破坏部分细胞膜的浓度的情况下使用,标记物是
一种能通过被破坏的细胞膜并和白细胞内所含的成
分结合的物质;以及这个处理是在pH值为3.0—
11.0的条件下进行的。
Description
本发明涉及一种对临床检验或细胞研究领域中的特定细胞进行分类和计数的方法。更具体地说,它涉及一种用于标记血液样品中所含白细胞的方法。
一般地说,在对含有多种细胞的生物样品(例如血液和尿)中的某种特定细胞进行测定时,如果细胞的外观(例如大小和形状)彼此明显不同;那么采用通用的透射式光学显微镜就不难将一种细胞同其它细胞分开。例如,因为血液中所含的红细胞、白细胞和血小板在大小和形状上彼此不同,所以可以容易地将它们区分开。
相比之下,对具有彼此相似外形的细胞进行分类却是困难的。例如,属于白细胞亚类的淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性细胞和嗜碱性细胞不易分类。在一般实验室中,可用一种适当的染色溶液染色细胞中所含的成分(例如白细胞中的细胞核、细胞粒、细胞质和胞内酶)根据目测,确定细胞中所含成分的存在,数量以及位置,因此可对这些细胞进行分类和计数。
另外,可利用一种测定细胞体积的装置或一种测定细胞散射光或荧光偏振光装置来代替显微镜。利用这样的装置检测同各个细胞的性质有关的区别信号而对细胞进行分类。如果仅仅用这样的装置不能获得区分信号,那么需要对这些细胞进行适当的处理以便获得细胞之间彼此不同的信号。这样处理的例子包括一种用一适当的细胞溶解剂溶解除了特定待检测细胞之外的细胞的方法或者一种用于检测细胞体积上的区别或散射光、荧光、吸收率等光学差别的方法。为了检测散射光、荧光、吸收率等在光学上的差别,最好使一种适当的标记物例如一种染料与细胞中的至少一种成分结合。
众所周知,细胞中所含的成分被一种称为细胞膜的膜同外界隔离而不渗漏出。然而,细胞膜并不能起同外界完全隔离的作用。相反,细胞生存所必需的一些物质可以渗入细胞内,以及细胞所不需要的废物可以从细胞中***出。细胞膜就这样准确而巧妙地有选择性地允许物质通过。细胞内外的物质通过膜上所提供的允许离子通过的各种不同的沟道并且借助扩散作用通过类脂双层。物质的这种选择运动持续的时间和细胞的存活时间一样长,一旦细胞死亡,这种选择作用就立即消失。根据这些现象,提出一种用于区分活细胞和死细胞称为染料排除试验的方法,在该法中利用一种能够侵入被破坏的细胞而不能侵入没有被破坏的细胞的染料作标记物。这种公知的染料排除试验的一个例子需要利用一种染料(例如锥虫蓝和曙红)。
然而,完成这种公知的方法,始终是困难的,即将一种标记物(例如染料)渗入细胞内是不可能的,因为细胞必然拒绝它们所不需要的物质的侵入,或者需要花费很长时间才有可能完成这个步骤。一般说来,当对细胞染色的时候,要对细胞进行各种不同的固定以抑制细胞的阻止侵入作用或防止细胞变形及细胞中所含成分的渗漏。通常,醛类(例如***和戊二醛)、甲醇和丙酮作固定剂。然而,这些固定剂的使用具有一些缺陷,例如涉及处理中的危险和需要对废水解毒(因为它们具有相当的毒性)以及花费时间长、固定过程繁琐等。
另一方面,一种不用固定即可产生光学差别的方法也是公知的,在该法中,通过抑制细胞膜的选择物质排斥作用促进细胞成分和一般不能通过细胞膜的染料结合。一个公知的例子包括这样一些步骤:用非离子表面活性剂,例如Triton X-100溶解细胞膜和细胞质;再用碘丙非啶和溴乙非啶等染色剩余的细胞核制备试验样品;随后通过流动血细胞计数器、显微分光光度计等测量细胞的荧光并且测量DNA的数量。然而,Triton X-100溶解细胞膜和细胞质的同时对细胞核也有相当程度的破坏,从而使所测定的DNA数据不准确。因此,在该法中必须使细胞核稳定,例如加入一种稳定剂[例如亚胺精(N-(3-氨基丙基)-1,4-丁二胺]或进行任何必要的固定。此外,当细胞核裸露的时候,通过用散射光等精确地将白细胞分成每一个亚类是不可能的。
已知使用两种季铵盐类表面活性剂将白细胞分成两类即单核细胞类和粒细胞类,然后对它们进行分析(例如在W084/03771和W084/02777中所公开的)。然而,表面活性剂的浓度很高,例如一种季铵盐类表面活性剂的浓度高达40-70g/L,而另一种的浓度高达2~7g/L,这样高浓度的表面活性剂可破坏白细胞核并使细胞核裸露,以致于不可能通过测定光学上的差别对白细胞进行分类和计数。
日本待公开专利申请88896/1986描述了一种用于分类和计数属于白细胞类的嗜碱性细胞的方法和试剂,该法利用PH范围限制在1.8-2.3的一种水溶性剂表面活性剂使血液样品产生与嗜碱性细胞有关的光学上的差别。然而,该表面活性剂使用浓度也高达10-20g/L。并且,该方法没有提出使用标记物。
本发明提供了一种血液分析的预处理方法,它包括利用至少含有一种表面活性剂的水溶液和一种标记物质处理血样选择性地标记白细胞,该表面活性剂是从包含阳离子表面活性剂和两性表面活性剂的组中选取的;这个表面活性剂水溶液的使用浓度不会破坏白细胞的整个细胞膜,却足以破坏细胞膜的一部分;标记物是能够通过破坏的细胞膜并与白细胞内所含的一种成分结合的任何物质;处理可在3.0~11.0的PH值下进行。
根据本发明的方法,可以采用未处理的血样以简单的方式只对白细胞选择性标记并且用光学装置对白细胞进行分类和计数。
图1是一个表示用氯化月桂基三甲基铵盐作为表面活性剂处理的血样的侧散射光(SSC)强度和红光荧光(RFL)强度之间关系的散布图。
图2是用氯化月桂基三甲基铵盐作为表面活性剂处理的血样的测散射光的矩形图。
图3是一个表示用月桂基二甲基氨基乙酸内铵盐作为表面活性剂处理的血样的侧散射光(SSC)强度和红光荧光(RFL)强度之间关系的散布图。
图4是用月桂基二甲基氨基乙酸内铵盐作为表面活性剂处理的血样的侧散射光的矩形图。
图5是一个表示用氯化苄基二甲基十六烷基铵盐作为表面活性剂处理的血样的侧散射光(SSC)强度和红光荧光(RFL)强度之间关系的散布图。
图6是用氯化苄基二甲基十六烷铵盐作为表面活性剂处理的侧散射光的矩形图。
图7是一个表示用没有加入非离子表面活性剂处理的血样的侧散射光(SSC)强度和红光荧光(RFL)强度之间关系的散布图。
图8是一个表示用C16H33O-(CH2CH2O)10-H作为非离子表面活性剂处理的血样的侧散射光(SSC)强度和红光荧光(RFL)强度之间关系的散布图。
图9是一个表示用C16H33O-(CH2CH2O)20-H作为非离子表面活性剂处理的血样的侧散射光(SSC)强度和红光荧光(RFL)强度之间关系的散布图。
图10是一个表示用C16H33O-(CH2CH2O)30-H作为非离子表面活性剂处理的血样的侧散射光(SSC)强度和红光荧光(RFL)强度之间关系的散布图。
图11是一个表示用C12H25O-(CH2CH2O)30-H作为非离子表面活性剂处理的血样的侧散射光(SSC)强度和红光荧光(RFL)强度之间关系的散布图。
图12是一个表示用C18H37O-(CH2CH2O)20-H作为非离子表面活性剂处理的血样的侧散射光(SSC)强度和红光荧光(RFL)强度之间关系的散布图。
图13是一个表示用C18H35O-(CH2CH2O)20-H作为非离子表面活性剂处理的血样的侧散射光(SSC)强度和红光荧光(RFL)强度之间关系的散布图。
图14是一个表示用C18H37COO-(CH2CH2O)25-H作为非离子表面活性剂处理的血样的侧散射光(SSC)强度和红光荧光(RFL)强度之间关系的散布图。
图15是一个表示用具有分子结构式为[Chem3]的非离子表面活性剂处理的血样的侧散射光(SSC)强度和红光荧光(RFL)强度之间关系的散布图。
图16是一个表示用具有分子结构式为[Chem4]的非离子表面活性剂处理的血样的侧散射光(SSC)强度和红光荧光(RFL)强度之间关系的散布图。
图17是一个表示用一阳离子表面活性剂并加入乙醇(100mL/L)作为含水醇处理的血样的侧散射光(SSC)强度和红光荧光(RFL)强度之间关系的散布图。
图18是一个表示用一阳离子表面活性剂并加入乙醇(100mL/L)作为含水醇处理的血样的侧散射光矩形图。
图19是一个表示用一阳离子表面活性剂并加入乙醇(100mL/L)作为含水醇处理的血样的侧散射光(SSC)强度和前散射光(FSC)强度之间关系的散布图。图中用侧散射光强度和前散射光强度作为坐标轴。
图20是一个表示用一阳离子表面活性剂并加入乙醇(200mL/L)作为含水醇处理的血样的侧散射光(SSC)强度和红光荧光(RFL)强度之间关系的散布图。
图21是用一阳离子表面活性剂并加入乙醇作为含水醇(200mL/L)处理的血样的侧散射光的矩形图。
图22是一个表示用一阳离子表面活性剂并加入乙醇(200mL/L)作为含水醇处理的血样的侧散射光(SSC)强度和前散射光(FSC)强度之间关系的矩形图。
图23是一个表示用一阳离子表面活性剂并加入乙醇(400mL/L)作为含水醇处理的血样的侧散射光(SSC)强度和红光荧光(RFL)强度之间关系的散布图。
图24是用一阳离子表面活性剂通过加入乙醇(400mL/L)作为含水醇处理的血样的侧散射光的矩形图。
图25是一个表示用一阳离子表面活性剂并加入乙醇(400mL/L)作为含水醇处理的血样的侧散射光(SSC)强度和前散射光(FSC)强度之间关系的散布图。
图26是表示用例4的试剂组合物处理的正常受试者静脉血样的红光荧光(RFL)强度和绿光荧光(GFL)强度之间关系的散布图。
图27是表示用例4的试剂组合物处理的正常受试者静脉血样的侧散射光(SSC)强度和红光荧光(RFL)强度之间关系的散布图。
图28是表示用例4的试剂组合物处理的正常受试者静脉血样的前散射光(FSC)强度和红光荧光(RFL)强度之间关系的散布图。
图29是表示用例4的试剂组合物处理的患急性髓细胞白血病的病人静脉血样的红光荧光(RFL)强度和红光荧光(GFL)强度之间关系的散布图。
图30是表示用例4的试剂组合物处理的患急性髓细胞白血病的病人静脉血样的侧散射光(SSC)强度和红光荧光(RFL)强度之间关系的散布图。
图31是表示用例4的试剂组合物处理的患急性髓细胞白血病的病人静脉血样的前散射光(FSC)强度和红光荧光(RFL)强度之间关系的散布图。
图32是表示用例4的试剂组合物处理的具有畸形淋巴细胞受体的红光荧光(RFL)强度和绿光荧光(GFL)强度之间关系的散布图。
图33是表示用例4的试剂组合物处理的具有畸形淋巴细胞受体的侧散射光(SSC)强度和红光荧光(RFL)强度之间关系的散布图。
图34是表示用例4的试剂组合物处理的具有畸形淋巴细胞受体的前散射光(FSC)强度和红光荧光(RFL)强度之间关系的散布图。
图35是表示用例4的试剂组合物处理的具有成红细胞和未成熟粒细胞受体的红光荧光(RFL)强度和绿光荧光(GFL)强度之间关系的散布图。
图36是表示用例4的试剂组合物处理的具有成红细胞和未成熟粒细胞受体的侧散射光(SSC)强度和红光荧光(RFL)强度之间关系的散布图。
图37是表示用例4的试剂组合物处理的具有成红细胞和未成熟粒细胞受体的前散射光(FSC)强度和红光荧光(RFL)强度之间关系的散布图。
图38是表示用例5的试剂组合物处理的正常受试者的静脉血样的红光荧光(RFL)强度和绿光荧光(GFL)强度之间关系的散布图。
图39是表示用例5的试剂组合物处理的正常受试者的静脉血样的侧散射光(SSC)强度和红光荧光(RFL)强度之间关系的散布图。
图40是表示用例5的试剂组合物处理的正常受试者的静脉血样的侧散射光(SSC)强度和阻抗信号(IMP)之间关系的散布图。
图41是用例5的试剂组合物处理的正常受试者静脉血样的侧散射光的矩形图。
图42是表示用例5的试剂组合物来处理正常受试者静脉血样的侧散射光(SSC)强度和绿光荧光(GFL)强度之间关系的散布图。
图43是表示用例5的试剂组合物处理的正常受试者静脉血样的侧散射光(SSC)强度和前散射光(FSC)强度之间关系的散布图。
图44是表示用参考资料例1的试剂组合物处理的血样的侧散射光(SSC)强度和红光荧光(RFL)强度之间关系的散布图。
图45是用参考资料例1的试剂组合物来处理的血样的侧散射光的矩形图。
图46是表示用参考资料例2的试剂组合物处理的血样的侧散射光(SSC)强度和红光荧光(RFL)强度之间关系的散布图。
图47是用参考资料例2的试剂组合物来处理的血样的侧散射光的矩形图。
用于本发明血液分析预处理方法的血样是指从人类和动物血液中取得的样品并且可以是骨髓液。血样必须含有白细胞。然而在某些情况下,可以使用已除去红细胞和血小板的样品。根据本发明的方法,通过处理全血样品能够选择性地分类和计数白细胞,而不用除去红细胞和血小板。在应用此方法之前通常用抗凝剂来处理血样。
在本发明中,水溶液至少含有一种从由阳离子表面活性剂和两性表面活性剂组成的组中选取的表面活性剂。本发明的水溶液最好含有溶于含水溶液(最好是水)的表面活性剂。
阳离子表面活性剂的优选例子是季铵盐类表面活性剂或吡啶鎓类表面活性剂。具体地说,季铵盐类表面活性剂用分子结构式(Ⅰ)表示:
其中R1R2R3分别为氢原子、C1-C8烷基或C6-C8芳烷基;R4是C8-C18烷基、C8-C18链烯基或C6-C18芳烷基;且X是阴离子。R1R2R3所意指的C1-C8烷基或C6-C8芳烷基的优选例子是辛基、庚基、己基和卞基,其中C1-C3烷基例如甲基和乙基更优选。R4意指的C8-C18烷基、C8-C18链烯基或C6-C18芳烷基的优选例子是辛基、癸基、十二烷基、十四烷基和苄基。
吡啶鎓类表面活性剂用分子结构式(Ⅱ)表示:
其中R5是C8-C18烷基以及X是阴离子。R5意指的C8-C18烷基的优选例子是C10-C18,直链烷基例如癸基、十二烷基和十四烷基。这些阳离子表面活性剂的具体例子是氯化月桂基三甲基铵盐、氯化十四烷基三甲基铵盐、氯化十六烷基二甲基乙基铵盐以及氯化苄基二甲基十六烷基铵盐。
两性表面活性剂包括具有分子结构式(Ⅲ)的内铵盐类表面活性剂:
其中R1、R2各自为氢原子、C1-C8烷基或C6-C18芳烷基;R4为C8-C18烷基、C8-C18链烯基以及C6-C18芳烷基;n是1或2。内铵盐类表面活性剂的具体例子包括月桂基三甲基氨基乙酸内铵盐以及十八烷基二甲基氨基乙酸内铵盐。
在本发明中,含有阳离子或两性表面活性剂的水溶液的使用浓度不会破坏白细胞的整个细胞膜却足以破坏局部细胞膜。最好在大约30~5000mg/L的范围内使用表面活性剂,优选的是大约50~2000mg/L,更优选的是大约50~1500mg/L。
如果使用过量的表面活性剂,那么一些标记物的标记作用就会被表面活性剂所抑制。而且所含的超过上限的高浓度的表面活性剂作用在细胞上并使细胞核裸露以致于用散射光几乎测不出光学上的差别。表面活性剂的水溶液最好在与血样的体积比为2-200的范围内使用。用表面活性剂溶液将血样稀释得太稀是不可取的,因为除白细胞之外的血液成分,例如红细胞不能被溶解,因此使得测定难于进行。
在本发明中,所用的标记物是能够通过白细胞的被破坏的细胞膜并与其中所含的成分结合的任何物质。例如当利用流动血细胞计数器测量一般的荧光和散射光,最好使用荧光染料。如果用流动血细胞计数器测定吸收率,那么可以用除荧光染料之外的染料。另外,也可以优选地使用能和细胞成分反应生成染料的物质。这些标记物质在与流动血细胞计数器有关的出版物中已给出。
在本说明书中,术语“与细胞成分结合”意指细胞成分与标记物之间的离子键合或细胞中所含的蛋白质(氨基)与标记之间的共价键合。
作为能和细胞核(DNA)结合的标记物的例子,溴乙非啶(EB)和碘丙非啶(PI)是公知的。另外,大部分碱性染料能用于染色细胞核。能与RNA结合。例子包括派诺宁Y、吖啶橙、TiazoLe Orange、10-12烷基溴化物以及槐黄-0。能与细胞中的蛋白质(氨基)结合的标记物的其它例子,包括荧光素异硫氰酸盐(FITC)以及7-氯-4-硝基苯并噁唑(NBD-CI)
如上所述,也可以使用除了那些通常用于流动血细胞计数器之外的染料。例如,也可以使用通常用于测定细胞膜电位的染料(例如3,3′-二已基氧杂羰花青[DioC6(3)],因为这样的染料可以很容易地通过细胞膜而染色细胞中所含的成分(例如细胞粒)。
本发明通过染色被处理的细胞展示了有区别的染色,它不同于染色正常活细胞或固定细胞所展示的染色。因此,本发明也可以用于开发那些已经用于不是为了分类和计数白细胞而染色细胞的染料的用途,或探讨尚未用于染色细胞的染料的使用可能性。
标记物以1-500mg/L的浓度加入,最好是大约1-200mg/L。
作为本发明的应用例子,通过用阳离子或两性表面活性剂处理区分有核和无核细胞,随后用能与细胞核(DNA)结合的标记物例如DNA探针(碘丙非啶和溴非乙啶)染色。另外,如果使用能测荧光或散射光的流动血细胞计数器,那么用荧光碱性染料作为标记物是适合的。
在本发明中,当表面活性剂和标记物作用在血样上时,溶液的pH范围,最好调节在3.0~11.0,更优选的是4.0~11.0。如果用侧散射光检测嗜酸性细胞,那么pH值最好在5.0~11.0。另外,如果标记物与细胞成分之间键合的形成或表面活性剂对细胞的作用取决于pH值,那么为了维持所要求的pH值,可以加入适当的缓冲剂。
用表面活性剂和标记物处理血样的方法并设有具体地限定所采用的公知的方法中的步骤。例如,使含有表面活性剂和标记物的试剂的水溶液和用抗凝剂预处理的血样混合。在这种情况中,试剂水溶液的pH值可以通过加入一种缓冲剂调节到上述范围。可以将缓冲剂同时加到反应***中。本发明的方法通常在室温至稍高的温度(例如大约10-50℃)下进行。基于本发明方法的反应,通常进行得非常快,例如在5-30秒内即可完成。因此,可以发现本发明适于用高速自动分析装置分类和计数白细胞。
在本发明,非离子表面活性剂可以加到阳离子或两性表面活性剂和标记物试剂的水溶液中。非离子表面活性剂最好含有至少一种从分子式为R6-R7-(CH2CH2O)n-H的聚氧乙烯乙二醇类试剂中选择的物质。其中R6是C8-C22烷基或C8-C22链烯基,R7是-0-,-COO-或-
-0-以及n是10或10以上的整数。
这种非离子表面活性剂在经济上具有价格低的优点。其中n(加成摩尔数)为10以上的非离子表面活性剂,因为其水溶性和细胞毒性小而尤其可取。聚氧乙烯乙二醇表面活性剂的具体例子是聚氧乙烯乙二醇壬基苄基醚的20摩尔加成产物,聚氧乙烯乙二醇十六烷基醚的30摩尔加成产物以及聚氧乙烯乙二醇油醚的20摩尔级成产物。而且,也可以使用不属于以上提到的聚氧乙烯乙二醇类的其它非离子表面活性剂即那些HLB(亲水亲油平衡)值为13以上的表面活性剂例如吐温类(聚氧乙烯脱水山梨醇烷基化物)。
上述非离子表面活性剂的量最好以100-10000mg/L的浓度使用,更优选的浓度是100-5000mg/L,所使用的量根据阳离子或两性表面活性剂的种类以及其它条件而变化。
关于非离子表面活性剂的作用机制目前还不清楚,据认为是由于非离子表面活性剂与细胞表面结合而控制离子表面活性剂对细胞膜的作用,因此抑制了用离子表面活性剂的细胞成分的溶解。例如,当阳离子表面活性剂的溶解活性强到使白细胞受到不必要的破坏强度时,把离子表面活性剂和非离子表面活性剂结合使用是可取的。非离子表面活性剂还将起到加速红细胞溶解的作用,这将引起在测量血样中所含的白细胞方面的问题。而且,非离子表面活性剂能增溶那些通过用阳离子表面活性剂中和细胞成分中包括的阴离子物质或血样的其它成分而从反应溶液中沉淀出来的物质。另外,它能抑制由于没有完全溶解而作为空壳残余下来的红细胞的聚集,这种现象发生在制备的血液试验样品中的红血球富集以及包括试剂水溶液的试验样品的稀释被迫降低的情况下。这时试剂的水溶液的稀释比必须很低,非离子表面活性剂才能被有效地利用,否则没有必要加入非离子表面活性剂。
另外,非离子表面活性剂通常起到溶解不溶于水的标记物的作用,这只有增加有用的标记物数目的价值。
根据本发明的方法,水溶性醇也包括在试剂的水溶液中,这时血样用至少含有一种阳离子或两性表面活性剂的试剂水溶液来处理。水溶性醇的例子包括具有2-5个碳原子的脂族醇例如乙醇、丙醇和丁醇,其中支链醇例如异丙醇或叔丁醇是优选的。利用烷氧醇(如甲氧乙醇)或芳香醇(如苯乙醇)也显示了类似的效果。
加入的水溶性醇的浓度取决于阳离子或两性表面活性剂的种类或其它条件。如果用乙醇最好在50~400mg/L的浓度下使用,并且醇中每增加一个碳原子,浓度就减半。
水溶性醇能选择性地加强离子表面活性剂的功能,因此低浓度的表面活性剂就能破坏细胞膜。而且,它还使细胞中所含的蛋白质并变性并使其不溶解。因此,使用水溶性醇能有效地减少细胞质和细胞粒的损失并使细胞膜的破坏达到最合适的程度。因此,水溶性醇还能保持通过散射光等测得的光学差别的效果。此外,水溶性醇使红细胞易于溶解。
采用经过本发明方法处理的血样时,例如用光学装置(如流动血细胞计数器或类似装置)或其它公知的方式能够很容易地分类和计数被标记的细胞。
另一方面,本发明还提供了适用于本发明方法的血样分析试剂。用于本发明的优选试剂如下:
(a)一种试剂,包括:
大约50-5000mg/L的阳离子或两性表面活性剂,
大约1-200mg/L的标记物,
余量为水或水溶性醇的含水介质,将其加入使试剂的最后容积为1升。
(b)一种试剂,包括:
大约50-5000mg/L的阳离子或两性表面活性剂,
大约100-10000mg/L的非离子表面活性剂,
大约1-200mg/L的标记物,以及:余量为水或水溶性醇的含水介质,将其加入使试剂的最后容积为1升。
(c)一种上述的试剂(a)和(b)在其中加入一种缓冲剂,以便将pH值调节到3.0-11.0。
下面进一步描述本发明的试剂组合物的组分的作用。
据信,本发明的表面活性剂具有拉出构成细胞膜的一部分的物质(可能是类脂的分子)的作用,在细胞膜上产生了能使通常不能通过细胞膜的物质通过的孔。本发明的效果就是通过这个作用得到的。特别是使标记物例如染料进入细胞并与细胞内成分迅速结合。例如,如果组合是按如下所述的离子键形成的,那么几乎立即可以完成标记。
第二个效果是,分子上带有正电荷的阳离子或两性表面活性剂具有这样一个作用:这个正电荷同带有负电荷的细胞内成分(例如带有磷基的RNA、带有羰基的蛋白质等发生离子键合,从而细胞内的成分变为不可溶解的。
不溶的成分甚至当细胞膜被破坏时也不能从中渗漏出来。而且,那些使不溶性成分聚集的细胞的细胞质、细胞核以及细胞粒大量的渗漏受到了限制。因此,如果试剂制备得合适,就可以象如下所述的那样,通过测定测散射光出人意料地测量出光学差别。
例1.阳离子或两性表面活性剂的浓度
将具有下列组分的水溶液
HEPES-NaoH缓冲剂(pH7.0)10mM
标记物(溴化乙非啶(EB))50mg/L
同由不同的表面活性剂和用抗凝剂处理过的静脉血(25μL)组成的水溶液(1mL)混合。将最终的溶液放到流动血细胞计数器内,用此仪器测定红光荧光和侧散射光以检测表面活性剂所用EB染色可用的浓度。检测结果如表1所示。
表1
表面活性剂 浓度
氯化月桂基三甲基铵盐(LTAC) 500mg/l
氯化十四烷基三甲基铵盐 100mg/l
氯化十六烷基三甲基铵盐 50mg/l
氯化十六烷基吡啶鎓 50mg/l
月桂基二甲基氨基乙酸内铵盐
(Anon BL,由NIHON YUSHI生产) 500mg/l
十八烷基二甲基氨基乙酸内铵盐 500mg/l
溴化十六烷基二甲基乙基铵盐 50mg/l
氯化苯基二甲基十六烷基铵盐 50mg/l
如表1所示,表面活性剂的疏水性越强,所用试剂浓度越低;表面活性剂越弱,所用的试剂浓度越高。
图1示出了通过用氯化月桂基三甲基铵盐(以后称为LTAC)所得到的侧散射光(SSC)和红光荧光(RFL)的散布图,图中将侧散射光强度和红光荧光强度作为座标轴。在图1中,通过根据白细胞和其它细胞产生的红光荧光信号的差别能将白细胞和其它血细胞区分开。而且,从图1中可清楚地看到,淋巴细胞Ly、白细胞oth1(不包括淋巴细胞Ly和嗜酸性细胞EO)以及嗜酸性细胞EO能够被分类和计数。图2是通过相同的实验所获得的侧散射光的矩形图。与图1相似,根据图2可以对淋巴细胞、粒细胞oth1(不包括淋巴细胞和嗜酸性细胞)以及对嗜酸性细胞进行分类和计数。
图3和图4是用月桂基二甲基氨基乙酸内铵盐(Anon BL)作为表面活性剂时的散布图和矩形图。于是也可以对淋巴细胞Ly、白细胞oth1(不包括淋巴细胞Ly和嗜酸性细胞EO)以及嗜酸性细胞EO进行分类和计数。
其它具有强溶解性的表面活性剂在上述条件下将白细胞分成两类。图5和图6示出了当氯化苯基甲基十六烷基铵盐用作表面活性剂场合下的散布图。从图中可以看到将白细胞只分成嗜酸性细胞EO和其它白细胞oth2两类,并对它们计数。可以通过加入非离子表面活性剂调节表面活性剂的溶解性能,借此得到如以后所描述的更详细的分类。
于是通过采用一种包含目前被认为不可能用来产生光学差别的非离子表面活性剂的试剂可以将白细胞分类。
通过观察表面活性剂和白细胞分类特性间的关系,可以发现细胞破坏的程度随着表面活性剂疏水性的增加而增加,结果导致对白细胞的分类困难。另外,可以发现,增加表面活性剂浓度使得分类变为困难。
例2包含非离子表面活性剂的效果
制备含有下列组分的试剂。
HEPES-NaOH缓冲剂(PH7.0) 10mM
溴化非乙啶(EB) 50mg/l
LTAG 1000mg/l
非离子表面活性剂 1000mg/l
将具有上述组分的试剂(1.0mL)与用抗凝剂处理的静脉血(25uL)混合。用流动血细胞计数器测量红光荧光和侧散射光。结果如图7-16所示。
图7是没有采用被称作坐标轴的离子表面活性剂时所得到的侧散射光(SSC)和红光荧光(RFL)的散布图。此时,通过增加LTAC的量可以加强溶解性,因此过度地破坏了白细胞。与从图1(LTAC 500mg/L)所看到的结果不同,此处可以观察到白细胞聚集成一团,从而不能对白细胞进行分类。
与之相反,图8-16示出了当表面活性剂内包含不同的非离子表面活性剂时,使白细胞的破坏受到控制,从而可以相对每种使用的非离子表面活性剂,将白细胞分类成淋巴细胞Ly、嗜酸性细胞EO以及其它白细胞oth1,并对它们计数。图8-10还表明聚氧乙烯乙二醇的加成摩尔数和疏水基的类型对测量的结果没有影响。
例3水溶性醇的作用
制备具有下列组分的试剂。
HEPES-NaOH缓冲剂(pH7.0) 10mM
溴化乙非啶(EB) 50mg/l
LTAC 250mg/l
非离子表面活性剂
C16H33O(CH2CH2O)30-H 1000mg/l
乙醇 100-400ml/l
将具有以上组分的试剂(1.0ml)与用抗凝剂处理的静脉血(25μl)混合。用流动血细胞计数器测红光荧光、前散射光和侧散射光。
图17~19示出了当含有被称为坐标轴的乙醇(100ml/l)时所得到的侧散射光(SSC)和红光荧光(RFL)的散布图;及其矩形图;还有以上述相同的方式用侧散射光(SSC)和红光荧光(RFL)所得到的散布图。正如从图中所看到的,将白细胞分成四类即淋巴细胞Ly、单核细胞MO、嗜酸性细胞EO以及其它白细胞oth3,并对它们进行计数。
图20~22示出了在含有乙醇(200ml/l)的条件下所获得的图,此时,将白细胞也分成四类即淋巴细胞Ly、单核细胞MO、嗜酸性细胞EO以及其它白细胞oth3,并对它们进行计数。
图23~25示出了在含有乙醇(400ml/l)的条件下所获得的图,此时,将白细胞分成三类即淋巴细胞Ly、嗜酸性细胞EO以及其它白细胞oth1,并对它们进行计数。
因此,可以发现使用过量的乙醇防止了细胞产生光学差别。
还可以发现,随着碳原子数的增加红细胞易于溶解。
例4试剂组合物的例子
制备具有下列组分的试剂。
氯化月桂基三甲基铵盐(LTAC) 1g
Brij35(聚氧乙烯乙二醇月桂基
醚/加成摩尔数:23) 1g
(非离子表面活性剂)
0.100g
(标记物:染料)
乙醇 0.100g
柠檬酸单水合物 2.1g
NaOH 适量*
纯水 0.9升
*加入一定量的NaOH以便将试剂的pH调节到4。
将含有上述组分的试剂(1.0ml)与用抗凝剂处理的静脉血(25μl)混合。在室温下20秒后,用流动血细胞计数器测红光荧光、绿光荧光、前散射光以及侧散射光。
图26~28示出了按照正常受试者的结果得到的散布图,此处红光荧光(RFL)和绿光荧光(GFL)、侧散射光(SSC)和红光荧光(RFL),将前散射光(FSC)和红光荧光(RFL)分别作为两个座标轴。正如从每个图上所看到的,白细胞被分成三类即淋巴细胞Ly、单核细胞MO和粒细胞Gr。顺便指出,De表示弄碎的红细胞膜和血小板。
本发明所用的LTAC是阳离子表面活性剂,它具有如下性质:
ⅰ)能破坏红细胞膜渗出其中所含的血红蛋白,从而使红细胞变成空壳,因此使红细胞是光学透明的,以及
ⅱ)能破坏白细胞膜以允许染料A0-10通过细胞膜。
LTAC用于破坏红细胞和白细胞膜的作用机制还不清楚。然而,据认为构成细胞膜的部分液体被表面活性作用所溶解,导致在细胞膜上形成了允许血红蛋白和染料通过的微孔。
Brij 35是非离子表面活性剂。它控制LTAC的作用以将严重破坏抑制到使细胞核裸露或白细胞变形的程度。该试剂还具有控制变成空壳的红细胞聚集的作用。而且Brij 35使难溶于水的A0-10溶解。
染料A0-10在吖啶橙的第十位上有一个十二烷基,所以通常用于同时染色DNA和RNA。由于A0-10通常不能通过细胞膜(因为长链烷基的立***阻),所以它只染色细胞膜而细胞中所含的成分不能被染色。因此,这种染料目前只被用作疏水性探针。
根据本发明,当细胞膜被破坏的时候,A0-10能侵入细胞并与其中所含的成分结合。当染料如例中所示被用于染色血液时,它以一种特殊方式与细胞中不同的成分结合。
例如,在淋巴细胞和单核细胞的细胞质中,A0-10以离子键与细胞质中存在的RNA结合并将成分染成橙色,此时从其中的细胞核和细胞粒中发射出绿光荧光。根据疏水性探针传统上公知的作用可以推测出,A0-10的长链烷基通过核膜和粒细胞膜侵入以便与细胞核和细胞粒结合。
在中性粒细胞中,由于细胞质很少有RNA,所以发射出绿光荧光。从中性粒细胞的细胞核和细胞粒中发射出绿光荧光,这与从淋巴细胞和单核细胞的细胞核与细胞粒中发射情形类似。
引起这些现象的原因可以认为是,A0-10与RNA结合时发生了因光异色作用,因此将RNA染成橙色,在细胞核与细胞粒中并没有发生因光异色作用,这是因为A0-10与细胞核及细胞粒的表面结合,因此发射出绿光荧光。
LTAC通过离子键与RNA结合并且电荷被中和,从而RNA不能溶解。据认为A0-10同这些不能溶解的成分发生了化合。
在本发明的例子中,从患血液病的病人身上抽取的血样用本发明的试剂组合物来测定。
图29~31示出了用从急性髓细胞白血病的病人身上抽取的血样得到的结果,对成髓细胞My进行分类和计数。
图32~34示出了从样品中得到的结果,在该样品中突然出现畸形的淋巴细胞Aly。对畸形的Aly进行分类和计数。
图35~37示出了从样品中得到的结果,在该样品中突然出现成红细胞Er和未成熟粒细胞Im。正如从图中所看到的,成红细胞Er和未成熟粒细胞Im被分类和计数。由于未成熟细胞Er和My、畸形淋巴细胞AIy、未成熟粒细胞Im中含有丰富的RNA,所以可通过染色RNA来检测。另外,从图37中可局部检测出网组织细胞Ret。在这个例子中,红细胞没有完全溶解,但是与之相反,只是红细胞膜被破坏。因此,变成空壳的细胞膜和细胞成分的RNA被染色,因此检测到网织红细胞。
按照常规讲,由于染料难于通过细胞膜,所以没有用于本发明的目的。然而,根据本发明,展示了不同于传统用途的染料的效果。
例5试剂组合物的例子
制备具有下列组分的试剂。
溴化吖啶橙黄涂料10-12烷 0.010g
(A0-10)(标记物)
DioC6(3)(标记物) 0.020g
氯化月桂基三甲基铵盐(LTAC) 0.5g
(阳离子表面活性剂)
聚氧乙烯乙二醇十六烷基醚 1.0g
(加成摩尔数:大约40)
(非离子表面活性剂)
异丙醇 0.050升
Nacl 4.0g
HEPES 2.3g
NaOH 适量*
纯水 0.95升
*加入一定量的NaOH以便将试剂的pH调到7。
将具有上述组分的试剂(1.0ml)与用抗凝剂处理的静脉血(25μl)混合。在室温下经20秒后,用不仅适于测光学差别而且适于根据电阻变化测阻抗信号(IMP)的复合流动血细胞计数器测定红光荧光、绿光荧光、前散射光、侧散射光以及阻抗信号。
在本例中,所用阳离子表面活性剂的量比例4中所用的量小,因此对白细胞的破坏程度小。另外,由于试剂组合物包含Nacl所以能测定阻抗信号,又由于组合物的pH在5以上,所以还能测定嗜酸性细胞。而且,当用红光荧光和绿光荧光测定时,加入能够易于染色细胞粒的染料DioC6(3),以便使细胞粒易于分开。
图38-43示出了用上述试剂组合物时的散布图和矩形图,此时红光荧光(RFL)和绿光荧光(GFL)(图38)、侧散射光(SSC)和红光荧光(图39)以及侧散射光(SSC)和阻抗信号(IMP)(图40)分别被作为坐标轴;还有侧散射光矩形图(图41)以及侧散射光(SSC)和绿光荧光(GFL)(图42)、侧散射光(SSC)和前散射光(FSC)(图43)分别被作为坐标轴。在这些图中,Ne+Ba表示中性粒细胞和嗜碱性细胞的分布。
在本例中,与例4相似,RNA能被染色。因此,未成熟细胞Er和My、畸形淋巴细胞Aly、未成熟粒细胞能被分类和计数。
顺便指出,在日本待公开专利申请H5-34251(1993)(USSNO7/902,979)中公开的流动血细胞计数器在本例中用于检测阻抗信号。
例6试剂组合物的例子
制备具有下列组分的试剂。
月桂基二甲基氨基乙酸内铵盐 2g
(两性表面活性剂)
(Anon BL:由NIHON YUSHI Co.生产)
聚氧乙烯乙二醇壬基苄基醚 1g
(加成摩尔数:20)
(非离子表面活性剂)
异丙醇 0.100升
柠檬酸单水合物 2.1g
NaOH 适量*
0.1g
纯水 0.9升
*加入一定量的NaOH以将试剂的pH调节到7。
将具有上述组分的试剂(800μl)与用抗凝剂处理的静脉血(400μl)混合并用流动血细胞计数器测定侧散射光和红光荧光。
本例有助于检测在冲淡稀释物中的痕迹量白细胞,这些白细胞是在用排除白细胞过滤器处理后残留下来的。通常,适于获得体积差的溶解剂以100~200倍的稀释浓度来使用以致于用它制备高浓度的试剂组合物例如本例中的那些组合物是不可能的。如果使用传统上用于血液制备的Triton x-100,那么血液与溶解剂的比例是1∶7.5。然而,本发明可以制备更浓的用于测定的试剂组合物。
而且,根据本发明,得到了与图3和图4类似的散布图,并可以将白细胞分成三类。如果用Triton x-100这是不可能的。
这样,通过本发明的方法可以使用具有较高浓度的试剂组合物,而用传统的方法在这样高的浓度下是不可能进行测定的。
参考例1
为了比较,制备如下含有高浓度的阳离子表面活性剂的试剂:
氯化十二烷基三甲基铵盐 55g/l
(阳离子表面活性剂)
氯化十四烷基三甲基铵盐 9g/l
(阳离子表面活性剂)
*** 0.300g/l
聚氧乙烯乙二醇烷基苄基醚 12ml/l
(非离子表面活性剂)
将具有上述组分的试剂(1.0ml)与用抗凝剂处理的静脉血(25ml)混合。保温20秒以后,用流动血细胞计数器测定侧散射光和红光荧光。结果如图44和45所示。
正如从图中所看到的,白细胞聚集成一团,因此,不能根据光学差别用侧散射光和红光荧光来分类。
参考例2
制备如下含有非离子表面活性剂的试剂并进行DNA染色。
诺乃洗涤剂P-40 1ml/l
(非离子表面活性剂)
柠檬酸钠 10g/l
将碘化丙非啶(50μg/ml)加入具有上述组分的试剂中,然后与用抗凝剂处理的静脉血(25μl)混合。保温20秒以后,用流动血细胞计数器测定侧散射光和红光荧光。结果如图46和47所示。
从图中可以看到,用侧散射光和红光荧光根据光学差别可以鉴别嗜曙红细胞,因为它们没有被裸露。然而,除嗜曙红细胞之外的白细胞不能被分成亚类。
1.根据本发明,标记物具有通过细胞膜的性质可通过包含阳离子和/或两性表面活性剂的水溶液和用没有经例如固定处理的标记物处理生物样品而得到增强。因此,几乎可以立即用各种标记物标记细胞。另外,在消除红细胞干扰的同时,可用不可能再使用的表面活性剂借助测散射光等而获得光学差别。
2.由于解决了标记物向细胞膜迁移的问题,所以使曾被认为不能用于细胞分类的标记物又可用于这种分类。
3.因此,可以发现标记物的不同于传统性质的特性(例如适合于作染料的那方面的性质等)。
4.用以前的技术没有实现的精确分类,现在可以借助利用非离子表面活性剂和醇完成。
5.本发明也可以用于检查标记物的性质。
Claims (23)
1、一种用于血液分析的预处理方法,包括用至少含有一种由阳离子表面活性剂和两性表面活性剂组成的组中选取的表面活性剂的水溶液和利用至少一种标记物选择性标记白细胞处理血样;其特征在于:
使用浓度不会破坏白细胞的整个细胞膜却足以破坏其部分细胞膜的表面活性。
标记物是一种能通过被破坏的细胞膜并能与白细胞中所含的成分结合的物质;以及
在pH值为3.0~11.0的条件下进行该处理。
2、根据权利要求1所述的用于血液分析的预处理方法,其中水溶液中所含的表面活性剂的浓度为30-5000mg/l。
3、根据权利要求2所述的用于血液分析的预处理方法,其中所含的表面活性剂的浓度为50~2000mg/l。
4、根据权利要求1所述的用于血液分析的预处理方法,其中阳离子表面活性剂是季铵盐类表面活性剂或吡啶鎓盐类表面活性剂。
5、根据权利要求4所述的用于血液分析的预处理方法,其中季铵盐类表面活性剂具有结构式(Ⅰ):
其中R1、R2和R3各自为氢原子、C1-8烷基或C6-8芳烷基;R4是C8-18烷基、C8-18链烯基或C6-18芳烷基;以及X是阴离子。
6、根据权利要求4所述的用于血液分析的预处理方法,其中季铵盐类表面活性剂至少是一种从一组合中选择的物质,该组合的组成是:
氯化月桂基三甲基铵盐,
氯化十四烷基三甲基铵盐,
氯化十六烷基三甲基铵盐,
氯化十六烷基二甲基乙基铵盐,以及
氯化苯基二甲基十六烷基铵盐
7、根据权利要求4所述的用于血液分析的预处理方法,其中吡啶鎓盐表面活性剂具有结构式(Ⅱ):
其中R5是C8-18烷基以及X是阴离子。
8、根据权利要求7所述的用于血液分析的预处理方法,其中吡啶鎓盐类表面活性剂是十六烷基吡啶氯化物。
10、根据权利要求9所述的用于血液分析的预处理方法,其中两性表面活性剂是十二烷基二甲基氨基乙酸内铵盐、十八烷基二甲基氨基乙酸内铵盐。
11、根据权利要求1所述的用于血液分析的预处理方法,其中所用的表面活性剂水溶液与血样的体积比为2-200。
12、根据权利要求1所述的用于血液分析的预处理方法,其中表面活性剂水溶液中所含的非离子表面活性剂的浓度是100-10000mg/l。
13、根据权利要求12所述的用于血液分析的预处理方法,其中所含的非离子表面活性剂的浓度是100-5000mg/l。
14、根据权利要求1所述的用于血液分析的预处理方法,其中水溶性醇被加入到表面活性剂的水溶液中。
15、根据权利要求14所述的用于血液分析的预处理方法,其中水溶性醇是乙醇并且使用浓度为50-400ml/l。
16、根据权利要求14所述的用于血液分析的预处理方法,其中水溶性醇是异丙醇并且使用浓度是25-200ml/l。
17、根据权利要求1所述的用于血液分析的预处理方法,其中标记物是能与白细胞的细胞核结合的染料。
18、根据权利要求17所述的用于血液分析的预处理方法,其中标记物是溴乙非啶或碘丙非啶。
19、根据权利要求1所述的用于血液分析的预处理方法,其中标记物是能与白细胞中所含的RNA结合的染料。
20、根据权利要求19所述的用于血液分析的预处理方法,其中标记物是派诺宁丫、吖啶橙、Tizole Orange、10-十二烷基吖啶橙溴化物或槐黄-0。
21、根据权利要求1所述的用于血液分析的预处理方法,其中1升表面活性剂的水溶液加入1-500mg标记物。
22、根据权利要求1所述的用于血液分析的预处理方法,其中被标记的白细胞用光学方法分类和计数。
23、根据权利要求1所述的用于血液分析的预处理方法,其中处理是在pH值为4.0-9.0的条件下进行的。
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