CN108414427A - 一种白细胞分类试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种白细胞分类试剂，其原料组成包括：离子型表面活性剂，调节pH的缓冲剂，调节渗透压的碱金属盐，具有助溶和加速作用的醇。该试剂可以使白细胞分为四个细胞团，并且各细胞团之间分界清晰，相对于传统的五分类溶血剂，单核与中性粒细胞团分界更加清晰，聚类性更强。并且该试剂的低温溶血能力强，温度范围宽，在低温环境下可以快度溶解红细胞，保证白细胞正常分类，降低了仪器温控上的制造成本。此外，该试剂的原料成本低，环保无毒，只需一种试剂即可实现对白细胞的分类，方便省时，降低生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及血液细胞分析领域，主要涉及一种白细胞分类试剂。
背景技术
在临床上，传统的血常规检查是利用人工镜检对血液中的白细胞、红细胞、血小板等参数进行分析，但是人工操作效率低，误差大，不适合大规模的检验需求。血液细胞分析仪的出现改变了传统的血液分析方法，使血液分析逐渐向自动化、标准化方向发展。其中白细胞分类和计数是临床检验中的一项重要内容，采集患者的血液样品，对白细胞进行分类和计数，可以为临床诊断和治疗提供依据，在疾病诊断中有非常重要的作用。
迄今为止，关于利用血液分析仪对白细胞进行分类计数的方法有很多，这些大部分是基于多种试剂对白细胞进行特殊处理，使不同的白细胞类群在体积或细胞的复杂度及荧光强度等方面产生差异，然后借助仪器的检测***对白细胞进行分类。
其中，中国专利CN104698157A提出了可以用两种试剂完成白细胞分类计数的方法。两种试剂都含有阳离子表面活性剂和缓冲剂，至少一种试剂中含有非离子表面活性剂和化学染料。两种试剂在基于流式激光散射原理的细胞分析仪上共同作用将白细胞分成淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞四个类群，该试剂成分复杂，低温下容易结晶，此外，试剂中含有化学染料，对环境污染严重，而且增加了仪器和试剂的复杂性，不利于长期使用。
中国专利CN101236192A公开了一种白细胞分类的试剂体系，该试剂体系中包含两个试剂，一种溶血剂和一种抑制剂，溶血剂溶解红细胞，对白细胞的结构进行特殊处理，抑制剂的作用是阻止溶血剂对白细胞形态结构的进一步破坏，使白细胞维持一定的形态特征，借助仪器的前向散射光信息和侧向散射光信息实现对白细胞的分类。该试剂体系中的溶血剂使用了多种表面活性剂，成分较复杂，并且由于pH过高，可能对血液分析仪的管路、器件等造成损害。涉及到和抑制剂的配合使用，增加了仪器的控制成本。
专利CN101070108A利用单试剂对白细胞进行分类，该试剂包含至少两种阳离子表面活性剂，至少一种带疏水基团及阴离子基团的有机化合物，以及缓冲剂，利用该试剂可以快速溶解红细胞，实现白细胞分类。但是该试剂的温度范围太窄，低温10℃就会出现溶血不足的情况，在30℃左右对白细胞的处理程度又会过度，使各细胞团向散点图的左下角挤压，影响了分类效果，该试剂对反应温度要求高，依赖于仪器的温度控制，增加了仪器温控成本。
专利CN101975851A公开的一种试剂显示，该试剂主要由表面活性剂和缓冲剂组成，可以将白细胞分为淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸细胞四个细胞团，并且低温下溶血效果好，但是常温和高温下图形分类差，中性粒细胞团容易上翘，造成与单核细胞的挤压、重叠，不利于算法的准确识别。
综上所述，现有的发明专利中还存在许多不足之处，比如试剂的使用温度范围过窄，图形分类不够清晰，试剂成本高，制备复杂等，需要对现有技术进一步改进。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种新的白细胞分类试剂，该试剂能在较宽的温度范围内使用，可以使白细胞分为界限清晰的四个细胞团，旨在解决现有白细胞分类试剂存在适用温度范围过窄、图形分类不够清晰等问题。
本发明的技术方案如下：
本发明公开一种用于白细胞分类的试剂，所述试剂组成包括：可以溶解红细胞，并使白细胞的细胞膜部分损伤的离子型表面活性剂；调节pH的缓冲剂；调节渗透压的碱金属盐；具有助溶和加速作用的醇；具有分散、乳化、增溶作用的非离子表面活性剂。
优选的，所述离子型表面活性剂为两性离子表面活性剂。
进一步优选，所述两性离子表面活性剂为甜菜碱型两性离子表面活性剂，为了保证白细胞的分类效果，一般选用至少两种离子型表面活性剂。所述两性离子表面活性剂用量为0.05-2g/L，优选0.1-1g/L。
优选的，所述试剂中缓冲剂是能够将pH调整在2-6范围内的缓冲剂。优选磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、甲酸盐缓冲液或Tris-盐酸缓冲液，进一步优选磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液及醋酸盐缓冲液。
所述试剂中含有渗透压调节剂。优选的，渗透压调节剂为碱金属盐，进一步优选，渗透压调节剂为氯化钠、氯化钾、硫酸钠或硫酸钾。渗透压调节剂调节本发明试剂的渗透压为400-900mOsm/kg，优选500-800mOsm/kg，进一步优选600-800mOsm/kg。
所述试剂进一步包括醇类，醇在本发明试剂中发挥助溶的作用，另一方面对反应的过程起到助溶和加速作用。优选的，所述试剂中的醇为甲醇、乙醇、异丙醇、苯氧乙醇。优选的，醇类物质使用量为1-10mL/L,进一步优选2-8mL/L。
所述试剂还包括一种非离子表面活性剂，非离子表面活性剂可以增强试剂的分散、乳化性能。优选的，所述非离子表面活性剂为脂肪醇聚氧乙烯醚AEO-3、AEO-5、AEO-7、AEO-9,烷基酚聚氧乙烯醚OP-7、OP-9、OP-10、OP-13、NP-10、TX-10，Triton X-100或Brij35等，进一步优选AEO-9、0P-10、Brij35。非离子表面活性剂的使用量为0.05-1g/L,优选0.1-0.5g/L。
本发明所述试剂以一定比例与全血样本混合以后，红细胞被迅速溶解，白细胞经过特殊处理，借助仪器的前向散射光和侧向散射光分别测定细胞的大小和形态信息，在散点图上将白细胞分成界限清晰、位置固定的淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞及嗜酸性粒细胞四个细胞团，经过算法处理得到白细胞分类计数结果。
有益效果：本发明试剂与现有技术相比，有以下优点：
利用本发明试剂在血液细胞分析仪上对白细胞分类检测时，可以将白细胞分为与淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞分别对应的四个细胞团，并且各细胞团之间分界清晰，相对于传统的五分类溶血剂，单核与中性粒细胞团位置分界更加明显，聚类性更强；并且，该试剂在低温环境下有较强的溶血能力，温度范围宽，可以快度溶解红细胞，保证白细胞正常分类，降低了仪器温控上的制造成本。本发明只需配制成一种试剂即可实现对白细胞的分类，相对于两种试剂，使用更加方便，生产成本更低。此外，该试剂的原料便宜，环保无毒，适合长期使用。
附图说明
图1为本发明实施例1中白细胞分类散点图。
图2为本发明实施例2中白细胞分类散点图。
图3为本发明实施例3中白细胞分类散点图。
图4为本发明实施例4中白细胞分类散点图。
图5a～图5d为本发明实验例1中原装试剂在DF50上白细胞分类散点图。
图6a～图6d为本发明实验例2中白细胞分类相关性。
具体实施方式
本发明提供一种白细胞分类试剂，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明所提供的一种白细胞分类试剂，其原料组成包括：离子型表面活性剂，调节pH的缓冲剂，调节渗透压的碱金属盐，具有助溶和加速作用的醇，防腐剂。此外，为了增强试剂的分散、乳化、增溶作用，可适当添加一种非离子表面活性剂。
具体地，所述离子型表面活性剂为两性离子表面活性剂，所述两性离子表面活性剂的作用是溶解红细胞，并使白细胞的细胞膜部分破坏，内部胞质流出，从而使不同类群的白细胞形态差异显现，利用仪器收集到的前向散射光信息和侧向散射光信息对不同类群的白细胞进行分选，再经过算法处理后实现白细胞分类计数。
所述两性离子表面活性剂优选为甜菜碱型两性离子表面活性剂，结构式如下式所示：
其中，R代表烷基或含6～20个碳原子的烷基基团，其溶血能力随着R链长的增加而增强。所述两性离子表面活性剂的用量要能溶解红细胞，并造成白细胞膜的部分损伤，为了保证白细胞的分类效果，一般选用至少两种两性离子表面活性剂。
作为优选，可以选择十二烷基二甲基甜菜碱、十四烷基二甲基甜菜碱、十六烷基二甲基甜菜碱、十八烷基二甲基甜菜碱、十二烷基二甲基磺乙基甜菜碱、十四烷基二甲基磺乙基甜菜碱、十六烷基二甲基磺乙基甜菜碱、十八烷基二甲基磺乙基甜菜碱、十二烷基二甲基磺丙基甜菜碱、十四烷基二甲基磺丙基甜菜碱、十六烷基二甲基磺丙基甜菜碱、十八烷基二甲基磺丙基甜菜碱，为了保证白细胞的分类效果，一般选用其中的至少两种两性离子表面活性剂。
所述两性离子表面活性剂用量为0.05-2g/L，优选为0.1-1g/L。只要保证使红细胞溶解，白细胞的膜部分破坏，不同类群细胞间的形态差异显现，选择上述任意两性表面活性剂的组合和用量均可。
本发明中，含有调整pH的缓冲剂。缓冲剂可以选择常见的如磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、甲酸盐缓冲液及Tris-盐酸缓冲液。作为优选，可选用磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液及醋酸盐缓冲液，缓冲液使用量为0.1-10％，优选0.2-5％。缓冲液可以较长时间控制恒定的pH范围，保证试剂pH稳定，对细胞形态及物质与细胞结合程度有重要作用。
所述白细胞分类试剂中含有调节渗透压的碱金属盐。渗透压可以在一定程度上改变细胞的形态，对细胞的分布趋势有影响，合适的渗透压可以增强细胞的聚集性，使不同类群白细胞之间的分界更加清晰。因此，为了改变红细胞的脆性，并使白细胞保持特定形态，需要将试剂的渗透压保持在合适范围。本发明试剂的渗透压通常为400-900mOsm/kg，优选为500-800mOsm/kg，进一步优选为600-800mOsm/kg。通常在试剂中加入碱金属盐，作为渗透压调节剂，碱金属盐没有特别限定，常用的如氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾等都可使用，使用量为使试剂的渗透压保持在合适范围的量。碱金属盐的使用量通常为1-10g/L，优选2-9g/L，进一步优选3-6g/L。
所述白细胞分类试剂中含有醇类。醇类有助溶的作用，可促进关键物质的溶解，对反应的过程有加速作用，本发明对醇类没有特别要求，常见的甲醇、乙醇、异丙醇、苯氧乙醇等都可使用。醇类物质使用量通常为1-10mL/L，优选2-8mL/L。
所述白细胞分类试剂中含有防腐剂。防腐剂可以抑制试剂在长期放置过程中微生物的滋生，防止试剂变质，延长试剂的储存和使用时间，保证试剂在效期内性能稳定。对试剂性能没有影响的防腐剂均可选用，常用的防腐剂有苯甲酸及其盐、山梨酸及其盐类、乙内酰脲类和异噻唑啉酮类化合物(Proclin300)以及苯氧乙醇、甲醛溶液均有一定的防腐功效。防腐剂的用量通常为0.01-4g/L，不同的防腐剂可以选择不同浓度，保证试剂在效期内功能正常即可。
除上述成分外，本发明试剂中还可加入一种非离子表面活性剂。非离子表面活性剂在水中不发生电离，是以羟基(—OH)或醚键(R—O—R′)为亲水基的两亲结构分子。由于非离子表面活性剂在水中不电离的特点，决定了它在某些方面较离子型表面活性剂优越，如在水中和有机溶剂中都有较好的溶解性，在溶液中稳定性高，不易受强电解质无机盐和酸、碱的影响。非离子表面活性剂具有优良的分散、乳化、增溶等多种作用，与其他表面活性剂配合使用可增强白细胞的分类效果。
所述非离子表面活性剂可选择脂肪醇聚氧乙烯醚AEO-3、AEO-5、AEO-7、AEO-9，烷基酚聚氧乙烯醚OP-7、OP-9、OP-10、OP-13、NP-10、TX-10，Triton X-100，Brij35等，优选为AEO-9、0P-10、Brij35。非离子表面活性剂的使用量通常为0.05-1g/L，优选为0.1-0.5g/L。
作为优选，本发明提供一种使白细胞分类的试剂，所述试剂的组分及含量为：两性离子表面活性剂0.1-0.8g/L、缓冲剂2-7g/L、碱金属盐2-6g/L、醇类物质3-10g/L、防腐剂0.1-0.6g/L，非离子表面活性剂0.1-1g/L；所述试剂的pH为3-5，所述试剂的电导率为15-25g/L，所述试剂渗透压为500-600mOsm/Kg。
进一步优选，本发明所述试剂的组分和含量为：两性离子表面活性剂0.1-0.6g/L、缓冲剂2-7g/L、碱金属盐2-6g/L、醇类物质3-10g/L、防腐剂0.1-0.4g/L，非离子表面活性剂0.1-0.8g/L；所述试剂的pH为4-5，所述试剂的电导率为15-25g/L，所述试剂渗透压为500-600mOsm/Kg。
本发明所述试剂以一定比例与全血样本混合以后，其中表面活性剂成分可以迅速溶解红细胞，并造成白细胞的细胞膜部分损伤，胞质流出，同时维持一定的渗透压，使不同类群间的白细胞形态差异显现。通过仪器测定细胞的大小和复杂程度信息，细胞的体积大小反映到前向散射光的强度，细胞的复杂程度、形态信息反映到侧向散射光强度，借助仪器的激光散射信息可以在散点图上将白细胞分成界限清晰、位置固定的淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞及嗜酸性粒细胞四个细胞团，经过算法处理后得到白细胞分类计数结果。
以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种用于白细胞五分类的试剂，该试剂由以下成分组成：
按上述配方配制的试剂pH为4.5。将上述试剂在DF50全自动血液细胞分析仪上测试血液样本A，结果如图1所示，散点图上可以将白细胞分为淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞及嗜酸性细胞四个清晰的细胞团。
实施例2
一种用于白细胞五分类的试剂，该试剂由以下成分组成：
按上述配方配制的试剂pH为5.5。将上述试剂在DF50全自动血液细胞分析仪上测试血液样本B，结果如图2所示，散点图上可以将白细胞分为淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞及嗜酸性细胞四个清晰的细胞团。
实施例3
一种用于白细胞五分类的试剂，该试剂由以下成分组成：
按上述配方配制的试剂pH为4.2。将上述试剂在DF50全自动血液细胞分析仪上测试血液样本C，结果如图3所示，散点图上可以将白细胞分为淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞及嗜酸性细胞四个清晰的细胞团。
实施例4
一种用于白细胞五分类的试剂，该试剂由以下成分组成：
按上述配方配制的试剂pH为4.8。将上述试剂在DF50全自动血液细胞分析仪上测试血液样本D，结果如图4所示，散点图上可以将白细胞分为淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞及嗜酸性细胞四个清晰的细胞团。
实验例1
原装试剂对比试验：
用厂家给定的原装试剂在DF50全自动血液细胞分析仪上测试血样A、B、C、D，结果如图5a～图5d所示，散点图上可以将白细胞分为淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞及嗜酸性细胞四个细胞团，但是中性粒细胞团上翘，造成与单核细胞挤压重叠，与单核细胞分界不清晰，影响其分类。而本发明试剂在单核细胞与中性粒细胞的分界上更加清晰，更便于算法的识别。
实验例2
白细胞分类相关性分析：
将本发明试剂在DF50系列血液细胞分析仪上的测试结果与人工镜检结果比较，取40例新鲜血样本进行白细胞分类计数，如表1所示，以镜检结果为横坐标，以本发明试剂的结果为纵坐标，得到各分类参数相关性线性回归方程，如图6a～图6d所示。结果表明，本发明试剂的白细胞分类结果与人工镜检比较，各分类参数相关系数r明显优于现有行业标准，表明两种检测方法有良好的相关性。
表1
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种白细胞分类试剂，其特征在于，原料组成包括：离子型表面活性剂，调节pH的缓冲剂，调节渗透压的碱金属盐，具有助溶和加速作用的醇；
所述离子型表面活性剂为两性离子表面活性剂，所述两性离子表面活性剂用量为0.05-2g/L；缓冲剂的使用量为0.1-10％；碱金属盐的使用量为1-10g/L，白细胞分类试剂的渗透压为400-900mOsm/kg；醇的使用量为1-10mL/L。
2.根据权利要求1所述的白细胞分类试剂，其特征在于，所述白细胞分类试剂中还包括非离子表面活性剂；非离子表面活性剂的使用量为0.05-1g/L。
3.根据权利要求2所述的白细胞分类试剂，其特征在于，所述两性离子表面活性剂用量为0.1-1g/L；缓冲剂的使用量为0.2-5％；碱金属盐的使用量为2-9g/L，白细胞分类试剂的渗透压为500-800mOsm/kg；醇的使用量为2-8mL/L；非离子表面活性剂的使用量为0.1-0.5g/L。
4.根据权利要求3所述的白细胞分类试剂，其特征在于，原料组成包括：用量为0.1-0.8g/L的两性离子表面活性剂、用量为2-7g/L的缓冲剂、用量为2-6g/L的碱金属盐、用量为3-10g/L的醇、用量为0.1-0.6g/L的防腐剂，用量为0.1-1g/L的非离子表面活性剂；所述白细胞分类试剂的pH为3-5，所述试剂的电导率为15-25g/L，所述白细胞分类试剂的渗透压为500-600mOsm/Kg。
5.根据权利要求4所述的白细胞分类试剂，其特征在于，两性离子表面活性剂的用量为0.1-0.6g/L、缓冲剂的用量为2-6g/L、碱金属盐的用量为2-6g/L、醇的用量为3-10g/L、防腐剂的用量为0.1-0.4g/L，非离子表面活性剂的用量为0.1-0.8g/L；所述白细胞分类试剂的pH为4-5，所述试剂的电导率为15-25g/L，所述白细胞分类试剂的渗透压为500-600mOsm/Kg。
6.根据权利要求1～5任一所述的白细胞分类试剂，其特征在于，所述两性离子表面活性剂至少选用两种不同的两性离子表面活性剂。
7.根据权利要求1～5任一所述的白细胞分类试剂，其特征在于，所述两性离子表面活性剂为甜菜碱型两性离子表面活性剂，结构式如下式所示：
其中，R代表烷基或含6～20个碳原子的烷基基团。
8.根据权利要求1～5任一所述的白细胞分类试剂，其特征在于，所述两性离子表面活性剂为十二烷基二甲基甜菜碱、十四烷基二甲基甜菜碱、十六烷基二甲基甜菜碱、十八烷基二甲基甜菜碱、十二烷基二甲基磺乙基甜菜碱、十四烷基二甲基磺乙基甜菜碱、十六烷基二甲基磺乙基甜菜碱、十八烷基二甲基磺乙基甜菜碱、十二烷基二甲基磺丙基甜菜碱、十四烷基二甲基磺丙基甜菜碱、十六烷基二甲基磺丙基甜菜碱、十八烷基二甲基磺丙基甜菜碱中的一种或两种以上。
9.根据权利要求2～5任一所述的白细胞分类试剂，其特征在于，所述非离子表面活性剂选择脂肪醇聚氧乙烯醚AEO-3、AEO-5、AEO-7、AEO-9，烷基酚聚氧乙烯醚OP-7、OP-9、OP-10、OP-13、NP-10、TX-10，Triton X-100，Brij35中的一种。
10.根据权利要求1～5任一所述的白细胞分类试剂，其特征在于，所述防腐剂为苯甲酸及其盐、山梨酸及其盐类、乙内酰脲类、异噻唑啉酮类化合物、苯氧乙醇或甲醛溶液；缓冲剂为磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、甲酸盐缓冲液或Tris-盐酸缓冲液；所述醇为甲醇、乙醇、异丙醇或苯氧乙醇；所述碱金属盐为氯化钠、氯化钾、硫酸钠或硫酸钾。
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